Souris

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune passant deux fois seize heures en cage métabolique individuelle, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit cinq injections quotidiennes de diurétique en état vigile, d'autres subissent une chirurgie sous anesthésie pour la pose d'une minipompe délivrant une molécule en continu, les souris témoins étant elles aussi ouvertes puis suturées pour rester comparables. Le protocole associe un régime pauvre en sel et une eau enrichie en oxalate afin de provoquer une atteinte rénale par cristaux, l'objectif déclaré étant de comprendre une néphropathie mal connue chez les patients déshydratés. Les critères d'arrêt sont la prostration ou la perte de 10 % du poids initial. Sur les atteintes, le porteur affirme que les souris ne seront pas impactées par la déshydratation grâce à la brièveté du protocole, tout en indiquant que l'ajout d'une autre molécule pourrait induire une insuffisance rénale modérée.

Objectifs

Notre projet porte sur l’étude de l’absorption digestive de l’oxalate dans le côlon en situation de déshydratation. L’oxalate est une petite molécule éliminée dans l’urine, qui précipite avec le calcium urinaire, formant des cristaux d’oxalate de calcium dans les reins et pouvant entrainer une insuffisance rénale aigue liée à une néphropathie oxalique dite « cristalline ». L’hyperoxalurie peut être génétique (production accrue d’oxalate par le foie) ou dgestive (absorption accrue de l’oxalate dans le côlon. Cependant, certains patients développent des insuffisances rénales aigües avec précipitation d’oxalate de calcium dans des circonstances de déshydratation extracellulaire (dû à des vomissements et/ou diarrhées, diurétiques...) sans que l’on identifie de cause classique d’hyperoxalurie. Le transporteur « DRA » au niveau colique permet le transport du chlore et de l'oxalate. Notre but est de montrer, lors d'un état de déshydratation, une augmentation de stimulation de ce transporteur, induisant ainsi une augmentation de l’absorption digestive de l’oxalate et par conséquent une augmentation de l’oxalate urinaire. L’objectif est de comprendre la physiopathologie d’une néphropathie cristalline encore mal connue, probablement plus fréquente que supposé, et de mieux comprendre la physiopathologie de l’hyperoxalurie suite à une déplétion sodée importante. Cette étude permettra également de déterminer la mise en place des mesures préventives spécifiques lors des épisodes de déshydratation extracellulaire chez les patients atteints de syndrome de grêles court ou autres conditions à risque de néphropathie oxalique.

Bénéfices attendus

Ce projet aura un impact clinique important si nos hypothèses se confirment. La néphropathie oxalique est caractérisée par la précipitation de cristaux d’oxalate et de calcium dans les tubules rénaux. Cette néphropathie peut entraîner une insuffisance rénale terminale dans 50 pourcents des cas. Sa fréquence est non négligeable. Cette prévalence augmente drastiquement dans les groupes de patients à risque, notamment les situations de malabsorption, qui concernent jusqu'à 50 pourcents des diagnostics de néphropathie oxalique. Ce projet permettrait de confirmer la voie innovante d'un potentiel effet propre de la déplétion sodée sur l'augmentation de l'activité de transport digestif de l'oxalate, menant ainsi à une hyperoxalurie digestive, tout en se passant de la voie physiopathologique classique malabsorptive (sus-mentionnée). En effet, les patients atteints de diarrhée chronique avec malabsorption (comme dans les situations de syndrome de grêle court, de maladie de Crohn...) sont affectés par une hyperoxalurie massive qui conduit au développement d'une insuffisance rénale. Si cette oxalurie est liée en partie à l'effet de l'angiotensine 2, cela permettra de prendre en compte la part liée à la déshydratation dans l’apparition de cette néphropathie, et de prévenir davantage le déclin de la fonction rénale en adaptant les apports hydro-sodés chez ces patients.

Procédures

Une partie des souris seront sous régime alimentaire pauvre en sel ou enrichie en oxalate (eau de boisson) pendant 5 jours ou 14 jours. Toutes les souris seront exposées à 2 reprises à un recueil urinaire en cages métaboliques en état vigiles au cours de chacune des procédures (15 jours avant le traitement et jour 5 ou jour 14 après le premier traitement) sur une durée de 16h impliquant un hébergement individuel. Certaines souris auront également des injections quotidiennes d'un diurétique pendant toute la procédure (5j), soit 5 injections au total sur souris vigile (durée de l’acte moins de 5 secondes). D'autres souris seront également soumises à une procédure chirurgicale sous anesthésie permettant la mise en place d'une pompe osmotique délivrant en continu une molécule (la mise en place de la pompe dure environ 5 minutes). Enfin, à l’issue de la période de maintien, tous les animaux seront soumis à un unique prélèvement sanguin (durée de cet acte 1 minutes) sous anesthésie et analgésie qui sera suivi d’une euthanasie par une méthode réglementaire sans réveil de l’animal.

Impact sur les animaux

Les souris seront injectées en diurétique ou en diluant seul administré quotidiennement. L’exposition à une alimentation pauvre en sel ne devrait pas avoir d'impact majeur sur les animaux qui seront en déshydratation extracellulaire modérée. Les souris ne seront pas impactées par cette déshydratation modérée grâce à la durée courte du protocole. En revanche, l'ajout de petites doses d’une autre molécule associé à ce régime pourrait induire une insuffisance rénale modérée, qui ne devrait pas avoir de retentissement pour les animaux grâce à une surveillance adaptée (mesure du poids). Les changements de régimes pourraient induire un léger stress chez les souris qui sont néophobes (peur de la nouveauté). Les injections sont nécessaires pour la mise en place du modèle pourraient induire un stress lors de la contention et une douleur légère et de courte durée au site d’injection (piqure de l’aiguille). Dans l’un des modèles, des mini pompes seront installées sous anesthésie générale/analgésie pour délivrer des molécules en continu ce qui nécessite une petite incision et un point de suture. Comme pour toute chirurgie, il y a un risque de surinfection lié à la chirurgie (rare), elle peut induite des douleurs/irritations notamment au niveau de la suture, ou encore des complications liées à l'anesthésie (stress thermique, détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire). De même, les souris contrôles devront également être anesthésiées, ouvertes et suturées et recevront 2 injections d’une analgésie pour garantir le même traitement des souris et éviter un bais suite à la chirurgie et de l’injection. Le recueil d'urine en cage métabolique peut induire un stress social pour les animaux. Enfin, un prélèvement sanguin unique et terminal sera effectué en fin de période, sous anesthésie et analgésie sans autre contrainte que la piqure permettant l’anesthésie correspondant à un stress lié à la contention et une douleur légère et de courte durée au site d’injection (piqure de l’aiguille).

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux par une méthode réglementaire.

Remplacement

Nous souhaitons étudier le mécanisme du système rénine angiotensine suite à une déplétion sodée avec ou sans apport d'oxalate sur les transporteurs rénaux et du tube digestif. Pour cela, nous souhaitons mettre en évidence la physiopathologie de plusieurs organes (reins, colon, foie) lors d'une déplétion sodée et l'expression des transporteurs d'oxalate ainsi que la réponse du système rénine angiotensine suite à ce stimulus. L'implication de plusieurs organes avec une supplémentation en oxalate (alimentation) et d'un traitement ne nous permet pas de réaliser ces procédures sur des cellules ou des organoïdes. Pour cela, le recours aux animaux est indispensable. Les essais thérapeutiques sur le modèle d'insuffisance rénale ne peuvent être réalisés que sur un organisme entier.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux par expérience a été calculé à partir des données déjà connues dans ce modèle. La taille des effectifs a été établis grâce à un calcul de puissance pour prendre en compte les risques afin de réduire au maximum d’animaux utilisés. Le nombre de 10 animaux par groupe est issu notamment de l’expérience dans le modèle connu de l’équipe. Un calcul de puissance nous a permis de déterminer un nombre minimal de 8 souris par groupe, auquel nous préférons ajouter un pourcentage de sureté expérimentale et pour pallier aux potentiels variabilités interindividuelles, soit 10 souris par groupe. Pour des raisons de reproductibilité, nous réaliserons une deuxième série, soit 20 souris par groupe. De plus, nous utiliserons des tests afin de prendre en compte l’effectif des souris par groupe et pourvoir obtenir des résultats fiables et les interpréter. Nous utiliserons également d’autres tests pour la comparaison de plusieurs groupes. Le nombre d'animaux prévu est de 240 souris à ratio égale de mâles et femelles de 3 mois.

Raffinement

La prise hydrique est contrôlée lors du change de biberons et si nous observons un groupe plus ou moins déshydraté, le personnel pourra ajouter de la nourriture hydratée directement dans la cage. Le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), d’un dôme en cellulose et de morceaux de bois à ronger. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter tout signe de douleur. Si une agressivité est observée, les souris seront placées en hébergement individuel pour une durée de 5 heures. Lors du regroupement au décours des 5 heures, les cages seront enrichies avec des cocoons et de la sizale en plus. Les critères d’arrêt sont la prostration, ou la perte de 10 pour cent du poids initial (les animaux seront pesés tous les jours). Le recueil d'urine n'est pas invasif et les animaux seront habitués aux cages métaboliques. Les points limites seront surveillés tout au long de la procédure par du personnel qualifié (écarts de poids, apparence physique externe, changement de comportement, évolution des signe cliniques, degré d’activité). Une surveillance quotidienne est réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et repérer tout saignement et/ou risque d'infections. Les gestes invasifs seront réalisés sous anesthésie/analgésie, et un suivi post-opératoire sera réalisé. Il y a un risque de surinfection lié à la chirurgie, mais qui est relativement rare car tous les instruments chirurgicaux sont nettoyés et stérilisés avant chaque intervention. Des mini-pompes osmotiques seront installées, sous anesthésie générale, sous la peau des souris ce qui nécessite une petite incision et un point de suture. Un analgésique sera donné aux souris 30 min avant le début de la chirurgie puis 5-6h après. Si des signes de douleurs persistent et sont détectés 20 heures après la chirurgie, l’analgésie pourra être injectée une troisième fois. Concernant la chirurgie, si au-delà de 48 heures post chirurgie, les souris présentent toujours des signes de douleur ou agitation, nous considèrerons que ce point limite nuit au bien-être animal et la souris sera euthanasié.

Choix des espèces

Le protocole ne peut pas être réalisé sur des cellules ou organoïdes, mais afin de pouvoir étudier la physiologie de plusieurs organes dans son ensemble, cela doit être réalisé sur un organisme entier. Le modèle murin permet d’avoir des résultats fiables en limitant au minimum le nombre d’animaux nécessaires ainsi que l’impact du protocole sur le bien-être des animaux. Pour les procédures, nous utiliserons des souris de 3 mois, âge à partir duquel les souris seront assez robustes pour supporter 16 heures dans une cage métabolique (cage individuelle avec grille avec un accès illimité à la boisson) et obtenir une quantité suffisante d'urine. Nous achèterons des souris qui auront 11 semaines et auront 1 semaine d’acclimatation avant les protocoles. Les souris auront donc 12 semaines au moment du protocole.

624 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant passer 48 heures seule en cage à métabolisme, sur une grille métallique de surface réduite. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent quinze jours d'un médicament qui reproduit les symptômes du syndrome de Gitelman, jusqu'à quinze jours de gavages deux fois par jour avec un risque de fausse route, deux prélèvements sanguins sous anesthésie, ou une chirurgie sans réveil pour prélever leurs reins. Le porteur écrit qu'aucun animal ne sera maintenu en vie en fin de procédure, et qu'une souris dont l'état se dégrade en cage à métabolisme est ramenée en hébergement classique avant le franchissement des points limites, sa mise à mort pouvant ensuite être envisagée.

Objectifs

Le syndrome de Gitelman est une maladie génétique rare conduisant à une perte rénale de sel qui s’accompagne d’une déshydratation modérée, d’une perte rénale de potassium et de magnésium ce qui provoque une baisse de leur concentration plasmatique (hypokaliémie et hypomagnésémie). La prévalence de cette maladie est de 1 sur 40000. Ce syndrome est dû à des mutations inactivatrices d’un gène codant pour un co-transporteur sodium et chlorure. A noter, qu’il existe un inhibiteur pharmacologique (la famille des thiazides) utilisé dans le traitement de l’hypertension qui reproduit les effets de ces mutations. L’hypokaliémie chronique entraine souvent de la fatigue et des troubles du rythme cardiaque. Des protéines participent à la conservation du potassium et ce projet vise à étudier si deux d’entre elles pourraient être mises en jeu dans le syndrome de Gitelman pour limiter la perte de potassium et l’hypokaliémie.

Bénéfices attendus

La découverte récente d’un lien entre un facteur de croissance, un transporteur rénal de potassium et la capacité du rein à retenir le potassium, nous a amené à envisager que cette voie pourrait être mis en œuvre dans le contexte du syndrome de Gitelman. Notre projet, qui utilisera 624 souris mâles et femelle invalidées ou non pour les gènes codant soit pour facteur de croissance soit pour transporteur de potassium permettra d’évaluer le rôlr de cette voie dans ce contexte pathologique ce qui pourrait permettre d’envisager d’agir dessus pharmacologiquement au bénéfice des malades. Par ailleurs, la mesure de du facteur de croissance dans le plasma ou l’urine des patients, pourrait devenir un outil diagnostique pour évaluer l’état de déplétion potassique de la personne considérée.

Procédures

Certains animaux seront traités avec un agent pharmacologique pendant 15 jour afin de mimer les symptômes du syndrome de Gitelman selon différentes méthodes : par injection 1 fois par jour sur animal vigile (quelques secondes par animal), ou via l’alimentation ou l’eau de boisson en prise spontanée.. Une partie des animaux subira une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie, à des fins de recueils de tissus/organes. Pour une autre partie des animaux et afin de mesurer l’effet du traitement pharmacologique, deux recueils urinaires sur animal vigile seront réalisés ce qui nécessitera de les placer 48 heures en cage à métabolisme (24h d’habituation et 24h pour le recueil). Toujours pour évaluer l’effet du traitement, nous effectuerons, également, 2 prélèvements sanguins à 9 jours d’intervalle sur animal anesthésié (1 minute par animal). Afin de documenter la voie de signalisation impliquée dans les effets du traitement pharmacologique, une partie des animaux sera soumise à 6 ou 15 jours de gavages deux fois par jour (30 secondes par animal) avec l’inhibiteur d’une protéine et subira un prélèvement sanguin unique sous anesthésie (1 minute par animal) pour analyser si l’inhibition de cette protéine affecte l’effet du traitement. Toutes les souris sont euthanasiées en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des interventions prévues chez la souris sont connus car celles-ci ont été et sont utilisées en routine dans d’autres projets. Une partie des animaux subira un prélèvement de sang sous anesthésie et analgésie (risque d’arrêt cardio-respiratoire) pouvant entrainer une hémorragie (stress hémodynamique). Pour le prélèvement de leurs reins, certains animaux seront également sujet à une chirurgie sans réveil sous anesthésie et antalgie susceptible d’entrainer une insuffisance respiratoire (risque d’arrêt cardio-respiratoire). En fonction des groupes expérimentaux, certains animaux seront hébergés individuellement permettant ainsi de recueillir leur urine et leur fèces. Ce type d’hébergement génère des nuisances sur les animaux car ceux-ci sont hébergés individuellement (stress social) et se déplacent sur une grille métallique de surface réduite (inconfort). Des animaux subiront également un gavage qui pourrait conduire à une fausse route (étouffement).

Devenir

Aucun animal ne sera maintenu en vie en fin de procédure. A la fin de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir utiliser leurs organes à des fins d’études post-mortem.

Remplacement

Dans la mesure du possible, le remplacement des animaux par des méthodes alternatives (par exemple des cellules en culture) est préférable. Toutefois, seules des études sur des animaux nous permettront d’étudier les conséquences physiopathologiques sur l’équilibre de la balance potassique induit par un syndrome de Gitelman. En effet ces processus font intervenir des systèmes complexes qui travaillent de concert et qui agissent également les uns sur les autres. L’identification de l’implication possible de ces différents acteurs pourra ouvrir de nouvelles possibilités pour développer des stratégies thérapeutiques novatrices.

Réduction

Ce projet a une durée de 5 ans, et nécessitera l’utilisation de 624 souris. Ce nombre a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Nous l’avons calculé au plus faible à l’aide de tests statistiques et sur la base de notre expérience. Nous limiterons le nombre d’animaux en réalisant des expériences sur les mêmes animaux en limitant toutefois les expériences qui aboutiraient à des souffrances trop importantes et qui pourraient impacter négativement certains résultats. Par ailleurs, le nombre d’animaux utilisé est susceptible d’évoluer à la baisse si nous constatons qu’il n’existe pas de dimorphisme sexuel, ce qui permettra de mélanger les résultats des souris mâles et femelles ou si nous constatons que certaines de nos hypothèses concernant l’implication de nos protéines d’intérêt ne sont pas validées.

Raffinement

Durant leur hébergement en stabulation, les animaux auront un accès libre à la nourriture et à de l’eau filtrée, et seront placés dans des cages ventilées. L’environnement des animaux sera enrichi avec du nid végétal, des cylindres en carton, des bouts de bois et des maisons en plastique. L'hébergement en cages à métabolisme sera lui aussi réalisé dans l'établissement utilisateur. Afin de limiter les désagréments liés à la grille, nous plaçons une coupelle en verre de 6 cm de diamètre sur cette grille ce qui permet à la souris de dormir ou de se réfugier en n’étant plus en contact permanent avec la grille, ce dispositif n’altérant pas le recueil d’urine. Par ailleurs, la détermination quotidienne du poids, de l’apparence physique et du comportement des animaux durant leur hébergement en cages à métabolisme nous permettra de définir les points limites et de replacer l’animal en stabulation classique avant que son état ne se détériore si ces points devaient être franchis. Le suivi de ces points limite continuera afin de vérifier s’ils reviennent à la normal. Le cas échéant, l’euthanasie de l’animal pourra être envisagé. Pour le prélèvement de leurs reins, les animaux subiront une anesthésie sans réveil. L’ensemble des expériences sera mené dans des locaux d’hébergement respectant les standards en vigueur, par des personnels hautement qualifiés et formés à l’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale de mammifère en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas suffisantes en ce qui concerne l'étude des fonctions rénales qui ont des effets systémiques. Nous avons choisi de mener nos expériences chez la souris, car les modèles d’invalidation des gènes susceptibles de nous intéresser ont été générés chez la souris. De plus, ces expériences ont pour objectif d'être associés à des expériences déjà réalisées dans le laboratoire sur ces mêmes lignées de souris. Nous utilisons des souris mâles et femelles, jeunes adultes matures sexuellement (âgées de 8 à 15 semaines), afin d’étudier le syndrome de Gitelman car c’est souvent dans cette période de la vie que les symptômes de cette maladie se manifestent chez l’Homme.

Les souris de ce projet portent la mutation d'une maladie osseuse pédiatrique rare qui remplace l'os des mâchoires par un tissu fibreux, et leur phénotype osseux s'installe entre six et dix semaines de vie. 72 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à six injections intrapéritonéales sous anesthésie, quatre examens d'imagerie à quinze jours d'intervalle et deux heures seules en cage métabolique pour le recueil d'urine. Toutes sont tuées par ponction cardiaque afin de prélever les tissus et de comparer l'évolution de l'os à celle des flores buccale et intestinale, une piste que le porteur présente comme suggérée par la littérature sans y avoir été confirmée.

Objectifs

Nous nous intéressons à une maladie osseuse pédiatrique rare caractérisée par le remplacement de l’os des mâchoires par un tissu mou fibreux appelé granulome. Cette pathologie se met en place vers 3 à 5 ans et est d’origine génétique. Les lésions spécifiques de cette maladie sont toujours symétriques et bilatérales et peuvent ne concerner que des zones restreintes de la mandibule ou au contraire toutes les mâchoires jusqu’au plancher de l’orbite. Le principal traitement proposé aux patients pour le moment consiste principalement en chirurgies itératives et quelques rares molécules pour les formes très sévères. Ce qui définit la localisation anatomique et la période d’apparition de cette pathologie ne sont pas connues. Avoir accès et comprendre l’apparition du granulome permettrait de proposer des traitements plus précoces et efficaces aux patients. L’objectif de ce projet est donc de définir le rôle du microbiote oral et microbiote intestinal dans le développement du phénotype osseux. Nos travaux précédents ont confirmé la progressivité du phénotype osseux entre 6 et 10 semaines. Nous souhaitons désormais étudier la qualité et le potentiel changement dans la composition de la flore buccale et intestinale. L’implication de cette flore orale dans le développement de la perte ossuese liée au chérubisme a été suggérée sans confirmation par la littérature. Nous allons donc suivre en parallèle le phénotype osseux et deles microbiotes oral et intestinal dans un modèle murin de la maladie pour mettre en évidence une éventuelle dysbiose susceptible de participer au développement de la perte osseuse. La cinétique d’évolution des 2 types de flores en parallèle du phénotype osseux n’a jamais été réalisée et pourrait démontrer l’importance de la flore buccale et intestinale dans le phénotype osseux et offrir de nouvelles possibilités de traitement de la maladie.

Bénéfices attendus

L’origine et la localisation très particulière du chérubisme ne sont pas clairement expliquées. L’implication du microbiote oral dans le développement des granulomes pathognomoniques du chérubisme a été suggérée. Nous souhaitons vérifier cette hypothèse. Cette implication pourra permettre de proposer de nouvelles stratégies de traitement (une fois des cibles thérapeutiques identifiées) pour le chérubisme dont les patients atteints manquent cruellement.

Procédures

examen d’imagerie non invasif sur animal anesthésié (5 min), tous les 15 jours au maximum 4 fois, recueil passif d’urine en cage métabolique, 1 fois, maximum 2h, injections en intrapéritonéal de fluorochrome, 2 fois, durée max d’une min.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis au maximum 6 injections intrapéritonéales (anesthésies et injections de fluorochromes), 2h de cage métabolique et une ponction cardiaque terminale. La répétition des manipulations entraine une sévérité modérée. Aucun autre dommage que d’être manipulé pour pratiquer les injections, lesquelles peuvent éventuellement provoquer une gêne très passagère qui ne nécessite pas de médication particulière. L’isolement en cage métabolique peut également engendrer un stress.

Devenir

L'étude nécessite la mise à mort de tous les animaux pour les prélèvements nécessaires aux analyses prévues.

Remplacement

Les mutations du gène identifé comme responsable de la maladie n'expliquent pas toutes les caractéristiques de la maladie. L’implication du microbiote oral a été proposée. Nous voulons aussi évaluer l’impact du microbiote intestinal dans le développement de la maladie. L’effet d’une perturbation de la flore intestinale ou orale sur le squelette ne peut pas être modélisée in vitro et nécessite un organisme entier avec son microbiote oral.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (72) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires à l’analyse de l'impact des flores orale et intestinale sur le développement du phénotype osseux.

Raffinement

Les mesures de densité minérale osseuse, seront effectuées tous les 15 jours sous anesthésie avec analgésie ). Le temps de radiographie sera d’environ 5 minutes par animal et il sera surveillé jusqu’à son réveil. Le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs assureront une surveillance quotidienne. Nous ne prévoyons pas de complications pour les animaux aux différents temps de la procédure. Cependant, dans l’éventualité d’apparitions de points limites mentionnés plus loin, une surveillance plus fréquente et un apport de nourriture gélifiée et appétente seront mis en place.

Choix des espèces

Les mutations du gène identifé comme responsable de la maladie n'expliquent pas toutes les caractéristiques de la maladie. L’implication du microbiote oral a été proposée. Nous voulons aussi évaluer l’impact du microbiote intestinal dans le développement de la maladie. L’effet d’une perturbation de la flore intestinale ou orale sur le squelette ne peut pas être modélisée in vitro et nécessite un organisme entier avec son microbiote oral. A 10 semaines le granulome est mis en place (comme décrit précédemment). Nous voulons analyser le phénotype osseux en parallèle de l’évolution du microbiote oral et du microbiote intestinal entre 6 et 10 semaines, les âges où le phénotype osseux est le plus prononcé.

Tuées à la fin du protocole pour des analyses post-mortem, ou réutilisées dans un autre projet pour 65 d'entre elles, 390 souris sont soumises à un régime gras dès l'âge de quatre semaines. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent 28 jours d'injections quotidiennes dans l'abdomen, des gavages, sept prélèvements de sang en deux heures par une incision de la queue, et trois minutes de contention dans un tube d'imagerie. Le porteur indique que le régime gras prolongé peut altérer leur mobilité et créer un état dépressif et de l'anxiété, et prévoit que les souris écartées du protocole après le régime soient utilisées pour l'enseignement ou des mises au point techniques.

Objectifs

Afin d’améliorer la quantité trop importante de sucre dans le sang, chez le diabétique de type 2, plusieurs approches médicamenteuses sont possibles. Parmi elles, il existe une famille de molécules proches d’hormones naturellement produites par l’intestin. A l’heure actuelle, les médicaments de cette famille sont nombreux sur le marché, mais ne cible généralement qu’un seul site d’action. La molécule de cette étude est la première capable de cibler deux sites à la fois, lui conférant ainsi un potentiel thérapeutique plus important que les médicaments actuellement le marché. L’avantage d’avoir deux cibles réside dans le fait que des mécanismes d’action différents et complémentaires pourraient exister et donc permettre une efficacité supérieure. L’étude de l’action de ce type de médicament a mis en lumière le fait qu’en plus d’améliorer le diabète, elles étaient capables d’améliorer le métabolisme des graisses, souvent perturbé chez le diabétique. En effet, l’accumulation de graisses dans le foie, est un phénomène courant chez le diabétique et a des effets délétères sur l’organe mais aussi sur le diabète en général. Le but de ce projet est d’identifier comment la molécule étudiée dans ce projet ciblant deux sites améliore le métabolisme à la fois du sucre et des graisses chez un modèle de souris obèse/diabétique et en particulier d’identifier quels sont les mécanismes d’action permettant ces améliorations au niveau du foie en essayant de discriminer l’implication de l’un ou l’autre site d’action. Pour permettre la mesure des paramètres pertinents pour cette étude, ce projet se déroulera sur 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

La prise en charge et le traitement du diabète de type 2 et de ses complications est un enjeu de santé publique de plus en plus prégnant. Les stratégies médicamenteuses bien que multiples voient leurs limites dans le fait qu’elles ne ciblent généralement qu’un site d’action et donc qu’un point précis du métabolisme, limitant ainsi les effets. Les études préliminaires sur les effets de la molécule de cette étude semblent montrer une efficacité accrue en raison de sa capacité à cibler simultanément les deux sites d’action. L’intérêt d’un tel ciblage est que l’activation des deux sites entraîne des effets différents et complémentaires. Là où deux molécules étaient nécessaires, avec la molécule de notre étude une seule serait suffisante. De plus, d’un point de vue « pratique », les études montrent qu’une prise hebdomadaire chez l’Homme est suffisante pour permettre d’avoir les effets escomptés. Néanmoins, certains effets bénéfiques en relation avec le métabolisme lipidique et notamment avec un site d’action particulier restent à déterminer En résumé, le développement et la compréhension du mécanisme de la molécule de cette étude devrait permettre de contrôler plus efficacement le diabète de type 2 et d’apporter un confort au patient par l’administration d’une prise hebdomadaire unique de la molécule.

Procédures

Pour les tests nécessitant un gavage, les animaux vigils recevront un bolus unique par gavage. Cette manipulation prendra une dizaine de secondes. Pour chaque test nécessitant des mesures sur le sang, un prélèvement de sang se fera sur animaux vigiles et consistera : - en un prélèvement unique de 100 µl sur 2 minutes à J-4. - ou de 7 prélèvements de 30 secondes sur 2h à J+25 ou J+27 selon le test utilisée Pendant les 28 jours de traitements, les drogues seront administrées par injection dans la partie abdominale sur les animaux vigils, qui auront été habitués à leur manipulateur. Cette intervention prend moins de 10 secondes par animal. En ce qui concerne l’imagerie, les souris, vigiles, seront insérés dans un tube permettant la contention et la mesure indolore durera 3 minutes. Toutes les interventions citées ici exceptée la dernière se tiendront dans l’EU1, La technique d’imagerie se tiendra dans l’EU2.

Impact sur les animaux

En plus d’une perturbation du métabolisme, un régime gras de longue durée peut entrainer une prise de poids importante et altérer la capacité des animaux à se Le régime gras peut également altérer la santé mentale des animaux et créer un état dépressif et de l’anxiété. Les gavages nécessitent la contention de la souris, celui-ci peut provoquer un stress. De plus le gavage peut provoquer une fausse route. Les prélèvements de sang au cours des différents test de tolérance (glucose, insuline et lipides) nécessitent une petite incision à la queue qui peut provoquer une douleur légère et passagère. L’imagerie se fera par insertion de la souris dans un tunnel sombre qui permet la mesure. Cet environnement étroit et nouveau, peut entraîner un stress durant la mesure.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux. Les animaux qui ne seront pas entrés dans le protocole de traitement, suite au régime serviront pour l’enseignement ou des mises au point techniques.

Remplacement

L’obésité et le diabète de type 2 sont des maladies multifactorielles entraînant une élévation incontrôlée du sucre dans le sang, ce qui a des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier les conséquences de cette pathologie, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. Par ailleurs l’utilisation de modèles cellulaires in vitro, issus des animaux obèses diabétiques nous permettra de mieux comprendre l’impact direct des traitements sur les différents organes et évitera l’utilisation d’un certain nombre d’animaux supplémentaires pour les études in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé sur la base de projets similaires précédemment réalisés. Grâce à notre expérience du travail sur les molécules antidiabétiques, nous avons pu au cours des projets réduire le nombre d’animaux par groupe en optimisant les temps et doses de traitement. En effet, il ne nous est plus nécessaire de tester beaucoup de doses, ni de multiplier les temps de traitements pour ce type de molécule. De plus, l’utilisation des animaux a été réfléchie afin qu’un maximum de données soient obtenues avec un minimum de douleurs et de stress pour les animaux. Ainsi des tests in vivo et des prélèvements d’organes seront réalisés chez les mêmes animaux. Pour ces raisons, avec une seule dose et un seul temps de traitement, nous avons réduit le nombre d’animaux pour mener à bien ce projet et obtenir un puissance statistique suffisante. En ce qui concerne le travail in vitro nous avons essayé d’optimiser le nombre pour permettre de travailler sur l’ensemble des tissus d’intérêts aux différentes doses et temps escomptés. Grâce à notre expérience de ce type de traitement et au nombre important d’animaux issu de la partie préliminaire (suite au régime et avant la division en groupe pour le traitement), nous pourrons limiter les tests à une partie seulement des souris : petit nombre d’animaux pour avoir des résultats significatifs. Notre expérience dans ces techniques in vitro nous permet de rationaliser ce nombre pour ne pas multiplier les conditions expérimentales.

Raffinement

Par expérience, nous appliquerons des conditions optimales à l’obtention du modèle en permettant de maintenir le bien-être nécessaire. Afin d’éviter le stress de l’isolement, les animaux seront plusieurs par cage (5 à 10). De plus, les animaux auront à disposition dans les cages des objets permettant l’enrichissement nécessaire : des tunnels en plastique permettront de diminuer le stress et de réduire l’ennui en stimulant l’activité et permettant un sentiment de sécurité. De plus de la « frisette »de carton, permettra aux animaux de créer un nid et de s’y réfugier, renforçant le bien-être et ce sentiment de sécurité. Les animaux auront libre accès à un biberon d’eau et des objets d’enrichissement de milieu seront placés dans les cages. Une partie de la nourriture pourra directement être placée dans la cage pour permettre aux souris obèses ayant des problèmes de mobilité d’avoir accès à la nourriture plus facilement. Les tunnels d’enrichissement seront aussi placés à proximité de la nourriture et l’eau pour permettre aux souris de monter sur ces objets et de leur donner un accès plus facile. Pour ce qui est de l’anesthésie, nous utiliserons un anesthésique chimique lors des procédures 2, 3 et 4 qui se tiendront dans l’EU 1 et un gaz anesthésiant lors de la procédure 1 qui se tiendra dans l’EU 2. Pour le transport des animaux entre les deux EU (fin de procédure 1), les souris seront mises dans une cage contenant du coton avec un couvercle filtrant et transportées dans l’EU2 qui se trouve en face du lieu où les souris sont hébergées (EU1). Le temps de trajet estimé est de moins de 5 minutes. Au cours de ce transport, les cages seront mises dans un sac noir afin de préserver les souris de l’environnement extérieur en termes de température et de stress. Nous veillerons aussi au points limites du projet engendré par le diabète de type 2 qui consiste principalement en une déshydratation, en veillant à réhydrater ces derniers en cas de besoin. Enfin, en ce qui concerne les traitements et prélèvements, le personnel maitrise très bien les gestes techniques nécessaires au bon déroulement du prélèvement de sang servant à la mesure de la glycémie ainsi que la mise en œuvre des injections intrapéritonéales. Tous les animaux de l’étude seront suivis par un personnel compétent selon les modalités mise en place par la structure chargée du Bien-être Animal du Centre de zootechnie.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’Homme. C’est pourquoi, le choix des modèles est important. Ainsi, il apparait logique de choisir un modèle de vertébré dont la physiologie est le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris. Leur métabolisme au sens large présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Les animaux utilisés seront des jeunes males de 4 semaines. L’utilisation d’animaux jeunes se justifient par le fait qu’à cet âge, l’efficacité du régime est optimale car ils sont en pleine croissance. Ceci permet donc de limiter le temps de régime et donc le stress et les nuisances engendrées. Par conséquent, les traitements qui auront lieu par la suite seront réalisés sur ces mêmes souris devenus adultes (20 semaines)

Des cellules tumorales sont injectées directement dans le rein gauche de chaque souris après incision du dos, puis la tumeur est suivie deux fois par semaine par imagerie sous anesthésie pendant un mois. 288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever reins et poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie cette chirurgie de "mineure et quasi non-invasive", et décrit par ailleurs une incision douloureuse et inflammatoire, une perte de poids liée à la croissance de la tumeur et des difficultés respiratoires en cas de métastases pulmonaires. Cette dérive métastatique vers les poumons fait partie de ce qu'il attend du modèle.

Objectifs

Le carcinome rénal à cellules claires (ccRCC) représente 80 pourcents des cas de cancer du rein. Malgré les avancées des dernières années en matière d’analyse transcriptomiques, la compréhension des mécanismes mis en jeu reste nécessaire pour raffiner les approches thérapeutiques mises en place. La récente découverte de l’expression intrinsèque augmentées des proteines du complément chez les cellules tumorales suggèrent des fonctions non-canoniques essentielles à la formation et l’agressivité des cellules tumorales rénales, et corrèlent notamment avec un pronostique défavorable chez les patients. Cependant, les mécanismes connectant les protéines du complément à la physiologie des cellules tumorales restent encore incompris. L’objectif de ce projet est de comprendre l’implication des proteines du complément intracellulaire exprimées par les cellules tumorales. Pour répondre à cet objectif, nous proposons de créer un modèle murin d’injection de cellules tumorales rénales contrôles ou invalidées pour des gènes du complément candidats, implantées directement au niveau du rein gauche de la souris. Cette méthode nécessitant une chirurgie cutanée mineure et quasi non-invasive à l’avantage de recréer l’environnement primaire des tumeurs, et dans lequel nous pouvons observer une progression tumorale similaire à celle observée chez l’homme. Ainsi, la mise en place de ce modèle orthotopique est pertinent pour l’analyse et l’étude de la fonction des proteines du complément intrinsèque aux tumeurs. De plus, il permettra d’étudier la tumeur dans son ensemble, à savoir la mise en place et les interactions existantes entre les cellules tumorales et le microenvironnement tumoral. Ce projet permettra la compréhension des mécanismes qui sont mis en jeu et sera utile pour l’étude de nouvelles thérapies.

Bénéfices attendus

La prévalence du cancer du rein atteint 3 pourcents parmi tous les types de cancer, avec la plus forte incidence observée dans les pays occidentaux. Parmi eux, le carcinome rénal à cellules claires (ccRCC) représente plus de 80 pourcents des cancers du rein. Malgré les récentes avancées dans la compréhension du système du complément, ses fonctions au niveau intracellulaire restent encore méconnues. De part son impact observé sur la progression tumorale des patients atteints de ccRCC, et de part la disponibilité modèle tumorale murin reproduisant la progression observée chez l’homme, les benefices attendus sont d’avoir une meilleure compréhension de l’impact des gènes du complément sur la progression tumorale. Les tumeurs récuperées serviront de matériel de départ pour différentes analyses qui permettront de déterminer les mécanismes cellullaires impliqués mis en jeu. Notamment, certaines données préliminaires suggèrent que le complément intracelllulaire agit différemment dans les cellules cancéreuses comparé aux cellules saines. Avec l’essor de récentes thérapeutiques ciblant l’action des protéines du complément, nous pourrons à terme tester des inhibiteurs validés chez l’homme dans d’autres pathologies, pour une redirection thérapeutique.

Procédures

Les souris seront soumises à une unique intervention chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie. Cette intervention est nécessaire afin d’injecter les cellules tumorales dans le rein gauche (moins de 10 minutes). Apres injection, la progression tumorale sera mesurée 2 fois par semaine par imagerie non invasive via la bioluminescence effectuée sous anesthésie générale (environ 5 minutes pendant 1 mois maximum). Le suivi de la progression tumorale jusqu’à la fin de l’experience durera 1 mois maximum.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales directement délivrées au niveau du rein requiert une chirurgie cutanée faiblement invasive nécessitant le recours à un traitment anesthésique et analgésique. L’incision réalisée au niveau du dos pourrait être source de douleur et d’inflammation. Les souris peuvent avoir faim ou soif après la chirurgie et lors d’une croissance rapide de la tumeur instillée en raison d’une réduction de la mobilité conduisant à une perte de poids. L’animal pourra présenter des signes de douleurs, de difficulté respiratoire en cas de métastases pulmonaires. Le suivi des animaux par imagerie impliquera des anesthésies fréquentes de courte durée pouvant générer un stress des animaux en raison des manipulations et un stress thermique du fait de l’anesthésie. L’ensemble de la procédure peut conduire à une perte de poids au cours du protocole, qui sera contrôlé par une pesée quotidienne des souris.

Devenir

Les souris sont euthanasiées par une méthode réglementaire afin de prélever les reins et le poumon dans le but d’analyser par des techniques de laboratoire les cellules tumorales et le profil des cellules immunitaires infiltrants la tumeur.

Remplacement

Nos expériences préliminaires de co-cultures in vitro suggèrent que l’abaltion des génes du complément intracellulaire chez la tumeur influence également la réponse immunitaire, améliorant la réponse anti tumorale. Cependant, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu (l’ensemble des cellules immunitaires, la vascularisation…). En effet, les cellules en culture ne permettent pas d'appréhender le processus de progression tumorale et les cellules immunitaires infiltrant la tumeur dans sa globalité. Les tumeurs seront ensuite collectées et analysées pour comprendre le comportement des cellules tumorales in vivo ainsi que les cellules du système immunitaire infiltrantes. Des experiences supplémentaires in vitro seront utilisées pour corroborer les observations faites in vivo.

Réduction

Les expériences seront regroupées pour limiter le nombre des animaux des groupes contrôles. Nous avons établi 16 souris par groupe. Nous utiliserons des techniques d'imagerie non invasive pour mesurer le volume tumoral et pour l’apparition des métastases aux cours du temps. Le nombre d’animaux impliqué dans l’étude est de 288. Nous utiliserons un test statistique permettant de comparer les moyennes des souris instillées par rapport aux contrôles.

Raffinement

Le raffinement implique l’optimisation de l’expérimentation afin de réduire et ou supprimer la détresse et la douleur des animaux. Afin de supprimer le stress des souris liés à un changement d’hébergement, nous respecterons le délai réglementaire de 8 jours minimum entre l’arrivée des animaux et la première manipulation de ces derniers dans le cadre de l’expérimentation. De plus, les souris seront hébergées dans des cages avec un milieu enrichi et limitées à 5 pour s’assurer d’un espace vital suffisant pour diminuer le stress. Au démarrage de la procédure, les dispositions nécessaires seront prises pour supprimer la douleur pendant l’instillation de la tumeur et soulager l’animal en phase de récupération. Ainsi, les souris seront sous anesthésie complète, combiné à un analgésique lors de l’acte chirurgical. La potentielle hypothermie induite par un endormissement prolongé sera prévenue par le maintien de la température de la souris à 37 degrés Celcius à l’aide d’un tapis chauffant. La micro-incision réalisée pendant l’opération nécessitera l’application de colle tissulaire pour permettre une cicatrisation complète. Au réveil, de la nourriture liquide sera placé au sol de la cage pour faciliter leur alimentation et leur ré-hydratation post-opératoire. Le temps estimé de l’opération est de moins de 10 minutes. La surveillance s’effectuera par le manipulateur à chaque mesure de suivi par imagerie non invasive des cellules tumorals par bioluminescence, 2 fois par semaine, en complément des surveillances quotidiennes opérées par le personnel de l’animalerie. Lors des mesures de la progression tumorale par imagerie, les souris seront endormies par anesthésie gazeuse permettant un réveil rapide dès l’arrêt de la procédure. Afin de prévenir la baisse de température corporelle due à un endormissement prolongé pendant les acquisitions d’images, les souris seront placées sur un tapis chauffant à 37 degrés Celcius. Le temps de cette procédure est estimé à 5 minutes

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour conduire nos expériences dans un systeme in vivo complexe et s’intègre dans un contexte scientifique où toutes les études similaires sont menées chez cet animal. Le modèle utilisé ici, récemment décrit dans la litterature, combine une approche rapide et peu invasive tout en récapitulant au mieux le tableau clinique observé chez l’homme avec l’implantation d’une tumeur primaire rénale et l’observation d’une dérive métastatique pulmonaire. Nous utilisons des souris couramment utilisées pour les expériences de bioluminescence. Les animaux commerciaux sont utilisés à l'âge de 7 à 9 semaines. Ce stade de développement a été choisi car les souris sont sevrées, ont atteint leur taille adulte et ont un système immunitaire mature.

1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever foie et rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un vecteur viral porteur du génome de l'hépatite B leur est injecté dans une veine, puis, selon les groupes, elles reçoivent deux fois par semaine pendant quatre semaines un produit provoquant une fibrose du foie, une injection unique déclenchant un cancer du foie, ou des anticorps détruisant une partie de leurs cellules immunitaires. Certaines subissent ces injections dès quinze jours de vie. Le porteur écrit que ces atteintes hépatiques entraînent des nuisances "inexistantes ou minimes", et affirme que le modèle murin est "indispensable" puisque aucun modèle in vitro, même un organoïde multicellulaire, ne reproduit les échanges entre le foie et le système immunitaire.

Objectifs

L'infection par le Virus de l'hépatite B (VHB) a touché plus d'un milliard de personnes dans le monde et est responsable d'infection chronique pour 250 millions de personnes, aujourd'hui. Ces infections chroniques peuvent conduire à la cirrhose et au cancer du foie. Environ un million de personnes décèdent tous les ans de cette infection virale. Il est donc essentiel de comprendre cette maladie virale afin de développer de nouvelles approches théraputiques. Notre projet de recherche basé sur nos précédents travaux, porte sur l'impact de l'expression d'un des gènes du VHB sur la pathogenèse hépatique et notamment en modulant la réponse immunitaire. Nous souhaitons évaluer le rôle de ce gène viral et les mécansimes associés en utilisant des virus complets ou délétés sur ce gène. Le modèle murin est indispensable pour évaluer les nombreuses interactions existantes entre les cellules du foie infectées et les cellules de l'environnement hépatique dont les cellules immunologiques. Cependant, le modèle murin n'étant pas infectable par le VHB. C'est pourquoi, nous avons généré des vecteurs viraux modifiés génétiquement qui sont d'une part, capables d'infecter le foie des souris et d'autre part, d'exprimer soit le génome complet soit un génome partiel du VHB. Ces vecteurs viraux et les modèles murins nous permettront ainsi d'évaluer l'impact d'une des protéines virales sur la pathogenèse hépatique et de déterminer le rôle de la réponse immunitaire dans cette progression.

Bénéfices attendus

Nos données acquises nous éclairerons sur la pathogenèse hépatique et le risque de développement du cancer du foie associé à une infection par le virus de l'hépatite B (VHB). Elles pourraient conduire à de nouvelles approches thérapeutiques ciblant l'infection par le VHB et des complications hépatiques associées chez les patients infectés par le VHB.

Procédures

Le transfert du génome du virus de l'hépatite B (VHB) sera réalisé après anesthésie (par injection pendant 5-10 secondes par voie intra-péritonéale) sur l'ensemble des souris incluses. Ce transfert sera réalisé par une unique injection par voie intra-veineuse (injection de 5-10 secondes). Parmi ces animaux, un groupe de souris vigiles sera soumis à une injection intra-péritonéale (5 à 10 secondes) deux fois par semaine pendant 4 semaines d'un réactif générant une fibrose hépatique. Un autre groupe également vigile sera soumis à une injection unique intra-péritonéale (5 à 10 secondes) d'un réactif générant un cancer du foie. Un troisième groupe de souris vigile aura été pré-immunisé par une injection intra-veineuse unique (de 5 à 10 secondes). Un dernier groupe de souris vigiles subira une déplétion de sous-population de cellules immunitaires par injections d'anticorps par voie intra-péritonéale (5 à 10 secondes) deux fois par semaine pendant 1 à 2 semaines. Au cours de cette étude, nous serons également amenés à prélever du sang (1 à 5 minutes). Le nombre de prélèvement de sang varie de 1 à 2 selon le temps d'expérimentation (de 7 semaines à 6 mois) de chaque procédure. Les animaux seront anesthésiés avant ce prélèvement de sang. A la fin de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

L'anesthésie des animaux pourrait engendrer un stress thermique. L’induction des pathologies hépatiques sont bien connues et ont montré des nuisances légères ou modérées de l'atteinte hépatique. La manipulation des souris, en particulier les injections, peuvent induire un stress et pourraient conduire à une douleur légère de courte durée au site d'injection au moment du geste. L'administration de différentes drogues pourrait induire une inflammation, une fibrose et un cancer hépatique. Néanmoins, compte tenu des court temps expérimentaux effectués et/ou du faible impact de certaines des drogues utilisées, les nuisances cliniques seront inexistantes ou minimes. Ils pourraient éventuellement générer quelques troubles digestifs transitoires et rapidement réversibles. Les prélèvements sanguins pourraient être source de stress au moment de l’anesthésie et conduire à des saignements/hématomes.

Devenir

Pour l’ensemble des animaux inclus dans ce projet, l'euthanasie est requise afin de prélever des échantillons biologiques (foie, rate,...) pour permettre de réaliser de nombreuses analyses expérimentales post-mortem (histologie, quantification de paramètres cliniques, virologiques et immunologiques...) et, ainsi, répondre à la question scientifique posée. Cet acte nécessaire sera réalisé par du personnel compétent et selon les bonnes pratiques d'euthanasie des animaux par une méthode réglementaire.

Remplacement

De précédents résultats effectués sur des hépatocytes primaires humains (PHH) in vitro suggèrent un rôle du VHB dans le recrutement et l'activation des différents intervenants du système immunitaire intra-hépatique. La mise en place d'un modèle in vitro récapitulant la réponse immunitaire innée et acquise, le recrutement des cellules de la moelle osseuse, ainsi que les interactions entre le foie et le système digestif (interactions essentielles à la pathogenèse hépatique) n'est pas réalisable à ce jour in vitro, même dans un modèle d'organoïdes multicellulaires. C'est pourquoi il est nécessaire de réaliser ces travaux dans un modèle in vivo afin étudier l'impact du VHB sur le recrutement et l'activation des différents acteurs du système immunitaire, par interaction directe et/ou indirecte avec les hépatocytes infectés.

Réduction

La réduction de l'échantillonnage d'animaux est liée à l'approche statistique qui nécessite 30 souris par condition afin d'évaluer une différence significative entre les groupes par des tests statistiques. Le nombre total d'animaux sera de 1050 souris. Ce nombre a été évalué selon un calcul de puissance adapté en prenant la somme de toutes les expérimentations prévues dans ce projet de recherche. A l'issue de ces expérimentations, de nombreux tissus seront récupérés sur chaque souris (sang, foie, rate...) afin de permettre de réaliser un grand nombre d'analyses sur une même souris et ainsi de répondre aux questions scientifiques soulevées.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation pour l’espèce concernée et un suivi quotidien sera assuré par un personnel formé et compétent. De plus, les cages seront raffinées par la présence de lanières Kraft et des abris en carton et installées sur des portoirs ventilés. Aucune souris ne sera isolée dans une cage. Les animaux seront manipulés uniquement par du personnel qualifié et sensibilité au bien-être animal. Les procédures nécessitant l'endormissement de l'animal sont raffinées avec un protocole d’anesthésie et d’analgésie approprié, la gestion du risque d’hypothermie par l’utilisation d’une lampe chauffante ou d'un tapis chauffant durant les manipulations des animaux sous anesthésie, et l’ajout d’un gel de protection oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire si besoin. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Si les points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le modèle murin syngénique (de génome identique) est un modèle parfaitement calibré à l'expérimentation animale. De plus, il existe une homologie relative avec l'Homme dans le fonctionement du système immunitaire et les interactions foie/autres tissus, que nous souhaitons étudier ici. Les animaux nés dans notre établissement seront utilisés à deux stades de développement, soit à 15 jours de vie pour l'initiation du cancer du foie, soit au moment ou quelques semaines après le sevrage pour les autres types d'expérimentation. Les souris adultes provenant de notre fournisseur seront de même fond génétique que les souris provenant de notre établissement. Ces souris seront acclimatées à notre environnement expérimental au moins une semaine avant inclusion dans une de nos procédures. Ces souris seront identifiées à l'inclusion dans une de nos procédures.

Jusqu'à 46 jours d'injections quotidiennes, 25 jours de L-Dopa, puis cinq séances de deux heures enfermée dans un cylindre de plexiglas pour observation, voilà ce que traverse chaque souris de ce projet. 13 896 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, après une chirurgie cérébrale de trente minutes injectant une toxine qui détruit leurs neurones dopaminergiques. La L-Dopa provoque ensuite les mouvements anormaux recherchés, que le porteur décrit comme pouvant gêner l'accès à l'eau et à la nourriture pendant deux à trois heures après chaque injection. L'effectif intègre des lots prévus pour refaire une troisième fois les expériences en cas de résultats discordants, et le porteur annonce que la "production" d'animaux sera réduite si moins de molécules sont retenues.

Objectifs

Le traitement classique des symptômes de la maladie de Parkinson est la L-Dopa. Au début du traitement la L-Dopa réduit les symptômes moteurs, mais après quelques années de traitement, des mouvements anormaux involontaires handicapants, appelés dyskinésies et induits par L-Dopa, se développent. L’objectif de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de molécules anti-dyskinétiques déjà commercialisées, ou non, sur ces mouvements involontaires dyskinétiques induits par le traitement chronique par L-Dopa. Ce projet permettra aussi d‘évaluer un potentiel effet protecteur de ces mêmes molécules sur les neurones atteints lors de la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

La maladie de Parkinson est la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente au monde. Originairement considérée comme une maladie des personnes âgées, elle est de plus en plus diagnostiquée avant l’âge de 65 ans, notamment comme dans les formes génétiques étudiées ici. Les seuls traitements disponibles sont symptomatiques, mais malgré leurs efficacités dans la réduction des symptômes moteurs, ils induisent des effets indésirables comme les dyskinésies qui sont des mouvements anormaux. D’où la nécessité d’explorer de nouvelles thérapies. Ce projet fera progresser les connaissances dans les domaines de la physiopathologie de la maladie de Parkinson et des dyskinésies induites par le traitement par L-Dopa. Ces recherches thérapeutiques sont en amont d’une application pratique en médecine humaine et requièrent une expérimentation animale afin d’apporter la preuve de concept concernant leur efficacité. Il est à noter que si la preuve de concept est apportée dans le domaine de la maladie de Parkinson, des approches similaires pourront être développées pour soigner d’autres maladies neurologiques. En étudiant l’expression des gènes dans certains régions du cerveau après traitement, on espère pouvoir mieux comprendre les mécanismes d’action de ces molécules anti-dyskinétiques que nous allons utiliser dans ce projet et identifier des nouvelles cibles thérapeutiques pour la prise en charge de la maladie de Parkinson. Les résultats de ce projet pourront également participer à un développement clinique chez les patients parkinsoniens.

Procédures

Les animaux seront soumis à une unique procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie, pour une injection dans une zone spécifique du cerveau pour la mise en place de notre modèle. Elle durera 30 minutes environ. Les animaux recevront des injections des molécules à évaluer (1 fois par jour pendant 46 jours maximum, seulement pour les groupes d’animaux qui seront traités avant la chirurgie) et du traitement de la maladie de Parkinson (L-Dopa, 1 fois par jour pendant 25 jours maximum). Les animaux seront placés chacun dans des cylindres en plexiglas pour pouvoir être observés, 5 fois pendant les 25 jours de traitement par L-Dopa, et pour une durée maximale de 2 heures, afin d’évaluer l’intensité des mouvements anormaux induits par la L-Dopa et l’action des molécules sur cette intensité. Tous les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses.

Impact sur les animaux

La chirurgie sera associée à un risque de douleur dans les heures ou les jours suivants. De plus l’injection réalisée pour la mise en place du modèle pourra générer un retard de récupération transitoire pour l’animal (difficultés transitoire motrices causant des difficultés pour s’abreuver et s’alimenter et engendrant des pertes de poids). L’anesthésie générale nécessaire pour la chirurgie génèrera une hypothermie et une sécheresse oculaire, elle pourra également être associée à des problèmes cardiorespiratoires. L’injection du traitement pour la maladie de Parkinson (L-Dopa) générera des mouvements anormaux (dyskinésies) pouvant générer un stress et pouvant aller jusqu’à provoquer des difficultés à s’alimenter et s’abreuver pour l’animal de façon très transitoire, dans les 2 à 3 heures suivant l’injection de la L-Dopa puis l’animal reviendra à son état habituel. Le changement d’environnement pour les tests comportementaux pourrait provoquer un peu de stress. Les injections peuvent également générer du stress et une douleur légère et de courte durée. Pour les injections répétées il existe un risque d’induration de la zone injectée, d’inflammation ou d’hématome.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés pour prélever les tissus d’intérêt pour permettre les analyses afin de répondre à notre question scientifique.

Remplacement

Notre projet propose d’étudier les conséquences de la mort des neurones dopaminergiques et sur d’autre partie du cerveau, et de trouver de nouveaux traitements pour les pallier. Le fonctionnement de ces neurones et leurs implications dans la production des mouvements normaux ou anormaux ne peut, à ce jour, pas être évaluée avec des modèles in vitro (cellulaires) ou computationnels. Le projet étudie des fonctions spécifiques du système nerveux dont l’exploration requiert un cerveau avec le moins d'altérations possibles, nécessitant des souris transgéniques et ne peut se faire qu'à l'aide d'études sur l'animal. D'une façon générale, nous nous efforçons continuellement à réévaluer nos approches et adapter nos expériences pour des modèles in vitro ou computationnels autant que possible.

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués sera de 13896 maximum. La taille des groupes expérimentaux est estimée en se basant sur des travaux précédents. 15 à 22 animaux par groupe seront nécessaires dans le cadre de ce projet pour obtenir des effets statistiquement significatifs dans les réponses que nous proposons de tester. Ces lots ont été définis en utilisant des tests statistiques afin de limiter au strict minimum les effectifs par groupe tout en obtenant des résultats statistiquement exploitables. En fonction des besoins expérimentaux pour les projets de recherche il est possible que nous produisions moins d’animaux que prévu. Par exemple, ce nombre inclut les lots expérimentaux nécessaires pour effectuer les procédures une troisième fois en cas de non-concordance lors de l’expérience de vérification des résultats initiaux. Ces lots ne seront utilisés qu’en cas de résultats non concordants lors des deux expériences. La production d’animaux sera réduite et adaptée en fonction du nombre de molécules anti-dyskinétiques qui seront sélectionnées lors des premiers résultats sur un nombre réduit d'animaux et le nombre total d’animaux s’en verra réduit. Tous les animaux participant à ces procédures conduiront à des analyses biochimiques en rapport avec les comportements observés, afin de réduire le nombre d’animaux qui auraient été utilisés si les analyses biochimiques étaient effectuées sur d’autres lots. Les doses de traitements et le schéma d’injection de toxine intracérébrale seront également optimisés pour limiter le nombre d’animaux qui ne développeraient pas de dyskinésies et qui ne pourraient pas être inclus dans les groupes expérimentaux après chirurgie, cela permettra de réduire le nombre total d’animaux opérés pour obtenir le bon nombre dans groupe expérimental.

Raffinement

L'hébergement et les protocoles expérimentaux utilisés ont été optimisés pour réduire au minimum la douleur et l'inconfort des animaux. Les souris provenant d’un fournisseur externe seront placées dans une salle d’acclimatation pendant au moins 6 jours avant toutes utilisation. Les animaux seront hébergés en groupe de 2 à 5, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne nocturne de 12h à changement progressif. L'eau et la nourriture seront fournies ad libitum. Un carré de coton pour nidifier ainsi qu’un bâtonnet à ronger seront placés dans chacune des cages de manière à offrir aux animaux un enrichissement. Si besoin, lors d’un petit effectif ou de tension dans le groupe un complément d’enrichissement peut être apporté par des maisonnettes ou des lanières de kraft. Les animaux seront observés quotidiennement, en cas d’anomalie un processus de déclaration au comité interne responsable du bien-être animal et à l’équipe de recherche est mis en place pour assurer la meilleure prise en charge des animaux. Pendant les procédures, les animaux seront observés, manipulés et pesée régulièrement. La chirurgie sera réalisée chez des animaux endormis et avec traitements anti-douleur adaptés. On maintiendra la température de l’animal à l’aide d’une chambre d’induction et de réveil chauffées et d’un tapis chauffant au cours de la chirurgie. Un gel oculaire sera mis en place pour éviter toute sécheresse oculaire. Après la chirurgie, les animaux recevront de la nourriture gélifiée et/ou réhydratée pour faciliter leur récupération, éviter de la déshydratation ou une perte de poids trop importante. Ils seront surveillés jusqu’à 2 fois par jour en période post-chirurgicale et seront pesés tous les 1-2 jours après chirurgie et jusqu’à récupération de leur poids initial. Le suivi que nous mettrons en place devrait permettre de détecter précocement tout signe de souffrance et mettre en place la prise en charge adaptée. L'évaluation de la douleur et de la détresse sera réalisée en observant l'aspect des souris et leur comportement. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Pour les traitements injectés, nous vérifierons la souplesse de la peau avant injection et nous changerons de site d’injection chaque jour. Une partie des animaux sera euthanasiée par injection d’un agent euthanasiant, cette injection sera précédée d’une pré-sédation afin de réduire le stress et la douleur induits par l’euthanasiant.

Choix des espèces

Dans le projet, la souris sera utilisée afin de tirer profit des techniques de transgénèse très efficaces dans cette espèce. La souris est le modèle le plus utilisé pour les maladies humaines du mouvement, notamment la maladie de Parkinson et donc la dyskinésie induite par traitement avec la Lévodopa. Pour l’études des dyskinésies, la méthode de lésion sélective des neurones dopaminergiques avecune toxine est très efficace et maitrisée chez cette espèce depuis de nombreuses années. La souris a des mouvements coordonnés des pattes pour des comportements moteurs élaborés qui sont fortement impactés par la dégénérescence des neurones dopaminergiques, ce qui en fait un modèle particulièrement pertinent pour l’étude de la maladie de Parkinson. Le striatum murin, comporte également une organisation anatomo-fonctionnelle proche de celles des primates non humains et humains, ce qui permet relativement facilement d’extrapoler les mécanismes découverts chez la souris à l’humain. La maladie de Parkinson étant une maladie qui touche les adultes, les expériences auront lieu que chez des animaux adultes adultes âgés de 6 à 10 semaines environ, afin de ne pas interagir avec les phénomènes développementaux.

Les souris sont mises à mort dès que se confirment une démarche saccadée et une perte d'équilibre, avant que s'installe une paralysie des pattes arrière. 50 souris de la lignée M83, modifiées génétiquement pour produire une forme humaine de l'alpha-synucléine, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles sont gardées jusqu'aux premiers troubles moteurs d'une maladie qui, selon le porteur, se déclare entre 8 et 22 mois, et subissent sous anesthésie une ponction cardiaque de deux minutes au plus. Le porteur présente le sang comme "une fenêtre non invasive sur l'état du cerveau", et le bénéfice annoncé se limite à une identification de marqueurs qui "ouvrirait la voie" à d'autres recherches.

Objectifs

Le projet vise à identifier des biomarqueurs sanguins dans un modèle de souris modifiées génétiquement pour développer une maladie associée à l’agrégation de l’alpha-synucléine, une protéine qui est le constituant principal des lésions cérébrales dans la maladie de Parkinson. Les vésicules extracellulaires sont des petites structures libérées par les neurones et qui sont retrouvées dans le sang. Leur présence dans le sang de souris offre une fenêtre non invasive sur l'état du cerveau. L'étude des vésicules extracellulaires neuronales dans le sang de ces souris M83 par des méthodes biochimiques permettrait d'identifier des biomarqueurs de maladie. Ces derniers sont des indicateurs biologiques de l'état pathologique du cerveau de la souris, et ils peuvent être utiles au diagnostic précoce de maladies neurodégénératives ou refléter l’existence de maladies différentes sur le plan lésionnel et clinique chez l'homme.

Bénéfices attendus

Le projet vise à rechercher si de nouveaux marqueurs moléculaires de la maladie peuvent être identifiés dans ce modèle expérimental à partir d’un prélèvement de sang. Réalisable par simple prélèvement sanguin et au cours de l’incubation de la maladie, cette identification ouvrirait la voie à des recherches de marqueurs précoces de la maladie.

Procédures

Les animaux sont soumis à une anesthésie, ainsi qu'à une ponction cardiaque d'une durée de 2 minutes au maximum.

Impact sur les animaux

L’apparition des signes cliniques moteurs se manifeste par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort compassionnelle des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort, dès l’apparition des premiers symptômes, afin de leur éviter des souffrances ultérieures.

Remplacement

Le projet qui vise à rechercher des biomarqueurs dans le sang ne peut être réalisé que sur animal vivant. Il n'existe pas aujourd'hui de méthode alternative pour évaluer le potentiel de ce type d'approche.

Réduction

Le projet complet prévoit un total de 50 souris, maintenues jusqu’à l’atteinte des points limites définis. La quantité de prélèvements issus de ces souris est jugée suffisante pour permettre la réalisation d’extraction de vésicules extracellulaires neuronales, et mener à bien nos analyses.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans un portoir ventilé par groupe de 5 souris de même sexe, et originaires de la même portée, et maintenus dans un environnement enrichi (dômes en plastique, buchettes en bois et éléments de nidification) pendant toute la durée de l’expérimentation. Ces enrichissements sont renouvelés chaque semaine, et la litière en rafle de maïs changée de façon bi-hedomadaire. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort. Le test de suspension par la queue montre une dégradation de l’écartement des pattes postérieures. La connaissance des zootechniciens concernant la symptomatologie et son évolution permet ainsi d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés selon les critères et le scoring prévu en annexe et justifiant la mise à mort de l’animal. Lors de la ponction intracardiaque, une analgésie est réalisée 30 minutes avant l'anesthésie.

Choix des espèces

Les souris M83 sont des souris modifiées génétiquement et qui produisent une forme de la protéine alpha-synucléine humaine entraînant le développement d’une pathologie de cette protéine accompagnée d’une symptomatologie motrice. Elles développent une maladie qui se manifeste cliniquement par l’apparition d’une paralysie lors du vieillissement, entre 8 et 22 mois. Elles constituent un modèle pertinent de la maladie de Parkinson chez l'homme.