Souris

Une injection de cellules tumorales sous l'omoplate, puis deux séances d'imagerie sous anesthésie dont une de deux heures : six souris ouvrent ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Viennent ensuite six rats, opérés une heure sous anesthésie pour qu'on leur greffe une tumeur dans le cerveau, puis passés trois fois à l'imagerie. Les douze animaux, tous immunodéficients pour accepter les cellules humaines, sont tués à la fin pour vérifier où le traceur radioactif s'est fixé dans leur corps. Le porteur annonce commencer par trois mâles et n'inclure les trois femelles, puis la phase chez le rat, que si les résultats sont concluants, ce qui pourrait ramener le total à trois animaux.

Objectifs

Les glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus graves chez l’adulte. Ils sont très difficiles à soigner, car certaines cellules résistent aux traitements et provoquent souvent des rechutes. Pour mieux lutter contre ces cellules résistantes, il est nécessaire de les repérer plus précisément. Une des méthodes actuelles utilise des anticorps, qui sont des composés capables de reconnaître les cellules cancéreuses. Mais ces anticorps sont souvent trop gros pour passer la barrière naturelle qui protège le cerveau. Cela limite leur efficacité. Ce projet s’intéresse à une version plus petite de ces anticorps, appelée fragment d’anticorps, qui pourrait mieux atteindre les cellules malades. En y ajoutant un élément radioactif, ces fragments peuvent être utilisés pour les rendre visibles grâce à une technique d’imagerie médicale appelée TEP (Tomographie par Émission de Positons). L’objectif est de tester ce nouveau fragment pour voir s’il permet de mieux détecter les cellules cancéreuses résistantes dans les glioblastomes. Si cela fonctionne, cela pourrait aider les médecins à suivre plus précisément l’évolution de la maladie et à adapter les traitements à chaque patient. À long terme, cela pourrait améliorer la prise en charge et les chances de survie des personnes atteintes de ce cancer.

Bénéfices attendus

En permettant une détection plus précoce et plus précise des cellules cancéreuses résistantes, les agents d’imagerie développés en amont de ce projet pourraient aider à mieux évaluer la progression de la maladie et à adapter les traitements de manière plus ciblée. À terme, cela pourrait contribuer à une prise en charge plus personnalisée des patients et à une amélioration de leur pronostic.

Procédures

Une injection sous-cutanée de cellules tumorale pour les souris (5min). Une chirurgie de greffe tumorale intracérébrale pour les rats (1h). / 2 examens d'imageries de 10min et 2h pour chaque souris et 3 examens d'imagerie de 15min, 20min et 2h pour chaque rat, sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

Chez la souris, la tumeur implantée sur l’omoplate peut gêner légèrement la locomotion. La mesure de la taille de la tumeur sur animal vigile peut induire un stress modéré. Le jeûne avant l'esamen d'imagerie peut entraîner une hypoglycémie. Les examens d’imagerie nécessitent des anesthésies répétées, de durée variable selon le protocole. Chez le rat, l'implantation de la tumeur peut entraîner des effets secondaires, notamment neurologiques. Les anesthésies seront également répétées et plus longues que chez la souris. Chez les deux espèces, les injections répétées dans la veine caudale peuvent provoquer une inflammation locale, une douleur transitoire.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés et les organes seront prélevés afin d'évaluer la fixation du fragment d'anticorps radioactif (diagnostic) dans le corps entier de l'animal.

Remplacement

Des études de biologie cellulaire en laboratoire ont été réalisées au laboratoire et ont montré des résultats prometteurs, néanmoins l’évaluation dans l'organisme du devenir du fragment d'anticorps reste indispensable. En effet, les modèles cellulaires actuellement disponibles ne reflètent pas fidèlement la distribution observée dans un organisme entier. Il est crucial de vérifier que ce produit se fixe bien sur la tumeur, sans accumulation dans d’autres organes, à l’exception de ceux impliqués dans son élimination (comme les reins). Par ailleurs, nos modèles de cellules sont enrichis en cellules souches cancéreuses. Cependant, la proportion de ces cellules varie considérablement d’une tumeur à l’autre. Ainsi, seule une évaluation dans un organisme vivant permet de juger de manière fiable le comportement et la spécificité du composé. De plus, pour savoir si le composé expérimental peut traverser la barrière protectrice du cerveau, il est indispensable d’utiliser un modèle animal de tumeur intracérébrale.

Réduction

Cette étude est conçue comme une étude exploratoire, en 2 phases, visant à évaluer le potentiel de fixation du fragment d'anticorps radioactif au niveau de la tumeur sous-cutanée puis intra-cérébrale. Phase 1 : Tumeur sous-cutanée chez la souris. Le nombre d’animaux a été strictement limité à six souris nude (trois mâles et trois femelles). Toutefois, seuls les mâles seront utilisés dans un premier temps (car le glioblastome a une prévalence masculine). Si les résultats obtenus sur les mâles sont concluants, les femelles seront incluses. Dans le cas contraire, les femelles ne seront pas testées et l'étude s'arrêtera, réduisant le nombre d’animaux à 3 au lieu de 6. Phase 2 : Tumeur intracérébrale chez le rat. Le nombre d’animaux a été strictement limité à six rats (trois mâles et trois femelles). Cependant, l’utilisation de ces animaux dépendra des résultats obtenus durant la phase 1. Si les résultats de la phase 1 ne sont pas concluants, la phase 2 ne sera pas initiée et les 6 rats nude ne seront donc pas utilisés. Cette approche progressive,permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés, tout en obtenant des données préliminaires essentielles pour orienter les étapes expérimentales ultérieures. Chaque animal sera son propre contrôle car le côté controlatéral pourra être utilisé comme référence de tissu sain.

Raffinement

Le transport des rats entre l’animalerie et le site d’imagerie, situé à proximité de la plateforme, sans passage à l’extérieur, sera réalisé en maintenant une température optimale par l’intermédiaire de bouillotes chauffantes placées sous les cages. Un suivi quotidien sera assuré pour tous les animaux, avec une attention particulière portée à l’état général, au comportement, à la mobilité et à l’alimentation-hydratation ainsi qu’à la vérification du bon état de la plaie. Des points limites précoces ont été fixés (perte de poids et problèmes de motricité essentiellement), afin d’anticiper toute souffrance ou dégradation de l’état général liée à la tumeur. Toute altération du bien-être entraînera une prise en charge adaptée ou une euthanasie anticipée si nécessaire. Toutes les manipulations potentiellement stressantes ou douloureuses (injection du composé radioactif, imageries) seront réalisées sous anesthésie générale, garantissant l’absence de douleur et de stress. Les animaux seront sous anesthésie générale de l’injection du composé radioactif et lors des examens d'imagerie, les animaux sont placés dans un lit chauffant avec surveillance respiratoire et cardiaque et le niveau d’anesthésie sera surveillé et adapté si besoin pour garantir un état stable et sécurisé des animaux. Leur réveil se fera dans un environnement calme et sous surveillance. L’ensemble des manipulations sera réalisé par du personnel qualifié et expérimenté.

Choix des espèces

Souris : Au cours de projet, il est indispensable de travailler avec des souris immunodéficientes pour éviter le rejet de greffes des cellules cancéreuses humaines. Rats : Il est indispensable de travailler avec des rats immunodéficients pour éviter le rejet de greffes des cellules cancéreuses humaines. Ce choix est également motivé par la limite de la résolution des appareils d'imagerie, qui ne permettrait pas d’obtenir une qualité d’image suffisante, pour analyser correctement les lésions tumorales intracérébrales (la tumeur ayant un volume plus réduit en intracérébral) sur des animaux plus petits comme les souris. Phase 1 : Des souris de 6 semaines (stade adulte) à leur arrivée seront utilisées. Elles auront 7 semaines lors de l’implantation des cellules tumorales et entre 8-9 semaines au moment des imageries. Phase 2 : Des rats âgés de 7 semaines au moment de la greffe (6 semaines à la réception) seront utilisées à un stade où la croissance crânienne est achevée.

Un gavage par jour pendant huit semaines, jusqu'à trois prélèvements sanguins, des antibiotiques dans l'eau de boisson et deux mois d'isolement en cage individuelle : 1 872 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes seront tuées pour qu'on analyse la répartition du microbiote dans leur intestin. L'objectif déclaré est de comprendre comment les bactéries colonisent l'intestin selon le profil du microbiote, avec l'espoir affiché de pouvoir un jour manipuler le microbiote humain. Le résumé tient en quelques lignes sur les procédures comme sur le raffinement, et ne détaille ni les points limites qu'il dit "stricts", ni le calcul qui mène à 1 872 animaux.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est de comprendre le rôle du microbiote intestinal dans la colonisation des bactéries. Les souris seront utilisées comme modèle pour divers profils de microbiotes intestinaux qui seront colonisés par des bactéries. Des thérapies distinctes seront également utilisées pour étudier les dynamiques de colonisation en réponse à ces thérapies. Ce projet fournira des informations essentielles sur le rôle du microbiote intestinal dans la colonisation bactérienne et la réussite des thérapies.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront non seulement d'améliorer la compréhension fondamentale des interactions entre l'hôte et les bactéries, mais aussi d'obtenir des informations mécanistiques essentielles qui pourront être exploitées pour manipuler le microbiote intestinal humain de manière à promouvoir et à préserver la santé humaine.

Procédures

Gavage: durée 5s ; un seul gavage ou un gavage par jour pendant 8 semaines en fonction de la procédure. Prélevement du sang: durée 30s ; fréquence 3 fois max pour 8 semaines. Antibiotique: ajouté une fois à l'eau de boisson tous les trois jours pour une durée allant de 1 à 5 jours. Hébergement individuel: une fois pour 2 mois.

Impact sur les animaux

La contention cause un stress de courte durée. Prélèvement de sang et gavages causent un stress et des douleurs légères de courte durée. Certains antibiotiques peuvent causer des perturbations intestinales. L'isolement des animaux peut causer du stress.

Devenir

1872 souris seront mises à mort pour analyser la composition spatiale du microbiote intestinal.

Remplacement

Des modèles de microbiote in vitro ont été utilisés pour étudier les interactions au sein des communautés bactériennes. Cependant, certains aspects de ces interactions complexes impliquant des cellules immunitaires et non immunitaires ne peuvent être étudiés que chez l'animal.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe pour assurer la reproductibilité des expériences et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi et des points limites stricts, spécifiques au projet, seront appliqués.

Choix des espèces

Dans l'étude des interactions hôte / microbiote, la souris est un modèle de choix, notamment car cette espèce est la plus facile à manipuler génétiquement et à obtenir en conditions germ-free (animaux sans microbiote). L'ensemble du project utilisera des souris après sevrage et âgées de 4 à 20 semaines,chez lesquelles le système digestif est arrivé à maturité.

Tester une thérapie génique contre les formes neurologiques de la maladie de Gaucher : 488 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse de leurs organes. Les unes servent de donneuses et reçoivent cinq injections quotidiennes destinées à enrichir leur moelle en cellules souches sanguines. Les autres en reçoivent quinze, réparties en trois séries de cinq jours, plus une greffe sous anesthésie et jusqu'à trois prélèvements sanguins à l'œil. Le porteur décrit une fatigue et une perte de poids qui durent de quinze jours à trois semaines, et précise que les souris porteuses de la mutation "restent en bonne santé et ne présentent pas de troubles neurologiques graves", précisément ce que le projet vise à traiter.

Objectifs

La maladie de Gaucher est la plus fréquente des maladies dites "lysosomales". Elle touche environ une personne sur 50 000 dans le monde. Ces maladies se caractérisent par un problème dans le fonctionnement de cellules, qui n’arrivent plus à éliminer certaines substances. Ces substances s’accumulent alors et peuvent provoquer des dégâts, en particulier dans des organes comme le foie, la rate ou les os. Dans la maladie de Gaucher, ce dysfonctionnement est causé par la mutation du gène responsable de la fabrication d’une enzyme impliquée dans la dégradation des lipides. Quand cette enzyme ne fonctionne pas bien, les lipides s’accumulent dans certaines cellules. Il existe plusieurs formes de la maladie. La forme la plus courante, le type 1, touche surtout les organes internes et les os. D’autres formes, plus rares, comme les types 2 et 3, affectent aussi le cerveau. Le type 2 provoque des troubles neurologiques graves dès la naissance, et le type 3 entraîne des problèmes progressifs chez l’enfant ou l’adulte. Malheureusement, les traitements actuels ne parviennent pas à soigner ces troubles du cerveau. Ce projet vise à tester dans un modèle murin, un nouveau traitement pour les formes neurologiques de la maladie, en particulier la forme de type 3. L’idée est d’utiliser une approche de thérapie génique : on prélève des cellules souches du sang, on les modifie en laboratoire pour qu’elles produisent une version efficace de l’enzyme, puis on les réinjecte dans l’organisme. Les cellules corrigées pourront se rendre jusque dans le cerveau et y apporter l’enzyme manquante. Cela permettrait non seulement de traiter les symptômes dans les organes et les os, mais aussi d’agir sur les atteintes du cerveau.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de la thérapie génique à corriger les défauts neuronaux dans la maladie de Gaucher en restaurant l’activité enzymatique déficiente dans les cellules cérébrales. Cette approche thérapeutique pourra être ensuite appliqués à l’Humain.

Procédures

Animaux donneurs des cellules souches sanguines : - Injection en vigile (souris éveillée) une fois par jour (quelques secondes) durant 5 jours d’une molécule permettant d’enrichir la moelle en cellules souches sanguines. Animaux receveurs des greffes de cellules souches sanguines : - Injection (quelques secondes) en vigile une fois par jour pendant cinq jours d’une molécule permettant une bonne prise de greffe des cellules souches sanguines. - Greffe des cellules souches du sang : 1 injection qui ne dure que quelques secondes et qui est réalisée sous anesthésie et analgésie. - Injection (quelques secondes) en vigile une fois par jour pendant cinq jours d’une molécule permettant une bonne colonisation du système nerveux central par les cellules greffées. - 3 prélèvements sanguins maximum (quelques secondes)

Impact sur les animaux

Injections nécessaires à une bonne prise de greffe et une bonne colonisation du système nerveux central : ces injections provoquent une brève douleur ainsi qu’un stress dû à la manipulation des animaux. Par ailleurs, ils peuvent entrainer une perte de poids et provoquer une fatigue des animaux entre15 jours et 3 semaines après l’injection. Intervention pour enrichir la moelle en cellules souches sanguines: L’injection durant 4 jours provoque du stress et une douleur au moment de l’injection (quelques secondes). Injection des cellules souches sanguines : L’injection intra-veineuse de cellules souches du sang dure quelques secondes, et se fait sous anesthésie générale. Cependant, il y a un risque d’infection. Expression de l’enzyme : l’expression de l’enzyme devrait avoir un effet bénéfique. En revanche, on ne peut exclure qu’elle produise des effets secondaires non prévisibles. Prélèvement sanguin : Le prélèvement sanguin entraine un stress dû à la contention, une brève douleur à l’œil ainsi qu’un risque d’infection.

Devenir

Il est prévu d’euthanasier tous les animaux afin de pouvoir analyser différents organes et quantifier l’activité de l’enzyme étudiée et de ses substrats.

Remplacement

La prise de greffe au cours de la transplantation des cellules souches sanguines ainsi que la colonisation du cerveau par certaines cellules transplantées sont des phénomènes complexes. Il n’existe aucune méthode alternative in vitro permettant de mimer ces phénomènes et les processus physiologiques mis en jeu lors de l’’implantation, de la survie, de la différenciation et de la colonisation des cellules. La transplantation chez un modèle animal est la seule façon aujourd’hui d’évaluer la capacité des cellules souches sanguines modifiées à se loger dans la moelle osseuse, reconstituer le système sanguin à long terme, atteindre le cerveau des receveurs et exprimer la molécule thérapeutique.

Réduction

Afin de réduire au mieux le nombre d’animaux, nous évaluerons d’abord l’effet des vecteurs de thérapie génique exprimant l’enzyme étudiée dans des systèmes de culture in vitro. Seuls les vecteurs permettant la sécrétion par les cellules modifiées de cette enzyme capable d’être réabsorbée par des neurones et ne générant pas de toxicité cellulaire seront évalués in vivo. Afin que les résultats soient statistiquement significatifs tout en réduisant au mieux le nombre d’animaux utilisés pour répondre à la question scientifique posée, les logiciels ainsi que notre expérience dans le domaine de la greffe des cellules souches sanguines montre que le nombre d’animaux minimum requis est de 8 par groupe.

Raffinement

Pour limiter au maximum les nuisances sur les animaux, la greffe de cellules souches du sang sera réalisée sous anesthésie et analgésie. Suite aux injections nécessaires à une bonne prise de greffe et une bonne colonisation du système nerveux central et à la greffe cellulaire, les souris seront examinées quotidiennement et une grille de d’évaluation sera remplie. Des points limites adaptés ont été déterminés afin de mettre en place un traitement approprié ou d’envisager l’euthanasie si un des critères d’arrêt est atteint. Au bout d’un mois, les souris continueront d’être observées une fois par semaine en plus de la visite journalière des animaliers afin de continuer à remplir la grille d’évaluation et de pouvoir intervenir en cas d’effet inattendu.

Choix des espèces

Les souris ont un système sanguin très proche de celui de l’être humain. C’est pourquoi elles sont souvent utilisées pour tester des greffes de cellules souches sanguines et pour évaluer l’efficacité de nouvelles approches de thérapie génique. Dans ce projet, on utilise des souris porteuses d’une mutation qui imite la maladie de Gaucher. Elles ont un déficit de l’enzyme, comme les patients, mais elles restent en bonne santé et ne présentent pas de troubles neurologiques graves. Elles nous permettront d’évaluer si les vecteurs de thérapie génique permettent aux cellules modifiées de produire suffisamment d’enzyme, vérifier si elle est bien sécrétée, et voir si cela permet de diminuer les substances anormales qui s’accumulent dans le cerveau et les autres organes. Les expériences seront faites chez de jeunes souris adultes, afin d’être dans des conditions où la prise de greffe est optimale.

4 038 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules tumorales par voie sous-cutanée, intraveineuse, intracardiaque ou directement dans un organe après ouverture chirurgicale, puis sept à dix séances d'imagerie sous anesthésie, cinq à huit prélèvements sanguins après quatre à six heures de jeûne, et des pesées quotidiennes. Une partie est immunodéficiente, donc vulnérable aux infections, et le porteur prévoit une perte de poids pouvant dépasser 15 %. Les bénéfices annoncés pour les patients, une immunothérapie plus sûre et modulable, restent au conditionnel, quand le porteur écrit que la nature des prélèvements d'organes "ne permet pas la survie des animaux".

Objectifs

Les thérapies géniques et cellulaires représentent une avancée majeure dans le traitement de nombreuses maladies, notamment les cancers. Grâce à des technologies innovantes comme les cellules génétiquement modifiées, il devient possible de modifier certaines cellules pour qu’elles reconnaissent et éliminent des cellules malades dans l’organisme. Après des résultats prometteurs dans les cancers diffus, notamment certaines leucémies, ces approches sont désormais autorisées pour le traitement de cancers solides tels que le mélanome. Elles marquent ainsi une véritable révolution en immunothérapie. Malgré leur efficacité, ces thérapies ne sont pas sans risques. Leur action prolongée dans l’organisme et leur caractères difficilement réversible peuvent entrainer des effets secondaires graves. Le plus fréquent est une réaction immunitaire excessive, pouvant provoquer des troubles neurologiques voire dans de rares cas la formation de cancers secondaires liés aux cellules modifiées. Pour faire face à ces risques, des systèmes de sécurité sont actuellement en cours de développement. L’objectif est de pouvoir activer ou désactiver précisément ces traitements de façon ciblée dans le temps et dans le corps. Ces systèmes permettraient de mieux contrôler l’effet des thérapies géniques et cellulaires afin d’offrir des thérapies plus sûres aux patients.

Bénéfices attendus

L’immunothérapie représente une avancée majeure dans le traitement de nombreuses maladies graves, notamment certains cancers et maladies auto-immunes. Mais ce type de traitement n’est pas sans risque. En stimulant fortement les défenses du corps, il peut entrainer des réactions indésirables parfois sévères. Il devient donc essentiel de pouvoir en contrôler précisément l’intensité et la durée. Des stratégies récentes cherchent à rendre l’immunothérapie plus sûre et plus modulable. L’une d’entre elles repose sur la thérapie génique. Elle consiste à insérer un gène dans les cellules du patient à l’aide de transporteurs, appelés vecteurs souvent des virus modifiés. Ce gène agit comme un interrupteur, permettant ainsi d’activer ou de d’arrêter le traitement si des effets secondaires apparaissent. Ces systèmes offrent un véritable progrès en matière de sécurité. Avant d’être utilisés chez l’Humain, ces dispositifs doivent être testés sur des modèles biologiques complets comme la souris. Cela permet de vérifier à la fois leur efficacité et l’absence d’effets indésirables majeurs dans un organisme vivant. A terme, ce type d’approche pourrait améliorer la prise en charge de nombreux patients pour lesquels les traitements actuels restent insuffisants. C’est le cas de certains cancers très résistants, comme le cas du cancer du foie dont le taux de survie à 5 ans est d’environ 18 pour cent. En rendant ces traitements plus contrôlables, ces avancées ouvrent la voie à une immunothérapie plus personnalisée, mieux tolérée et potentiellement accessible à un plus grand nombre de patients.

Procédures

Dans ce projet de recherche, des souris sont utilisées pour évaluer l'efficacité, la distribution et la tolérance de traitements innovants dans l'organisme en conditions saines ou pathologiques. Les animaux suivent différentes étapes expérimentales. Certains reçoivent une seule injection d'un des deux produits thérapeutiques sur souris soit vigile soit anesthésiées d'une durée inférieure à 30 secondes. Pour créer des modèles tumoraux, plusieurs méthodes sont utilisées: une injection unique de cellules tumorales disséminées (sous anesthésie, 30 secondes), injection de cellules tumorales solides (1 fois, sous anesthésie, 45 secondes) ou injection directe dans un organe (1 chirurgie par souris, moins de 20 minutes, sous anesthésie générale avec une analgésie préventive et post opératoire pendant 3 jours). Les traitements expérimentaux comprennent l'injection de cellules thérapeutiques (1 fois, sous anesthésie, 30 secondes), de vecteurs viraux (1 fois, sur souris vigile, 30 secondes) et de médicaments complémentaires (1 fois par jour pendant 3 à 5 jours, sur animal vigile, 30 secondes). Le suivi de la tumeur repose sur des mesures manuelles (1 à 2 fois par semaines, 2 minutes sur animal vigile), de l'imagerie par bioluminescence (1 à 2 fois par semaine pendant 4 à 8 semaines, soit 7 à 10 fois par animal, anesthésie légère 10 minutes accompagné de l'injection d'un agent de contraste 30 secondes et de l'échographie (1 fois, 15 minutes, sous anesthésie). Les souris subissent aussi des prélèvements sanguins hebdomadaires (5 à 8 fois sur animal vigile à jeun 4 à 6heures, 30 secondes, une pesée quotidienne (contention 30 secondes) réalisée à la suite de l'implantation tumorale (de J0 à J4 soit 4 pesées) puis tous les 2 à 3 jours (soit 2 à 3 pesées par semaine) dont la fréquence est réaugmentée à un rythme quotidien si l'état général des animaux le justifie. Une observation clinique quotidienne est également maintenue tout au long du protocole. A la fin de l'étude, les animaux reçoivent une anesthésie avec une analgésie préventive (1 injection de 30 secondes, 30 minutes avant l'anesthésie) puis le prélèvement sanguin suivi de l'euthanasie est réalisé sous anesthésie en 10 minutes. Toutes les interventions sont réalisées par du personnel formé dans le respect de la réglementation avec une prise en compte du bien-être de l'animal à chaque étape.

Impact sur les animaux

(i)Nuisance physiologique. Une mise à jeun de 4 à 6 heures peut être appliquée dans le cadre des modèles développés dans ce projet et est susceptible de provoquer une sensation de faim légère. L’induction des vecteurs ainsi que la progression tumorale dans certains modèles peut entrainer une perte de poids réelle supérieure à 15%. (ii)Nuisance comportementale. Les phases de contention (pesée, injection, prélevement sanguin, mesure du volume tumoral) peuvent générer un stress ponctuel ainsi qu'une douleur légère et transitoire généralement inférieur de 30 secondes. L'anesthésie gazeuse utilisée dans certaines procédures peuvent accentuer l'anxiété et provoquer une perte transitoire de chaleur corporelle. (iii)Nuisance liée au statut immunodéficient. Les souris immunodéficientes présentent une vulnérabilité accrue aux infections. (iv)Nuisance liée au développement tumoral. Le développement tumoral peut conduire à l'apparition de lésions cutanées au point d'injection ainsi qu'à des altérations du bien-être notamment au niveau du toilettage, la mobilité ou l'alimentation. (v)Nuisance liée aux interventions chirurgicales. L'anesthésie gazeuse prolongée utilisée dans certaines procédures peut entrainer une perte transitoire de chaleur corporelle. La suture peut occasionner une réaction inflammatoire locale transitoire au niveau de la cicatrice.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures expérimentales sont euthanasiés en fin d’étude. Cette euthanasie est scientifiquement indispensable car elle permet la réalisation de prélèvements d’organes et de tissus nécessaires à l’atteinte des objectifs du projet. Plus précisément, les tumeurs sont prélevées pour des analyses histopathologiques. Le sang et la rate sont recueillis pour l’analyse phénotypique des cellules thérapeutiques administrées. Les organes sont prélevés dans leur totalité afin de permettre la validation du ciblage tissulaire spécifique des vecteurs de thérapie génique. La nature des prélèvements ne permet pas la survie des animaux. Ainsi aucun animal n’est conservé après les procédures, l’ensemble des animaux est euthanasié de manière programmée et encadrée conformément aux règles en vigueur.

Remplacement

Les thérapies géniques et cellulaires offrent des pistes très prometteuses pour soigner certaines maladies, mais elles doivent être rigoureusement contrôlées avant de pouvoir être utilisées chez l’humain. Il est notamment essentiel de vérifier si elles ciblent bien la zone souhaitée comme une tumeur ou un organe précis et de s’assurer qu’elles n’agissent pas par erreur sur d’autres parties du corps. Des premiers tests ont déjà été réalisés en laboratoire sur des cellules. Ces expérimentations ont permis d’évaluer l’expression du transgène, la viabilité cellulaire. Elles fournissent des données essentielles pour comprendre le fonctionnement initial du traitement. Cependant, ces vérifications ne peuvent pas se limiter aux expériences sur cellules. Les études réalisées chez l’animal sont indispensables pour observer la diffusion et l’action du traitement dans un organisme complet et ainsi recueillir les informations nécessaires pour juger de sa sécurité et de son efficacité avant toute application chez l’humain.

Réduction

Conformément au principe des 3R, ce projet repose sur plusieurs approches concrètes visant à réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse scientifique. Trois principaux leviers sont mobilisés pour optimiser la conception expérimentale et limiter l’impact sur les animaux. L’étude prend en compte les 2 sexes (mâles et femelles) afin d’inclure la variable sexe dans le plan expérimental, ce qui augmente la portée statistique et réduit les biais d’interprétation. Ne pas considérer cette variable peut conduire à des résultats non reproductibles ou non généralisables. Les différences de pharmacocinétique entre les mâles et les femelles peuvent également fausser des conclusions lorsqu’elles sont extrapolées d’un sexe à l’autre. Bien que cela soit contre intuitif, l’intégration des 2 sexes apporte une valeur scientifique renforcée aux données recueillies. Grâce à l’imagerie in vivo, chaque animal est utilisé de façon optimale afin d’obtenir un maximum d’informations. Les groupes expérimentaux sont conduits en parallèle, ce qui limite le recours aux groupes témoins. Chaque individu fait l’objet d’un protocole d’analyse complet permettant de rassembler un grand nombre de données tout en réduisant le nombre total d’animaux mobilisés. Ainsi 4038 animaux sont utilisés dans le cadre de ce projet.

Raffinement

Des mesures précises et rigoureuses seront mises en œuvre pour assurer le bien-être des animaux. (i) Les points limites sont définis suivant une observation de signes cliniques dictant un arbre décisionnel. Les signes cliniques sont ceux altérant l’apparence physique, le poids et le comportement qui dictent l’intervention à tenir allant du soin à l’euthanasie. (ii) La gestion de la douleur se fait par administration d’analgésiques en cas de souffrance détectée. (iii) Le suivi rigoureux et proactif des animaux se fait par une surveillance quotidienne des animaux par un personnel qualifié, formé aux procédures, qui prend en charge conformément aux protocoles établis et à la grille de suivi garantissant une réponse rapide et adaptée. (iv) Dans un environnement enrichi, l’hébergement (de 2 à 5 individus par cage) en groupes sociaux compatibles des animaux favorise les comportements exploratoires et réduit ainsi le stress avec une période d’acclimatation de 10 jours avant les procédures. (v) L'anesthésie gazeuse utilisée pour certaines procédures provoque une perte transitoire de chaleur corporelle compensée par l'installation de l'animal sur un plateau chauffant pendant l'intervention puis par un réveil en cage thermostatée. (vi) Les souris immunodéficientes sont maintenues dans des conditions strictes d'hébergement et de manipulation afin de limiter les risques d'exposition aux agents infectieux.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour étudier la formation tumorale grâce son taux élevé de prise de greffe et à sa petite taille qui facilite la manipulation. La disponibilité de diverses lignées immunodéficientes permet d’utiliser des greffes d'une autre espèce sans risque de rejet tandis que les lignées dépourvues de poils facilitent le suivi visuel de la croissance tumorale. De plus, le vaste éventail de modèles génétiquement modifiés et la connaissance approfondie du génome murin permettent d’étudier en détail les mécanismes moléculaires du cancer. Le cycle de vie court de la souris favorise la constitution de cohortes pour garantir une bonne puissance statistique, et l’existence de nombreux protocoles standardisés simplifie la comparaison des résultats entre études. Enfin le comportement bien documenté des souris permet d’identifier rapidement les signes de souffrance évaluable assurant ainsi une prise en charge efficace. Les souris utilisées seront des jeunes adultes sexuellement matures âgées de 8 à 12 semaines. Ce choix correspond à une période où les fonctions physiologiques, notamment immunitaires et métaboliques, sont pleinement développées, tout en restant stables et homogènes d’un individu à l’autre. A cet âge, les animaux présentent également un comportement plus stable, ce qui réduit la variabilité expérimentale et les réactions excessives liées au stress. L’utilisation de cette tranche d’âge permet donc à la fois de garantir la maturité biologique, de limiter les biais comportementaux liés à l’anxiété et de favoriser la robustesse des résultats.

Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids, cessent de se toiletter ou bougent à peine seront mises à mort. 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs poumons. Elles reçoivent des traitements par gavage, par injection dans la veine de la queue et par instillation de gouttes dans le nez sous anesthésie, ainsi qu'une molécule bactérienne qui déclenche une inflammation pulmonaire. Une partie appartient à la lignée Scnn1b, modifiée pour reproduire l'atteinte pulmonaire de la mucoviscidose. Le porteur écrit n'attendre "aucune douleur importante ou stress fort", et renvoie au long terme les retombées annoncées pour les patients.

Objectifs

La mucoviscidose est une maladie génétique caractérisée par une vulnérabilité à l’infection par les microbes de l’environnement qui induit une forte inflammation des poumons, dégradant progressivement cet organe et conduisant à l’insuffisance respiratoire. Une des raisons pouvant participer à la gravité de la réponse inflammatoire est une mauvaise production par ces patients de lipides aidant à résoudre l’inflammation, aussi appelés SPMs. A l’heure actuelle, nous ne comprenons pas encore pourquoi les patients produisent moins de SPMs. Nous étudierons la production de ces SPMs en mimant une infection du poumon. Nous évaluerons aussi si les SPMs peuvent être utilisés pour traiter l’inflammation. Le projet sera utilisé pour définir les protocoles permettant l’étude de ces SPMs dans le contexte d’une inflammation du poumon. Nous utiliserons ici des souris qui reproduisent des symptômes proches des patients vivant avec la mucoviscidose au niveau du poumon pour que notre modèle soit réaliste. Nous nous intéresserons aussi aux différences d’inflammation et de production des SPMs chez les souris mâles et femelles car il existe des différences de l’atteinte respiratoire entre patients et patientes encore inexpliquées. A terme ce projet servira aussi à étudier l’inflammation du poumon après avoir été exposé à la pollution de l’air.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme de ce projet sont : - le développement d’un modèle plus simple, moins contraignant et moins douloureux pour étudier l’inflammation des poumons chez la souris - l’identification de la meilleure façon d’utiliser les SPM pour traiter l’inflammation des poumons. - la compréhension du rôle du système immunitaire et des raisons pour lesquelles les souris atteintes d’une forme proche de la mucoviscidose ne produisent pas assez de SPM. - La description des différences entre animaux mâles et femelles l’inflammation du poumon - L’utilisation des connaissances collectées pour un projet de plus grande ampleur sur l’impact de la pollution de l’air sur la santé du poumon. A long terme, les résultats de cette étude pourront être utilisés pour développer de nouveau traitement de l’inflammation des poumons chez les patients vivant avec la mucoviscidose.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations de traitement en solution soit par gavage, soit par injection dans la veine de la queue soit par aspiration de gouttes par le nez. Conformément aux normes éthiques en vigueur, les deux premiers traitements seront administrés sur souris éveillées, pour le dernier, les souris seront anesthésiées. Ces administrations durent moins de 30 secondes pour le gavage et l'injection dans la veine de la queue et autour de 30 secondes (moins d'une minute) pour l'aspiration de gouttes par le nez.

Impact sur les animaux

Les SPM sont des molécules produites par notre corps de façon naturelle. Elles ne sont pas toxiques et, à ce jour, aucun effet secondaire n’a été observé chez les souris quand elles en ont reçues. Nous ne prévoyons donc pas d’effets indésirables suite à l’utilisation de SPM. De plus, certaines études montrent que les SPM pourraient avoir un effet anti-douleur. Pour provoquer l’inflammation des poumons, nous administrons une solution d’une molécule produite par les bactéries. Cette molécule ne peut pas causer d’infection du poumon mais elle agit comme un signal qui alerte les défenses du corps. Le résultat est une réaction inflammatoire dans le poumon. Cela peut entraîner une perte de poids chez la souris ainsi qu’un inconfort temporaire et une diminution de l’activité. Cependant, aucune douleur importante ou stress fort n’est attendu. Les animaux seront tout de même suivis quotidiennement pour s’assurer de l’absence d’effet néfaste inattendu. Ils seront pesés et observés chaque jour pour détecter tout signe de malaise. Si nécessaire, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans la cage des souris pour faciliter leur alimentation et leur hydratation. Si un animal se trouve dans un état grave imprévu, celui-ci sera mis à mort pour éviter toute souffrance.

Devenir

Les animaux utilisés ici seront mis à mort à la fin des protocoles pour un prélèvement des organes et une analyse de la réponse inflammatoire dans le poumon.

Remplacement

Nous étudions ici un modèle complexe qui repose sur l’interaction entre plusieurs types de cellules, entre différents organes, et le déplacement de cellules d’un organe à un autre. Nous voulons aussi regarder des différences entre mâles et femelles. Malheureusement, à l’heure actuelle seule l’expérimentation sur des animaux vivants permet l’étude de ces différents éléments.

Réduction

Afin d’utiliser le moins d’animaux possible, nous avons lu les études préexistantes et pris en compte leurs résultats pour construire notre projet. Un certain nombre d’expériences ont aussi été effectuées au préalable sur des modèles de cellules pour sélectionner un nombre réduit de SPM à tester dans notre projet sur la souris. Enfin, une étude statistique a été menée pour choisir le nombre minimal de souris à utiliser tout en étant sûr de pouvoir observer toute différence relevante entre nos groupes de souris.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans un environnement adapté où elles disposeront de nourriture et eau à volonté. Les éléments nécessaires pour former un nid et une maisonnette seront fourni dans la cage pour assurer le bien-être des souris. Autant que possible, les souris seront au contact d’une seule personne pour leur permettre de s’habituer à elle et de diminuer leur stress. Le personnel qui manipule les souris est formé pour assurer leur bien-être et leur éviter toute souffrance. Les animaux seront anesthésiés lorsqu'il devront recevoir des traitements par dépot de gouttes sur le nez. Au cours des expériences, les souris seront pesées et observées pour détecter tout mal-être le plus tôt possible et agir en conséquence. Ces observations sur le poids, le comportement et la mobilité des souris, permettront le calcul d'un score clinique spécifique au projet présenté en Annexe 1. Si ce score clinique est élevé les souris des mesure spécifiques au projet seront mises en oeuvre : - Si besoin (faible diminution de la mobilité, perte de poids supérieure à 10%, manque de toilettage) de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans la cage de la souris - Si un animal se trouve dans un état grave imprévu (perte de poids supérieure à 20%, forte diminution de la mobilité, absence de toilettage) , celui-ci sera mis à mort pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour plusieurs raisons : 1. Les souris se reproduisent rapidement, ce qui permet d’avoir assez d’animaux pour l’étude en peu de temps. 2. Le fonctionnement des poumons et du système immunitaire chez la souris est proche de celui de l’humain, ce qui rend les résultats plus utiles pour la recherche médicale. 3. Notre équipe est déjà formée et expérimentée dans le travail avec les souris de laboratoire. 4. C’est l’animal pour lequel on dispose du plus grand nombre d’outils scientifiques pour étudier les tissus, l’inflammation et les SPMs. 5. Cette lignée de souris génétiquement modifiées (appelée Scnn1b) est la seule à reproduire le phénotype pulmonaire des personnes atteintes de mucoviscidose. 6. L'utilisation d'animaux de 8 semaines dans ce projet permet de s'assurer que les défenses immunitaires de l'animal sont complètement développées.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur sang et leurs organes, chacune portant sur le dos une capsule où se nourrissent jusqu'à trente tiques. Elles reçoivent neuf gavages, puis trois à quatre prélèvements sanguins dont certains par ponction du sinus de l'œil, et passent cinq jours isolées en cage individuelle pour que leurs congénères ne mangent pas les tiques. Une partie d'entre elles est génétiquement modifiée pour ne pas produire le sucre alpha-Gal, molécule sur laquelle repose la piste vaccinale testée contre la maladie de Lyme. Le porteur explique qu'il faut cinq souris par groupe parce que la plupart des tiques se détachent ou meurent avant d'avoir fini leur repas, cinq à dix seulement arrivant gorgées par animal.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est de tester une stratégie visant à protéger contre la maladie de Lyme, causée par la bactérie Borrelia, transmise par les tiques. Cette approche consiste à administrer des bactéries non pathogènes (comme E. coli) modifiées pour exprimer une molécule appelée α-gal (un type de sucre). L'objectif est d'induire la production d'anticorps spécifiques contre α-gal, qui pourraient aider à prévenir l'infection par Borrelia. Les étapes spécifiques du projet sont les suivantes : Induction d'anticorps anti-α-gal : En administrant oralement ces bactéries aux animaux, nous espérons stimuler la production d'anticorps spécifiques (IgM et IgG) contre α-gal. Évaluation de la réponse immunitaire et de la protection contre l'infection : Nous mesurerons si la réponse immunitaire induite permet de réduire la charge de Borrelia dans les tiques parasitant les animaux immunisés. Analyse de la charge bactérienne de Borrelia : Après infestation par des tiques infectées, nous analyserons la présence de Borrelia dans les tiques et dans divers tissus des animaux immunisés. Étude de la mortalité et du comportement des tiques : Nous observerons le comportement alimentaire des tiques et leur taux de mortalité afin d'évaluer si l'immunisation a un impact sur leur cycle de vie. Ce projet vise à déterminer si cette méthode peut non seulement protéger contre l'infection, mais également avoir un effet sur les tiques elles-mêmes

Bénéfices attendus

Les tiques sont les principaux transmetteurs de pathogènes provoquant des maladies graves chez les humains et les animaux, comme la maladie de Lyme causée par Borrelia spp. et transmise par les tiques Ixodes. Borrelia burgdorferi est la principale espèce responsable de la maladie de Lyme en Amérique du Nord, transmise par Ixodes scapularis, tandis que Borrelia afzelii est plus courante en Europe, où elle est transmise par l'espèce homologue I. ricinus. Actuellement, il n'existe pas de vaccin efficace contre Borrelia spp., et la lutte contre les tiques repose principalement sur l'utilisation d'acaricides, qui contaminent l'environnement ainsi que les produits animaux destinés à la consommation humaine. De plus, l’utilisation d’acaricides peut entraîner la sélection de populations de tiques résistantes. Étant donné la gravité des maladies transmises par les tiques et l'absence de mesures préventives efficaces, hormis l'évitement des piqûres de tiques, ce projet vise à développer des stratégies de vaccination plus sûres et plus efficaces. En particulier, il cherche à développer des vaccins basés sur le sucre α-Gal, offrant une protection à la fois contre les tiques et contre la maladie de Lyme

Procédures

Les souris seront immunisées par voie orale. Elles recevront 9 administrations et subiront un maximum de 3 prélèvements sanguins. Aux jours 0, 14, 30 et 51, des prélèvements sanguins seront effectués par ponction du sinus, en alternant les côtés à chaque fois, sous anesthésie locale et générale. Une ponction dure 8 minutes, anesthésie comprise. L'administration des probiotiques se fera par gavage. Cette méthode sera appliquée pendant 3 jours consécutifs, avec une pause de 5 jours entre chaque session, sur une période de 3 semaines, soit un total de 3 cycles (une fois par semaine). Chaque gavage durera entre 3 et 5 minutes, anesthésie comprise. Les jours 0,14 et 30 après l’administration orale, un prélèvement sanguin sera effectué dans la veine auriculaire ; ce prélèvement durera environ 8 minutes, anesthésie comprise. Le prélèvement du jour 14 permettra de suivre la production normale des anticorps induits par l’immunisation. Le jour 51, après la dernière administration orale, un dernier prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie générale. Après la fixation des capsules, les souris seront hébergées en cages individuelles pendant une durée de 5 jours. Elles bénéficieront des mêmes conditions d’enrichissement que dans les cages collectives. Et afin d’atténuer les effets de l’isolement, des enrichissements supplémentaires seront ajoutés pour favoriser leur bien-être

Impact sur les animaux

Les tiques sont placées sur le dos des souris au sein d'une capsule. Les souris peuvent se sentir mal à l'aise lorsque la capsule est placée sur leur dos. Cependant, le placement des capsules sur le dos de l'animal a été optimisé pour minimiser l'inconfort chez l'animal et maximiser les résultats expérimentaux. les rongeurs sont un réservoir naturel de Borrelia spp, ce qui signifie qu'ils peuvent porter l'infection sans montrer de symptômes graves ou évidents, contribuant ainsi à la transmission de la bactérie par les tiques. D'autre part, l'immunisation peut causer une inflammation et une douleur au site d'injection, ou des réactions allergiques. Le prélèvement sanguin peut provoquer du stress lié à la manipulation ou de la douleur. Pour minimiser ces effets, les procédures sont effectuées sous anesthésie et un suivi constant est assuré afin de détecter tout symptôme indésirable.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupération du sang total et des organes.

Remplacement

Ce projet vise à étudier l’effet protecteur des anticorps anti-α-gal contre Borrelia, en nourrissant des tiques sur des souris immunisées oralement avec différentes souches non pathogènes d'E. coli exprimant α-gal sur leur membrane. Les objectifs incluent l’évaluation de la survie des tiques et de la transmission de Borrelia, par ces dernières. Actuellement, il n’existe pas de modèle in vitro capable de reproduire avec précision la réponse immunitaire induite par voie orale chez les souris en réponse à une infection bactérienne. Par conséquent, l’utilisation d’un modèle animal est essentiel pour analyser l’effet protecteur des anticorps et la colonisation des tiques par Borrelia.

Réduction

Chaque souris peut nourrir jusqu'à 30 tiques, mais entre 20 et 25 tiques se détachent sans avoir terminé leur repas ou meurent. En moyenne, nous pouvons obtenir 5 à 10 tiques gorgées par souris. Par conséquent, il est nécessaire d'utiliser 5 souris par groupe pour obtenir entre 25 et 50 tiques gorgées, ce qui est le nombre requis pour nos analyses. Le nombre total d'animaux a été calculé afin de minimiser leur utilisation tout en garantissant le nombre de tiques gorgées nécessaire à la réalisation des analyses.

Raffinement

Les souris seront logées par groupes de 5 dans des conditions standards, avec l'enrichissement nécessaire à leur bien-être, notamment des carrés de coton et des maisons en plastique. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter d’éventuels signes cliniques. Lorsque les souris porteront des capsules sur le dos pour nourrir les tiques, elles seront placées en cages individuelles, car elles pourraient retirer les capsules des autres souris ou manger les tiques. Malgré leur isolement, elles bénéficieront des mêmes conditions d'hébergement, avec les enrichissements nécessaires pour leur bien-être. Pour les souris hébergées en cages individuelles des mesures seront prises le temps de leur hébergement individuel afin de garder un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter l'apparition d'éventuels signes cliniques. Des points limites ont été défini pour décider de la mise à mort des animaux en cas d'atteinte sévère de leur état de santé. Par ailleurs afin de limiter la douleur et l'anxiété des souris des protocoles d'anesthésie sont prévus pour certains actes pouvant engendrer une anxiété ou une souffrance.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui ne produisent pas le sucre α-Gal ; elles peuvent toutefois produire des anticorps spécifiques contre celui-ci. Ces lignées sont importantes pour étudier comment le corps réagit à cette molécule. Nous utiliserons également des souris non modifiées génétiquement. Elles seront utilisées comme groupe contrôle pour comparer les résultats avec ceux des souris génétiquement modifiées et obtenir des résultats plus proches des animaux sauvages. Les souris auront entre 7 et 8 semaines d'âge. Ce stade de développement (7 à 8 semaines) correspond à une maturité immunologique optimale chez la souris, ce qui est essentiel pour évaluer efficacement la réponse immunitaire induite par l’immunisation avec l’α-Gal. Il s’agit également d’un âge standard dans les modèles d’infection par Borrelia, permettant la comparaison avec des études antérieures et garantissant la reproductibilité des résultats. Par ailleurs les souris âgées de 7 à 8 semaines sont des souris adultes ce qui facilite les actes de prélèvements sanguins car elles sont plus grosses.