Souris

5 652 souris et 1 296 rats vont être utilisés sur cinq ans, tous tués pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mères subissent des injections et des gavages à l'état vigile, une césarienne sous anesthésie, une perfusion de deux heures et une traite de quinze à trente minutes, tandis qu'une partie de la descendance reçoit un produit chimique déclenchant une colite pendant deux cycles de six jours. Les régimes imposés aux mères simulent un retard de croissance intra-utérin ou un diabète gestationnel, pour observer les conséquences sur l'immunité intestinale des petits, tués à trois ou cinq semaines. Aucun modèle cellulaire in vitro ne pourrait reproduire l'intégralité de ces interactions, affirme le porteur, qui annonce par ailleurs recourir à des organoïdes intestinaux pour l'analyse fine des mécanismes.

Objectifs

La période périnatale (gestation et allaitement) est une période déterminante pour le développement de l'immunité chez le bébé. Certaines complications pendant la grossesse, comme un retard de croissance du bébé dans l'utérus ou le diabète gestationnel, augmentent le risque que l'enfant développe plus tard des maladies inflammatoires chroniques. Et nous manquons encore de données scientifiques pour comprendre précisément comment ces problèmes perturbent l’immunité du bébé et comment cela perdure dans le temps. Nous utilisons différents régimes alimentaires sur des modèles de rongeurs pour simuler ces complications de la grossesse et étudier leur impact sur le développement de l’immunité du bébé et si cela augmente le risque de maladies chroniques intestinales à l’âge adulte.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de confirmer ou d’infirmer notre hypothèse quant au problème de transfert de l’immunité de la mère à son bébé lors de complications de la grossesse. Notre projet permettra d’identifier les acteurs et les mécanismes mis en jeu, responsables du problème initial et à l’âge adulte. Il permettra de trouver le ou les nutriments manquants pour restaurer les défauts. Le projet devrait ainsi fournir des bases scientifiques pour de futurs essais cliniques afin d’améliorer la santé de la maman et de son bébé, réduisant l'impact des maladies inflammatoires chroniques chez le futur adulte en vue de l'amélioration de la santé de toute la population.

Procédures

Nos deux premiers groupes d'animaux recevront 2 à 3 injections à l'état vigile, et notre troisième groupe, à l'état vigile, recevra 4 administrations par voie orale. Chacun de ces actes sera d’une durée réduite de quelques secondes à 1 minute. Le prélèvement de lait réalisé sous anesthésie durera entre 15 et 30minutes. L'étude des flux de nutriments nécessite de réaliser une perfusion sur animal anesthésié d'une durée de 2h. Les animaux subiront un seul acte chirurgical, une césarienne, effectué sous anesthésie et analgésie, la durée de cet acte est de 10 à 15 minutes.

Impact sur les animaux

Pour nos trois procédures expérimentales, les préhensions, injections ou administrations par voie orale sur les animaux vigiles devraient constituer un stress et une douleur de faible intensité et d’une durée réduite de quelques secondes à 1 minute, il s'agit d'actes expérimentaux de sévérité légère. Néanmoins, la réalisation consécutive de plusieurs actes expérimentaux incluant nos manipulations à l'état vigil, cités précédemment, avec des actes sur animaux anesthésiés et sous anti-douleur, requalifie nos procédures 1 et 2 en procédures de sévérité modérée. Notre procédure 3 constitue une procédure de sévérité modérée. En effet, l’administration du produit induisant la colite, a un impact modéré au dosage administré au vu des tests déjà effectués au sein de notre animalerie. Cet acte expérimental devrait occasionner une inflammation de grade modéré au niveau du côlon distal durant les deux cycles de 6 jours de traitement. Celle-ci peut être associée à des selles molles ou des diarrhées et une perte modérée de poids. L’arrêt de l’administration du produit (remplacé par de l’eau de boisson seule) entraîne l’arrêt progressif de ces symptômes et une récupération de l’état physiologique normal au bout de 4 jours. Pour toutes nos procédures, l’habituation à la préhension et l’administration par voie orale par des techniciens expérimentés, et l’utilisation de sondes souples, réduira les nuisances à leur niveau minimum. Les animaux auront une inflammation modérée du côlon, ou colite, qui durera 6 jours sur deux périodes espacées d'une période de 14 jours. Cette inflammation peut être associée à des selles molles ou des diarrhées et une perte modérée de poids. L’arrêt du traitement inflammatoire au bout des 6 jours entraine l’arrêt progressif de ces symptômes et un retour à la normale dès 4 jours.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d'organe.

Remplacement

Notre étude implique de suivre l’évolution physiopathologique de la transmission de l’immunité de la mère à sa descendance en situation de complications de la gestation tels que le retard de croissance intra-utérin ou le diabète gestationnel, et d’analyser les conséquences sur la santé intestinale de l’adulte en devenir. L’utilisation d’animaux est indispensable dans les études évaluant l’impact au long cours des complications de la gestation qui sont initiées in utero et qui nécessitent d’étudier l’interface mère-enfant. Par ailleurs, notre projet de recherche implique des interactions multi-systèmes complexes, tels que le microbiote intestinal, l’écosystème microbien le plus riche sur terre, et la muqueuse intestinale, qui met en jeu un système immunitaire très dense. Il n’existe pas de modèle cellulaire in vitro pouvant reproduire l’intégralité de ces interactions. Néanmoins, nous envisageons d’utiliser, pour les analyses plus précises des mécanismes en jeu, des systèmes in vitro de culture cellulaire et des cultures d’organoïdes intestinaux.

Réduction

Ce projet de recherche sur cinq ans implique l'utilisation d'un total de 5652 souris et 1296 rats pour trois procédures distinctes. Le nombre d'animaux par procédure a été déterminé en tenant compte de la variabilité intra- et intergroupe inhérente à l'expérimentation in vivo, avec un minimum de trois répétitions indépendantes pour assurer la reproductibilité des résultats. Cette stratégie permettra une évaluation statistique robuste des effets des régimes alimentaires sur les réponses immunitaires placentaires et intestinales, ainsi que sur l'inflammation intestinale, en incluant des analyses statistiques guidées par des logiciels et des références bibliographiques d’aide à la décision statistique. Ces différents outils nous ont permis de déterminer le nombre optimal d’animaux par groupe pour obtenir des résultats significatifs permettant de répondre à nos hypothèses. Enfin, les schémas expérimentaux et le nombre d'animaux associés à chaque procédure ont été validés par les statisticiens de l'équipe pour garantir leur robustesse et leur efficacité dans la génération de données scientifiques fiables.

Raffinement

L’environnement des souris sera enrichi (tunnel, bâton à ronger, frisottis, dôme). Après deux semaines d'acclimitation à leur environnement les femelles seront mises en reproduction. Une observation hebdomadaire avec suivi du poids des animaux sera réalisée dès leur arrivée dans l’animalerie de façon à identifier un éventuel problème. Les quatre gavages de la procédure 3 seront effectués par un personnel animalier expérimenté et ils seront réalisés en utilisant des sondes fines et souples. Lors de l’induction de l’inflammation intestinale (colite par traitement chimique), les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel animalier compétent pour détecter d’éventuels signes de souffrance. L’évaluation de l’état des animaux sera effectuée selon des critères définis (poids, apparence physique -pelage, posture-, activité, comportement, fréquence respiratoire). Si une douleur était constatée chez un animal durant le traitement induisant la colite, un analgésique de type central sera administré. Les points limites définis conduiront, s’ils sont observés, à la mise à mort des animaux le cas échéant.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée en nutrition, est idéale pour les études sur les régimes obésogènes, les colites expérimentales et l'âge maternel avancé. Elle offre l'avantage d'être immunologiquement bien caractérisée et d'accéder à de nombreux modèles génétiquement modifiés dans ce fond génétique. La ratte est un modèle maîtrisé au laboratoire, est adaptée à l’étude du retard de croissance intra-utérin induit par un régime pauvre en protéines. Son système immunitaire, proche de celui de l’humain, renforce le potentiel translationnel des résultats. Ce modèle permet également d’évaluer, lors de transferts de microbiote, d’éventuels obstacles interespèces liés à des spécificités microbiennes d’hôte. Ces analyses anticipent la faisabilité du transfert de microbiote humain à murin et ajustent le choix du modèle axénique. De façon à étudier l’effet de l’âge maternel sur le transfert immunitaire de la mère à la descendance, les animaux (rattes et souris) commandés auprès de l’établissement éleveur, pour la première partie du protocole, seront âgés soit de 7 semaines soit de 24 semaines. Après une phase d’acclimatation de deux semaines, les animaux seront mis en reproduction. De façon à étudier l’effet de nos différents régimes sur le transfert d’immunité de la mère à la descendance, une partie des mères gestantes et des fœtus sera mise à mort au dernier tiers de la gestation. L’autre partie des animaux sera maintenue sous leurs régimes respectifs jusqu’au sevrage. Au sevrage, les mères seront traites pour récupération du lait puis mises à mort pour l’analyse de populations immunitaires intestinales. Les petits âgés de 3 semaines seront alors mis à mort pour l’analyse des marqueurs de maturation immunitaire intestinale ou seront placés sous régime contrôle. L’évolution de leur maturation immunitaire sera étudiée et les derniers groupes de descendants seront mis à mort à 5 semaines de vie. Pour la troisième partie du projet, les souris axéniques, sans germe, âgées de 3-4 semaines seront commandées auprès de l’établissement éleveur de façon à réaliser immédiatement à leur arrivée un transfert microbien en période de sevrage. Une partie des animaux sera mise à mort à l’âge de 8 semaines avant l’induction de la colite pour regarder l’état de maturation immunitaire puis à 4 temps différents au cours de la colite pour suivre l'évolution inflammatoire et mimer la pathologie humaine.

Identifiés sous anesthésie dans les trois jours précédant la greffe, castrés ou ovariectomisés pour moins d'un dixième d'entre eux, parfois privés de surrénales, 400 souris et 100 rats reçoivent ensuite une injection de cellules tumorales. Suivent les pesées et les mesures de volume tumoral sous contention, puis un regroupement avec de nouveaux congénères le jour de la randomisation. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et servent à amplifier du matériel tumoral pour greffer par la suite des cohortes plus nombreuses, dans le cadre d'une prestation de services en recherche préclinique. Porteurs de tumeurs, tous sont mis à mort en fin de procédure.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’amplifier du matériel tumorale de modèles déjà mis en place chez les rongeurs (rats ou souris), dans le but de pourvoir greffer par la suite une cohorte d’animaux plus important permettant de réaliser des études d’évaluation d’efficacité de nouveaux composés thérapeutiques en développement.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer. Pour réaliser ces évaluations, il est nécessaire d’amplifier le matériel tumoral afin pouvoir greffer des cohortes d’animaux plus important nécessaire pour les études d’efficacité.

Procédures

Mise en place d’un système d’identification de l’animal, sous anesthésie générale (en conditions d’asepsie, réalisée entre 0 et 3 jours avant la greffe (

Impact sur les animaux

La greffe tumorale pourra engendrer une douleur et un stress léger. L’évolution du volume tumoral entrainera une distension de la peau. Il est aussi possible, que la progression tumorale entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. Pour les études sur modèles hormonodépendants (modèles prostatiques/ovariens), les animaux pourront être castrés/ovariectomisés avec ou sans surrénalectomie entrainant une douleur modérée sur 1 ou 2 jours et un stress modéré. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress de 1-2j.

Devenir

Du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, ils seront tous mis à mort en fin de procédure

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais reste toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposable à l’homme.

Réduction

Dans le cadre des amplifications de matériel tumoral, le nombre d’animaux à greffer est défini selon les données historiques de prise tumorale incluant l’hétérogénéité du modèle tumoral. En fonction de ces données, un nombre limité mais suffisant d’animaux sera engagé dans cette procédure. La règle générale est la suivante : le nombre d’animaux engagé dans la phase d’amplification sera déterminé sur la base qu’une tumeur d’un volume d’environ 800 mm3 permettra de greffer 8 à 10 animaux par la suite, en fonction de la qualité du matériel tumoral. Un coefficient de 1.3 sera également appliqué afin de palier à l’hétérogénéité de la prise tumorale des modèles. Par conséquent, une étude d’activité antitumorale nécessitant la greffe de 60 animaux nécessitera d’inclure en 8 et 10 animaux dans la phase d’amplification. Cette règle générale pourra être ajustée en fonction des spécificité du modèle (taux de prise tumoral faible ou forte hétérogénéité)

Raffinement

Toutes les procédures sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par le vétérinaire. L’impact de ces procédures sera toujours analysé par la structure chargée du bien-être des animaux. Toutes les procédures invasives et faiblement invasives, sont réalisées sous anesthésie générale par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de mesure des volumes tumoraux seront adaptée à la vitesse de croissance du modèle. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Les animaux sont observés quotidiennement. Dès l’apparition des premiers signes cliniques qui pourront amener aux points limites des antalgiques pourront être prescrits sous l’autorité du vétérinaire. Les chirurgies pratiquées dans ce projet sont des procédures de gravité modérée, réalisée sous anesthésie. Les chirurgies sont réalisées de façon aseptique et les animaux reçoivent des l’antalgiques, avec surveillance post opératoire et soins post opératoires adaptés si nécessaires. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations vétérinaires. Un document de référence est à disposition des concepteurs et des techniciens. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître les signes de mal être des animaux. Les expérimentateurs et les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. En cas de suspicion de toxicité, un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal ou sur l’arrêt des traitements. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites (mais sans dépassement du point limite) est observé, l’animal est mis en observation et un traitement de soins est mis en place. Par exemple, en cas de douleur constatée, le vétérinaire prescrira un traitement antalgique.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Toutefois, ils pourraient être reçus à partir de 5 semaines mais ne seront pas manipulés avant 7 semaines minimum. Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales.

Des dépilations, des croûtes et des ulcérations au point d'irradiation pendant cinq à six jours : 3 592 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyses post-mortem. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales sous anesthésie, une irradiation ciblée, puis des traitements d'immunothérapie et des prélèvements sanguins jusqu'à trois mois après. L'objectif est de tester si de nouvelles techniques d'irradiation combinées à l'immunothérapie contrôlent mieux les tumeurs agressives et les métastases, les essais cliniques restant annoncés pour la fin du projet. Le choix de la souris tient à l'abondance de la littérature en radiothérapie et à des modèles tumoraux décrits comme pertinents pour la transposition clinique.

Objectifs

Certaines tumeurs solides, comme les cancers du sein triple négatif et les mélanomes, sont particulièrement difficiles à traiter en raison de leur agressivité, de leur capacité à métastaser et/ou de leurs taux de récurrence locale très élevée. Le cancer du sein triple négatif évolue plus agressivement que les autres formes de cancer du sein, a un taux élevé de récidive à distance et est souvent diagnostiqué après que la tumeur se soit étendue au-delà du sein. Le mélanome, un cancer de la peau, peut se propager à d’autres parties du corps. Le carcinome épidermoïde de la cavité buccale, un type de cancer de la tête et du cou, représente le 6e cancer les plus répandus dans le monde, avec un pronostic souvent défavorable en raison de la récurrence locale et des risques de complications, notamment à proximité des glandes salivaires. La radiothérapie est l’un des traitements les plus efficace et couramment utilisés contre le cancer, mais la méthode conventionnelle présente des limitations pour certaines tumeurs agressives et métastatiques, car elle peut endommager les tissus sains environnants et est moins efficace pour contrôler les métastases (la radiothérapie conventionnelle est un traitement plutôt local). Ce projet propose de combiner des techniques de radiothérapie innovantes avec l’immunothérapie, un traitement prometteur qui renforce la capacité du système immunitaire à attaquer les cellules cancéreuses. Ces nouvelles techniques de radiothérapie permettent une distribution plus ciblée des doses, réduisant ainsi la toxicité pour les tissus sains, favorisant une activation plus forte du système immunitaire et un effet systémique. Ces approches ont montré des résultats prometteurs en termes de contrôle de la croissance tumorale, même à des doses élevées, et d'efficacité contre les métastases. L’objectif principal de ce projet est de démontrer que la combinaison de la radiothérapie innovante et de l’immunothérapie constitue une approche thérapeutique plus efficace pour traiter des tumeurs solides, notamment les plus agressives et/ou métastatiques. Nous évaluerons cette stratégie sur plusieurs types de tumeurs afin d’étudier son potentiel à améliorer le traitement de cancers difficiles à soigner avec les méthodes actuelles.

Bénéfices attendus

Ce projet pionnier a un fort impact sociétal. Il explore des techniques novatrices en radiothérapie (RT), moins agressives pour les tissus sains. Le gain en matière d'épargne/récupération tissulaire contribuera à l'élimination du principal obstacle dans les traitements de cancer par RT : les doses de tolérance des tissus sains. Dans ce projet nous cherchons à améliorer le résultat des traitements en combinant des techniques d’irradiation innovantes avec de l’immunothérapie. A la fin du projet, nous disposerons d'études radiobiologiques complètes qui nous permettront de procéder à des essais cliniques pouvant bénéficier à des patients qui actuellement reçoivent un traitement seulement palliatif ou pour lesquels les conséquences sur les tissus sains sont très impactantes pour leur qualité de vie et pouvant également ouvrir une voie vers un traitement efficace des tumeurs très métastatiques. . le projet est sur la voie qui va de la conception de l'idée aux éventuels premiers essais cliniques.

Procédures

Dans une première procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux sous anesthésies générale gazeuse et locale (environ 20 minutes) sur tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Dans une seconde procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux sous anesthésies générale gazeuse et locale (environ 20 minutes) sur tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. A un temps prédéterminé, les souris seront irradiées au niveau de la tumeur sous anesthésie générale gazeuse (environ 20 minutes) puis recevront des traitements selon 2 schémas différents soit 2, 5 et 8 jours post irradiation soit 24h avant l’irradiation puis 48h et 120h post irradiation (durée de chaque administration inf à 10 sec). Des prélèvements de sang seront réalisés à différents temps : 24 h avant, , 7 jours post-irradiation et 3 mois post-irradiation pour les animaux suivis à long terme. A chaque prélèvement, les animaux seront anesthésiés avec un mélange d’air et d’isoflurane à 4% puis seront maintenus sous anesthésie gazeuse toute la durée du prélèvement (environ 10 minutes).

Impact sur les animaux

L’implantation tumorale va conduire au développement de tumeurs ou de métastases qui pourront avoir pour conséquence une gêne à la mobilité ou des difficultés respiratoires. Suite à l’irradiation des signes de dermatites peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids transitoire et d’une réduction de la mobilité pendant 3 à 5 jours. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations au site d’irradiation pendant 5 à 6 jours. Les traitements d’immunothérapie n'ont montré aucun signe de toxicité chez les souris traitées dans la littérature. , ni dans nos précédentes expériences

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de ce nouveau traitement vont porter sur la préservation des tissus sains environnants la tumeur et sur le contrôle de la croissance des tumeurs irradiées et des métastases. Les mécanismes inflammatoires, d’infiltration immunitaire et vasculaires induits par l’irradiation ne pourront être étudiés que dans la globalité d’un organisme vivant intégré. Ces mécanismes sont les clés pour une combinaison efficace avec l’immunothérapie. Dans une première étude in vivo, nous avons démontré que les nouvelles techniques de radiothérapie que nous évaluons induit un recrutement efficace des cellules immunitaires et cela justifie l’évaluation de la combinaison avec des immunothérapies. De plus, l’évaluation des combinaisons radio-immunothérapies requièrent l’expérimentation in vivo où l’interaction entre la réaction à la radiation et le système immunitaire peuvent être activées. Il est donc impossible de faire nos études avec des approches in vitro ou en utilisant des organoïdes. Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux à utiliser a été calculé à l'aide d'outils statistiques. Ce nombre est ajusté au plus bas mais permet tout de même de pouvoir conclure.

Raffinement

Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Une étape de socialisation des souris sera mise en place avant toute expérimentation : les souris seront manipulées quotidiennement pour les habituer au manipulateur et à la préhension et permettre ainsi une réalisation plus aisée et moins stressante des procédures expérimentales par la suite. Dans un souci de raffinement, tout d’abord, nous veillerons quotidiennement au bien-être des animaux (une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux) pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal-être (détail des points limites appliqués dans la description de chaque procédure). L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie générale adaptée aux interventions chirurgicales mises en place, avec une prise en charge antalgique. Suite à la croissance tumorale et à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant quelques jours (3 à 5 jours) pour y remédier, des soins support seront mis en place et des aliments appétants sont ajoutés dans la cage. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations à l’endroit de l’irradiation pendant quelques jours (5 à 6 jours), une crème, apaisante cicatrisante antalgique sera administrée sur la peau pour permettre la cicatrisation (au minimum 1 semaine, application quotidienne). En cas d’atteinte d’un point limite, conformément à la grille de score, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les souris sont particulièrement utilisées en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. Les modèles tumoraux que nous allons utiliser sont bien caractérisés dans la littérature et pertinents pour la translation clinique (ex. métastatiques ou très agressives) Les procédures seront réalisées sur des animaux adultes de 8 à 10 semaines, âge compatible avec un développement suffisant et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.

Vingt-quatre souris subissent chacune six gavages, six anesthésies générales pouvant atteindre deux heures et douze injections intraveineuses, une fois leur tumeur greffée développée. 360 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses de tissus : 40 reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, 320 une greffe chirurgicale dans le coussin graisseux, et 48 d'entre elles enchaînent trois anesthésies et six injections intraveineuses. Le porteur décrit des nuisances courtes et de faible intensité, hormis l'inflammation modérée au point d'injection des cellules tumorales. Il annonce des protocoles d'imagerie diagnostique transférables aux patients, quand le projet consiste à observer par scintigraphie et échographie comment une tumeur greffée contourne un traitement anti-angiogénique.

Objectifs

Les thérapies anti-cancéreuses dites anti-angiogéniques ont pour but d’arrêter la formation de nouveaux vaisseaux sanguins dans les tumeurs et ainsi empêcher leur croissance. Cependant, une reprise de la croissance des vaisseaux sanguins de la tumeur est observée après quelques mois de traitement dans la majorité des cas. Cette resistance au traitement est également observée dans le modèle de cancer chez la souris que nous développons. Ce projet propose une étude des vaisseaux sanguins et de la consommation de glucose de la tumeur lors du traitement anti-angiogénique. Nous utiliserons pour cela des caméras d’imagerie médicale non invasive, techniques utilisées également chez l'homme en clinique : scintigraphie et échographie. La scintigraphie permet d'acquérir une image révélant la consommation en glucose des tumeurs, paramètre lié à leur croissance et leur agressivité. L'échographie nous permettra d'obtenir une image des vaisseaux sanguins de la tumeur à l'échelle micrométrique. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les cancers adaptent leurs vaisseaux sanguins et leur façon de se nourrir en réponse aux traitements anti-angiogéniques.

Bénéfices attendus

Cette étude aura pour résultats: (1) de mieux comprendre comment les tumeurs adaptent leur vaisseaux sanguins et leur façon de se nourrir en réponse aux traitements anti-angiogéniques, (2) de développer des protocoles d'imagerie diagnostique permettant de classer les cancers au moment de leur détection entre tumeurs pouvant répondre favorablement aux traitements et tumeurs résistantes, méthodes pouvant in fine être transférée chez les patients, (3) de développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant le métabolisme tumoral en complément de la destruction du réseau vasculaire.

Procédures

40 souris recevront une greffe de cellules par injection sous cutanée sous anesthésie gazeuse. Cette procédure devrait durer moins de 10 minutes. 248 souris auront une contention pour recevoir une dose d’analgésique par injection puis auront une chirurgie pour avoir une greffe dans le coussin graisseux sous anesthésie gazeuse. Cette procédure devrait durer 10 à 15 minutes. 72 animaux auront une contention pour recevoir une dose d’analgésique par injection puis une chirurgie pour avoir une greffe dans le coussin graisseux sous anesthésie gazeuse. Cette procédure devrait durer 10 à 15 minutes. Lorsque leur tumeur se sera développée, 48 de ces souris subiront : Gavage (

Impact sur les animaux

Lors des séances d'imagerie sous anesthésie, les animaux peuvent ressentir du stress et de l’inconfort lors de la manipulation et de la fatigue suite aux anesthésies (nuisances courtes et de faible intensité). A la suite des injections intraveineuses d'agent de contraste d'imagerie sous anesthésie, les animaux peuvent ressentir une douleur légère et de courte durée au site d’injection. La chimiothérapie anti-angiogénique sera administrée par gavage, ce qui peut générer du stress et de l’inconfort de courte durée (nuisance légère). L’injection de cellules tumorales peut provoquer de l’inflammation au niveau de la zone d’injection pouvant induire une irritation (nuisances modérées courtes).

Devenir

A l'issue de ce projet, tous les animaux seront mis à mort afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses ex vivo nécessaires au projet.

Remplacement

Les analyses in vitro ne sont pas suffisantes pour l’étude du lien entre métabolisme et vascularisation tumoraux, ce qui intègre le micro-environnement tumoral. Il est donc très difficile voire impossible de reproduire fidèlement l'ensemble de ces interactions in vitro, dans des modèles de cellules isolées. De plus, les cellules humaines de paragangliomes ne poussent pas en culture in vitro. Il est donc encore nécessaire d’utiliser un modèle de tumeur chez la souris afin de s’approcher au plus des tumeurs humaines. De plus, les méthodes de diagnostique testées dans ce projet sont des méthodes d'imagerie médicale ayant vocation à être appliquées ensuite chez l'homme. Ce projet ne peut donc pas être réalisé in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été évalué d'après nos précédentes études d'imagerie sur ce modèle, qui ont fait l'objet de publication. Nous nous aidons de plus d'une plateforme internet qui propose un outil de calcul statistique pour l'expérimentation animale. Les groupes ont été établis de façon à ce que les résultats obtenus soient suffisant statistiquement pour arriver à des conclusions robustes. Les données générées seront ensuite analysées à l'aide de tests statistiques appropriés.

Raffinement

La procédure chirurgicale sera pratiquée après administration en sous-cutané d’un analgésique 30 min avant la chirurgie. Les animaux sont ensuite endormis et maintenus par anesthésie gazeuse sur un tapis chauffant puis surveillés jusqu’à leur réveil. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été établis pour le suivi de l'état des animaux. Par ailleurs, les animaux seront maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi.

Choix des espèces

Le choix des souris permet d’avoir accès à des animaux constituant un modèle préclinique particulièrement adapté à la réalisation de greffes de cellules et/ou tumeurs humaines ou de souris. Nos lignées cellulaires sont issues de souris ayant un fonds génétique mixte, rendant préférable l’utilisation d’une souris receveuse afin de minimiser le risque de rejet. Enfin, nous disposons au laboratoire de systèmes d’imagerie du petit animal particulièrement adaptés à la souris. Les animaux seront âgés de 7 à 8 semaines (jeunes adultes ayant atteint la maturité ; cet âge correspond à l’âge médian de développement de la maladie chez l’homme). C'est cet âge qui est le plus souvent rapporté dans la littérature pour ce type d'étude, ce qui nous permettra de confronter nos résultats avec ceux d'autres équipes.

Pour mesurer quelles cellules immunitaires entourent une tumeur osseuse selon la quantité d'une protéine de détoxication qu'elle produit, 46 souris reçoivent une injection de cellules d'ostéosarcome dans le muscle de la cuisse. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées pour l'analyse de la tumeur primaire et des poumons. Le porteur annonce des expériences n'excédant pas deux semaines et une tumeur qui gênerait légèrement les mouvements sans entraver l'accès à l'eau ni à la nourriture. La surveillance repose sur un examen clinique et une pesée deux fois par semaine, avec des points limites dont le contenu n'est pas précisé.

Objectifs

Nos travaux précédents ont identifié la corrélation inverse entre le niveau d'expression du gène d'intérêt et la réponse des cellules d'ostéosarcome aux chimiothérapies. La prétine étudiée est une protéine de détoxication, produite par une cellule en présence de composés jugés dangereux tels que la chimiothérapie dans notre cas. Concrètement, elle peut neutraliser physiquement certains composés avant qu’ils puissent agir. Elle est ainsi parfois impliquée dans la résistance aux chimiothérapies. Une autre fonction de cette protéine est de servir de réservoir/distributeur de zinc intracellulaire. Le zinc est essentiel au bon fonctionnement de centaines de protéines cellulaires et en particulier d'une autre protéine, qui joue un rôle clé dans la décision d’induction de mort de la cellule. Nous avons montré que lorsque notre protéine d'intérêt est en grande quantité dans la cellule, elle provoque une déficience en zinc et empêche l'autre protéine d’induire la mort de la cellule tumorale sous chimiothérapie. Nos travaux plus récents suggèrent que la prétéine étudiée peut sortir de la cellule et provoquer une déficience en zinc extracellulaire autour de la cellule. Cela influencerait l'activité des cellules immunitaires au contact de la tumeur, pour favoriser un environnement immunosuppressif. Ce projet de validation préclinique vise à analyser, à l’échelle de la cellule unique, la qualité et quantité des cellules immunitaires au sein de tumeurs exprimant peu ou beaucoup la protéine étudiée. Il permettra de compléter les données déjà obtenues in vitro, et viendra confirmer l'implication de cette protéine dans la tolérance immunitaire des tumeurs d'ostéosarcome. Il informera également des conséquences d’une forte expression de cette protéine sur la possible résistance aux immunothérapies (en essai clinique actuellement).

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des informations clés sur les populations immunitaires sensibles à la présence de la protéine étudiée et orientera sur des possibles résistances aux traitements par immunothérapie. Des stratégies thérapeutiques pourraient alors être envisagées afin d’optimiser les immunothérapies, voire prévenir ou contrebalancer la résistance.

Procédures

L'injection unique en intra-musculaire, dans la cuisse, des cellules tumorales se fera sous anesthésie gazeuse. Les souris ne seront anesthésiées que pendant quelques minutes. Aucun prélèvement ne sera effectué avant euthanasie.

Impact sur les animaux

Nuisances : douleur potentielle après l’injection des cellules tumorales par voie intra-musculaire: modérée au maximum. Effets indésirables : développement tumoral pouvant gêner légèrement les mouvements des souris sans entraver leur déplacement ni leur accès à la nourriture ou la boisson. Aucun effet systémique attendu.

Devenir

Tous les animaux devront être euthanasiés pour analyses des tumeurs primaires et des poumons.

Remplacement

Ce projet nécessite d’utiliser un organisme vivant dont le système immunitaire est intact, complet et fonctionnel. Les relations et communications entre les différentes populations immunitaires sont cruciales pour une réaction complète contre la tumeur. La construction de modèles in vitro ou ex-vivo récapitulant l’ensemble des interactions est actuellement impossible du fait de leur complexité. Des simulations in silico ne sont pas encore possibles car cela nécessite de compiler un grand nombre de données or les ostéosarcomes sont des tumeurs rares, très hétérogènes et encore mal connues. Ce projet fait suite à de nombreuses analyses in vitro ayant apporté des arguments solides en faveur d’une influenced'une protéine d'intérêt sur certaines cellules immunitaires et sur leur comportement vis-à-vis des cellules d’ostéosarcome. Cependant ces expériences in vitro montrent rapidement leurs limites car elles n’impliquent ni l’ensemble des populations immunitaires, ni les interactions dynamiques et temporelles entre les cellules pendant le développement d’une tumeur. Le caractère incontournable du recours à l’animal vivant entier est donc établi. Ceci nous permettra d’étudier la modulation des populations immunitaires dans leur ensemble. Notre modèle cellulaire est une lignée issue d’une tumeur spontanée chez la souris. Cela nous permet d’implanter ces cellules tumorales à des souris de la même espèce c’est-à-dire dont le système immunitaire n’est pas modifié et réagit normalement.

Réduction

Une étude pilote sur un nombre restreint de souris permettra de déterminer le temps optimum pour l'arrêt des procédures, ce qui permettra de limiter le nombre total d'animaux du projet. En second lieu, nous procèderons à l'étude comparative. Afin de n’utiliser qu’un nombre minimal d’animaux tout en gardant une validité statistique de l’étude, nous avons déterminé le nombre mnimal de sujets par groupe. Ce projet utilise un nombre limité d'animaux qui a été soigneusement et scientifiquement déterminé.

Raffinement

Les animaux bénéficieront systématiquement de plusieurs enrichissements. Aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Ce projet fait l'objet de procédures rigoureuses réalisées par un personnel formé et vigilant quant à la détection de points limites (suivi quotidien de l’état de santé des animaux, examens cliniques et contrôle du poids 2 fois par semaine). L’injection des cellules tumorales sera réalisée par une voie qui permet le développement homogène des tumeurs. L’utilisation d’analgésiques limitera toute souffrance aux animaux. Les expériences du présent projet n’excéderont pas 2 semaines. Les animaux feront l'objet d'une surveillance quotidienne et d'examens cliniques adaptés à leur évolution. Des points limites ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Afin d'étudier le comportement du système immunitaire dans un environnement physiologique naturel, nous implantons des cellules tumorales dérivant d'un ostéosarcome spontané chez la souris dans un animal de même espèce et de la même souche : souris de souche Balb/c (= modèle syngénique). Ces animaux sont immunocompétents c’est-à-dire que leur système immunitaire est complet, fonctionnel et non modifié. Les souris seront âgées de 5-7 semaines au début de l’expérimentation. Un âge de jeune adulte améliore en effet la croissance tumorale.

580 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour éviter la souffrance liée à la croissance de la tumeur. Chacune reçoit une injection de cellules de glioblastome humain directement dans le cerveau, parfois accompagnée de la pose d'un implant, avec un suivi par IRM hebdomadaire. Une partie d'entre elles fait, à chaque séance de radiothérapie, un trajet routier de 95 kilomètres entre deux établissements, soit deux heures de transport aller et retour. Le porteur écrit qu'il n'existe "pas d'alternatives ni d'explants, ni d'organoides, ou coupes organotypiques" pour ses questions, après avoir décrit les études protéomiques et la modélisation informatique déjà conduites sur cellules.

Objectifs

L’identification récente de nouvelles "cibles", pouvant constituer de véritables moteurs de la maladie cancéreuse fait naitre de nouveaux espoirs de prise en charge du glioblastome (GB), tumeur du cerveau la plus fréquente et la plus agressive chez l’homme. L'objectif de ce projet est : - dans un premier temps d'étudier la tumorigénicité et la radiorésistance, en utilisant la radiothérapie externe aux rayons X en tant que traitement de référence, des cellules de Glioblastome humaines exprimant ces "cibles" et en parrallèle, de concevoir des thérapies spécifiques dirigés contre ces "cibles" - dans un second temps d'appliquer ces thérapies dans le GB pour anéantir la fonction tumorigénique de ces "cibles". Deux modalités d’administration locorégionale sont envisagées : l’injection directe sur la tumeur en place et l’application d'implants pour une délivrance « long terme » au sein des cavités de résection. Ce projet permettra d’explorer davantage ces "cibles" dans le GB et de qualifier de nouveaux outils afin si possible d’ouvrir la voie à des essais chez l’homme. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (ici référencés EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l'innovation thérapeutique par le ciblage de nouvelles cibles thérapeutiques sur une tumeur en place. Mais également une meilleure compréhension des effets d'implants interventionnels au sein des cavités d'éxérèse dans le glioblastome en synergie avec d'autres thérapeutiques pour une amélioration de la prise en charge de ces tumeurs ultérieurement chez l'homme.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés et soumis à des actes expérimentaux modérées telles que : - l'injection intracérébrale de cellules tumorales (durée d'environ 30 minutes) réalisée à l'EU1 - l'injection intracérébrale de cellules tumorales associée à la pose d'implants (durée d'environ 1h30) réalsiée à l'EU1 - l'injection intracérébrale de thérapies spécifiques (durée d'environ 30 minutes) réalisée à l'EU1. En fonction de la procédure concernée un animal peut subir d'un seul acte jusqu'à 2. Pour toutes les procédures, les suivis IRM (durée d'environ 30 minutes) sont réalisés de manière hebdomadaire à l'EU1. L'un des actes, la radiothérapie externe sera réalisé à l'EU2 et inclut un transport d'environ 95 kilomètres (soit environ 1 heure) pour aller à de l'EU1 à l'EU2 et la même durée pour revenir à l'EU1.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus par les procédures chirurgicales peuvent être comportementales et physiques, exemples : fatigue, stress, réponses au stimulus altérés, mauvaise cicatrisation, perte de poids, prostration... Ces effets indésirables peuvent être présents, plus ou moins prononcés ou même absents selon les procédures subies et les animaux eux-mêmes. L'effet attendu de l'implantation des cellules tumorales est le volume de la tumeur qui peut être plus ou moins important selon les traitements appliqués par la suite aux animaux. Pour plus de détails, voir le tableau des points limites adaptés en annexe 1. En ce qui concerne le transport, celui-ci peut induire une fatigue et un stress nécessitant pour les animaux du repos.

Devenir

Tous les animaux du projet sont mis à mort pour éviter toute souffrance liée à la pousse du glioblastome.

Remplacement

Le projet ici proposé a pour but l’étude de "cibles" et leur ciblage par une thérapeutique innovantes sur tumeur en place et au travers de bio-implants polymères sur cavité d'exérèse pour l’éradication de tumeurs cérébrales. Si sa mise en place nécessite l’utilisation d’animaux dans des modèles dédiés pour valider les étapes finales de caractérisation des "cibles" (tumorigénicité, radiorésistance des lignées) et celle d’élimination (au travers de l’application de procédures de traitement par SiRNA et ASOs sur tumeur en place et sur la cavité d'exérèse), alors de nombreuses étapes amont, ont été réalisées in vitro sur des modèles cellulaires pour répondre aux normes de remplacement. Des études protéomiques et la modélisation informatique de ces données ont été faites sur des cellules hors du contexte animal. Par ailleurs justement pour ces dernière validation dans le contexte réel, il n'y a pas d'alternatives ni d'explants, ni d'organoides, ou coupes organotypiques sur lesquelles nous pourrions répondre à nos questions de tumorigénicité et de réponse au traitement dans le contexte global.

Réduction

En amont de ces expériences chez l'animal, divers essais sur ces lignées cellulaires contrôles et exprimant les "cibles" ont été réalisés limitant aux seuls prototypes utiles alors implantés chez l'animal la réalisation de cette étude. Le nombre d'animaux utilisés a été défini pour pouvoir générer des données statistiquement interprétables.

Raffinement

Les mesures spécifiques pour réduire les nuisances sur le bien-être animal dans les procédures expérimentales incluent : une surveillance accrue, des soins pré et post-opératoires, des mesures de gestion de la douleur, de bonnes conditions d'hébergement, l'enrichissement du milieu. Les mesures de raffinement pour le transport des animaux incluent : l’évaluation de la santé des animaux pour ne transporter que les animaux en bonne santé, le choix des contenants appropriés, la température et humidité contrôlées (véhicules climatisés), l’alimentation et hydratation, la minimisation du stress et la planification de l’arrivée.

Choix des espèces

Nous étudions la tumorigénicité de "cibles" d'intérêts dans des lignées cellulaires humaines qui nécessite donc que ce modèle soit utilisé chez la souris CB17-SCID. Les souris seront utilisés à 8 semaines car elles seront, à ce stade, de jeunes adultes matures.