Souris

180 souris femelles reçoivent dès le sevrage, à trois semaines, un régime pauvre, modéré ou riche en zinc, et le suivent pendant un an. Chacune passe seize heures en cage métabolique individuelle à trois, six, neuf et douze mois pour le recueil des urines, puis est tuée sous anesthésie pour le prélèvement des reins et du cœur. Le groupe soumis à la ration pauvre en zinc risque de développer des calcifications et une insuffisance rénale, ce que le porteur présente comme l'objet même de l'étude. Le bénéfice espéré, proposer le zinc comme traitement des calcifications pathologiques, reste une hypothèse, quand les douze mois de régime contrôlé et les quatre passages en cage métabolique sont, eux, planifiés.

Objectifs

Les calculs rénaux (lithiase urinaire) voient leur incidence augmenter, affectant près de 10 pourcent de la population mondiale. La lithiase urinaire est à l’origine de nombreuses interventions chirurgicales et hospitalisations, source d’infections parfois gravissimes. La première étape de formation des calculs rénaux est très souvent le développement de plaques de Randall : des calcifications du tissu rénal qui affectent la papille rénale. De forts taux de zinc ont été identifiés dans les plaques de Randall des souris ; ce zinc pourrait jouer un rôle d’inhibiteur de la minéralisation. L’objectif du projet est de déterminer si les apports alimentaires en zinc ont un impact sur les calcifications vasculaires et rénales au long terme. L'hypothèse est que les apports de zinc protègent contre le développement des calcifications qui surviennent avec l’âge, et ce notamment chez des sujets prédisposés (mutations génétiques) pour ces calcifications.

Bénéfices attendus

Le zinc est un oligo-élément qui a prouvé avoir des effets bénéfiques sur les calcifications des valves aortiques. De forts taux de zinc ont été identifiés dans les plaques de Randall des souris et nous supposons que ce zinc pourrait jouer un rôle d’inhibiteur de la minéralisation. L’objectif du projet est de déterminer si les apports alimentaires en zinc ont un impact sur les calcifications vasculaires et rénales. L'hypothèse est que l’administration de faibles doses de zinc aggraverait le développement attendu des calcifications rénales et vasculaires tandis que l'administration de fortes doses de zinc protègerait contre les calcifications rénales (plaques de Randall) mais également vasculaires. Cela permettrait de proposer l’administration de zinc comme traitement contre les calcifications pathologiques. En effet, la formation de calculs rénaux affectent près de 10 pourcent de la population mondiale, et est à l’origine de nombreuses interventions chirurgicales et hospitalisations. Ces calculs peuvent conduire à une insuffisance rénale chronique, voire à la mise en dialyse dans les cas les plus sévères.

Procédures

Les souris vont être à partir du sevrage (environ 3 semaines), et cela pendant 1 an, soumis à un régime spécial pouvant impacter l'évolution de la survenue de calcifications rénales et aortiques : pauvre, modéré et riche en zinc. Elles seront également mises en cage métabolique afin de doser les paramètres urinaires à 3 mois 6 mois, 9 mois et 12 mois du traitement. Cette intervention sera de 16 heures mais pourra être adaptée si un point limite de l'animal est constaté. A la fin de l'étude les animaux seront anesthésiés et analgésiés, puis soumis à un prélèvement sanguin unique et différents prélèvements de tissus / organes nécessaires aux analyses (rein, cœur, etc.).

Impact sur les animaux

Le changement de régime pourrait causer un stress (néophobie) et une baisse de la consommation de manière transitoire. Le recueil d'urine en cage métabolique individuelle peut induire un stress pour les animaux (stress social). Il y a un risque de survenue de calcifications pouvant entraîner une insuffisance rénale pour le groupe exposé à une faible concentration en zinc, ceci en fait l'objet de cette étude.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux expérimentaux par une méthode réglementaire.

Remplacement

Nous souhaitons étudier l'effet du zinc sur le développement de calcifications rénales et vasculaires. Le modèle murin est particulièrement approprié pour ce projet car nous possédons au sein de l'animalerie un modèle murin prédisposé à calcifier la papille rénale. Cette étude s'intéressant à l'évolution des calcifications au sein d'organes précis, elle ne peut donc pas être réalisée sur des cellules ou des organoïdes.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux par expérience a été calculé à partir d'un calcul de puissance et des données déjà connues dans ce modèle. Le nombre d'animaux prévu est de 180 souris (femelles de 3 semaines).Des tests statistiques seront mise en oeuvre pour l'analyse des données afin de réduire le nombre d'animaux dans les prochains groupes .

Raffinement

Le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), d’un dôme en cellulose et de morceaux de bois à ronger. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter tout signe de douleur. Les critères d’arrêt sont la prostration, ou la perte de dix pour cent du poids initial (les animaux seront pesés 1 fois par semaine). Le recueil d'urine n'est pas invasif et les animaux seront habitués aux cages métaboliques. Les points limites seront surveillés tout au long de la procédure.

Choix des espèces

Notre modèle de souris est le reflet de la pathologie humaine sur le développement de calcifications rénale et vasculaire. Les souris seront utilisées au sevrage (environ 3 semaines) car habituellement il y a un changement d'alimentation à cette étape de développement des animaux. Nous profitons donc de ce changement pour intégrer l’alimentation spécifique en zinc.

Pendant les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, la glycémie est suivie en cinétique et du glucose est administré si le seuil défini est franchi. 644 souris génétiquement modifiées pour développer de l'athérosclérose vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Elles subissent des contentions et des injections intrapéritonéales jusqu'à trois fois par semaine, un gavage, deux mises à jeun de cinq heures, des prélèvements de sang à la queue par microcoupure et un prélèvement rétro-orbitaire sous anesthésie. Le porteur annonce un effectif calculé par analyse de puissance sans donner ni le nombre de groupes ni le nombre d'individus par groupe.

Objectifs

L’obésité est associée à une augmentation du risque de développer des maladies cardiovasculaires, en particulier des pathologies des artères du cœur (maladie coronarienne) ou des artères carotides, pouvant entraîner l’infarctus du myocarde ou des accidents vasculaires cérébraux. Ces maladies des artères sont causées par la formation de plaques d’athérome (ou athérosclérose). L’athérosclérose est caractérisée par une réaction inflammatoire chronique dans la paroi des artères, impliquant divers types de cellules immunitaires, dont les macrophages. Cependant, l’impact de l’obésité sur la fonction des macrophages dans l’athérosclérose reste méconnu. Ce projet a pour objectif de (i) caractériser avec précision les macrophages vasculaires dans un modèle combinant l’obésité et l’athérosclérose chez la souris et (ii) évaluer le ciblage thérapeutique des macrophages dans le traitement de l’athérosclérose dans un contexte d’obésité chez la souris, et utilisera pour ce faire un modèle d'athérosclérose associé à l'obésité induite par des régimes particuliers riches en gras et/ou cholesterol. Ce projet nous permettra d’approfondir les connaissances concernant l’impact de l’obésité sur les mécanismes inflammatoires de l’athérosclérose et de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Ce projet permettra également d’évaluer l’efficacité thérapeutique du ciblage des macrophages dans le développement de l’athérosclérose dans un contexte d’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’approfondir les connaissances concernant l’impact de l’obésité sur les mécanismes inflammatoires de l’athérosclérose et de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Ce projet permettra également d’évaluer l’efficacité thérapeutique du ciblage des macrophages dans le développement de l’athérosclérose dans un contexte d’obésité.

Procédures

-Contention (maximum 3 fois par semaine; quelques secondes) -Injections intrapéritonéales (maximum 3 fois par semaine; quelques secondes) -Injections intraveineuses sous anesthésie (1 fois, quelques secondes) -Gavage par sonde gastrique (1 fois, quelques secondes) -Prélèvement de sang à la queue sur souris vigiles (2 fois prélèvements répétés sur une période de 2 heures) -Mise à jeun (2 fois 5 heures) -Individualisation pendant les tests de tolérance au glucose ou à l'insuline (2 fois; environ 2h)-Anesthésie (1 fois; quelques minutes) -Prélèvement sanguin rétroorbital sous anesthésie (1 fois; quelques secondes)

Impact sur les animaux

Inconfort lié à la préhension et contention des animaux (nuisance légère de courte durée); injections intrapéritonéales : douleur de courte durée au point d'injection (nuisance légère de courte durée); inconfort lié au gavage du glucose lors du test de tolérance au glucose (nuisance légère de courte durée); prélèvement de sang lors des tests d’intolérance au glucose et à l’insuline: douleur de courte durée au site de prélèvement par microcoupure de la pointe de la queue (nuisance légère de courte durée); mise à jeun des souris avant tests d’intolérance au glucose et à l’insuline: stress liée au retrait temporaire de la nourriture (nuisance légère de courte durée); stress lié à l'individualisation des animaux durant la durée des tests de tolérance à l'insuline et au glucose (nuisance légère de courte durée)

Devenir

Tous les animaux sont mis à morts à la fin de la procédure. La mise à mort est nécessaire pour prélèvement d'organes nécessaires aux analyses prévues dans le projet.

Remplacement

Les questions scientifiques adréssées dans ce projet ne peuvent l'être que grâce à l'utilisation d'un modèle animal in vivo. En effet, l’athérosclérose et l’obésité sont des maladies impliquant divers organes et types cellulaires interagissant de manière complexe. Les mécanismes cellulaires et moléculaires de l'athérosclérose et de l’obésité doivent être étudiés dans un modèle qui imite le plus fidèlement possible la pathologie humaine. Actuellement il n'existe pas de système in vitro qui reproduise, imite ou permette la modélisation des interactions cellulaires et moléculaires qui conduisent au développement de l’obésité et de l’athérosclérose. L’expérimentation in vivo est également le seul modèle permettant d’appréhender l’intégration et la participation d’acteurs de différents tissus dans une même pathologie. Les modèles in vivo sont donc une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes impliqués dans l’obésité et l’athérosclérose, ou pour évaluer le potentiel effet de nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Nous avons déterminé un nombre minimum de souris par groupes expérimentaux pour garantir une analyse statistique fiable, à partir de calculs statistiques (analyse de puissance) et à partir de notre expérience préalable sur les méthodes utilisées dans ce projet. Les données obtenues seront analysés à l'aide de tests statistiques prédéfinis et appropriés. Des mesures spécifiques sont mises en oeuvre pour éviter les biais expérimentaux: randomisation, analyse des données "en aveugle". Nous visons toujours à maximiser l'information qui peut être récupérée à partir d'un seul animal.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Un enrichissement complémentaire spécifique à la procédure sera implémenté : bâtonnets de bois pour éviter la pousse ou abrasion dentaire anormale des animaux sous régime riche en gras (aliment mou). Lors des procédures expérimentales, les nuisances seront réduites au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie adaptés et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures. Pour la procédure des tests métaboliques de tolérance à l'insuline et au glucose, la glycémie sera suivie en cinétique et l'apport de glucose sera réalisé si nécessaire en fonction des points limites définis. Les animaux feront l’objet d’une surveillance par les expérimentateurs pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’athérosclérose dans un organisme biologique complexe, développant une pathologie présentant des similitudes à l'athérosclérose humaine. Les souris génétiquement modifiées présentant une prédisposition à l'athérosclérose utilisées dans ce projet représentent un modèle communément utilisé dans ce domaine de recherche, ce qui permettra une intégration et comparaison des résultats obtenus à la littérature scientifique existante. Les complications cardiovasculaires de l'obésité se manifestent à l'âge adulte. Nous utiliserons donc des souris âgées de 8 à 12 semaines au début des expériences, ce qui constitute un âge adulte. De plus, cet âge est communément utilisé dans les modèles souris d'athérosclérose et d'obésité, facilitant ainsi l'intégration et la comparaison de nos données à la litérature existante.

Toutes tuées à l'issue pour que leurs tissus soient prélevés, 368 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation qui les fait cesser de prendre du poids vers dix semaines, développer une pathologie musculaire vers un an, puis une atteinte cardiaque qui les tue autour de quatorze mois, avec une survie médiane de 10,8 mois. À 5 et 10 mois, elles passent une semaine de tests comportementaux que le porteur qualifie d'inoffensifs sans les nommer, avant une chirurgie sans réveil. Sur le remplacement, il indique que les modèles cellulaires ne permettent pas d'étudier des profils de comportement et affirme devoir passer par la souris, y compris pour accéder à des tissus inaccessibles chez l'humain.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative. Elle se déclare à l'âge adulte (40-80 ans) et évolue, en 3 à 5 ans, vers la paralysie complète et le décès du patient. Elle est causée par la mort de certains neurones, entraînant un affaiblissement progressif et une atrophie des muscles. A ce jour, il n'existe pas de traitement contre la SLA car les mécanismes sont méconnus. La SLA touche les deux sexes et son incidence augmente avec l'âge à partir de 40 ans. De manière intéressante, elle peut dans certains cas être associée à des troubles de type démence. Des travaux précèdent sur une cohorte de patients souffrant de cette forme de démense, avait permis d’identifier une mutation sur un gène . Un modèle murin a été créé et caractérisé. Parmi tous les facteurs impliqués dans la pathogenèse, certains défauts dans la cellule s’avèrent essentiels et pourrait contribuer à la pathogenèse des maladies neurodégénératives. Nous émettons l'hypothèse qu’un type de désorganisation cellulaire déclenche des cascades dans le système nerveux central, contribuant à la pathogenèse des maladies neurodégénératives. Nous voulons ainsi tester l’inhibition de cette cascade sur la neurodégénération.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément les mécanismes moléculaires conduisant à la neurodégénérescence. Ils pourraient également permettre le développement de modèle pouvant être utilisés pour développer de nouveaux médicaments ciblant les mécanismes imlpliqués, pour permettre de prévenir ou freiner le développement des maladies neurologiques chez les patients. Dans cette optique, notre partenaire va tester sur des modèles cellulaires l'efficacité de l'Elamipretide (un médicament déjà utilisé dans des essais cliniques en phase précoce). A plus long terme, un essai préclinique dans notre modèle murin pourrait être développé. Ce projet présente également potentiellement des bénéfices clinique et sociétal : Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un projet financer par l'Agence Nationale de la Recherche et il se fait en collaboration avec des cliniciens. Ainsi les résultats obtenus ont le potentiel d'améliorer la prise en charge de plusieurs maladies rares en termes de diagnostic moléculaire et d'engagement des patients/public. En mettant l'accent sur les processus pathogènes dans les maladies mitochondriales reconnues et les maladies neurodégénératives, ce projet contribuera à la définition de cibles thérapeutiques. Actuellement, les traitements pour les maladies mitochondriales et les maladies neurodégénératives sont inefficaces et la prise en charge des patients a un coût important en termes de santé publique en raison de la gravité de l'invalidité présentée par ces patients. Les avantages économiques de cette recherche sont difficiles à évaluer à ce stade. Néanmoins, les bénéfices pour les patients en termes d'optimisation du diagnostic sont inestimables et les possibilités thérapeutiques potentielles permettront de réduire le coût des soins.

Procédures

Des tests comportementaux seront effectués sur les animaux de 5 et 10 mois pendant 1 semaine. Aucune nuisance d’ordre général n’est attendue durant ses tests compte-tenu de leurs innocuités. Une étape d’habituation sera effectuée en amont pour limiter les perturbations dues à la manipulation. Une chirurgie sans réveil sera effectuée avant analyse de certains tissus.

Impact sur les animaux

L'étude de la lignée murine réalisée par nos collaborateurs indique qu’elles sont normales à la naissance mais à partir de 10 semaines commencent à moins prendre de poids. Vers l'âge d'un an, elles présentent une pathologie des muscles . Leur état s'aggrave rapidement avec une perte de poids importante et des tremblements, et elles développent une pathologie du coeur sévère, conduisant à la mort des animaux vers 14 mois. Cette étude indique également que le modèle présente une altération des capacités d'apprentissage et de mémoire dès 10 mois. L’atteinte neurologique est mesurable mais reste limitée et n’est pas responsable de la mortalité, qui est principalement liée à la pathologie cardiaque. Les signes cliniques apparaissent au stade terminal, débutant par une perte de poids importante. De même, l’apparition de symptômes tels qu’un affaiblissement partiel de l’extension des pattes ou des tremblements, combinée à l’incapacité de la souris à se retourner sur le flanc en moins de 15 secondes, indiquera une réduction significative de la mobilité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation car leurs tissus seront récoltés pour analyse.

Remplacement

La caractérisation du modèle a d’abord été réalisée avec des modèles cellulaires. Les expériences réalisées sur des fibroblastes issus de patients porteurs de la mutation d'intérêt ont permis d'identifier de potentiels mécanismes impliqués dans les atteintes mitochondriale et neurodégénérative. Cependant, pour l’étude de maladies neurodégénératives avec des composantes motrices et cognitives, les modelés cellulaires ne peuvent pas être utilisés pour disséquer les effets des variations moléculaires sur des profils de comportements. C’est pourquoi nous devons utiliser le modèle murin pour mieux comprendre la pathologie au cours du temps et pour tester si l’inactivation d’un processus moléculaire peut ralentir ou inverser les processus pathologiques permettant d’envisager des voies d’intérêt thérapeutiques dans l’avenir. L'utilisation de modèles murins, permet aussi d'accéder à des tissus auxquels on n'a pas accès chez l'homme.

Réduction

Avec l’aide des statisticiens de notre institut de recherche, les protocoles permettant l'analyse de plusieurs paramètres sur un même prélèvement ont été établis, réduisant au maximum le nombre d’animaux. Ainsi dans un but de réduction du nombre d’animaux à utiliser pour cette étude, des statistiques prédictives ont été réalisées dans le but d’utiliser le minimum d’animaux nécessaires et les effectifs des groupes expérimentaux ont été ajustés : - en tenant compte de notre expérience, - en fonction de la nature de l'expérience et des paramètres mesurés, - de la variabilité de ces paramètres, - de façon à produire des résultats interprétables, permettant d'atteindre une signification statistique, vérifiée par les statisticiens.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux inclus dans le projet, axé sur leur état général de santé, est prévu. Il sera associé à l’utilisation d’une fiche d'observation détaillée permettant un suivi optimal des animaux. Ce suivi quotidien permettra d’identifier précocement tout signe clinique, de stress ou de douleur. Le phénotype de notre modèle murin étant associé à une perte de poids. En effet à partir de l'âge de 10 semaines, les souris malgré un apport calorique normal ne prennent plus de poids normalement. Les courbes de poids au cours des 5 dernières semaines de vie montrent qu’une perte rapide de poids peut être observée avant le stade final. De plus l'analyse de survie a révélé que les souris avaient une survie significativement réduite par rapport à leurs compagnons de cages non génétiquement modifiés, avec une survie médiane de 10.8 mois. Ainsi, dès 8 mois, en plus d’être pesés une fois par semaine, une surveillance accrue sera mise en place : la fréquence du suivi augmentera, de l'eau et de la nourriture gélifiées seront placées au sol dans la cage pour éviter des complications si les animaux éprouvent de l'inconfort ou des difficultés à atteindre la trémie alimentaire et la source d'eau. De plus si des signes de stress sont observés, l’enrichissement de la cage sera amplifié (avec litière en cellulose, tunnels en carton, rouleaux de coton, etc.). Enfin, lors de cette surveillance quotidienne, si la perte de poids dépasse un seuil par rapport à la pesée précédente, cela conduira à la mise à mort.

Choix des espèces

La caractérisation du modèle murin a permis de mieux comprendre comment la mutation étudiée (chez l'Homme) d'un gène codant pour une protéine mitochondriale est impliqué dans le dysfonctionnement mitochondrial. Cette caractérisation a en particulier permis de montrer que le modèle murin présente des déficits moteurs ou cognitifs qui sont liés à un déficit de traitement des signaux de communication chez la souris mesurée par des méthodes d’électrophysiologie L'analyse du phénotype neurodégénératif des souris pourra permettre d’étudier si l’invalidation de certains gènes permet une protection contre la neurodégénérescence. L'évolution du phénotype pourra également être étudiée au cours de la vie relativement courte de l'animal et seul le modèle murin permet cette étude comportementale. Nous avons identifié les stades de développement intéressant à étudier sur la base de résultats publiés précédemment. - stade précoce, apparition des premiers signes moléculaires = 5 mois de vie : dans ce modèle l’atteinte neurologique est mesurable mais reste limitée et n’est pas responsable de la mortalité, qui est principalement liée à la cardiomyopathie. Ce modèle ne présente aucun phénotype avant l’âge de 6 mois et le stade 5 mois correspond à l’apparition d’une atteinte mitochondriale au niveau moléculaire. - stade final précédant l'atteinte finale de la maladie = 10 mois de vie : à partir de l’âge de 6 mois les animaux commencent à perdre du poids et développent une cardiomyopathie mitochondriale fatale avant l’âge de 14 mois (survie médiane de 10.8 mois).

1 250 souris vont être utilisées, dont cinquante pour entraîner le geste chirurgical et quinze par donneur humain, avec des mises à mort échelonnées sur trois dates. Une partie est immunodéficiente, donc exposée aux infections et aux tumeurs, ce que le porteur nomme un phénotype dommageable. Chacune subit deux chirurgies de la moelle épinière à quarante-huit heures d'intervalle, l'une pour détruire la myéline, l'autre pour y greffer des cellules immunitaires humaines, puis des tests de traversée d'une barre crantée et de force des pattes avant. Toutes sont tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour fabriquer le modèle animal de sclérose en plaques qui manque aujourd'hui.

Objectifs

La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire et démyélinisante du système nerveux central. Dans cette pathologie les macrophages et lymphocytes du sang pénètrent le cerveau et la moelle épinière et viennent détruire une composante essentielle du système nerveux : la myéline. On distingue différent type de lésions décrites chez les patients atteints de sclérose en plaques. Un type de lésion en particulier est associé à une maladie plus agressive. Mais, à l’heure actuelle, aucun modèle animal ne permet l’étude de ce genre de lésion. L’objectif de ce projet sera de développer un nouveau modèle animal de lésions chroniques actives afin d’étudier la formation et l’évolution de ces lésions que l’on observe chez les patients atteints de forme agressive de la maladie.

Bénéfices attendus

En France, plus de 130 000 personnes vivent avec la sclérose en plaques (SEP), une maladie qui touche 2,8 millions de personnes dans le monde. Elle est souvent diagnostiquée entre 25 et 35 ans, mais peut aussi apparaître plus tôt ou plus tard. Chaque année, 5 000 nouveaux cas sont recensés en France. La SEP concerne principalement les femmes (trois malades sur quatre), mais leur progression vers le handicap est plus lente que chez les hommes, qui présentent un risque plus élevé de complications neurologiques. Il existe deux formes principales de la maladie : La forme rémittente (RR) : elle évolue par poussées, avec des symptômes qui apparaissent puis disparaissent. C'est la forme la plus fréquente et elle débute souvent entre 25 et 35 ans. Avec le temps, elle peut évoluer vers une forme plus sévère. La forme progressive (PP) : plus rare, elle se développe généralement après 40 ans et entraîne un handicap progressif, sans poussées distinctes. Les traitements actuels sont efficaces pour la forme rémittente, mais restent très limités pour la forme progressive, qui est la plus sévère. Certains types de lésions sont associés à cette forme aggressive de de la maladie, mais il manque aujourd’hui un modèle animal permettant de étudier en détail la formation et le développement de ce type de lésion. Notre recherche vise à mieux comprendre ces lésions et, à terme, à tester de nouveaux traitements pour améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Une partie des animaux auront une seule procédure chirurgicale pour optimiser le geste chirurgical menant à une lésion de démyélinisation de la moelle épinière. Les animaux participeront à deux tests comportementaux afin d’évaluer leurs capacités motrices. Dans le premier test, l'animal est placé sur une barre crantée et on mesure la durée de la traversée de la barre et le nombre d'erreurs, l'animal étant libre de ces mouvements durant le test. Dans le deuxième test l'animal est placé sur une grille sur laquelle l'animal s'accroche ce qui nous permet de mesurer la force de ses pattes avant. Ces deux tests comportementaux durent respectivement 90 secondes et 60 secondes. Les animaux réaliseront 2 procédures chirurgicales sous anesthésie générale et analgésie adaptée, à 48 heures d’intervalle, l’une pour la mise en place de la lésion de démyélinisation et la deuxième pour l’injection de cellules immunitaires humaines sur le site lésionnel. Chaque chirurgie durera 15 minutes. Une dernière procédure sous anesthésie générale et analgésie adaptée sera réalisée pour évaluer les voies sensorielles de l’animal entre une zone stimulée et le cerveau (1 fois, 30 minutes maximum par animal). Toutes les souris seront euthanasiées en fin de procédure expérimentale par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Une partie des animaux utilisés dans le projet sont immunodéficients (phénotype dommageable) et seront donc susceptibles de contracter des infections et des tumeurs. Les tests comportementaux pourront générer un stress aux animaux dû au changement d’environnement et aux manipulations. Les procédures chirurgicales (lésion de démyélinisation, greffe de cellules humaines) génèreront une douleur et un inconfort post-opératoire, et pourront être associées à des complications inattendues telles qu’un saignement ou une infection. L’anesthésie générale nécessaire pour leur réalisation impliquera une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque de dépression cardio-respiratoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de réaliser des prélèvements post-mortem nécessaires pour répondre à notre question scientifique.

Remplacement

Le seul moyen à notre disposition pour décortiquer le processus de remyélinisation endogène et de démyélinisation chronique est d’utiliser un modèle animal bien établi du processus de démyélinisation/ remyélinisation développé il y a 20 ans que nous avons réadapté pour le rendre plus proche des conditions pathologiques des patients. En ce qui concerne la souche de souris immunodéficiente utilisées, la greffe de cellules humaines nous contraint à utiliser les souris les plus adaptée pour éviter le rejet de greffe. Pour étudier le processus de développement d’une lésion chronique l’utilisation d’un modèle animal est nécessaire. En effet des alternatives pour étudier la remyélinisation existe (comme l’utilisation de culture ex vivo de cervelet) mais celles-ci ne peuvent pas être utilisé dans notre cas car nous étudions l’évolution d’une lésion à long terme (3mois). De plus l’étude de tissus humain ne nous permet l’étude qu’à un temps donné des lésion chronique et non l’évolution. Il nous est donc impossible de substituer ces travaux par d’autres méthodes n’utilisant pas ces animaux

Réduction

Pour l'optimisation du geste chirurgical, des souris seront utilisées. Nous avons défini qu’un maximum de 50 souris pourrons être utilisées sur les 5 années du projet afin de perfectionner la technique d’injection dans le cordon dorsal de la moelle épinière. De plus, nous allons étudier la mise en place d’une lésion chronique en greffant les lymphocytes de deux types de patients atteints de sclérose en plaque, nous aurons 2 groupes de patients avec 20 patients par groupe et 40 donneurs sains, soit 80 sujets au total. Pour chaque patient, nous injecterons 15 souris puis nous échelonnerons les euthanasies sur 3 temps différents nous permettant ainsi d’avoir au final 5 souris par temps d’euthanasie et par patient. Par expérience nous savons que cet effectif sera suffisant pour des tests statistiques fiables. Pour les analyses statistiques nous aurons donc pour chaque temps 400 souris au total, 100 pour le premier groupe de patient avec une forme modérée de la maladie , 100 pour le deuxième groupe de patient avec une forme aggressive de la maladie et enfin 200 pour le groupe de donneurs sains. Nous aurons donc besoin au total de 1250 souris au total.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés et dans des conditions de température et d’hygrométrie définies par les normes européennes (directive européenne 2010/63/UE) soit 22Cplus ou moins 2C pour la température et entre 45 et 65 pourcent d’hygrométrie avec un cycle jour,nuit progressif de 12h. De plus, ils seront hébergés dans un environnement enrichi (animaux hébergés en groupe avec carré de coton et bâton à ronger) et observés quotidiennement. Ils bénéficieront d’une semaine d’acclimatation à leur arrivée. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par notre vétérinaire désignée si nécessaire. Les animaux sont hébergés dans des cages à ventilation individuelles, des précautions lors de la manipulation sont prises comme manipulation sous hotte, changement de gant et nettoyage de l’endroit de manipulation entre chaque cage. Ils seront ensuite habitués à l’expérimentateur pendant 1 semaine avant le début des procédures pour réduire leur stress. Les animaux auront une période d’acclimatation aux pièces à raison de 30min à 1h avant chaque début des expériences comportementales, acclimatation également aux tests comportementaux à raison de 3 essais/tests/jours avant d’établir la performance basale de l’animal, pour diminuer le stress de l’animal. Entre chaque essais l’animal aura un temps de repos au minimum égal à son temps passé à faire le test. De plus les animaux seront manipulés de façon à diminuer le stress Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec une prise en charge analgésiques adaptée. Une surveillance renforcée sera mise en place en période post-chirurgie pendant 2 jours et puis 2 fois par semaine après la première semaine afin de s’assurer de la bonne récupération des animaux et afin d’adapter la prise en charge analgésique en fonction de l’observation de signes de douleurs une grille de score (mise au point avec la structure du bien être animal est utilisée pour définir la prise en charge de l’animal. En cas de signe de mauvaise santé (stress, blessure, comportements anormaux) un avis vétérinaire sera demandé, Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

Notre projet nécessitant un acte chirugical d’injection dans la moelle épinière, nous prévoyons d’optimiser le geste chirurgical des personnes (étudiants ou ingénieurs) associés à ce projet sur des souris immunocompétentes avant de réaliser ce geste ainsi que les injections de cellules humaines aux souris immunodéficiences. Notre projet nécessitant des greffes de cellules immunitaires humaines, nous utiliserons des souris immunodéprimées. En effet, ces souris présentent un système immunitaire déficient, elles sont donc de bonnes candidates pour la greffe de cellules humaines car il n’y aura pas de rejet de greffe. Les souris sont utilisées car le modèle de démyélinisation a été bien décrite chez la souris et nous avons une grande expérience de ce modèle dans notre équipe. Les animaux utilisés sont âgés d’au moins 8 semaines afin d’avoir une maturité suffisante du système nerveux central (jeunes adultes).

Issus d'un croisement entre une femelle témoin et un mâle porteur d'une mutation du gène Magel2, 612 souriceaux naissent pour être testés puis tués au premier ou au deuxième jour de vie. Avec les 40 femelles allaitantes qui servent de support au test, 652 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souriceau est séparé de sa mère quatre heures, puis reçoit une injection d'ocytocine ou de véhicule avant un test de saisie de tétine de deux minutes. Leur mise à mort sert à prélever un fragment pour le génotypage, et les femelles sont tuées en fin de projet, à six ou huit mois, après trois ou quatre portées.

Objectifs

Ce projet porte sur la compréhension des déficits de tétée chez des souris modèles d’une maladie rare chez l’homme (le syndrome de Prader-Willi, SPW) et le rôle d’une hormone, l’ocytocine, comme effet thérapeutique. En effet, il a été montré que l’ocytocine (OT) est impliquée dans l’initiation ou le maintien de l’activité de tétée, qu’il y a un dysfonctionnement de cette activité de tétée chez les souris déficiente en OT, aboutissant à une mortalité d’environ 50 % des souriceaux deux jours après la naissance (P2) pour les souriceaux qui n’arrivent pas à téter après 24 post-natal, mais une survie équivalente à des souriceaux contrôle pour les souriceaux qui ont réussi à initier une tétée dès la naissance (P0). Ces études ont également montré que l’administration d’OT à la naissance supprime la mortalité entre P0 et P2 en rétablissant l’activité de tétée chez ces souriceaux. Ces études précliniques ont engendré des essais cliniques chez des bébés atteints du SPW qui ont montré une stimulation de l’activité de tétée par l’OT chez ces bébés. Les travaux précédents suggèrent également que chez la souris, l’effet de l’OT est différent entre la première tétée et les tétées suivantes. Dans la continuité de ces travaux l’objectif de ce projet est donc de caractériser précisément 1) les étapes de la succion qui sont altérées chez les souriceaux déficientes en OT et 2) l’effet d’une administration oro-nasale ou d’une injection sous cutanée d’OT juste après la naissance sur la survie et la restauration de la séquence comportementale de tétée chez ces souriceaux. Au total 652 animaux (612 souriceaux et les 40 femelles adultes) seront inclus dans ce projet.

Bénéfices attendus

Les objectifs permettront d’identifier le rôle de l’ocytocine (OT) dans la tétée, d’argumenter l’intérêt d’utiliser l’OT dans le traitement de déficit de succion afin de définir les conditions optimales pour traiter les souris modèles du syndrome Prader-Willi chez l’homme (SPW). Cette étude aura des retombées sur le traitement des patients SPW.

Procédures

Souriceaux : 1 test de saisie de tétine sur femelles allaitantes (2 min) et/ou 1 injection d’ocytocine ou véhicule (

Impact sur les animaux

Les injections d’anesthésique sur femelles allaitantes peuvent représenter, comme toute injection, une nuisance par leur caractère nociceptif, malgré la durée très courte de cette intervention. Les injections d’ocytocine sur souriceaux à P0 et P2 peuvent représenter, comme toute injection, une nuisance par leur caractère nociceptif, malgré la durée très courte de cette intervention. La séparation de 4h des souriceaux de leur mère avant le test de saisie de tétine peut engendrer un stress pour les souriceaux.

Devenir

L’ensemble des souriceaux produits et testés dans ce projet sont euthanasiés au 1er ou 2ième jour après la naissance, après avoir réalisé le test de saisie. Cela permettra de réaliser la biopsie post-mortem pour le génotypage. Ils ne peuvent pas être gardés dans les structures d’élevage de l’unité ou pour d’autres projets du fait qu’ils proviennent d’un croisement entre une femelle contrôle et un mâle mutant. Les 40 femelles allaitantes, support du test de saisie de tétine, seront euthanasiés en fin de projet du fait qu’elles auront entre 6 et 8 mois et qu’elles auront déjà donné 3-4 portées.

Remplacement

Nous travaillons sur la physiologie et la physiopathologie de la tétée qui est altérée dans la majorité des maladies neurodéveloppementales et en particulier dans une maladie rare chez l’homme (le syndrome de Prader-Willi, SPW). Il n’y a, à ce jour, aucune alternative à l’utilisation de mammifères pour conduire ce type d’étude. La stratégie de l’équipe a consisté en particulier à travailler sur des modèles humains dans un cadre thérapeutique et des spuris modèle, génétiquement modifiésmodèles en fonction des questions posées, afin d’apporter le maximum de réponses pour comprendre les mécanismes mis en jeu en situation normale et pathologique et, ainsi, mieux traiter les patients atteints de ces troubles précoces de la succion.

Réduction

L'utilisation de souches murines fixées génétiquement permet de réduire la variabilité et donc le nombre d'animaux utilisés. Les tests comportementaux présentent par nature une variabilité interindividuelle importante, encore plus avec les souriceaux à la naissance ou à P2. Nous utiliserons des femelles qui ont déjà donné naissance à au moins une portée, pour favoriser le comportement maternel et ainsi optimiser le taux de survie des souriceaux. Notre importante expérience pour ces tests, appuyée par des tests de Puissance montre qu’il est généralement nécessaire d’utiliser des effectifs de 15-20 animaux par groupe pour valider la démarche statistique. Le fait de ne pas distinguer les souriceaux mâles et femelles dans nos analyses (les travaux antérieurs ne montrent pas d’effet sexe sur le comportement de tétée entre P0 et P2) nous permet de diminuer de moitié le nombre de portées étudiées.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés dans des cages enrichies avec du matériel de nidification (dôme et coton) et la présence d'objets (cylindre carton). Le bien-être et la bonne santé des animaux adultes est évalué quotidiennement via l'observation de leur aspect (absence de poils hirsutes, position voutée, yeux fermés) et de leur comportement (absence d’apathie, d’agressivité, de nidation, ou de déplacement sur la pointe des pattes). Les souriceaux qui réaliseront le test de saisie seront isolés de leur mère pendant 4h avant le test (afin de standardiser leur motivation à téter). Pendant les temps de séparation de leur mère les souriceaux seront laissés dans leur nid, dans leur cage (pour maintenir les odeurs maternelles) et en posant ce bac sur une plaque chauffante à 38°C pour maintenir le nid à 36°C malgré l’absence de la femelle et ainsi éviter un stress thermique des souriceaux. Lors des injections sur les souriceaux à P0 et P2 de la lidocaïne 5% (gel anesthésique local) sera appliquée sur la peau 5 minutes avant l’injection pour diminuer la sensation de douleur potentielle.

Choix des espèces

L’étude que nous menons, dans le contexte pathologique, sur les déficits de tétée et l’effet de l’ocytocine dans des conditions physiologiques et pathologiques ne peut pas être menée sur des modèles in vitro ou via des modélisations. Cette étude nécessite d’évaluer des paramètres de comportement de tétée qui nécessitent d’étudier des mammifères et en particulier des modèles de maladies rares mais aussi d’avoir la possibilité de travailler sur des modèles d’animaux génétiquement modifiés. A ce jour, les rongeurs sont les animaux les plus adaptés à ce type d’étude. Nous étudions l’activité de succion des souriceaux le jour de la naissance (P0), après la première tétée afin d’étudier les déficits moteurs de la séquence comportementale des souriceaux mutant mis en évidence dans notre étude précédente. Nous les étudions également à P2 puisqu’il a été montré qu’à ce stade, ces animaux sont les plus discriminants et les plus sensibles au contexte sensoriel au cours de la tétée.

Pour comprendre le rôle des cellules qui tapissent les vaisseaux de la moelle osseuse dans la myélofibrose, 75 souris subissent des lésions provoquées de ces cellules, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sur trente jours, chacune reçoit jusqu'à huit injections intraveineuses et subit jusqu'à huit prélèvements sanguins sous anesthésie, avant un prélèvement terminal de 800 microlitres qui exclut tout réveil : elles sont tuées par dislocation cervicale. Le porteur attend une perte de poids, une baisse d'activité, un poil rude, des paupières en partie closes et une respiration accélérée. Il annonce des points limites spécifiques permettant de soustraire l'animal aux procédures, sans dire lesquels.

Objectifs

La moelle osseuse est le lieu de la production des cellules du sang, dont les plaquettes. La myélofibrose est une maladie de la moelle osseuse caractérisée par l'accumulation de tissu fibreux, avec de graves complications au niveau des vaisseaux et du sang. Au fur et à mesure que la myélofibrose progresse, la production de cellules sanguines est inefficace et le nombre de plaquettes circulantes est réduit pouvant induire des saignements. Les traitements actuels visent à soulager les symptômes, en dehors de la greffe de cellules souches visant à remplacer ces dernières. La myélofibrose peut survenir à la suite de mutations de gènes ou d'anomalies affectant la moelle. Les cellules de la surface des vaisseaux, en interagissant avec les cellules souches, jouent un rôle clé dans le soutien de l’environnement de la moelle. En fournissant des éléments essentiels, les cellules à la surface des vaisseaux régulent les cellules souches. Des études menées sur des patients atteints de myélofibrose ont révélé des perturbations majeures des vaisseaux dans la moelle osseuse, sans explication claire. Nous faisons l’hypothèse que les cellules de la surface des vaisseaux protègent la moelle du développement de la fibrose. Pour répondre à cette question, nous utiliserons un modèle de souris qui permet d'induire des lésions dans les cellules de la surface des vaisseaux, sans atteinte des cellules souches. Ce modèle donne la possibilité de décrypter le rôle des cellules de la surface des vaisseaux sur la fibrose de la moelle et le repeuplement progressif de la moelle. L'objectif à long terme est de mieux comprendre les mécanismes par lesquels les cellules de la surface des vaisseaux exercent une influence sur les cellules souches. Cela permettra d'identifier de nouvelles pistes de traitement pour freiner la progression de la myélofibrose.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer le rôle des cellules de la surface des vaisseaux dans la protection de la moelle face au développement de la fibrose. Cela pourrait permettre d'identifier de nouvelles pistes de traitement pour freiner la progression de la myélofibrose.

Procédures

Les souris anesthésiées seront soumises à des prélèvements de sang (maximum 8 prélèvements sur 30 jours, 10 µL par prélèvement) et à des injections intraveineuses (maximum 8 sur 30 jours, 5 mL/kg au maximum). Les souris anesthésiées subiront un prélèvement de sang terminal (800 µL).

Impact sur les animaux

Pour le prélèvement de sang à la queue, les nuisances attendues sont un saignement de courte durée, une douleur localisée et un stress de l’animal. Pour l’injection du produit, on s’attend à une inflammation et une douleur localisée au point d’injection et un stress. De manière générale, les nuisances attendues sont une perte de poids, une réduction de l’activité, une apparence anormale (poil rude, paupières en partie closes) et une respiration accélérée.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale car le prélèvement de sang de grande quantité n’est pas compatible avec un réveil de l’animal.

Remplacement

Ce projet a pour but de décrypter le rôle des cellules de la surface des vaisseaux sur la fibrose de la moelle et le repeuplement progressif de la moelle par des cellules souches. Le processus étudié est un processus complexe et intégré qui relève du fonctionnement de l’organisme complet (vaisseaux, moelle osseuse, os, cellules souches, circulation du sang…). Il n’est donc pas possible de remplacer le modèle animal par de l’in vitro du fait de la nécessité du métabolisme de la souris pour évaluer le processus complet. De plus, il est extrêmement difficile de cultiver les cellules primaires endothéliales (isolement très délicat, rendement faible et culture longue), qui n’arborent pas les spécificités nécessaires à l’objectif poursuivi (morphologie, jonctions cellulaires, expression de récepteurs, source de molécules). Il n’est donc pas possible de remplacer l’animal par des techniques in vitro.

Réduction

Pour évaluer la fibrose de la moelle, on utilisera une coloration de coupes histologiques mettant en évidence le collagène, nous permettant de déterminer le pourcentage de fibrose. Nous comparerons alors la moyenne des souris témoins à celle des souris traitées. Selon les données de la littérature, on s’attend à ne voir aucune fibrose chez les témoins et en moyenne 25% de fibrose chez les souris traitées. Ces moyennes théoriques ainsi que l’écart type théorique permettent de réaliser le calcul du nombre de souris nécessaires par groupe.

Raffinement

Les animaux disposent de 14 jours d’acclimatation entre leur arrivée à l’animalerie et leur utilisation en procédure. Une habituation à la manipulation d’une durée de 5 jours est prévue et pourra démarrer 7 jours après l’arrivée des animaux dans notre animalerie. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Le changement d’hébergement en fonction des groupes n’est réalisé que si nécessaire. Aucun regroupement n’est réalisé afin d’éviter le risque de conflits, nous séparerons seulement les souris qui ne subiront pas l’expérimentation des souris qui la subiront afin de ne pas laisser des animaux qui subiront des injections avec d’autres qui ne seront pas manipulés. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont maintenus en groupes sociaux afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une analgésie de l’animal avant le prélèvement de sang terminal. Et par traitement antalgique en cas de signes de douleur • Par l’application d’une goutte d’anesthésique local après les injections • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin de lutter contre l’hypothermie pendant les procédures. • Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.

Choix des espèces

La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont maitrisés et caractérisés. La moelle osseuse de souris ainsi que la production des cellules du sang est largement maitrisée, en faisant un bon modèle pour l’étude du rôle des cellules de la surface des vaisseaux sur la fibrose de la moelle et son repeuplement progressif. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.

Greffées avec des cellules de cancer colorectal, puis soumises à trois séances de protonthérapie de vingt minutes sous anesthésie générale et à des injections d'immunothérapie deux fois par semaine pendant trois semaines, 374 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles font l'aller-retour entre deux établissements, l'irradiation par protons n'ayant lieu que sur l'un des deux, et leur tumeur est suivie six mois. Le porteur décrit des douleurs, des infections, une perte de poids et des zones de tissu mort à la surface des tumeurs, tout en écrivant qu'aucun effet secondaire n'est attendu de la protonthérapie ni des immunothérapies. Toutes sont tuées, même guéries, au motif qu'elles pourraient récidiver.

Objectifs

Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2). L'objectif de cette étude est de comparer l'efficacité de deux approches thérapeutiques pour traiter le cancer du côlon en utilisant la protonthérapie et l'immunothérapie. La protonthérapie est une technique de radiothérapie qui utilise des protons (particules chargées) pour cibler de manière précise les cellules cancéreuses, réduisant ainsi les dommages aux tissus sains voisins de la tumeur. L'immunothérapie, utilisant des anticorps vise à stimuler le système immunitaire pour qu'il reconnaisse et détruise les cellules cancéreuses. Les deux traitements seront administrés de deux manières : simultanément (protonthérapie et immunothérapie en même temps) ou de manière séquentielle (d'abord la protonthérapie, puis l'immunothérapie). Notre étude s'intéresse à l'impact de cette combinaison sur l'environnement immunitaire autour de la tumeur. L’étude utilisera des souris, qui recevront des greffes de cellules de côlon cancéreuses. Après les traitements, la croissance du cancer sera suivie pendant six mois pour déterminer quelle association de traitements est la plus efficace. Le but est d’optimiser cette association de protonthérapie et d’immunothérapies pour améliorer le traitement du cancer du côlon.

Bénéfices attendus

Nous voulons identifier la meilleure façon de donner ces traitements : soit en les administrant ensemble, soit en les donnant l'un après l'autre. Le but final est de trouver un traitement antitumoral beaucoup plus efficace. Les résultats de cette recherche pourraient ensuite servir à développer un essai clinique sur la meilleure des deux approches, ce qui pourrait grandement aider à créer de nouvelles stratégies de traitement contre le cancer.

Procédures

EU1 : Un groupe d'animaux subira une injection de 1 min sous anesthésie générale, puis un prélèvement sanguin de 1 min toutes les deux semaines sur animal vigil. EU1 : Un groupe d'animaux subira une injection de 1 min sous anesthésie générale, puis un prélèvement sanguin de 1 min toutes les deux semaines sur animal vigil, puis 1 injection d'une minute 2 fois par semaine sur animal vigil pendant 3 semaines. EU2 : Un groupe d'animaux subira un prélèvement sanguin de 1 min, puis 3 séances d’irradiation sous anesthésie générale d'une durée de 20 minutes chacune. EU2 : Un groupe d'animaux subira un prélèvement sanguin de 1 min, puis 1 injection d'une minute sur animal vigil, suivie par 3 séances d’irradiation sous anesthésie générale d'une durée de 20 minutes chacune.

Impact sur les animaux

Lorsque des cellules cancéreuses sont implantées chez la souris, cela peut causer des douleurs, des infections, une perte de poids temporaire et parfois de la déshydratation. Les tumeurs issues de ces cellules peuvent parfois développer des zones de tissu mort en surface, ce qui a été observé dans d'autres études. Les immunothérapies que nous utiliserons ont déjà été testées et n'ont pas causé d'effets secondaires. Cependant, les injections répétées peuvent engendrer un peu de stress pour les animaux et une inflammation ou une infection au point d’injection. Le transport des souris entre les deux établissements peut induire du stress, mais il est indispensable pour les amener sur le site où elles seront irradiées avec des protons. Quant à la protonthérapie, aucun effet secondaire n'est attendu, hormis le stress des anesthésies répétées.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort si les points limites sont atteints ou à la fin du projet, car aucune d’entre elles ne peut être maintenue en vie. En effet, ayant toutes reçu des injections de cellules cancéreuses, elles présentent un risque et pourraient récidiver, même si elles sont guéries.

Remplacement

Pour étudier l'efficacité des traitements combinés avec la protonthérapie, il est important d'utiliser des animaux car ils ont des fonctions physiologiques complètes, comme dans un corps humain. De plus, pour tester l'association avec des immunothérapies, il est nécessaire d'utiliser des animaux dont le système immunitaire fonctionne bien. La recherche montre que l'effet de la protonthérapie dépend du niveau d'oxygène dans les tissus, qui peut varier, ainsi que de l'environnement autour de la tumeur. Nos premières études sur ce modèle nous ont aidés à choisir les bonnes immunothérapies à associer à la protonthérapie. À ce stade, seule une étude sur des animaux peut évaluer l'impact de la combinaison de ces traitements sur la réponse du système immunitaire. Les études sur des cultures cellulaires, qui utilisent des cellules en dehors d'un organisme, ne peuvent pas reproduire la complexité d’un corps entier, surtout lorsqu’il s’agit d’étudier comment fonctionne le système immunitaire.

Réduction

Les études préliminaires ont contribué à sélectionner les immunothérapies les plus adaptées, ce qui a permis de réduire le nombre de groupes. Le nombre d'animaux requis a été défini de manière à garantir un échantillon suffisant pour effectuer une analyse statistique fiable.

Raffinement

Chaque protocole expérimental prend en compte un potentiel impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour justifier un arrêt de l'expérience en cours. Les animaux seront hébergés à 5-8 souris par cage, avec de la litière, des frisures de papier kraft, des tubes de coton (nidification), des bâtons et des tunnels. Les procédures expérimentales seront réalisées par des manipulateurs qualifiés. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement deux semaines avant de démarrer les procédures. Des anesthésies et des analgésies sont appliquées dès que possible pour éviter tout risque de stress et de souffrance. Pendant les phases où les souris seront anesthésiées, elles seront maintenues au chaud et leurs yeux seront protégés. Au réveil, si nécessaire, une réhydratation sera administrée. Les souris seront pesées régulièrement, leur état de santé général sera soigneusement suivi et la taille des tumeurs sera mesurée trois fois par semaine. Si des signes de détérioration sont détectés, une surveillance renforcée pourra être mise en place (jusqu’à deux fois par jour). Si nécessaire, le responsable du projet ou un vétérinaire interviendra pour ajuster les soins ou, en dernier recours, décider de mettre fin à la souffrance de l’animal. Les injections seront effectuées par du personnel qualifié en utilisant des aiguilles adaptées. Les prélèvements sanguins seront réalisés avec soin pour minimiser les risques d’hématome permettant ainsi une bonne cicatrisation. Lors des transports en voiture, les souris seront placées dans des boîtes de transport équipées de filtres pour éviter toute contamination. Ces boîtes contiendront de la litière, de la nourriture, de l’eau en gel et des éléments pour leur confort afin de réduire leur stress. Si la température extérieure est trop froide, des chaufferettes seront placées sous les boîtes pour maintenir une température agréable.

Choix des espèces

Les souris sont couramment utilisées en laboratoire en raison de leur petite taille, de leur reproduction rapide et de leur faible coût d’élevage comparé à d'autres animaux. Ce choix repose principalement sur leur similitude avec l’homme au niveau de l'anatomie, de la physiologie et de la génétique. L’utilisation de souris adultes est justifiée par le fait qu’à ce stade de leur développement, leurs systèmes biologiques, notamment leur système immunitaire, sont pleinement développés et fonctionnels, permettant ainsi d’étudier de manière réaliste la progression du cancer et la réponse immunitaire aux traitements. Contrairement aux cultures cellulaires, qui offrent une vision restreinte des interactions biologiques, les souris adultes permettent d’observer les mécanismes immunitaires et tumoraux dans un organisme vivant et complexe. Cette approche est essentielle pour mieux comprendre comment le système immunitaire combat les tumeurs et pour tester l'efficacité de thérapies innovantes, telles que les traitements immunitaires, dans un contexte proche de la réalité humaine. De plus, le système immunitaire de la souris est bien documenté et les outils d’analyse disponibles sont parfaitement adaptés à ce modèle animal.