Souris

188 souris BALB/c reçoivent chacune une injection unique de chimiothérapie, sous la peau du dos rasé ou dans la veine de la queue, sous anesthésie gazeuse. Le protocole consiste à monter les doses sur quatre paliers pour trouver la dose maximale tolérée, celle qui produit l'effet recherché juste avant les effets indésirables jugés inacceptables, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles est saignée par ponction cardiaque après injection d'une dose létale de pentobarbital, la mort étant achevée par élongation cervicale, les autres tuées pour prélever les organes et la zone d'injection. Le porteur met en avant une administration sous-cutanée plus confortable pour le patient et bien moins coûteuse que les chimiothérapies actuelles.

Objectifs

L’administration de médicaments anticancéreux par voie sous-cutanée est actuellement limitée par leur faible solubilité, leur viscosité et leur toxicité au niveau du site d’injection (irritations voire nécroses cutanées). Nous proposons dans ce projet une nouvelle approche permettant d’administrer efficacement par voie sous-cutanée des chimiothérapies anticancéreuses déjà présentes sur le marché. Nous avons en effet développé une technologie innovante qui consiste à coupler un agent de chimiothérapie existant, la Vinblastine, à une succession de molécules pour le rendre soluble et injectable par voie sous-cutané. L’objectif de cette étude est d’étudier la toxicité et la distribution dans l'organisme de cette prodrogue de Vinblastine administrée par voie sous-cutanée (SC), comparativement à la Vinblastine seule, administrée en intraveineuse (IV). L’étude de toxicité a pour objectif de déterminer la dose maximale tolérée (DMT, dose la plus élevée qui produira l’effet souhaité sans entrainer d’effets indésirables inacceptables) par voie SC de la prodrogue de Vinblastine, et de vérifier qu’elle n’induit pas de toxicité au niveau du site d’injection. L’étude de pharmacocinétique permettra de vérifier qu’il est possible d’avoir une exposition au principe actif comparable à la voie intraveineuse, et donc une efficacité thérapeutique similaire.

Bénéfices attendus

L’objectif de cette étude est de démontrer l’innocuité de la prodrogue polymère de Vinblastine administrée par voie sous-cutanée (SC) et de comparer son profil pharmacocinétique à celui de la Vinblastine libre administrée en intraveineuse (IV). De tels résultats permettraient d’envisager la délivrance des principes actifs anticancéreux par voie sous-cutanée, qui seraient à la fois efficace, confortable pour le patient et bien moins couteuse dans son utilisation que les chimiothérapies actuelles.

Procédures

Chaque souris recevra une seule injection de la prodrogue polymère par voie sous-cutanée sous anesthésie gazeuse (sévofluorane 3%) dans la région dorsale préalablement rasée ou de la Vinblastine libre en intraveineuse sous anesthésie gazeuse (sévofluorane 3%). Cette intervention durera environ 10 minutes, anesthésie comprise. Certaines souris subiront également un prélèvement sanguin terminal effectué par ponction cardiaque après injection d’une dose léthale d'anesthésique de pentobarbital, un anesthésique puissant, et la mise à mort de l'animak sera confirmée par élongation cervicale. Cette intervention durera environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances suivantes sont attendues : - L'anesthésie par cage à induction qui pourrait entrainer un stress de l'animal avant endormissement. - Les injections de la vinblastine en intraveineuse dans la veine de la queue et de la prodrogue en sous-cutané, qui pourraient causer une gène ou une inflammation au niveau du site d'injection - Les pesées qui peuvent entrainer un stress chez l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de prélever les organes et la zone d'injection pour des études histologiques afin de vérifier l’absence de toxicité systémique et de toxicité locale aigue (procédure 1) ou pour effectuer des prélèvements sanguins terminaux (procédure 2).

Remplacement

Les médicaments, durant leur transport dans l’organisme, vont interagir avec les éléments du système immunitaire et être soumis à une métabolisation (hépatique, rénale, …) qui peut provoquer l’apparition de métabolites pouvant être plus ou moins actifs voire toxiques. Cette chaine de phénomènes complexes ne peut pas être modélisée ou mimée in vitro. Il est donc nécessaire de mener ces études sur des animaux vivants pour reproduire tous ces processus et évaluer la toxicité et la fraction de substance active qui arrive dans le sang.

Réduction

Les études préliminaires in vitro ont permis le criblage de différentes formulations dont une seule sera testée in vivo, permettant ainsi une réduction du nombre d’animaux nécessaires dans cette étude. Une planification statistique minutieuse permet aussi de réduire le nombre d’animaux tout en préservant la validité statistique de l’étude. La DMT de la prodrogue sera déterminée en testant des doses croissantes de prodrogue à partir de la dose équivalente à la DMT par voie IV de la molécule libre (connu dans la littérature) car la prodrogue polymère est censée avoir une DMT supérieure à celle de la molécule libre. Quatre doses seront testées au maximum, nous nous arrêterons avant si la DMT de la prodrogue est atteinte. Le dimensionnement des groupes a été déterminé par un test de puissance (erreur de 5% et puissance de 80%) qui permet de mettre en évidence une perte de poids de 10% avec une variabilité de 10% avec 4 animaux par groupe. La DMT du principe actif libre, bien décrite dans la littérature, ne sera testée qu’à deux doses maximum pour tenir compte de la variabilité inter-souche. Pour la pharmacocinétique de libération du principe actif, une seule dose sera testée pour déterminer quelle est la prodrogue qui permet une libération optimale du principe actif dans le sang. La prodrogue polymère et la molécule libre seront administrées à une dose équivalente permettant leur détection pendant 48 à 72 heures, afin de pouvoir comparer la cinétique de la molécule libre et de la prodrogue. Nous cherchons à mettre en évidence une augmentation du temps de présence de la molécule dans l'organisme. Le nombre d’animaux nécessaire (erreur 5%, puissance 90%) a été évalué à 4 animaux par groupe. L’analyse statistique des données sera effectuée avec un test non-paramétrique.

Raffinement

Dans notre laboratoire, les animaux en provenance des centres d'élevage sont pris en charge dès leur arrivée (environ 8 jours avant le début de l'expérimentation), jusqu'à l'euthanasie. Le bien-être animal sera respecté : -Conditions d’hébergement adaptées : nourriture et eau à volonté, température constante de 20°C et mise en place d’un cycle jour/nuit inversé par période de 12 heures. -Temps d’acclimatation de 8 jours avant toute procédure -Souris hébergées en groupes (6 par cage) -Enrichissement des cages : dômes (Plast Hut) et cotons prédécoupés spécifiques (Cell Nest) -Définition des points limites et évaluation quotidienne des signes de douleurs (difficultés respiratoires, prostration, atonie, défaut d’alimentation, isolement, ou tout autre signe physique tel que la position des oreilles ou des vibrisses). La définition exacte des points limites se trouve dans une grille des scores de la douleur, qui évalue le bien-être animal sur chacun de ces points et décrit la conduite à tenir en fonction de l’état de l’animal (par exemple augmentation de la fréquence du suivi, utilisation d’analgésique…). De plus, toutes les procédures se feront sous anesthésie pour éviter toute forme de douleur.

Choix des espèces

Pour la réalisation de nos études, nous utiliserons des souris BALB/c. Les souris BALB/c sont un bon modèle car elles sont blanches et permettent de suivre plus facilement les apparitions de nécroses ou d’irritations au niveau cutané. Les premières études ayant été réalisées sur cette souche, cela nous permettra aussi de comparer les résultats. Nous utiliserons des souris jeunes adultes de 7-10 semaines qui ont un système immunitaire mature et des fonctions physiologiques bien établies.

Gavées chaque jour pendant trois semaines, irradiées, greffées par injection dans le sinus de l'œil ou dans la veine de la queue, 1 048 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Un amendement ajoute à 400 d'entre elles une greffe sous-cutanée de cellules tumorales, suivie de deux séances d'imagerie par semaine pendant vingt et un jours et de mesures de la tumeur au pied à coulisse trois fois par semaine. Le projet vise à accélérer la reconstitution du système immunitaire après greffe de cellules souches chez des malades du sang, en la ramenant de deux ans à trois mois. Pour ces souris porteuses de tumeurs, le porteur annonce des points limites entraînant une mise à mort anticipée, sans préciser lesquels.

Objectifs

La greffe de cellules souches offre des perspectives de guérison aux patients atteints d’hémopathies malignes (cancer du sang) et à d'autres troubles hématologiques comme les déficits immunitaires. La transplantation avec des cellules souches peut être autologue (provenant des propres cellules du patient) ou allogénique (provenant d’un donneur sain et compatible avec le receveur). La greffe allogénique est limitée par le manque de donneurs compatibles. Lorsqu’un patient est atteint d’un cancer du sang, celui-ci subira des chimiothérapies et/ou irradiation réduisant à néant son système immunitaire avant d’être injecté par des cellules souche. Mais la durée de restauration d’un système immunitaire efficace et fonctionnel après la greffe peut aller jusqu’à deux ans. Durant cette période, le patient n’a pas d’immunité pleinement fonctionnelle et peut contracter de multiples infections représentant une des principales causes de mortalité. Nous proposons de réduire cette période de risque chez les patients en proposant une approche thérapeutique innovante pour accélérer la reconstitution d’un système immunitaire fonctionnel. De cette façon, le délai de reconstitution est réduit à 3 mois (au lieu de deux ans) permettant de réduire les durées d’hospitalisation et les risques d’infections opportunistes. Dans cette perspective, les résultats précliniques doivent être consolidés par des données pharmacologiques dans un modèle murin adulte mimant la condition clinique des patients. La souris représente un modèle pertinent pour l’étude. Ces souris nécessitent un conditionnement par chimiothérapie et/ou irradiation comparable à ceux utilisés chez les patients avant d’être greffés. Ces souris représentent un modèle indispensable afin de tester in vivo les stratégies thérapeutiques proposées dans des conditions similaires à celles utilisées chez les patients. Il s’agit d’une étape indispensable à l’application de nouvelles stratégies innovantes dans les protocoles cliniques. Le projet se déroulera sur deux EU différentes.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de valider et de justifier la mise en place d'une stratégie thérapeutique utilisant l’injection de cellules immunitaires pour lutter contre les cancers du sang. L’acquisition de ces données est indispensable au développement de cette thérapie innovante, à fort potentiel translationnel. De plus, les études de régénération d’un thymus chez les souris âgées peuvent ouvrir la voie à une nouvelle perspective thérapeutique chez les patients souffrant de complications liées au processus de vieillissement, au SIDA, ou aux radiations dues à une catastrophe nucléaire. En effet, dans tous les cas cités, les personnes sont susceptibles de perdre leurs systèmes immunitaires et l’approche thérapeutique proposée permettrait de régénérer de façon rapide et efficace une défense immunitaire fonctionnelle. AMENDEMENT : Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des progéniteurs lymphoïdes qui pourront avoir un éventuel effet antitumoral.

Procédures

Les interventions se limiteront à : 1. Irradiation : L’irradiation durera moins de 5 minutes sur les animaux vigiles. 48 souris seront irradiées 1 fois (EU1). 2. Une seule injection intraveineuse dans le sinus orbitale gauche et/ou droit sous anesthésie générale. L’injection durera 1 minute / animal sur 128 souris (EU1) 3. Une injection intraveineuse dans la veine caudale de la queue des souris vigiles maintenues dans un tube de contention. L’injection durera

Impact sur les animaux

De façon général, les médicaments de chimiothérapies et/ou irradiation peuvent occasionner chez l'animal des symptômes cliniques de type amaigrissement et anémie. Les injections peuvent provoquer une légère douleur localisée et un stress nécessitant une anesthésie générale au préalable. Le gavage peut provoquer un stress et une douleur au niveau de l’œsophage chez l’animal. AMENDEMENT : L’injection sous-cutanée de tumeurs peut entrainer un stress ou une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. La manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse peut également induire un stress chez les animaux. Le transport entre les deux animaleries peut également engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérience pour le prélèvement et l’analyse des organes nous permettant de conclure sur l'efficacité du traitement.

Remplacement

Des études de différenciation in vitro ont été réalisées afin d’optimiser les conditions de préparation des cellules à injecter et de s’assurer de leur potentiel à donner des cellules fonctionelles. Les expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus expérimental de mises au point. Les études précliniques de pharmacologie (mode d’administration, effet dose-réponse, efficacité de colonisation du thymus âgés) sont demandées par les autorités règlementaires avant les essais cliniques et ne peuvent pas être substituées ou mimés in vitro.

Réduction

La méthode de chimiothérapie et/ou irradiation la plus adaptée sera préalablement choisie avant les études de dose réponse. Ces études permettront de choisir une condition de greffe optimale et ainsi de diminuer les échecs de greffe. Le modèle animal choisi et le plan expérimental sont inspirés de plusieurs études similaires très bien documentées dans la littérature. Cela confirme la pertinence du modèle expérimental et renforce la validité de nos hypothèses évitant des étapes intermédiaires de mise au point chez l’animal. Le nombre d’animaux par groupe dans les différentes procédures a été calculé selon une méthode fiable et très utilisée dans la littérature permettant de fournir des données statistiquement exploitables. Les expérimentations seront regroupées au maximum et dans la mesure de la faisabilité technique, afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Une partie des animaux pourra ne pas être utilisée en fonction des résultats obtenus pour permettre l’ajustement de la dose des traitements (168 souris potentielles). AMENDEMENT : L’utilisation de l’imagerie permet une surveillance non invasive de la croissance tumorale en évitant la mise à mort sequentielle d’animaux.

Raffinement

Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés dans des cages enrichies à l’aide de coton de nidification et de rouleaux en carton pour favoriser les cachettes et le jeu. Le nombre de souris sera limiter à 5 animaux par cage. Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de l'étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés. La mise à mort sera précédée par une anesthésie générale pour éviter le stress et la souffrance. Nous n’attendons aucun phénotype dommageable ou souffrance à l’issue de la greffe des cellules immunitaires au sinus retro-orbital chez les animaux greffés. Toute chimiothérapie et/ou irradiation sera suivie rapidement par une greffe de cellules et toute manifestation de signes de douleur sera scrutée selon les critères de définition des points limites de la présente étude. En cas de signe de souffrance et selon les résultats de la grille préétablie, le personnel qualifié et le responsable scientifique de l’étude pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de la mise à mort de l'animal. AMENDEMENT : Des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Lors du transfert, les souris seront transférées dans des boites de transport avec de l’enrichissement et de la nourriture, les 2 établissements étant sur le même palier. Des mesures analgésiques adaptées seront mises en œuvre avec le vétérinaire pour limiter la douleur.

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement du systéme immunitaire. En effet, le système immuno-hématologique murin est très similaire au système humain dans sa fonctionnalité et son développement permettant une extrapolation des résultats obtenus. Cette espèce est facile à élever en animalerie et présente une grande homogénéité génotypique. Souris adultes de 6 à 12 semaines (et souris adultes âgées de plus de 9 mois) car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier son développement.

Les souris sont tuées quand le volume de leur tumeur atteint le maximum toléré, ou plus tôt en cas de nécrose ou d'ulcération de la tumeur, de poil hérissé, de dos voûté ou de déshydratation. 1 466 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur système immunitaire est d'abord affaibli par une irradiation à 2 grays ou neuf jours de gavage à la ciclosporine, avant la greffe de cellules tumorales humaines et des prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie. Le porteur affirme que la croissance tumorale ne semble pas induire de douleur jusqu'à cette limite, tout en citant la nécrose et l'ulcération parmi les motifs d'arrêt.

Objectifs

Les lymphomes cutanés à cellules T (CTCL) touchent environ 1/100 000 adultes chaque année. On estime que l’incidence a triplé en 30 ans. Des données préliminaires ont démontré que deux traitements (anti-CCR8 et anti-PAR2) sont capables de recruter des cellules immunitaires ce qui permet d’induire la mort des cellules tumorales. Pour aller en phase I d’essai chez l’Homme, nous devons tester l’efficacité de ces traitements sur des souris. Pour cela nous devons avoir une souris qui possède un système immunitaire (nos deux traitements reposent sur une coopération avec le système immunitaire) et qui permet une prise des cellules tumorales dans l’organisme. Nous allons tester 3 modèles de souris différents pour réussir à avoir des souris xénogreffées avec un système immunitaire. Nous testerons les 3 possibilités et nous garderons in fine qu’une seule de ces 3 méthodes en fonction des résultats (prise de la greffe, nombre de cellules immunitaires). Nous testerons ensuite les deux traitements, ciblant CCR8 ou PAR2, sur le modèle le plus efficace. Le but de ce projet étant de prouver, in vivo, l’efficacité de ces nouveaux traitements contre les lymphomes cutanés à cellules T.

Bénéfices attendus

Le projet vise à proposer des immunothérapies innovantes pour les lymphomes cutanés à cellules T). Les lymphomes sont des maladies rares avec un manque de traitements. Ce projet nous permettra de démontrer l’efficacité de ces deux traitements grâce aux cellules immunitaires présentes dans ces souris qui permettent de détruire les cellules tumorales liées aux anticorps que nous testons. Si les résultats sont concluants, et en association avec les résultats de toxicologie, ce projet pourra conduire à un essai de phase I d’essai chez l’Homme.

Procédures

Pour réussir à greffer des cellules tumorales dans des souris, nous allons devoir diminuer le système manière de façon transitoire, pour cela nous irradierons les souris. Pour visualiser l’effet des traitements sur les cellules tumorales, nous allons prélever de façon hebdomadaire 75uL de sang. Pour cela, les souris seront préalablement anesthésiées pour réduire leur douleur.

Impact sur les animaux

Dans notre protocole, soit nous irradions des souris, soit nous injectons de la cyclosporine par gavage pendant 9 jours avant la greffe de cellules tumorales humaines. Les souris seront irradiées une fois 24h ou 48h avant la greffe à 2 grays. Cette faible dose de radiation induit une perte de poids à 7-10 jours avant que les souris reprennent leurs poids initiaux. Selon la littérature, cette dose n’affecterait pas la durée de vie de la souris. Si le protocole d’irradiation ne fonctionne pas, nous allons traiter les souris oralement avec de la cyclosporine. Le gavage se fera sur souris anesthésiées par isoflurane. Il est attendu une perte de poids au jour 5 avant un retour aux poids initiaux à jour 12. Ensuite, nous injecterons des cellules tumorales humaines aux souris en intrapéritonéales. Au bout de 2 semaines nous prévoyons la formation de tumeur. Nous injecterons en intrapéritonéale des cellules immunitaires ce qui provoquera une douleur modérée. Dans toutes les contritions, nous injecterons les deux traitements en intrapéritonéale ce qui provoquera une douleur modérée. Nous arrêterons le protocole quand le volume de leur tumeur sera trop important ou que l’animal présente des signes de mal-être (poil hérissé, dos vouté, déshydratation) ou en cas de nécrose ou d’ulcérisation des tumeurs. Nous prélèverons du sang toutes les semaines pour doser les cellules tumorales circulantes dans le sang. Les souris seront alors anesthésiées et 75uL de sang sera prélevé de façon hebdomadaire.

Devenir

Pour l'ensemble de ces procédures, les souris seront mises à mort quand le volume tumoral attendra le maximum tolérable. À noter, ces modèles de lymphome sont largement documentés et la croissance tumorale ne semble pas induire de douleur pour l'animal jusqu'à cette limite. En cas de non-développement ou de régression de la tumeur, les souris seront conservées pour une durée de 6 semaines après traitement (durée la plus couramment publiée) puis mis à mort pour analyse.

Remplacement

Nous utilisons différentes lignées humaines de lymphomes ainsi que des cellules de patients. Ces cellules nous ont permis d’obtenir nos données préliminaires, et de confirmer l’activité anti-tumorale des anticorps en question. Nous devons donc maintenant tester les deux traitements dans des modèles in vivo. Pour cela nous souhaitons utiliser deux modèles de souris immunodéficientes pour confirmer l’intérêt thérapeutiques des anticorps et leur capacité à induire une forte régression tumorale. Nous pourrons également obtenir par ces modèles, des données pharmacocinétiques (demi-vie de l’anticorps, concentration dans le sang) et des données d’histopathologie. Cela nous permettra ainsi d’aller en essai de phase I chez l’Homme.

Réduction

Pour limiter le nombre de souris utilisées, des tests préliminaires in vitro ont été fait pour démontrer l’effet des deux traitements sur des lignées cellulaires. Ces tests nous ont permis d'évaluer l'efficacité et la toxicité des traitements et de sélectionner les combinaisons les plus prometteuses, réduisant ainsi le nombre de tests nécessaires sur les souris. Pour déterminer le nombre de souris nécessaires, nous avons utilisé des calculs statistiques ce qui nous a permis de déterminer le nombre de souris par groupe par traitement. Ainsi, nous avons besoin d'au moins 11 souris par groupe pour garantir la validité des tests.

Raffinement

Afin de limiter la douleur des animaux, des points limites précis ont été définis (volume maximum de la tumeur, perte de poids...). Aussi, lors des phases d'implantation de cellules tumorales dans des souris, les souris seront anesthésiées sous isoflurane. Nous mettons en place des conditions d'hébergement optimales et des stratégies de raffinement rigoureuses pour améliorer le bien-être des souris. Les cages sont spacieuses et équipées de litières absorbantes et non toxiques, renouvelées régulièrement pour assurer un environnement propre. Nous fournissons également des enrichissements environnementaux, tels que des tunnels, des roues d'exercice, et des matériaux de nidification, pour favoriser les comportements naturels et réduire le stress. Les souris sont maintenues à une température et une humidité contrôlée, avec un cycle lumière/obscurité approprié pour respecter leur rythme circadien. De plus, nous effectuons des évaluations régulières de la santé et du comportement des animaux, et ajustons les conditions d'hébergement en fonction des besoins spécifiques identifiés. Ces pratiques de raffinement sont essentielles pour garantir le bien-être des souris tout en obtenant des résultats expérimentaux fiables et reproductibles.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris pour vérifier l’efficacité des traitements et obtenir des données pharmacocinétiques. Cela permet de voir si les traitements vont diminuer la taille des cellules tumorales. Toutes les études préliminaires ont été mises en place sur des cellules de patients ou des lignées cellulaires. Les souris sont génétiquement modifiées pour être partiellement ou totalement immunodéficientes ce qui permet de greffer de tumeurs humaines, y compris les lymphomes T humains et d'éviter les réactions de rejet de greffes. Nous allons sélectionner des jeunes adultes de 6 à 10 semaines. Ces souris ont fini leur croissance et refléteront au mieux la physiopathologie du lymphome cutané à cellules T dont les tumeurs surviennent principalement chez l'adulte. La standardisation de l'âge permettra une meilleure reproductibilité expérimentale.

Chaque souris peut recevoir jusqu'à quatre-vingt-dix injections dans l'abdomen et quatre-vingt-dix gavages au cours d'une même procédure, plus dix prélèvements sanguins, un prélèvement dans le fémur et une greffe de cellules leucémiques par voie rétro-orbitale. 668 souris sont utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur range ces effets parmi une gêne oculaire, un boitement transitoire et une gêne transitoire. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour prélever leurs organes, la mort étant confirmée par l'absence de réflexes et de signes cardiaques.

Objectifs

La Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) est un cancer du sang dû à l’apparition d’une anomalie dans la cellule souche sanguine, cellule à l’origine des différentes cellules du sang. Cette anomalie entraîne une sur-production de globules blancs (un des premiers symptômes de la LMC). Dans les années 2000, des médicaments ont été développés et permettent d’empêcher la sur-production de globules blancs. Ces traitements ont été révolutionnaires mais ils provoquent chez certains patients des effets secondaires tels que des nausées, des douleurs musculaires, des œdèmes ou des diarrhées. Des essais cliniques visant à arrêter le traitement après plusieurs années ont permis de montrer que 40% des patients restent sans traitement et sont donc guéris. Cependant, 60% des patients rechutent démontrant la persistance de cellules souches sanguines leucémiques dans leur moelle osseuse qui n’ont pas été éliminées par le traitement. Ce médicament seul ne suffit donc pas. Notre but est d’identifier et les cellules souches leucémiques qui persistent lorsque l’on traitera nos souris avec les médicaments utilisés chez l’homme. Puis, nous essaierons de trouver de nouveaux médicaments qui pourraient éliminer ces cellules souches leucémiques persistantes.

Bénéfices attendus

Modéliser la leucémie myéloïde chronique est un enjeu majeur pour « guérir » la LMC dans les années à venir. En effet, ce modèle va permettre d'identifier et caractériser les cellules souches leucémiques persistantes à l’origine des rechutes observées dans les études d’arrêt de traitement et trouver d’autres médicaments.

Procédures

Prélèvements sanguins sur animaux vigiles – 5 à 10 fois/procédure – durée 1min Prélèvements intrafémoraux sur animaux anesthésiés – 1 fois par procédure – durée

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un stress dû à la contention/préhension des animaux, 2/ une gêne oculaire suite à l’injection en retro-orbitale pour les greffes, 3/ un perte de poids transitoire lors des traitements, 4/ un boitement transitoire lors des prélèvements intrafémoraux 5/ une gêne transitoire lors des injections intrapéritonéales. 6/ Les animaux peuvent subir une perte ou une prise de poids transitoire en fonction des traitements. 7/ potentiels effets secondaires des molécules injectées.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort par du personnel expérimenté afin de prélever les organes cibles et ainsi réaliser les analyses phénotypiques, moléculaires et histologiques nécessaires à la conclusion de l'étude. La mort des animaux sera confirmée par l’absence de réflexes, de signes respiratoires et cardiaques.

Remplacement

Les leucémies sont des modèles intégrés qui font intervenir un grand nombre de mécanismes physiologiques et de tissus avoisinants qui ne peuvent être modélisés in vitro. Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel pour cette dernière étape : le modèle animal. Cependant, des analyses ex vivo réalisées à partir de moelle osseuse provenant de nos souris leucémiques nous ont permis de valider et déterminer l’efficacité des différents traitements seuls ou en combinaison et de ne choisir que les plus efficaces pour les traitements in vivo.

Réduction

Nous combinerons nos lots témoins dans le but de restreindre le nombre d’animaux. Les lignées transgéniques utilisées comportent 1. des systèmes inductibles qui vont permettre à la fois d’induire l’expression des transgènes dans un tissu spécifique mais également à un temps donné et 2. des systèmes rapporteurs fluorescents qui vont permettre d’analyser finement et spécifiquement l’évolution des cellules leucémiques et ainsi permettre de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé pour chaque expérience en utilisant un test de puissance et des tests statistiques seront utilisés post expérimentation pour évaluer la significativité de nos résultats.

Raffinement

Les lignées transgéniques utilisées comportent des systèmes rapporteurs fluorescents qui vont permettre d’analyser finement et spécifiquement l’évolution des cellules leucémiques et ainsi permettre de détecter l’apparition de cellules leucémiques très précocement ce qui permettra d’améliorer le bien-être animal par une prise en charge plus rapide. Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, Les animaux recevront des analgésiques et des anesthésiques en pré et/ou post opératoire Les animaux recevront une surveillance quotidienne et des soins adaptés (mesure hebdomadaire du poids des souris, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt).

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. C’est la raison pour laquelle l’ensemble des techniques de la transgénèse chez les mammifères a débuté chez la souris. De surcroit, toute la collection des systèmes inductibles nécessaires à nos études n’existe que chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 12 semaines lorsqu’elles ont atteint leur maturité sexuelle.

Dès l'âge de 4 ou 6 semaines et jusqu'à 60 semaines, des souris, des rats et des hamsters dorés reçoivent une alimentation hypercalorique, avec ou sans boissons enrichies en fructose, en éthanol ou en composé pro-inflammatoire, pour provoquer obésité, diabète ou stéatose du foie. 4 750 rongeurs, soit 2 750 souris, 500 rats et 1 500 hamsters dorés, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent les composés testés une à deux fois par jour, par la bouche, sous la peau, dans l'abdomen ou dans une veine sous anesthésie, subissent trois prises de sang et passent à trois reprises 40 heures seuls en cage sans enrichissement, et 24 heures sur grille en cage métabolique en fin de projet. Le porteur retient le hamster parce qu'il "consomme spontanément" l'éthanol, et invoque la hausse de la consommation d'alcool depuis la pandémie de COVID-19. En fin de projet, tous sont tués pour prélever leurs tissus et leur sang.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. En outre, ces modèles animaux ne tiennent pas compte du fait que les patients atteints de NASH consomment également de l'alcool. Il a été démontré que la consommation d'alcool favorise la progression de la NASH vers des formes plus sévères. De plus, cette consommation d'alcool a considérablement augmenté dans la population générale depuis la pandémie de COVID-19, à cause des périodes de confinements. Par conséquent, il est important d'inclure la contribution de l'alcool dans les complications hépatiques liées à l'obésité et la NASH afin de mieux modéliser le contexte humain. Si les modèles d'alcool chez le rat ou la souris ne sont pas très pertinents car ces deux espèces ne sont pas naturellement attirées par l’alcool, le hamster est un modèle intéressant car il consomme spontanément et métabolise efficacement l'éthanol. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés, a lieu dans la poche pré-gastrique. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques chez la souris, le rat et le hamster, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en éthanol et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Trois prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (en début, milieu et fin de projet) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectué la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement. Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons le débit de filtration glomérulaire (GFR) en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. La GFR consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies et les GFR, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique.

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal ne suit pas la courbe de poids attendue, une recherche approfondie d’éventuels symptômes sera faite. Les points limites de ce projet seront les suivants : absence de mouvement, piloérection et dos courbé. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas dans les 48 heures, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront. Si un animal atteint l'un des points limites, il sera euthanasié immédiatement. Pendant la phase de traitement, si la perte de poids est supérieure à 20% en l'espace de 3 jours et associée à d'autres signes tels que la prostration, le dos courbé et l'absence de toilettage, l'animal doit être euthanasié ou la dose et la fréquence de traitement adaptées.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques. Les hamsters présentent un métabolisme du cholestérol et des acides biliaires semblable à celui des humains. Les rats et les hamsters peuvent aider à étudier les effets de médicaments potentiels pour les complications cardiovasculaires (dysfonctionnement diastolique) et rénales. Chez les hamsters, la combinaison d'un régime riche en graisses, en cholestérol et en fructose et de la consommation d'alcool peut imiter le mode de vie de certains patients atteints de NASH, notamment pendant et après le confinement lié à la pandémie COVID-19. Si le modèle associé à la consommation d'alcool chez le rat ou la souris n'est pas très pertinent, le hamster est un modèle intéressant car il consomme et métabolise l'éthanol très facilement. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés a lieu dans la poche prégastrique. Les animaux sont utilisés à partir de 4 ou 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.

Toutes tuées à l'issue pour que leur cerveau soit analysé, 400 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cent d'entre elles reçoivent deux chirurgies cérébrales successives, lésionnelle puis implantation de sondes, de deux à deux heures trente chacune, espacées de dix jours. Suivent trente jours d'hébergement individuel, la coupe des vibrisses et une restriction alimentaire d'une vingtaine de jours qui les ramène à 85 % de leur poids initial, condition posée par le porteur pour qu'elles exécutent la tâche comportementale. Il affirme que ces mécanismes ne peuvent s'étudier que chez des animaux vigiles et qu'aucun modèle in vitro ne peut être utilisé ici.

Objectifs

La prise de décision dirigée par la perception est le processus par lequel les informations sensorielles entrantes sont intégrées par le cerveau afin de guider le comportement de l’individu en produisant une réponse motrice appropriée. Chez les rongeurs, il apparaît de plus en plus clairement que cette intégration des fonctions sensoriels et de la motricité fait intervenir deux zones cérébrales clés. La première zone est la partie du cerveau qui reçoit les informations sensorielles provenant des moustaches. La deuxième zone est la partie qui va planifier et organiser les mouvements. Elle est impliquée dans la sélection et l’exécution des commandes motrices. La première zone quant à elle constitue un système sensoriel important pour les rongeurs permettant de collecter les informations sensorielles de l’environnement. Les rongeurs ont en effet développé un système sensoriel complexe et utilisent de préférence leurs moustaches pour explorer leur environnement tactile immédiat. Pourtant, on ne sait toujours pas à ce jour comment ces deux zones cérébrales interagissent pour assurer une prise de décision adaptée en réponse à la perception de l’environnement. Par ailleurs, la plupart de nos connaissances proviennent d'études utilisant des tâches comportementales peu naturelles (avec immobilisation de la tête de l’animal par exemple). De plus le rôle de ces zones cibles et de leur interaction dans des conditions qui reproduisent ce qui se passe dans la nature de façon éthologiques reste à ce jour inconnu. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Ce projet est avant tout un projet de science fondamentale. Il vise à comprendre au niveau cellulaire les principes de l’intégration des informations sensorielle et motrice qui permettent l’adaptation de la prise de décision en réponse à la perception de l’environnement. Tout cela dans un contexte environnemental le plus éthologique possible. Au-delà de cet aspect fondamental, le projet vise à explorer des problématiques que l’on retrouve en clinique. En effet, l'accent mis sur la prise de décision au cours d’une tâche ayant une vraie valeur éthologique dans un environnement naturel est central dans les neurosciences cognitives modernes, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre la tâche comportementale proposée est une caractéristique frappante de plusieurs troubles moteurs et perceptifs. Le projet est donc particulièrement bien placé pour dessiner les bases d'études plus appliquées, en reliant notamment les techniques de neurosciences les plus récentes aux processus cognitifs essentiels. Enfin, le projet est à la pointe de nombreuses techniques expérimentales, allant de modèles comportementaux innovants à la neuroanatomie avancée et l’étude des signaux électriques générés par l'activité des neurones pendant la prise de décision.

Procédures

Les animaux seront d’abord acclimatés à leur hébergement dans le premier établissement utilisateurs pendant 2 jours. Puis les animaux seront soumis à une neurochirurgie lésionnelle et/ou implantatoire de sondes. Ces chirurgies se feront sous anesthésie et dureront chacune entre 2h et 2h30. 75 animaux auront une chirurgie lésionnelle, 150 animaux auront une chirurgie implantatoire, et 100 animaux auront ces deux chirurgies (lésionnelle et implantatoire). 75 animaux auront une injection de solution saline pour servir de contrôle. Un intervalle de 10 jours sera respecté entre chaque chirurgie lorsqu'il est nécessaire de faire une chirurgie lésionnelle puis de faire une chirurgie implantatoire. Après 10 jours de récupération et de surveillance post-opératoire, les animaux seront déplacés dans le deuxième établissement utilisateurs puis acclimatés à leur nouvelle animalerie pendant 10 jours. Ensuite, les animaux seront soumis à une restriction alimentaire qui durera une vingtaine de jours. Pendant ces 20 jours les animaux auront l’étape de comportement avec 3 phases : l’habituation (5 jours), l’apprentissage (5 jours) et le contrôle (5 jours). La finalité des tests comportement est d’étudier la prise de décision lorsqu’elle est dirigée pas la perception. Pour la phase d’habituation les animaux auront des essais durant 30 minutes. Pendant la phase d’habituation et de contrôle, les animaux auront 60 essais par jour ce qui représentera environ 2 heures par jour. Les animaux seront hébergés de façon individuel après la chirurgie pour éviter tout arrachement des sondes pendant 30 jours.

Impact sur les animaux

Le projet peut induire des effets indésirables sur les animaux, listés ci-dessus. ● Le risque de douleur durant la chirurgie. ● Le risque de douleur aiguë lié à la récupération post-opératoire. ● Le risque d’infection des implants. ● Le risque de stress lié à l’hébergement individuel après la chirurgie.● Le contrôle des apports caloriques en régulant la quantité de nourriture disponible, nécessaire à l’exécution de la tâche comportementale, sera limitée pour qu’elles atteignent 85% de leur poids initial, soit une réduction maximal de 15%. •La coupe des vibrisses.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issu des procédures. La mise à mort des animaux sera nécessaire pour réaliser des contrôles d’immunohistochimie sur les cerveaux.

Remplacement

Par définition, les mécanismes neuronaux de la prise de décision perceptuelle ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Cela est d’autant plus vrai dans le cadre d’expérimentation avec une forte valeur éthologique ajoutée. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici.

Réduction

Les techniques expérimentales utilisées ici permettent de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groupes expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques.

Raffinement

Une grille de notation sur le comportement de construction du nid chez la souris sera réalisée comme un indicateur du bien-être. En effet, lors de stress, de douleur ou de mal être chez la souris la construction des nids est affectée. Cette évaluation permettra d’alerter ou d’identifier un mal-être ou une douleur éventuelle lorsque la qualité du nid est altérée. Elle permettra également de témoigner d’un bien-être lorsque le nid est de bonne qualité. Les animaux sont hébergés et manipulés dans le cycle jour/nuit inversé correspondant à leur phase d’éveil/sommeil. En effet, les souris sont des animaux nocturnes. Pour respecter leur rythme de vie et les manipuler lorsqu’ils sont réveillés, le jour ils seront donc dans l’obscurité avec lumière rouge (non visible pour eux) et la nuit hébérgés avec de la lumière. Les tests comportementaux sont ainsi réalisés lors des phases actives des souris et elles ne sont pas dérangées lors de leurs phases inactives. Les résultats avec des souris en cycle jour/nuit inversé seront plus pertinents sur le plan éthologique et fourniront des données plus fiables si elles sont menées pendant la phase nocturne, alors que les souris sont normalement éveillées et actives. Les tests comportementaux ont également été raffinés pour étudier des comportements de prise de décision éthologique (qui existent effectivement dans la nature) dans des conditions quasi-naturelles au sein même du laboratoire. Le projet comprend des chirurgies qui se feront sous anesthésie générale avec une couverture antalgique qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les procédures de chirurgie ont été raffinées grâce à la cartographie du cerveau permettant des injections précises ciblant seulement les structures d’intérêt, permettant ainsi de réduire considérablement les effets secondaires liés à des injections peu spécifiques. Les animaux, bien que hébergés de façon individuelle, auront un contact olfactif et visuel avec leurs congénères. Ils auront un enrichissement important (nid, maison, tunnel, bâtonnets à ronger) et seront manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur. Des points limites spécifiques suffisamment précoces seront définis.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 8 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge jeune adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène, garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.

Une restriction alimentaire ramenant les animaux à 85 % de leur poids initial conditionne la tâche comportementale : 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une ou deux neurochirurgies de deux à deux heures trente, lésion cérébrale, implantation de sondes ou les deux, puis trente jours d'hébergement individuel pour éviter l'arrachement du matériel, et une coupe des vibrisses. Les tests durent une vingtaine de jours, avec jusqu'à soixante essais quotidiens sur environ deux heures, et le porteur revendique des conditions "quasi-naturelles" obtenues en laboratoire. Le projet relève de la science fondamentale, ses retombées cliniques restant à l'état d'orientation pour des études ultérieures.

Objectifs

La prise de décision dirigée par la perception est le processus par lequel les informations sensorielles entrantes sont intégrées par le cerveau afin de guider le comportement de l’individu en produisant une réponse motrice appropriée. Chez les rongeurs, il apparaît de plus en plus clairement que cette integration des fonctions sensoriels et de la motricité fait intervenir deux zones cérébrales clés. La première zone est la partie du cerveau qui reçoit les informations sensorielles provenant des moustaches. La deuxième zone est la partie qui va planifier et organiser les mouvements. Elle est impliquée dans la sélection et l’exécution des commandes motrices. La première zone quant à elle constitue un système sensoriel important pour les rongeurs permettant de collecter les informations sensorielles de l’environnement. Les rongeurs ont en effet développé un système sensoriel complexe et utilisent de préférence leurs moustaches pour explorer leur environnement tactile immédiat. Pourtant, on ne sait toujours pas à ce jour comment ces deux zones cérébrales interagissent pour assurer une prise de décision adaptée en réponse à la perception de l’environnement. Par ailleurs, la plupart de nos connaissances proviennent d'études utilisant des tâches comportementales peu naturelles (avec immobilisation de la tête de l’animal par exemple). De plus le rôle de ces zones cibles et de leur interaction dans des conditions qui reproduisent ce qui se passe dans la nature de façon éthologiques reste à ce jour inconnu. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Ce projet est avant tout un projet de science fondamentale. Il vise à comprendre au niveau cellulaire les principes de l’intégration des informations sensorielle et motrice qui permettent l’adaptation de la prise de décision en réponse à la perception de l’environnement. Tout cela dans un contexte environnemental le plus éthologique possible. Au-delà de cet aspect fondamental, le projet vise à explorer des problématiques que l’on retrouve en clinique. En effet, l'accent mis sur la prise de décision au cours d’une tâche ayant une vraie valeur éthologique dans un environnement naturel est central dans les neurosciences cognitives modernes, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre la tâche comportementale proposée est une caractéristique frappante de plusieurs troubles moteurs et perceptifs. Le projet est donc particulièrement bien placé pour dessiner les bases d'études plus appliquées, en reliant notamment les techniques de neurosciences les plus récentes aux processus cognitifs essentiels. Enfin, le projet est à la pointe de nombreuses techniques expérimentales, allant de modèles comportementaux innovants à la neuroanatomie avancée et l’étude des signaux électriques générés par l'activité des neurones pendant la prise de décision.

Procédures

Les animaux seront d’abord acclimatés à leur hébergement dans le premier établissement utilisateurs pendant 2 jours. Puis les animaux seront soumis à une neurochirurgie lésionnelle et/ou implantatoire de sondes. Ces chirurgies se feront sous anesthésie et dureront chacune entre 2h et 2h30. 75 animaux auront une chirurgie lésionnelle, 150 animaux auront une chirurgie implantatoire, et 100 animaux auront ces deux chirurgies (lésionnelle et implantatoire). 75 animaux auront une injection de solution saline pour servir de contrôle. Un intervalle de 10 jours sera respecté entre chaque chirurgie lorsqu'il est nécessaire de faire une chirurgie lésionnelle puis de faire une chirurgie implantatoire. Après 10 jours de récupération et de surveillance post-opératoire, les animaux seront déplacés dans le deuxième établissement utilisateurs puis acclimatés à leur nouvelle animalerie pendant 10 jours. Ensuite, les animaux seront soumis à une restriction alimentaire qui durera une vingtaine de jours. Pendant ces 20 jours les animaux auront l’étape de comportement avec 3 phases : l’habituation (5 jours), l’apprentissage (5 jours) et le contrôle (5 jours). Ces tests comportementaux permettront d'étudier la prise de décision lorsqu'elle est dirigée par la perception. Pour la phase d’habituation les animaux auront des essais durant 30 minutes. Pendant la phase d’habituation et de contrôle, les animaux auront 60 essais par jour ce qui représentera environ 2 heures par jour. Les animaux seront hébergés de façon individuel après la chirurgie pour éviter tout arrachement des sondes pendant 30 jours.

Impact sur les animaux

Le projet peut induire des effets indésirables sur les animaux, listés ci-dessus. ● Le risque de douleur durant la chirurgie. ● Le risque de douleur aiguë lié à la récupération post-opératoire. ● Le risque d’infection des implants. ● Le risque de stress lié à l’hébergement individuel après la chirurgie. ● Le contrôle des apports caloriques en régulant la quantité de nourriture disponible, nécessaire à l’exécution de la tâche comportementale, sera limitée pour atteindre une réduction maximale à 85% de leur poids initial. ● Coupe des vibrisses

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés des procédures. La mise à mort des animaux sera nécessaire pour réaliser des contrôles d’immunohistochimie sur les cerveaux.

Remplacement

Par définition, les mécanismes neuronaux de la prise de décision perceptuelle ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Cela est d’autant plus vrai dans le cadre d’expérimentation avec une forte valeur éthologique ajoutée. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici.

Réduction

Les techniques expérimentales utilisées ici permettent de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groupes expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques.

Raffinement

Une grille de notation sur le comportement de construction du nid chez la souris sera réalisée comme un indicateur du bien-être. En effet, lors de stress, de douleur ou de mal être chez la souris la construction des nids est affectée. Cette évaluation permettra d’alerter ou d’identifier un mal-être ou une douleur éventuelle lorsque la qualité du nid est altérée. Elle permettra également de témoigner d’un bien-être lorsque le nid est de bonne qualité. Les animaux sont hébergés et manipulés dans le cycle jour/nuit inversé correspondant à leur phase d’éveil/sommeil. En effet, les souris sont des animaux nocturnes. Pour respecter leur rythme de vie et les manipuler lorsqu’ils sont réveillés, le jour ils seront donc dans l’obscurité avec lumière rouge (non visible pour eux) et la nuit hébergés avec de la lumière. Les tests comportementaux sont ainsi réalisés lors des phases actives des souris et elles ne sont pas dérangées lors de leurs phases inactives. Les résultats avec des souris en cycle jour/nuit inversé seront plus pertinents sur le plan éthologique et fourniront des données plus fiables si elles sont menées pendant la phase nocturne, alors que les souris sont normalement éveillées et actives. Les tests comportementaux ont également été raffinés pour étudier des comportements de prise de décision éthologique (qui existent effectivement dans la nature) dans des conditions quasi-naturelles au sein même du laboratoire. Le projet comprend des chirurgies qui se feront sous anesthésie générale avec une couverture antalgique qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les procédures de chirurgie ont été raffinées grâce à la cartographie du cerveau permettant des injections précises ciblant seulement les structures d’intérêt, permettant ainsi de réduire considérablement les effets secondaires liés à des injections peu spécifiques. Les animaux, bien que hébergés de façon individuelle, auront un contact olfactif et visuel avec leurs congénères. Ils auront un enrichissement important (nid, maison, tunnel, bâtonnets à ronger) et seront manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 8 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge jeune adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène, garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.

Pour vérifier si la graisse corporelle protège le foie des polluants, 192 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection déclenche chez elles une fonte progressive du tissu adipeux, de 50 % en un mois et de 80 % en trois mois, puis elles reçoivent les polluants par gavage hebdomadaire et subissent des tests de tolérance mensuels au glucose et à l'insuline, avec prélèvements sanguins à la queue. Le porteur affirme que ce dialogue entre organes ne peut être étudié hors d'un organisme vivant. Il ajoute que si un effet apparaît, les mécanismes seront ensuite explorés sur des modèles cellulaires déjà utilisés au laboratoire.

Objectifs

Les maladies non-alcooliques du foie (i.e. NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease) sont devenues une priorité de santé publique à cause de leur prévalence grandissante (20% de la population générale et plus 70% des personnes obèses). Elles débutent avec la stéatose hépatique (foie gras), stade bénin, qui peut progresser vers la stéatohépatite ou NASH (non-alcoholic steatohepatitis), propice au développement des cirrhoses et cancers du foie. Bien que les causes/mécanismes de cette progression pathologique restent à clarifier, l’exposition aux perturbateurs endocriniens (PE) seuls ou mélange, est suspectée. Il apparait donc urgent de développer de nouveaux modèles permettant de mieux évaluer l’impact des PE sur la santé, en particulier dans les NAFLD. Le tissu adipeux, aussi appelé graisse corporelle, est l'endroit principal où notre corps stocke les lipides, c'est-à-dire les graisses. En plus de cette fonction de réserve d'énergie, il joue un rôle important en capturant les perturbateurs endocriniens (PE), des substances chimiques pouvant perturber le fonctionnement de nos hormones, et aide ainsi à protéger les autres organes de leurs effets nocifs. Certaines études ont montré que plusieurs polluants présents dans notre environnement favoriseraient le développement de maladies du foie liées à des troubles métaboliques, comme le « foie gras ». Nous faisons l'hypothèse que le tissu adipeux pourrait agir comme un bouclier pour le foie, en le protégeant des effets de ces polluants.

Bénéfices attendus

Ce travail expérimental pourrait permettre de démontrer le potentiel protecteur du tissu adipeux contre l’exposition aux polluants. Ces résultats pourraient avoir des répercussions importantes en termes de santé publique, notamment en soulignant l’importance du tissu adipeux dans la protection contre les effets néfastes des polluants environnementaux. Une meilleure compréhension de ce mécanisme de protection pourrait ouvrir de nouvelles voies pour la prévention des maladies hépatiques liées à l'exposition aux polluants, et renforcer les politiques de santé publique visant à limiter cette exposition.

Procédures

Pour induire la délétion du tissu adipeux, nous injectons des souris transgéniques avec un agent pharamacologique donné . Cette procédure n’entraine pas d’autre inconfort que l’injection par voie intrapéritonéale. L’exposition aux polluants se fait par gavage hebdomadaire. Cette procédure n’entraine pas d’autre inconfort que celle d’un gavage. Les tests de tolérance (glucose et insuline) sont effectués une fois par mois et requièrent 5x3 soit 15 microlitres de sang, avec une semaine d'intervalle entre les deux tests. L'administration du glucose se fait par voie orale (gavage), celle de l'insuline par injection intra-péritonéale.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont des irritations aux points d'injection, des douleurs lors des prélèvement à la queue (prise de glycémie), et de l'inconfort lors des gavages oraux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort afin de prélever les tissus sur lesquels les analyses moléculaires seront réalisés. Ces analyses sont l'objectif premier du projet et nous permettrons d'établir l’effet du tissu adipeux sur le développement de la NASH en situation d’exposition aux polluants.

Remplacement

Le but de notre étude est d’étudier l’effet du tissu adipeux sur les maladies métaboliques lors d’une exposition à des polluants. Ce dialogue inter-organe ne peut être utilisé hors d’un organisme vivant. Si un phénotype est observé, les mécanismes pourront être abordé ultérieurement sur des modèles cellulaires utilisés au laboratoire.

Réduction

Le projet nécessite l’utilisation d’un total de 192 animaux, ce qui, dans un souci de réduction, correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs, en accord avec nos données précédentes. L'utilisation d'un ouill statistique de prédiction prévoit un usage de 16 animaux par groupe pour obtenir des données robustes, notamment pour les tests métaboliques. La répartition du tissu adipeux étant différente chez les mâles et les femelles, il est indispensable de réaliser les analyses sur les deux sexes. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés pour évaluer la relevance de nos données.

Raffinement

Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et frisottis, ainsi qu'un tube tunnel, tous deux fabriqués en polycarbonate. De plus, nos interventions chirurgicales se dérouleront avec une couverture anesthésique et analgésique adaptée pour les gestes invasif et en conditions de stérilité. Nous utilisons des aiguilles micro-fines pour l'injection, ce qui réduit la douleur. Nous utilisons des sondes de gavage en polypropylène, ce qui diminue la nuisance de cette procédure. Nous avons détaillé dans la section concernant la procédure notre stratégie en termes de points limites gradués et adaptés aux nuisances observées. La surveillance quotidienne, y compris le week-end, permet une application stricte et efficace de la stratégie élaborée.

Choix des espèces

Nous avons généré et étudié des souris qui présente une perte progressive du tiss adipeux. Nous connaissons bien le modèle et nous savons d'ores et déjà que suite à l’injection de tamoxifene, la masse adipeuse va progressivement réduire, de 50% en 1 mois et de 80% en 3 mois. Adulte, des souris de 8 semaines, le phénotype des animaux à cet âge a été caractérisé dans notre publication précédente et nous avons montré que, à ce stade, les animaux traités développent une perte de tissus adipeux.