Souris
Effet de molécules naturels (extrait de bois de châtaignier) et de composés de synthèse sur la réponse inflammatoire dans un modèle de colite chimio induite par DSS chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Choisies pour leur système immunitaire fonctionnel et âgées de trois à quatre mois, 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Elles reçoivent du dextran sulfate de sodium à 2 % dans leur boisson pendant quatorze jours pour déclencher une colite, un gavage quotidien avec un extrait de bois de châtaignier ou des molécules de synthèse, et sont isolées chaque jour le temps qu'on récupère leurs fèces. Le porteur affirme n'attendre aucun effet délétère des composés testés et décrit une baisse de poids seulement modérée, alors que le projet déclare des procédures de niveau sévère. Toutes seront tuées à J14, ou plus tôt si un point limite est atteint, pour prélever le côlon et le sang.
Objectifs
Diverses pistes de travail ont mené aux développements de traitements contre les Maladies Inflammatoires Chronique de l’Intestin (MICI). Tout d’abord, nous avons travaillé depuis plusieurs années dans le criblage de molécules biosourcées et synthétiques anti-inflammatoires dans le contexte des MICI. En particulier, deux familles de molécules (Famille A : biosourcée et Famille B : synthétique) ont été analysées et ont démontrées divers effets anti-inflammatoires et anti-oxydants in vitro intestinaux et leucocytaires. D’autre part, nous étudions l’effet des Extrait de Bois de Châtaignier (EBCs) sur la modulation de la réponse inflammatoire chez l’hôte. Nos travaux sur les EBCs nous ont permis de démontrer la capacité des EBCs à réduire la réponse inflammatoire au sein de cellules leucocytaires et intestinales humaines. L’objectif de ce projet est d’analyser l’effet anti-inflammatoire dans un modèle de colite chimio-induite par le dextran sulfate de sodium (DSS) chez la souris de ces trois séries de traitements potentiels dans les cas pathologiques de MICI. Grâce à cette étude, nous pourrons valider les effets modulateurs de ces différentes familles de composés anti-inflammatoires sur la réponse inflammatoire. De plus, nous pourrions analyser dans ce projet l’effet de ces trois séries de traitements potentiels dans les cas pathologiques de MICI avec une série commune de contrôles et une même série de références pour comparer les effets de traitement issus de produits naturels, biosourcés ou synthétiques. Ainsi, nous respectons au mieux la règle des 3R en réduisant le nombre de souris nécessaires pour nos recherches. Nous pourrons ainsi comparer l’intérêt de produits naturels vis-à-vis de molécules synthétiques et en extraire des données sur les avantages et inconvénients suivants les effets observés des composés étudiés. De plus, cela nous permettra de valoriser plus tard, parmi les 3 séries de molécules, la série avec le plus fort potentiel thérapeutique pour les patients atteints de MICI.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont multiples, aux profits de la santé humaine et animale. D’après la littérature, ce projet nous permettra de mettre en évidence l'effet anti-inflammatoire de ces composés anti-inflammatoires. De plus, les résultats de ce projet seront disponibles à moyen et long terme en fonction du temps nécessaire pour traiter la densité des données acquises lors de ce projet, pour structurer et publier ces résultats auprès d’un éditeur. Ce projet pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des patients, avec des traitements moins agressifs et moins contraignants, tout en renforçant l’arsenal thérapeutique. Pour la santé humaine, cela permettrait d'offrir des traitements plus diversifiés et pouvant servir d’alternatives dans les traitements de poussées modérées chez les patients MICI. Ces traitements ne se limitent pas à la pathologie des MICI, mais aussi à d’autres pathologies liées à une réponse inflammatoire dérégulée ou à des pathologies présentant des dérégulations du micro-environnement intestinal. Concernant la santé animale, l’EBC pourrait permettre d’améliorer le bien-être animal dans les phases précoces de son développement jusqu’au stade adulte. Ce traitement d’origine naturelle permettrait de protéger le microbiote intestinal et d'atténuer un potentiel état inflammatoire dérégulé par une infection microbienne chez l’animal.
Procédures
Les souris seront observées et pesées tout au long du projet, du J0 au J14. Avant le début de l’expérience, les souris seront mises à isolement pendant 7 jours. Les souris contrôles ne recevront aucun traitement durant l’expérience. Les souris contrôles DSS ainsi que les souris traitées recevront dans leur boisson à 2% de DSS et resteront en contact de ce produit tout au long de l’expérience (J14). Les souris traitées se verront administrer par voie orale (gavage / per os) quotidiennement soit 50mg/kg d’urolithine B (métabolite naturelle de polyphénol), soit une dose de 5mg/kg de l’extrait de bois de châtaignier (KT), soit 100mg/kg des molécules de la famille A ou B. Durant la pesée des souris, nous isolerons les souris le temps de pouvoir récupérer des fèces pour chaque souris et chaque jour composant notre étude. Au 14ème jour, si les souris n’ont pas subi d’euthanasie précoce due aux différents points limites cités précédemment, nous euthanasierons les souris à J14 afin de récupérer les organes et du sang.
Impact sur les animaux
En raison de son aspect naturel et son utilisation dans l’alimentation animale, nous n’attendons aucun effet délétère ou négatif de l'extrait de bois de châtaignier sur nos souris aux concentrations décrites dans notre protocole expérimental. Concernant les deux familles A et B, nous n’attendons aucun effet délétère ou négatif de ces deux familles A et B sur nos souris aux concentrations décrites dans notre protocole expérimental. En ce qui concerne le modèle murin de colite chimio-induite par DSS, le traitement des souris par DSS à 2% peut entrainer une baisse modérée de la masse corporelle au cours du temps. La concentration de DSS utilisée dans ce projet n’entraine pas une baisse de la masse corporelle brutale chez les souris. Il est possible d’observer dans ce modèle une altération du comportement de la souris accompagnée d’isolement ou d’une mobilité réduite.
Devenir
L’intégralité des souris de cette étude seront mises à mort. Nous récupérerons le colon des souris de chaque condition ainsi que du sang afin de réaliser des études histologiques et de quantifier par PCR divers médiateurs moléculaires impliqués dans le processus inflammatoire.
Remplacement
Nos études ont démontré un effet anti-inflammatoire et anti-oxydant de trois familles de composés dans des cellules leucocytaires et intestinales humaines : une famille de produits naturels avec les EBCs, une famille de composés biosourcés (A) et une série de composés synthétiques (B). Nous nous sommes ensuite rapprochés de l’Homme avec le modèle de nématode C. elegans infecté par Candida albicans. Ce modèle nous a permis d’aller plus loin sur la toxicité de nos composés dans un organisme plus complexe que le modèle cellulaire intestinal ou de macrophage. Cependant, l’étude de l’effet de ces composés sur la réponse inflammatoire dans un modèle murin est une étape nécessaire. Le modèle murin étant proche de l’Homme, nous pourrons conclure sur l’effets des EBCs et des composés des familles A et B sur la réponse inflammatoire chez l’hôte. Ce projet nous permettra de mieux comprendre leur effet sur le microenvironnement intestinal dans un organisme plus complexe que les nématodes. Cette étude nous permettra d’analyser l’effet de divers traitements issus de produits naturels ou synthétiques sur l’expression de récepteurs du système immunitaire innée ainsi que de médiateurs pro-inflammatoires. Nous pourrons mieux comprendre l’impact de ces traitements sur la modulation de la composition du microbiote intestinal ainsi que leur effet sur la perméabilité intestinale lors d’un processus inflammatoire. Nous pourrons ainsi comparer les variabilités ou non de ces traitements tout en ayant les mêmes contrôles, les mêmes référentiels et les mêmes individus afin de pouvoir valoriser la famille de composés démontrant le plus fort potentiel thérapeutique.
Réduction
Nous souhaitons réaliser l’expérience de traitement par les trois familles de composés dans le modèle murin de colite chimio induite sur deux lots de 100 souris. Les souris seront réparties en 10 groupes de 10 souris en fonction des traitements effectués (contrôles, molécules d’origine naturelle ou molécules synthétiques). Un lot est constitué de 100 souris et l’expérience sera réalisée deux fois (100 x 2 = 200 souris) sur une période de 14 jours. L’effet de ces diverses familles de composés sur la modulation de la réponse inflammatoire pourront ainsi être comparés avec les mêmes contrôles et les mêmes références afin de sélectionner la famille de composés présentant le meilleur potentiel en termes de transfert de technologies et de valorisation. Les paramètres expérimentaux étudiés seront les variations de masse corporelle chez les souris, le score clinique des souris, le taux de médiateurs pro-inflammatoires dans le colon, et les modifications de la composition de la flore intestinale suite à l’inflammation et/ou aux traitements par rapport à la condition physiologique. Le test statistique utilisé lors de ce projet permettra de comparer deux échantillons indépendants de petite taille entre eux.
Raffinement
Notre protocole expérimental a pour but d’étudier et d’évaluer l’effet anti-inflammatoire de trois familles de composés sur un modèle murin dans un contexte inflammatoire induit par DSS. L’utilisation d’anesthésiques, d’analgésiques et/ou d’anti-inflammatoires altérerait le suivi de notre étude. Par conséquent, divers points limites ont été établies afin d’observer et de gérer quotidiennement l’apparition de toute forme de souffrance chez ces souris jusqu’à la fin de notre étude. L’intégralité des souris seront mises à mort à la fin de notre étude.
Choix des espèces
Notre équipe possède des compétences et des savoirs-faires sur le modèle murin de colite chimio induite par DSS. Ce modèle nous permet d’observer et d’étudier l’effet des EBCs, de la famille A et B sur la modulation de la réponse inflammatoire dans un contexte d’inflammation intestinale mimant ce qui se passe chez les patients atteints de MICI. La souris étant le modèle le plus utilisé et le plus proche de l’Homme pour étudier l’efficacité d’un traitement, ce modèle nous semble approprié à la vue de nos résultats et de la continuité de nos travaux in vitro et sur le modèle de nématode. Notre projet concerne la réponse inflammatoire chez l’hôte. Les souris devront avoir un système immunitaire fonctionnel. Par conséquent, les souris seront âgées entre 3 et 4 mois.
Impact de la perte de fonction d’un gène sur la longévité chez des souris transgéniques immunocompétentes
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour mesurer combien de temps vivent des souris privées d'un gène soupçonné d'intervenir dans le vieillissement, 480 d'entre elles sont maintenues en cage jusqu'à leur mort, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Aucune intervention n'est prévue au-delà d'un examen de cinq minutes toutes les six semaines à partir de dix-huit mois, jusqu'à la fin de vie. Elles développent les atteintes propres au grand âge, tumeurs, dermatites, difficultés à se déplacer, sans médication sauf avis vétérinaire. Certaines meurent dans leur cage, les autres sont tuées quand une grille de fragilité indique qu'un point limite est franchi, et leurs organes sont ensuite prélevés.
Objectifs
Le vieillissement et les pathologies liées à l’âge deviennent des thématiques prioritaires en recherche car ils ont un fort impact sur la santé publique. Réduire le vieillissement et étendre l’espérance de vie en bonne santé est un enjeu économique majeur. Ce projet de recherche s’inscrit dans cette thématique. Nous avons mis en évidence, via des études in vitro, que notre gène d’intérêt est impliqué dans le vieillissement. L’objectif de ce projet est de valider in vivo cette hypothèse via une étude de longévité qui évaluera la mesure de l’espérance de vie des animaux transgéniques déficientes pour ce gène. Les expériences in vivo réalisées sur un modèle rongeur permettront de démontrer l’impact de notre gène d’intérêt sur la santé des animaux vieillissant.
Bénéfices attendus
L’étude de la longévité est un enjeu actuel majeur. Cette étude: i) mettra en évidence le rôle clef joué par notre gène d’intérêt dans le vieillissement physiopathologique chez les souris mâles et femelles ; ii) avancera la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires du vieillissement via l’identification des acteurs de la sénescence. Cela nous permettra de développer des nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter certaines pathologies liées à l’âge comme la neuro-dégénération ou le cancer et ainsi étendre l’espérance de vie en bonne santé.
Procédures
Étude de longévité incluant uniquement le maintien des animaux à long terme en conformité avec la réglementation et incluant un suivi avec établissement d’un score (5 min par animal - 1x toute les 6 semaines à partir de 18 mois et jusqu’à la fin de vie).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une contrainte liée à la contention lors de leur évaluation et, également, les effets indésirables inhérent au vieillissement (éventuelle possible apparition de tumeurs, dermatite, difficulté à se déplacer).
Devenir
Dans le cadre de cette étude de vieillissement, certains animaux seront susceptibles de décéder naturellement au cours de cette procédure de longévité ou seront euthanasiés en cas d’atteinte des points limites définis. Des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.
Remplacement
Notre projet vise à définir les conséquences de la modification avec l’âge de la signalisation moléculaire et cellulaire. Aucun modèle cellulaire ne permet de reproduire les interactions inter-organes et la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu lors du vieillissement. L’utilisation d’un modèle petit rongeur, comme la souris, se justifie par l’espérance de vie relativement courte de ces animaux, permettant la réalisation du projet dans le temps imparti (5 ans).
Réduction
Le projet impliquera un total de 480 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Nous appliquerons un test statistique approprié pour comparer la survie des animaux. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Il est prévu de réaliser une veille bibliographique attentive et continue afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et bâtons à ronger). L’aliment sera mis dans les cages pour les animaux fatigués ou avec des problèmes d’accessibilité à la nourriture. En collaboration avec la cellule du bien être animale de la structure, un changement d’aliment sera envisagé pour les animaux très vieux. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés. Nous avons inclus dans le protocole de longévité des grilles d’évaluation de la fragilité des animaux, incluant des observations cliniques et le suivi de poids des animaux. Les animaux fragiles identifiés seront soumis à une vigilance accrue, notamment via l’établissement de points limites, des signes de souffrance, qui entraineraient l’euthanasie de l’animal. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées en cas d’atteinte des points limites préétablis. Il n’y aura pas de médication utilisée dans le cadre de cette étude de longévité sauf avis vétérinaire.
Choix des espèces
Le choix d’utiliser la souris dans cette étude est justifié par des considérations scientifiques et éthiques. Tout d’abord, la souris est un organisme complet et fonctionnel dont le système immunitaire peut être comparé à celui de l’homme, ce qui en fait un modèle pertinent. De plus, sa génétique est bien caractérisée, ce qui facilite les études génétiques et moléculaires. La souris est largement reconnue et utilisée comme modèle animal standard dans la recherche scientifique, notamment dans les études précliniques. Sa large utilisation au sein de la communauté scientifique internationale permet une meilleure comparabilité des résultats et une meilleure validation des observations entre différentes études. Nous disposons d’installations adaptées pour les souris, ainsi que d’une expertise solide en matière de techniques d’expérimentation animale et de suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Les animaux seront suivis pendant toute leur vie afin d’évaluer l’espérance de vie maximale des individus.
Etude de l’impact des inhibiteurs de points de contrôles en présence de cytokines anti-tumorales sur la réponse anti-cancéreuse.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Greffées d'une tumeur sous la peau du flanc ou directement dans la glande mammaire, 3 069 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Certaines subissent une chirurgie de trente minutes puis restent endormies deux à trois heures pour de l'imagerie, et toutes sont manipulées chaque jour pour mesurer la tumeur. Le projet cherche à comprendre pourquoi les immunothérapies ne guérissent qu'une minorité de patients, moins de 30 % selon le porteur. Celui-ci écrit que les immunothérapies ne sont pas toxiques et que la tumeur ne gênera l'animal ni pour bouger ni pour s'alimenter, tout en fixant un volume tumoral au-delà duquel la souris est tuée.
Objectifs
Ces dix dernières années, les immunothérapies ont révolutionné la prise en charge des patients atteints de cancer. En éduquant nos défenses immunitaires à reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales, ces traitements permettent en effet de guérir du cancer avec peu de toxicité et de façon durable, à la différence des traitements standards de chimiothérapie et radiothérapie. Malgré ces avancées majeures, les immunothérapies sont efficaces chez une minorité (
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche permettra d’apporter des connaissances essentielles sur le mode d’action d’immunothérapies actuellement utilisées en clinique ou en cours de développement pour le traitement des cancers solides (ex : cancer du sein, de la peau, du colon, lymphome de la peau, etc) et pour lesquelles une majorité des patients rechutent ou ne répondent pas. Comprendre les raisons pour lesquelles ces immunothérapies guérissent seulement une petite fraction des patients est alors primordial afin d’en générer des nouvelles de plus grande efficacité ou d’identifier les patients à même de répondre positivement au traitement. A court terme, ce projet nous permettra de proposer de nouvelles combinaisons thérapeutiques capables de contourner les limitations que nous aurons identifiées et donc avec une meilleure efficacité. Ainsi, nos travaux offriront au long terme de nouvelles thérapies pour traiter la majorité des patients atteint de cancer solide et améliorer leur espérance de vie.
Procédures
La greffe de la tumeur consistera en une injection de quelques secondes au début de l’expérience. Les animaux seront ensuite manipulés quotidiennement pour mesurer la pousse de la tumeur. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale de 30 minutes pour effectuer de l’imagerie et seront ensuite maintenus endormis pendant 2 à 3h.
Impact sur les animaux
Notre projet propose d’étudier les immunothérapies anti-tumorales et nécessite donc la greffe de tumeur aux souris en sous-cutanée au niveau du flanc et en orthotopique au niveau de la glande mammaire. Pour l’injection dans la glande mammaire, les souris seront anesthésiées. La piqûre d'aiguille en sous cutanée ou en orthotopique dans la glande mammaire pour l’injection de tumeur entraîne une douleur légère de courte durée. Il en est de même pour les injections en intra-veineuse des immunothérapies ou des d’autres molécules. Les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention et une introduction d’une aiguille selon les bonnes pratiques vétérinaires. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée. La pousse de la tumeur pourra engendrer un inconfort pour la souris qui sera léger et pris en charge.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront reçu initialement des cellules tumorales.
Remplacement
De nombreuses expériences seront validées au préalable in vitro à l’aide des lignées cellulaires pour remplacer les animaux. Ces expériences pourront être effectuées dans des cultures cellulaires en 2 dimensions ou des organoïdes (structures en 3 dimensions mimant certains aspects des tumeurs solides in vivo) et nous permettront de déterminer des doses ou la cinétique sur laquelle nous souhaiterions étudier le mode d’action de la thérapie in vivo. Différentes doses seront utilisées in vitro afin de déterminer la dose optimale de la thérapie. Ces travaux nous permettront de réduire le nombre d’animaux que nous utiliserons par la suite pour identifier le mode d’action de la thérapie in vivo. Une telle approche permettra de réduire de façon significative le nombre d’animaux dont nous aurons besoin pour notre recherche. Néanmoins, les tests in vitro ne permettent pas de récapituler la complexité des réponses immunitaires ayant lieu in vivo. C’est la raison pour laquelle nous avons recours aux animaux afin de décortiquer le mécanisme d’action de certaines thérapies.
Réduction
L'utilisation de l'imagerie sur l'animal vivant permet de réduire le nombre d'animaux utilisés car l'observation en temps réel permet un suivi longitudinal d’un même animal. Dès que possible, les différents tests seront effectuées sur les mêmes animaux et les expériences de séquençage entier ou d’ARN aussi, afin de limiter leur utilisation. D'après notre expertise issue des projets précédents et notre collaboration avec le département de statistiques, nous avons déterminé́ les nombres d'animaux par groupe qui nous permettra d'utiliser les tests statistiques robustes. Selon les procédures, les paramètres évalués seront variables, cela entraine des nombres de groupes variables que nous avons optimisés et réduits au maximum pour obtenir des résultats significatifs tout en prenant en compte la variabilité de la croissance tumorale ainsi que les effets cages. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car ils seront porteurs de cancer et auront reçu un traitement anti-tumoral.
Raffinement
Les immunothérapies ne sont pas toxiques à la différence des traitements conventionnels. Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis fréquemment et des points limites précoces et spécifiques sont établis pour raffiner les procédures et les mettre à mort si le point limite est atteint. En cas de déshydratation, les souris pourront être réhydratées. Un suivi fréquent sera réalisé pour évaluer l’état de l’animal et la pousse de la tumeur. L’animal sera mis à mort si le volume de la tumeur atteint le point limite. Cette limite est idéale pour limiter l’impact de la tumeur sur le bien-être de l’animal qui ne rencontrera aucune difficulté à bouger ou à s’alimenter. Pour pallier l’inconfort de la pousse de la tumeur, une litière douce sera utilisée pour le bien être des animaux. Après l’administration de l’immunothérapie, la température corporelle de l’animal sera mesurée afin de s’assurer d’une bonne tolérance au traitement. En cas d’hypothermie, les cages seront chauffées. Dans les cas d'exérèse de la tumeur mammaire chez certaines souris, une administration d’’analgésique pourra avoir lieu, afin de prévenir la douleur.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est très proche du système immunitaire humain. Les souris sont l’espèce la plus appropriée pour nous éclairer sur les mécanismes d’action des immunothérapies pour le traitement des cancers chez l’humain. Par ailleurs, l’imagerie intravitale en temps réel peut être réalisée relativement facilement sur des souris. Tous les animaux utilisés dans ce projet de recherche seront adultes (>5 semaines). Notre étude s’effectue sur un système immunitaire adulte afin de se rapprocher au mieux de la clinique et des patients porteurs de ces cancers.
Evaluation comportementale et neurochimique des effets de nouvelles entités pharmacologiques dans des modèles d’autisme chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
5 060 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 3 360 en gravité sévère. Des femelles gestantes reçoivent une injection destinée à faire naître une descendance présentant des symptômes proches de l'autisme, puis sont tuées après le sevrage parce qu'elles ne développent pas elles-mêmes ces troubles. Leur descendance passe jusqu'à quinze tests comportementaux en cinq mois, avec jusqu'à vingt heures de jeûne, vingt-trois jours de cage individuelle, une exposition à une lumière et un bruit forts, et des stimuli aversifs douloureux. Seules 900 souris, celles qui n'ont reçu aucun traitement et ne sont approchées par les autres que lors des tests de sociabilité, seront réutilisées ailleurs, le porteur affirmant que la complexité des troubles autistiques impose le recours à des modèles in vivo.
Objectifs
Les Troubles du Spectre Autistique (TSA) sont considérés comme des maladies du développement du système nerveux qui se manifestent dès la petite enfance. Ces pathologies se traduisent par des troubles du comportement, de l’interaction sociale, par des problèmes de communication, qui ne sont pas systématiquement associés à des retards intellectuels. Afin de chercher des pistes thérapeutiques contre les TSA, il est nécessaire de passer par des modèles animaux. Cependant, aucun modèle animal ne récapitule l’ensemble des symptômes des TSA, c’est pourquoi nous utiliserons 4 modèles souris dans ce projet. Notre objectif sera donc de tester par des études comportementales (évaluation de l’anxiété, compulsivité, sociabilité, mémoire… des souris) et/ou neurochimiques (évaluation des contenus en différents neurotransmetteurs dans le cerveau des souris) de nouvelles molécules issues de notre centre de recherche sur ces modèles souris de TSA. Nous utiliserons deux modèles d’autisme induits pendant la gestation, et deux modèles génétiques, avec en particulier un modèle du syndrome de l’X Fragile qui portera la même mutation que chez l’humain, et qui entraîne un TSA chez 10 à 30% des patients.Ce projet nous permettra ainsi de mener 50 études (chaque étude permettant de tester l'efficacité de 3 candidats médicaments ou de 3 doses d'un même candidats) sur 5 ans dans nos 4 modèles d'autisme.
Bénéfices attendus
A court terme, les procédures mises en œuvre permettront de caractériser les différents modèles d’autisme chez la souris et d’évaluer la capacité de nouvelles entités pharmacologiques à moduler les symptômes autistiques observés. A long terme, ce projet permettra de générer des données scientifiques pré-cliniques indispensables au processus de développement de nouveaux candidats médicaments, notamment avant le passage en phase de tests cliniques.
Procédures
Des souris femelles gestantes vont recevoir une unique injection d’un produit pharmacologique afin d'obtenir une descendance présentant des symptômes proche des troubles du spectre autistique. La détermination des symptômes autistiques chez les souris se fera grâce à une série de tests comportementaux (activité locomotrice, sociabilité, anxiété, compulsivité, mémoire…). Ces tests seront d’une durée maximale de 30 minutes par animal et par jour, et dans la limite de 15 tests sur 5 mois. La majorité des tests se fera sur une seule journée, avec un seul test par semaine, et au maximum une même souris sera testée sur 5 jours consécutifs. Une administration de candidats médicaments sera effectuée avant chaque test, avec dans la majorité des tests une seule administration par semaine, pouvant aller jusqu’à 4 par semaine dans le cas d’un test. Les délais d’administration avant les phases de test seront de 0 à 4h. Pour chaque administration une courte contention de quelques secondes sera nécessaire. Pour un test impliquant une dérogation de la mise à jeun, les animaux seront mis à jeun pendant maximum 20h. Dans un autre test impliquant une dérogation à l’hébergement, les souris seront hébergées en cages individuelles pendant une période maximale de 23 jours (incluant une phase d’habituation aux conditions expérimentales d’au moins 7 jours).
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirables attendus sur les souris, on aura le stress de la courte contention le temps de l’administration de produits, qui pourra également causer une courte et légère douleur dans le cas d’une injection. Un test de comportement nécessitera que les souris soient hébergées en cages individuelles, ce qui est source de stress pour les souris qui sont des animaux sociaux. Cependant, l'enrichissement sera maintenu (appareil de nidification...) ainsi que le contact visuel, olfactif et auditif avec les congénères afin de limiter ce stress. D’autres tests comportementaux utilisés pour caractériser les symptômes autistiques de nos modèles souris pourront par ailleurs induire d’autres types de stress brefs de durées maximales inférieures à 30 minutes. De plus, dans le cadre d’un protocole spécifique, les souris pourront être soumises à une courte période de restriction alimentaire. Pour un autre protocole, la lumière et le bruit ambiant seront forts pour motiver la recherche d’un refuge dans un labyrinthe, et seront donc source de stress chez les animaux. De plus, un protocole comprend des stimuli aversifs qui sont susceptibles de causes une douleur passagère chez les rongeurs.
Devenir
Les femelles ayant reçu un traitement pharmacologique durant la gestation sont mises à mort après sevrage des petits. En effet, ces femelles ne peuvent pas être incluses dans les procédures car elles ne développent pas de troubles autistiques. A la fin de tous les tests comportementaux et neurochimiques toutes les souris appartenant à nos 4 modèles autistes sont mises à mort, puisqu’une analyse des contenus en neurotransmetteurs dans leur cerveau (nécessitant une mise à mort) pourra être réalisée dans le cadre d’une procédure de ce projet, et si ce n’est pas le cas elles ne pourront être réutilisées.. Seules les souris utilisées comme stimulus social (et n’ayant subi aucun traitement) dans un de nos tests comportementaux pourront être réutilisées dans d’autres projets au sein du centre de recherches.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de nouvelles entités pharmacologiques sur les troubles du spectre autistique dans le cadre du développement de nouveaux médicaments. La nature des troubles du spectre autistique mettant en jeu des processus complexe et intégré qui requière la mise en place de modèles in vivo afin de pouvoir apporter des données comportementales et une efficacité potentielle d’un candidat médicament.
Réduction
Un effectif minimum de 16 souris par groupe expérimental est prévu pour la robustesse des tests statistiques, au vu de la variabilité attendue du comportement des rongeurs dans nos tests comportementaux. Ces tests statistiques nous permettront en effet de déterminer pour chaque expérience s’il existe bien une différence entre notre groupe contrôle et notre/nos groupe(s) traités avec des composés pharmacologiques.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement (tunnel, igloo, appareil de nidification…) et avec accès illimité à l’eau et à la nourriture. Seule un test comportemental nécessite un hébergement en cages individuelles des souris et toujours avec un enrichissement maintenu et un contact visuel et olfactif avec des congénères. Autant que possible, les animaux seront placés de manière transitoire dans des cages de transfert individuelles après l’administration des produits et/ou le test afin de réduire le stress induit par le replacement de l’animal au sein de ses congénères. Lors du change des cages hebdomadaire, les animaux font l’objet d’un suivi par l’expérimentateur avec entrée des observations (et des éventuelles action prises) dans une base de données. Les membres de la SBEA (Structure Bien-Etre Animal) effectuent une observation mensuelle de tous les animaux.. Le raffinement sera aussi obtenu grâce au recours à des procédures les moins invasives possibles ainsi qu’à une familiarisation des animaux aux procédures expérimentales (période d’habituation aux pièces et aux dispositif, phase de familiarisation aux manipulations...). De plus, des points limites adaptés (impliquant l'arrêt des expériences sur l'animal concerné), suffisamment prédictifs et précoces, ont été définis afin de limiter la douleur des animaux à son minimum.
Choix des espèces
La souris est déjà grandement caractérisée d’un point de vue comportemental et neurochimique et possède un système nerveux suffisamment évolué pour envisager raisonnablement une extrapolation à l’homme de certains résultats. De nombreux parallèles existent en effet entre les caractéristiques comportementales étudiées chez la souris et les caractéristiques du comportement humain. Cette espèce est la plus couramment utilisée pour évaluer les troubles du spectre autistique. De plus, la souris est une espèce pour laquelle il est possible d’avoir des effectifs permettant d’avoir une robustesse des résultats statistiques, et pour laquelle les quantités nécessaires de lots de recherche synthétisés par la chimie sont minimes. Dans deux de nos modèles d’autisme induits pendant la gestation, les injections de produits se font entre le 9ème et le 15ème jour de gestation, d’après les données de recherche qui suggèrent qu’ils s’agit d’une fenêtre critique pour l’induction des symptômes autistiques dans la descendance. Les études comportementales et/ou neurochimiques menées sur la descendance dans ces deux modèles, mais également dans nos deux modèles génétiques de l’autisme, se feront sur des souris jeunes adultes à partir de 7 semaines (animaux sevrés depuis plus de 3 semaines et suffisamment âgés pour avoir un comportement social élaboré).
Rôle des cellules dendritiques dans le développement et la progression du cancer du pancréas
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2 442 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune ouverte au niveau de l'abdomen pour recevoir une injection de cellules cancéreuses directement dans le pancréas. 244 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, les 2 198 autres d'un niveau modéré. À la chirurgie s'ajoutent jusqu'à cinq séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie et seize gavages, tandis que la tumeur pancréatique provoque des douleurs abdominales et, chez quelques individus, des métastases au foie ou au côlon. Le porteur vise l'identification de cibles moléculaires susceptibles d'améliorer un jour la réponse à la chimiothérapie, dans un cancer dont il rappelle qu'il a le plus mauvais taux de survie à cinq ans.
Objectifs
Le cancer du pancréas a le plus mauvais taux de survie à 5 ans de tous les types de cancer et est souvent résistant à la chimiothérapie classique. Il est donc urgent de trouver des options thérapeutiques innovantes. Les tumeurs sont des systèmes complexes constitués d'une multitude de populations cellulaires immunitaires et non immunitaires différentes, qui forment ensemble le microenvironnement tumoral. Au cours de la dernière décennie, il est devenu évident que les cellules dendritiques jouent un rôle clé dans l'initiation des réponses immunitaires anti-tumorales en absorbant les antigènes tumoraux et en amorçant les cellules T cytotoxiques dans les ganglions lymphatiques. Cependant, les études les plus récentes montrent que les cellules dendritiques sont généralement sous-représentées dans le microenvironnement tumoral de différents cancers et qu'elles sont peu performantes. Chez l'homme, les patients présentant un nombre élevé de cellules dendritiques dans le microenvironnement tumoral ont une meilleure survie et une meilleure réactivité au traitement, quel que soit le type de cancer en question. Cependant, le mécanisme qui cause la rareté et le dysfonctionnement des cellules dendritiques dans le microenvironnement tumoral est inconnu. L'objectif du projet est donc de comprendre l'hétérogénéité et la composition du microenvironnement de la tumeur pancréatique et la manière dont cela affecte la fonction des cellules dendritiques en ce qui concerne le développement et la progression de la tumeur. Sur le plan technique, une technologie de pointe permettra de caractériser la composition et le positionnement des cellules immunitaires dans le microenvironnement de la tumeur pancréatique au cours des différentes étapes de l'apparition et du développement du cancer dans un modèle de souris couramment utilisé pour le cancer du pancréas. L'objectif final est d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles permettant d'améliorer l'efficacité anti-tumorale des thérapies actuellement disponibles et de nouvelles options thérapeutiques centrées sur les cellules dendritiques.
Bénéfices attendus
Dans ce projet, nous visons à caractériser les cellules immunitaires et en particulier les cellules dendritiques dans le microenvironnement tumoral de l'adénocarcinome pancréatique à différents stades de l'apparition et du développement du cancer. Les cellules dendritiques sont souvent sous-représentées dans le microenvironnement tumoral et ne parviennent pas à exercer leur fonction normale, à savoir la présentation d'antigènes dérivés de la tumeur aux cellules immunitaires T dans les ganglions lymphatiques et l'induction de réponses immunitaires antitumorales. Notre objectif est d'identifier les interactions entre les cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral qui sont à l'origine de la rareté et du dysfonctionnement des cellules dendritiques dans l'adénocarcinome pancréatique. Ensuite, nous utiliserons les connaissances acquises pour sélectionner des cibles moléculaires potentielles qui pourraient aider à améliorer la réactivité à la chimiothérapie et à la thérapie par 'checkpoint' immunitaire.
Procédures
Les animaux auront une injection chirurgicale de cellules dans le pancréas. Durée 15 min par animal, sous anesthésie générale et analgésie adaptée.. Les animaux auront des injections d'analgésiques en sous-cutanée (3 en tout) Avant les injections sous-cutanées, un anesthésique local sera utilisé pour anesthésier la peau. Imagerie in vivo : une fois par semaine, durée 15 min par animal, (n=5 au maximum) sous anesthésie générale, avec injection d'agent pour la luminisecence (1 fois par séance, sous anesthésie générale). Gavage oral pour certaines souris : deux fois pendant des jours consécutifs, 8 sessions, soit 16 gavages, 1 min par animal. Prises de sang : un animal par groupe sera prélevé sous anesthésie générale, 1 fois, durée 3 minutes.
Impact sur les animaux
La chirurgie d'injection de cellules dans le pancréas induira par elle même des nuisances légères dues à la préhension puis à la cicatrisation de la plaie (inconfort, douleur légère). La croissance des tumeurs dans le pancréas induira pour la majorité des individus des nuisances modérées (potentiellement : douleurs abdominales) du fait du suivi clinique et en imagerie (arrêt de la procédure à une taille limitée). Pour certains individus (rares), il pourra y avoir des métastases hors du pancréas (foie, colon). Dans, ce cas, les conséquences pourraient être éventuellement sévères (douleurs, anorexie potentielle). Le nuisances liées aux gavages, injections et prises de sang seront légères et temporaires (inconfort, stress temporaires).
Devenir
Tous les animaux participant à cette étude subiront une chirurgie abdominale pour introduire l'adénocarcinome pancréatique. Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever la tumeur et différents organes (sang, ganglions lymphatiques) pour différents types d'analyses immunologiques. La réutilisation des animaux n'est pas possible.
Remplacement
Ce projet nécessite l'établissement de l'adénocarcinome pancréatique dans toute sa complexité au niveau systémique. À l'heure actuelle, les approches organoïdes (= 3 D structure composée de cellules et ressemblant à un organe) existantes pour l'adénocarcinome pancréatique ne parviennent pas à reproduire la diversité des cellules immunitaires infiltrant et existant dans le microenvironnement tumoral. En outre, le projet nécessite la présence de une formation de cellules sanguines dans la moelle osseuse, d'une circulation sanguine et de ganglions lymphatiques. Dans notre cas, cela est important car les cellules dendritiques proviennent de la moelle osseuse et atteignent le pancréas via la circulation sanguine. Après avoir absorbé les antigènes tumoraux, les cellules dendritiques migrent de la tumeur vers les ganglions lymphatiques pour induire des réponses immunitaires antitumorales. Nous rechercherons régulièrement des stratégies de remplacement dans la littérature. De futures questions scientifiques, par exemple l'essai de médicaments qui ciblent les cellules ou les molécules identifiées dans ce projet, pourraient permettre de passer à une approche in vitro d'organoïde 3D à l'avenir.
Réduction
Nous avons pris en compte de multiples facteurs qui nous permettent de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour répondre aux questions scientifiques sous-jacentes. Tout au long du projet, nous adhérons à des normes largement acceptées dans la littérature internationale et continuons à réviser nos approches. Le nombre d'animaux analysés dans les groupes expérimentaux est maintenu aussi bas que possible afin de pouvoir tirer des conclusions valables et significatives des expériences proposées. En outre, pour répondre à nos questions scientifiques, nous utiliserons des méthodes à haut débit impartiales qui maximisent les connaissances acquises à partir d'une petite cohorte d'animaux. En outre, nous planifierons et exécuterons les expériences de manière réfléchie afin de combiner le plus grand nombre possible de tissus d'intérêt et de groupes de contrôle. Grâce à ces stratégies, nous visons à réduire le nombre d'animaux au minimum, tout en garantissant des résultats scientifiquement pertinents.
Raffinement
Des contrôles seront effectués quotidiennement. En outre, les chercheurs évalueront fréquemment (deux fois par semaine) les souris sur le plan clinique selon les critères définis précis. Les critères scientifiques de suivi sont atteints avant que la souffrance ne dépasse les points limites définis par l’éthique. En détail, les critères scientifiques de suivi sont sélectionnés pour couvrir chaque étape du développement de la tumeur. Les points temporels précoces et intermédiaires sont sélectionnés pour étudier le remodelage des tissus et l'établissement de la tumeur. Les points temporels longs (> 28 jours) sont sélectionnés pour assurer la croissance de la tumeur. Quand le point limite est atteint, les souris sont immédiatement retirées de l'étude . En ce qui concerne la manipulation des souris, celles-ci disposeront de suffisamment de temps pour s'acclimater à leur nouvel environnement, y compris pour entrer en contact avec les chercheurs avant le début des expériences. Nous appliquerons des méthodes visant à réduire le stress induit par la manipulation des souris, par exemple en évitant de les attraper par la queue et en optant plutôt de les recuperer aux creux des de nos mains ou tunnels. Les procédures seront effectuées dans un environnement stérile et des mesures appropriées seront prises pour éviter les infections post-procédure. L'anesthésie et l'analgésie seront pratiquées chaque fois que nécessaire pour réduire le stress et la douleur. Dès que les souris montrent de l'inconfort, la fréquence de surveillance sera augmentée et des mesures seront prises pour soulager le stress/la douleur. Les cages contiendront des enrichissements sous la forme de sizzlenest et de maisons ou tunnels en carton. Après le début de l'expérience (= injection de cellules tumorales), les souris resteront dans leur habitat habituel et seront continuellement hébergées en groupes sociaux.
Choix des espèces
- grande similitude avec l'homme en ce qui concerne la génétique et la complexité du système immunitaire - disponibilité d'une large gamme de modèles de souris génétiquement modifiées - disponibilité d'un modèle de tumeur murine bien établi - large éventail de techniques de laboratoire établies pour les souris Souris sexuellement matures, 8 et 12 semaines. Il est nécessaire d'utiliser des souris sexuellement matures entre 8 et 12 semaines pour s'assurer que a) la taille et le poids des souris sont suffisamment élevés pour supporter la croissance de la tumeur, b) la taille du pancréas est suffisamment grande pour l'injection de cellules tumorales et la croissance de la tumeur, c) le système immunitaire est mature.
Etude des effets de la défaite sociale sur le sommeil et des mécanismes neuronaux sous jacents chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Choisies pour leur comportement territorial pleinement développé, des souris CD1 de neuf à quatorze semaines sont mises face à d'autres souris mâles, cinq minutes durant, pour leur infliger une défaite sociale. 1 275 souris vont être utilisées au total, dont 806 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit deux chirurgies crâniennes sous anesthésie, l'une de deux heures et l'autre de quatre à six heures, l'implantation d'électrodes et de fibres optiques, cinq prélèvements de sang à la queue, puis des enregistrements de dix heures pendant son sommeil. Toutes sont tuées, pour prélever leur cerveau ou vérifier les sites d'injection.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre l’impact du stress sur le sommeil, en particulier le sommeil paradoxal, souvent perturbé dans les troubles psychiatriques comme le stress, l’anxiété et les troubles du stress post-traumatique. Nous utilisons un modèle de “défaite sociale” chez la souris, qui reproduit des symptômes similaires à ceux observés chez les humains souffrant d’anxiété. L’objectif est de déterminer comment ce stress affecte le sommeil en étudiant l’activité de cinq types de cellules cérébrales réparties dans des régions spécifiques du cerveau connues pour réguler le sommeil et le stress. Des techniques avancées seront utilisées pour observer et manipuler l’activité de ces cellules avant, pendant et après une situation de stress, afin de mieux comprendre leurs rôles dans les troubles du sommeil liés au stress.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à clarifier comment le stress perturbe le sommeil, en identifiant les cellules cérébrales impliquées. Ces connaissances sont cruciales pour développer de nouveaux traitements pour les troubles du sommeil et les maladies psychiatriques associées, telles que la dépression et le syndrome de stress post-traumatique. En comprenant mieux les mécanismes du sommeil, nous espérons améliorer la qualité de vie des personnes touchées par ces troubles.
Procédures
Les animaux seront soumis à quatre types d’interventions principales : prélèvements sanguins, chirurgies, et une procédure de stress psychosocial couplée à des enregistrements comportementaux et physiologiques. 1/ Prélèvements sanguins : Ces prélèvements rapides (moins de 5 minutes) se feront au niveau de la queue, trois fois au maximum sur une seule journée avant le stress, puis à deux moments précis après celui-ci (1 heure et 8 heures). Cette approche permet de suivre les réponses physiologiques au stress tout en minimisant les manipulations. 2/ Chirurgies : Deux interventions sous anesthésie générale sont prévues pour la majorité des animaux. La première est une intervention préparatoire d’environ 2 heures. La seconde, plus complexe, réalisée au moins 7 jours plus tard, dure entre 4 et 6 heures. 3/ Stress psychosocial : certains groupes d’animaux participeront à une session unique d’interaction sociale contrôlée pour induire un stress modéré. 4/ Enregistrements comportementaux et physiologiques : Après une phase d’habituation post-chirurgicale, des enregistrements de 10 heures seront réalisés, principalement durant le sommeil des souris. Ces enregistrements seront répétés après l’exposition au stress, sur une durée totale ne dépassant pas 10 semaines après la chirurgie. Enfin, tous les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances attendues concernent l’implantation d’électrodes, de fibres optiques, et l’usage d’implants. Ces procédures, couramment pratiquées, ont démontré une excellente tolérance chez les animaux, sans inconfort significatif ni modifications comportementales. Cependant, certaines nuisances pourraient apparaître: - Court terme (0 à 24h après la chirurgie) : Les risques incluent les réactions à l’anesthésie, l’hypothermie, et les hémorragies, tous systématiquement gérés par nos procédures opératoires. - Moyen terme (1 à 7 jours) : Les risques sont liés à des infections locales du tissu cérébral ou à l’ischémie suite à l’implantation d’électrodes ou de fibres. Nos suivis montrent une tolérance élevée des implants et des électrodes, avec un risque très faible d’infection ou de lésion cérébrale. - Long terme (au-delà de 15 jours) : Bien que l'implantation puisse théoriquement induire des nuisances liées à la présence physique de l'implant, telles que des chocs ou des difficultés de mouvement, notre expérience montre que ces événements sont rares. L'isolement nécessaire à la protection des implants peut conduire à des répercussions émotionnelles. Cet isolement est géré avec des périodes d'interaction sociale sous supervision pour maintenir un équilibre social. Les implants sont conçus pour être légers et compacts. Cette conception minimise tout désagrément et assure que la liberté de mouvement des animaux reste intacte. L'usage de câbles connectant l'implant au matériel d'enregistrement, bien que potentiellement restrictif, est attentivement géré à travers une surveillance constante durant les sessions d'enregistrement. Cette approche permet d'ajuster le dispositif en temps réel pour éviter tout inconfort, assurant une acclimatation progressive des souris au système. Dans le cadre du protocole de défaite sociale, la souris testée peut être exposée à un risque de blessure lors de l’interaction avec une souris dominante. Cependant, une surveillance attentive pendant les 5 minutes d’exposition permet d’intervenir rapidement pour prévenir toute violence excessive, assurant ainsi la sécurité des souris. Nos méthodes éprouvées garantissent un contrôle efficace des interactions, ce qui permet de collecter des données fiables sur le comportement induit par le stress.
Devenir
À l’issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés, certains pour permettre la récupération des cerveaux en vue d’analyses histologiques, et d’autres pour vérifier avec précision les sites d’injection.
Remplacement
Notre objectif est d’étudier les mécanismes neuronaux responsables de l’adaptation des états de vigilance après un stress. Ces études ne peuvent pas, pour le moment, être réalisées in vitro, ex vivo ou in silico. Les invertébrés, avec leur système nerveux simplifié, ne fournissent pas non plus un modèle adéquat pour notre étude. Nous examinons des réponses électrophysiologiques et des paramètres physiologiques essentiels, tels que la respiration et le rythme cardiaque, qui nécessitent un organisme complexe et proche physiologiquement de l’être humain pour des comparaisons pertinentes. Les comportements spécifiques, les cycles de sommeil, et l'existence de souris génétiquement modifiables font de ce modèle le plus adapté pour explorer l'impact du stress sur le sommeil. La souris est donc indispensable pour notre projet, étant le seul modèle qui satisfait à l'ensemble de ces exigences.
Réduction
Afin de minimiser l’utilisation d’animaux, nous améliorerons l’efficacité des différentes procédures chirurgicales et le suivi longitudinal des animaux. Nous couplerons également les différentes techniques à l’analyse électrophysiologique systématique. Cela nous permettra d’avoir des données complémentaires pour chaque souris. L’utilisation de différents sites d’implantation des électrodes nous permet de récolter un nombre conséquent de données par animal, permettant ainsi de réduire le nombre total d’animaux utilisés pour répondre à différentes questions. Quand cela est possible scientifiquement, les animaux sont utilisés dans différentes conditions expérimentales (condition sans stress vs après stress) afin qu’ils soient son propre contrôle et ne pas doubler le nombre d’animaux. Le nombre d'animaux requis pour ces expériences sera réduit au minimum nécessaire pour pouvoir réaliser des tests statistiques à partir de nos résultats avec une puissance suffisante. Étant donné que nos résultats dépendent du taux de succès des expressions des constructions permises grâce aux injections virales, de la qualité des signaux recueillis par les électrodes implantées, de la bonne position des fibres et de la qualité des signaux fluorescent obtenues, nous nous attendons à un taux global de succès situé au alentour de 70%. Ce chiffre prend en compte l’implantation optimale des électrodes, le maintien de l’intégrité du connecteur et de la fenêtre crânienne et la variabilité des expériences comportementales. Actuellement, le comportement de défense de territoire, essentiel au protocole de défaite sociale, n'est pas clairement établi chez les femelles, nous conduisant à utiliser uniquement des souris mâles. Cette spécificité réduit davantage le nombre d'animaux nécessaires à notre étude.
Raffinement
- Une semaine avant la chirurgie, les animaux seront acclimatés pour réduire le stress. Une manipulation quotidienne sera réalisée pour les habituer aux interactions humaines. Leur environnement sera enrichi par du coton, un dôme et des tubes pour leur offrir un confort optimal. - Les interventions chirurgicales respecteront rigoureusement les normes d’anesthésie et d’analgésie. Une prise en charge spécifique de la douleur sera assurée pendant une semaine de convalescence, avec un suivi quotidien pour détecter et traiter tout signe de douleur post-opératoire. - Si une souris présente des signes de malaise ou un comportement anormal, une évaluation sera effectuée pour déterminer si des analgésiques ou, dans les cas graves, une euthanasie sont nécessaires. En cas d’infection, un traitement adapté sera administré. - Les implants utilisés sont conçus pour être légers et compacts, minimisant tout inconfort et préservant la liberté de mouvement des animaux. Pendant les sessions d’enregistrement, les câbles connectant l’implant au matériel sont surveillés en permanence, permettant des ajustements en temps réel pour éviter toute gêne et favoriser une acclimatation progressive des souris. - Dans le protocole de défaite sociale, les souris sont exposées à une souris dominante, ce qui peut présenter un risque de blessure. Pour limiter ce risque, la phase d’exposition directe est strictement limitée à 5 minutes, avec une surveillance constante pour prévenir toute violence excessive et garantir la sécurité des souris. Si une blessure survient malgré ces précautions, la souris sera immédiatement replacée dans sa cage, et la plaie désinfectée. La blessure sera surveillée, et un vétérinaire consulté en cas de cicatrisation difficile ou d’infection. - Les souris seront hébergées individuellement dans un environnement enrichi. Si des signes d’anxiété persistante ou d’inactivité sont observés, tels qu’une réduction de la mobilité, de l’apathie, un isolement comportemental ou une posture passive, un enrichissement supplémentaire sera ajouté (matériaux à ronger, sciure pour fouissage). Une manipulation humaine douce et régulière sera également effectuée. Si les symptômes persistent, des sessions d’interaction contrôlée seront organisées avec un congénère de même sexe et de la même fratrie.
Choix des espèces
Les rongeurs, en particulier les souris, sont privilégiés dans la recherche comportementale et physiologique, grâce à leur cognition complexe et leur similitude fonctionnelle avec les humains. La souris se distingue par sa capacité d'adaptation rapide, ce qui la rend particulièrement appropriée pour nos études. Cette espèce bénéficie également d'un vaste corpus de données électrophysiologiques préexistantes et d'un éventail étendu d'outils pharmacologiques et de modèles génétiques. Cette richesse de ressources facilite l'intégration avec les recherches antérieures et contribue à une réduction globale du nombre d'animaux nécessaires. De plus, les avancées en génétique de la souris permettent des manipulations ciblées des réseaux neuronaux, offrant des possibilités inégalées par d'autres modèles et essentielles pour approfondir notre compréhension des mécanismes en question. Les procédures chirurgicales seront réalisées chez des animaux de 6 à 8 semaines, âge où le développement du cerveau et du crâne est stabilisé, garantissant des coordonnées d’injection précises et cohérentes. Les enregistrements d’activité cérébrale se limiteront à 10 semaines après l’implantation des électrodes, soit jusqu’à 4 mois. Cette durée est essentielle pour préserver une qualité de signal constante et éviter les variations liées à l’usure des implants. De plus, cette limite prend en compte l’évolution de l’architecture du sommeil avec l’âge, ce qui pourrait altérer la comparabilité des données. Les souris de la lignée CD1 dominantes auront entre 9 et 14 semaines, âge où leur comportement social et territorial est pleinement développé. Cela garantit des interactions sociales standardisées et réduit les variations dues à l’immaturité ou à des changements physiologiques chez des animaux trop jeunes ou trop âgés.
Activité interaréale pendant l’apprentissage de la locomotion et de l’orientation
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérées une ou deux fois du crâne sous anesthésie, certaines subissant en plus une intervention de deux heures pour mesurer leur activité musculaire, 500 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse histologique du cerveau. Elles enchaînent ensuite une quinzaine de sessions d'enregistrement de trente à quarante minutes, jusqu'à deux par jour, la tête fixée et les mouvements limités. Le projet cherche à comprendre comment le cervelet et le cortex coordonnent la marche et l'orientation dans l'espace. Une partie des souris est hébergée seule pour protéger les implants, sans que le RNT précise combien ni pendant combien de temps, et aucun des tests comportementaux annoncés n'est nommé.
Objectifs
Dans ce projet, nous étudierons l'orientation spatiale et le contrôle moteur, ainsi que l'intégration multisensorielle et les transformations sensorimotrices nécessaires à ces processus. Nous étudierons comment le cerveau code et combine les informations provenant de sources internes et externes pour percevoir l'environnement, produire un sens de l'orientation et exécuter les réponses comportementales appropriées. Nous utilisons des approches expérimentales complémentaires à plusieurs niveaux chez les rongeurs, au niveau des cellules et des circuits in vivo. Avec nos expériences, nous voulons répondre aux questions suivantes: Comment l'activité cérébelleuse et l'interaction entre le cervelet et le cortex cérébral génèrent-elles une production motrice coordonnée et facilitent-elles l'orientation ? Comment l'activité neuronale se traduit-elle par une activation musculaire et, à son tour, par une production motrice ? Comment des sous-classes de neurones spécifiques contribuent-elles au contrôle moteur et à l'orientation ? Nous visons à étudier l'activité de la population neuronale liée aux schémas de marche spatiale et à l'orientation de la tête, révélant ainsi les mécanismes cérébraux du contrôle moteur, de la coordination, de la navigation spatiale, de la cognition et de l'apprentissage.
Bénéfices attendus
Notre recherche vise à comprendre les bases fonctionnelles qui permettent au cerveau de s'orienter dans l'environnement et d'effectuer des tâches motrices complexes. Nous serons ainsi en mesure, à terme, de démontrer comment le cerveau est capable d’orienter et d’orchestrer le mouvement dans des conditions physiologiques. Une meilleure compréhension du fonctionnement des neurones dans les structures concernées est nécessaire pour permettre un diagnostic précoce et un traitement des pathologies neurologiques liées à des dysfonctionnements moteurs et à des déficits d'orientation.
Procédures
Dans cette étude, les souris participeront à l’une des trois approches expérimentales suivantes : Approche 1 : Étude de l’activité cérébrale pour comprendre le rôle du cervelet et de son interaction avec le cortex dans le contrôle des mouvements et l’orientation dans l’espace. Approche 2 : Enregistrement simultané de l’activité cérébrale et de l’activité musculaire pour explorer comment le cerveau contrôle les mouvements. Approche 3 : Analyse des liens de cause à effet entre l’activité cérébrale et les comportements des souris. Selon l’approche, les souris seront soumises à une ou deux interventions chirurgicales pour permettre la mesure optique ou électrique de l'activité neuronale. Ces interventions chirurgicales durent 1 heure. Quelques souris subissent une intervention chirurgicale pour mesurer l'activité musculaire qui dure 2 heures. Les souris participeront ensuite à environ 15 sessions de tests comportementaux pendant lesquelles leurs mouvements, leur activité cérébrale et, dans certains cas, leur activité musculaire ou leurs réponses optogénétiques seront mesurés. Chacun de ces enregistrements dure de 30 à 40 minutes, avec un maximum de deux par jour. Pour éviter que leurs congénères n’endommagent les dispositifs implantés, certaines souris seront hébergées individuellement après l’implantation. Pendant les enregistrements, les animaux seront placés de manière à limiter leurs mouvements pour garantir la précision des mesures.
Impact sur les animaux
Les chirurgies prévues par le protocole impliquent des dommages osseux et tissulaires. En conséquence, les animaux peuvent être potentiellement exposés à la douleur combinée à une perte de poids, à l'immobilité ou à un comportement anormal. Avant, pendant et après la chirurgie, nous traitons ces problèmes potentiels par l'administration de médicaments analgésiques et anti-inflammatoires. La durée typique de récupération après une opération est de 2 à 3 jours, période pendant laquelle les animaux sont traités avec ces médicaments. La fixation de la tête pendant l'exécution d'une tâche motrice complexe peut induire un état de stress chez l'animal. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement anormal indésirable. Pour éviter cette situation, chaque animal subira un protocole d'habitutation progressive sur une période de 2 à 3 jours comprenant une augmentation progressive du temps passé en situation de tête immobilisée.
Devenir
Le cerveau des 500 animaux est utilisé après le protocole expérimental pour effectuer des analyses histologiques.
Remplacement
L'intégration des informations sensorimotrices pendant la navigation spatiale libre implique de multiples régions et réseaux cérébraux. Afin de comprendre le rôle des neurones dans le comportement moteur et l'orientation, il est donc primordial de réaliser des expériences sur animal vivant et libre de ses movements afin de conserver la structure et l’activité des réseaux neuronaux sous-jacents. : Il s’agit d’un projet de neurophysiologie intégrative qui ne peut être conduit que sur animal vivant.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, cette étude d'imagerie in vivo est réalisée avec des implants chroniques. Une fois implantés, les animaux sont maintenus en vie et utilisés pour de nombreuses sessions d'enregistrement. L'optimisation des soins aux animaux contribue en outre à l'utilisation d'animaux pour plusieurs sessions d'enregistrement. Enfin, nous utiliserons les tests statistiques appropriés afin d’obtenir des résultats exploitables à partir du plus petit nombre d’animaux possible. Les tests statistiques que nous appliquerons seront adaptés aux analyses.
Raffinement
Les animaux de l'étude optogénétique sont gardés dans des cages dans l'animalerie avec leurs congénères. Les animaux sous examen électrophysiologique doivent être hébergés seuls après l'étape d'implantation afin de protéger l'implant des dommages causés par les congénères. Les cages seront enrichies de roues de course et des rouleaux pour se cacher. Les souris seront maintenues avec eau et nourriture ad libitum. Leur état général sera surveillé de façon quotidienne pendant toute la durée du protocole. Pour éviter toute souffrance, tout signe de douleur, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques et anti-inflammatoires. Une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. La surveillance régulière de l'animal permettra d'arrêter toute procédure expérimentale en cas de signes d’anxiété ou de souffrance définis dans l’échelle d’évaluation.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle reconnu pour les expériences de neurophysiologie intégrative. En combinant souris transgénique et injections virales nous serons en mesure de mesurer l’impact fonctionnel d’une population neurale spécifique. Il s'agit de mammifères dont le fonctionnement du cerveau peut être comparé à celui de l'homme pour les questions abordées dans ce projet. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge où leur activité motrice est arrivée à son niveau mature (>P30) et pendant les deux mois qui suivent. À cet âge, la locomotion est entièrement développée et les structures cérébrales impliquées dans la locomotion et l'orientation sont matures.
Etude des réponses immunitaires et de la diminution de l’infection chez des souris vaccinées contre Besnoitia besnoiti
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Éveillées, les souris subissent quatre prises de sang, deux ou trois instillations de vaccin dans le nez et, pour certaines, une ou deux injections dans le derme et un poinçon à l'oreille. 73 souris adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour un vaccin destiné aux bovins contre la besnoitiose, une maladie parasitaire des troupeaux. Le porteur écrit qu'"aucun modèle animal, même chez les bovins, ne permet de reproduire la pathologie", et que le choix de la souris "peut se justifier" par la présence du parasite chez des souris sauvages. Il prévoit de mesurer la multiplication du parasite et la baisse de la charge parasitaire, sans qu'aucune procédure ne décrive l'infection des souris.
Objectifs
La besnoitiose, causée par le parasite unicellulaire Besnoitia besnoiti (B. besnoiti), représente une menace significative pour l’élevage bovin. Cette maladie entraîne des conséquences graves telles que l’infertilité, des atteintes cutanées, une perte de poids et une mortalité jusqu’à 10% au sein des troupeaux. Maladie ré-émergente en Europe, la besnoitiose progresse du sud vers le nord en France. Les parasites présents dans la peau peuvent être transmis par l’intermédiaire d’insectes ou d’aiguilles avec une progression jusqu’à 20% de nouveaux animaux infectés par an dans les troupeaux touchés. Une transmission par ingestion de parasites présents dans l’environnement sous forme d’oocystes est également suspectée. Aucun traitement curatif n’est disponible en Europe et les moyens de lutte sont limités au dépistage et à l’élimination des animaux malades ou à l’application d’insecticides. Le développement d’un vaccin efficace offrirait aux éleveurs une meilleure stratégie de contrôle de cette maladie. Le but de ce projet est d’évaluer l’immunogénicité et l’efficacité d’un vaccin sous-unitaire à administration nasale et dermique contre la besnoitiose. Ce vaccin est constitué de protéines et de glycolipides de B. besnoiti associés à un muco-excipient à base d’amidon. Les souris seront immunisées par voie nasale seule ou par voie nasale puis par voie intradermique afin de déterminer la meilleure stratégie d’administration pour déclencher une réponse immunitaire optimale, tant systémique que locale (cutanée). En effet, la voie nasale d’administration du vaccin devrait déclencher une réponse immunitaire muqueuse, notamment du système respiratoire et de l’intestin, permettant une protection contre une infection orale. Cependant, il n’est pas certain que cette voie d’administration déclenche une réponse immunitaire protectrice contre une infection cutanée. Dans ce cas, une administration intradermique pourrait être nécessaire. Au total, 73 souris adultes seront nécessaires. Puisque le remplacement par des méthodes in vitro n'est pas envisageable en raison de la complexité du système immunitaire et de la nécessité d'étudier l'ensemble de ses réponses, le nombre de souris a été réduit au minimum requis pour obtenir des résultats significatifs. Les souris seront hébergées conformément aux directives européennes, avec un enrichissement (cachette, matériaux à ronger, renforcement positif alimentaire). Toute médication interférant avec la réponse immunitaire est proscrite.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la mise en évidence du développement d’une immunité protectrice contre Besnoitia besnoiti associée à un effet protecteur contre une infection par le parasite. Ces résultats sont essentiels pour envisager une vaccination de bovins, cibles du vaccin anti-besnoitiose.
Procédures
Les animaux vigiles subiront 4 prises de sang et 4 pesées à 2 semaines d’intervalle et recevront 2 ou 3 instillations par voie nasale à 2 semaines d’intervalle. Certains animaux seront soumis à 1 ou 2 administrations intradermiques à deux semaines d’intervalle et certains animaux seront identifiés une fois à l'oreille. Chacune de ces interventions dure moins d’une minute.
Impact sur les animaux
La contention nécessaire pour les administrations nasales et intradermiques ainsi que pour les prises de sang peut engendrer du stress. L’identification des animaux par poinçon à l’oreille peut entrainer une douleur locale temporaire. Les prises de sang peuvent entrainer un hématome ainsi qu’une douleur localisée temporaire. L’injection intradermique peut entrainer une douleur locale temporaire. L’administration du vaccin peut entraîner une inflammation.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin d'étudier les réponses immunitaires cellulaires induites par les différentes formulations vaccinales, de déterminer la capacité du parasite à se multiplier in vivo et de déterminer la protection induite par la vaccination en terme de réduction de la charge parasitaire.
Remplacement
Il n'existe actuellement aucun modèle de remplacement capable de reproduire la complexité du système immunitaire et d'étudier l'ensemble des réponses immunitaires suite à une vaccination.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience acquise sur des projets de vaccination contre des parasites de la même famille. Les analyses statistiques seront faites sur les dosages des molécules produites par les cellules du système immunitaire et sur le nombre de parasites.
Raffinement
Les souris seront hébergées en accord avec les directives européennes sur des portoirs ventilés à raison de 4 maximum par cage, dans un environnement enrichi permanent (de type igloo pour se cacher) ou ponctuel (de type carré en cellulose pouvant être dépouillé pour la confection d’un nid) après chaque procédure. Une habituation à la prise en main sera réalisée avant le début du protocole. Un renforcement positif sous forme de récompense alimentaire (par exemple : rondelle de banane séchée, popcorn…) sera appliqué après chaque utilisation d’aiguille. Les responsables du projet ont l’habitude de pratiquer les procédures mises en place. Des points limites sont déterminés en vue de mettre fin à d'éventuelles souffrances.
Choix des espèces
Les rares essais d’infection expérimentale par Besnoitia besnoiti sont peu concluants puisqu’aucun modèle animal, même chez les bovins, ne permet de reproduire la pathologie. De plus, le parasite n’est pas détecté chez tous les individus infectés lors d’une même expérience. Le choix de la souris peut se justifier par le fait que Besnoitia besnoiti a déjà été détecté chez la souris sauvage, que les parasites ont été localisés dans la cavité péritonéale et les organes internes après infection intrapéritonéale de souris et que les parasites présentaient la même morphologie chez des souris expérimentalement infectées que chez des bovins naturellement infectés. Animaux adultes. Cette expérience ne nécessite pas un stade de développement particulier.
Etudes de l’effet d’un thérapeutique dans un modèle d’AVC thromboembolique chez des souris hyperglycémiques.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
95 souris rendues hyperglycémiques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une incision entre l'œil et l'oreille droite, la section du muscle masséter, une craniotomie et le retrait de la dure-mère précèdent l'injection qui déclenche l'accident vasculaire cérébral, après cinq jours d'injections quotidiennes et dix prélèvements de sang au bout de la queue. Elles passent à cinq reprises des tests de traversée de couloir et de force des membres antérieurs, puis une IRM, avant d'être tuées à J15 par perfusion transcardiaque sous anesthésie. Le porteur écrit que la région cérébrale lésée ne cause pas d'effets délétères à long terme et que l'animal peut continuer à s'alimenter, s'abreuver et se fabriquer un nid.
Objectifs
Le but de l'expérience est de déterminer si une nouvelle formulation du tPA peut permettre une augmentation de son efficacité thrombolytique sur le caillot généré chez la souris hyperglycémique.
Bénéfices attendus
L'accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral dans le cas des ischémies thrombotiques est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Le tPA permet une réduction significative de l’œdème cérébral généré suite à la mort des neurones causée par la sous oxygénation des cellules due à l’ischémie vasculaire. Il est cependant connu que le tPA altère le caillot thrombotique en surface. Administré sous une autre forme, le tPA pourrait avoir une durée de vie plus grande dans le système vasculaire, avoir une action plus ciblée sur le caillot thrombotique et avoir, selon des études préliminaires, une action thrombolytique au cœur du caillot en plus d’attaquer ses surfaces externes ce qui permettrait en théorie d’avoir un effet thrombolytique supérieur et par conséquent une lésion cérébrale réduite ainsi qu’une meilleure récupération fonctionnelle. Cette étude pourrait mettre en évidence une formulation du tPA plus efficace que celle utilisée actuellement contre les AVC thromboemboliques.
Procédures
Les animaux subiront pendant 5 jours une injection quotidienne. Ensuite, 2 fois par semaine pendant 5 semaines, un jeûne de 4h avant prélèvement d’une goutte de sang pour sera réalisé. Pour le premier prélèvement, l’expérimentateur incisera le bout de la queue de l’animal vigil. Pour les prélèvements suivants, il suffira de gratter le tissu cicatriciel au bout de la queue pour récupérer une goutte de sang. Durée du prélèvement inférieure à 1 minute. Les animaux réaliseront des tests comportementaux (observation de la traversée de chaque animal dans un couloir et mesure de la force des membres antérieurs) avant chirurgie ainsi qu’à J1, J3, J7 et J15. Chaque test prendra 5 minutes. Sous anesthésie (à J0), une pose de cathéter sera réalisée sur la veine caudale. Ce dernier restera en place et sera retiré une fois le traitement administré. Nous comptons en moyenne 5 minutes pour la pose du cathéter. Elle sera suivie du modèle d’AVC de l’artère cérébrale moyenne (ACM) : Le site d’ouverture sera tondu et désinfecté avant l’application d’un analgésique local. Une incision de la peau sera effectuée entre l’œil et l’oreille droite. Le muscle masséter sera dissocié de la face latérale de l’os pariétal puis coupé en deux parties. Après repérage de l’ACM, une craniotomie localisée suivie du retrait local de la dure-mère seront réalisés. L’approche chirurgicale durera 20 minutes. L’ischémie cérébrale sera induite par une injection lente dans l’artère via une micro-pipette. L’incision sera suturée par méthode des points séparés. Chaque traitement sera administré 20 minutes post ischémie sur 40 minutes. A J1, les animaux anesthésiés subiront une IRM. Cette imagerie sera réalisée en 10 minutes. A J15, sous anesthésie profonde, les animaux seront mis à mort. Une perfusion transcardiaque permettra la fixation du cerveau avant prélèvement.
Impact sur les animaux
Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC ischémique à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Associé à l’hyperglycémie, nous nous attendons à avoir une lésion cérébrale plus importante ainsi qu’à l’apparition de légères transformation hémorragiques avec l’injection de tPA classique. Cela peut entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion. Néanmoins, le modèle utilisé ici affecte une région du cerveau ne causant pas d’effets délétères sur le long terme : l’animal peut continuer à s’alimenter, s’abreuver ou encore se fabriquer un nid.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement de sang et du cerveau post fixation pour analyse.
Remplacement
Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. D’un point de vue statistique, nous avons déterminé que le nombre idéal d’animaux par groupe est de 16. En effet, ce nombre est reconnu pour réduire au maximum le nombre d’individus, tout en conservant la pertinence scientifique et la significativité statistique.
Raffinement
Les souris seront 5 par cage maximum avec plusieurs enrichissements (sizzle-dri kraft, alpha-dri et bûchette de peuplier), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique adaptée au pallier de chirurgie. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Un analgésique local est appliquée dans les conduits auditifs. La température corporelle de l’animal est maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée. Pour toutes les phases chrurgicales, le site d’incision de la peau fait appel à une tonte préalable du pelage, puis à une désinfection et enfin l’application d’un analgésique local. Le choix de la technique de suture se porte sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Lors de la phase de réveil, la concentration d’anesthésique est ramenée à zéro, et le débit d’oxygène est élevé pour permettre une meilleure récupération post-opératoire. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera mis à mort. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivant l’opération (2 fois par jour). Avant la mise à mort, les animaux seront mis sous anesthésie sous-léthale et auront une couverture analgésique adaptée.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la protection, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par un AVC ischémique. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines soit un poids de 40-45g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.
essai d’un antihypertenseur sur des souris gestantes ayant une pathologie génétique
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
Traitées par l'eau de boisson pendant la dernière semaine de gestation, des souris mères mettent bas des souriceaux porteurs d'une maladie génétique rare qui provoque une mortalité périnatale par atteinte cardiorespiratoire. Une biopsie de génotypage est prélevée sur chaque petit au premier jour de vie, puis le traitement antihypertenseur continue dans l'eau pendant quatre semaines. 246 souris au total sont utilisées, 74 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 172 en souffrance légère. À la fin de la lactation, à quatre semaines, elles sont tuées pour examen de leur cœur et de leurs poumons.
Objectifs
L’étude porte sur deux pathologiques génétiques rares caractérisées par un retard de croissance sévère, des extrémités courtes, une peau épaisse et une raideur articulaire. Certains patients présentent des complications cardiorespiratoires responsables d'une mortalité précoce.. Des études préliminaires sur cellules issues de patients ont montré qu‘un traitement antihypertenseur permettrait de restaurer les atteintes cellulaires observées . De plus, ce traitement a été administré chez 3 patients atteints d’une de ces 2 pathologies, et a permis l’amélioration de l'épaisseur cutanée et de la raideur articulaire. Nous souhaitons étudier le bénéfice de ce traitement sur la mortalité et sur les atteintes cardiorespiratoires de ces deux pathologies chez les souris modèles étudiées dans notre laboratoire.
Bénéfices attendus
Ce nouveau projet permettra l'obtention de résultats préliminaires concernant l'efficacité d’un traitement antihypertenseur sur la mortalité de ces 2 pathologies génétiques. En cas de réduction de mortalité, cela permettra d'encourager la réalisation d'un essai clinique chez les patients en postnatal
Procédures
Les interventions sur le souris gestantes sont : - Traitement eau de boisson en continu (Durée = 1 semaine) Les interventions sur le souriceaux sont: - Traitement eau de boisson en continu (Durée = 4 semaines) - Biopsie pour le génotypage (à P1, durée: 1minute, nombre = 1 fois)
Impact sur les animaux
Les deux modèles murins présentent une mortalité en période perinatal secondaires à des atteintes cardiagues, respiratoires et des voies aériennes supérieures. Le traitement antihypertenseur n'est pas responsable d'une baisse de tension artérielle chez les souris aux doses utlisées selon les données de la litérature. Le traitement est bien toléré par ailleurs. Le poids sera surveillé 3 fois par semaine ce qui peut engendrer un stress. La manutention, notamment des souriceaux, peut engendre un stress.
Devenir
Ce projet comporte différentes expérimentations au cours desquelles les souris seront mises à mort à 4 semaines (fin de lactation) pour étudier et traiter l’atteinte cardio- respiratoire.
Remplacement
Il a déjà été montré que l’ajout de traitement antihypertenseur corrigeait les anomalies observées sur cellules de patients. Cependant, l’établissement d’une preuve d’efficacité d’un traitement pour une maladie multi-organe ne peut se faire qu’en utilisant des organismes vivants mimant la maladie humaine.
Réduction
Nous avons calculé le nombre de souris afin de pouvoir effectuer une analyse de puissance statistique suffisante. Les données seront analysées avec un test statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans un environnement enrichi (avec matériel à ronger et matériel de nidification), en évitant de conserver des animaux isolés. Les signes cliniques observés sont scorés grâce à une grille d’évaluation adaptée au modèle, permettant l’administration si besoin de molécules antalgiques. Si aucune amélioration n’est constatée, une décision de mise à mort sera prise. Les animaux seront maintenus au maximum de 5 par cage après sevrage dans un environnement enrichi (avec matériel à ronger et matériel de nidification), en évitant à chaque fois que cela est possible de conserver des animaux isolés. Pour les accouplements, un maximum de 2 femelles gestantes (et donc pas plus de 2 portées) seront maintenues par cage dans un environnement enrichi (avec matériel à ronger et matériel de nidification). De plus, afin de réduire le stress des mères allaitantes, des maisonnettes seront ajoutées à la cage.
Choix des espèces
L’étude sur des souris nous permettra d’étudier l'efficacité d'un traitement prénatal par traitement antihypertenseur dans les deux pathologies étudiées. La mortalité étant forte uniquement en période néonatale, nous traiterons les mères durant la gestation puis la lactation et recherchons une baisse de la mortalité périnatale. Nous étudierons les souris au stade juvéniles, stade où se manifestent les atteintes cardiorespiratoires.
Etude des circuits de la résignation acquise chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Génotypées entre six et huit jours de vie, les souris surnuméraires porteuses du génotype recherché sont transférées vers les projets d'autres équipes. Les 898 retenues ici subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger à sévère, 286 en gravité sévère et 120 opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. Chaque animal subit une chirurgie crânienne pouvant durer deux heures trente, puis trois jours de tests comportementaux dont deux séances de cinquante minutes, pour mesurer le rôle d'une région cérébrale dans un comportement de résignation, toutes étant tuées ensuite pour prélèvement de tissus. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne convient, la structure étudiée n'ayant été localisée à ce jour que chez les mammifères.
Objectifs
Il y a une quinzaine d’années, une nouvelle structure cérébrale a été identifiée. Cette région, en plus de ses connexions avec des zones cérébrales impliquées dans des pathologies psychiatriques, joue un rôle central dans la régulation des circuits cérébraux associés à la motricité et à la motivation. Elle est ainsi impliquée dans des pathologies telles que la maladie de Parkinson, l’addiction et la dépression. L’identification récente d’un marqueur spécifique pour cette région permet désormais de l’étudier de manière ciblée. Les objectifs de ce projet sont de tester le rôle de cette région et les conséquences dans sa modulation dans l’expression des symptômes dépressifs.
Bénéfices attendus
L'objectif premier de ce projet est fondamental et concerne la caractérisation du rôle d’une région cérébrale encore peu connue dans le développement et l’expression d’un comportement de résignation. Les données obtenues auront aussi un intérêt translationnel en psychiatrie, en ajoutant potentiellement une structure cérébrale clé à notre compréhension des mécanismes sous-tendant ce symptôme dans les troubles psychiatriques. À plus long terme, l’identification du rôle de cette structure pourrait permettre d’ouvrir vers la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques, avec notamment la recherche de médicaments pouvant affecter son activité pour le soulagement de troubles psychiatriques.
Procédures
Les animaux subiront 1 chirurgie d’au maximum 2h30. Les animaux subiront une séance de test comportemental par jour sur 3 jours, deux de 50 minutes et une de 15 minutes.
Impact sur les animaux
La chirurgie peut entraîner une inflammation locale transitoire au site d’incision (peau du crâne). Les expériences réalisées sont originaires de stress chez les animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus.
Remplacement
Compte tenu du sujet du projet, il est impossible de remplacer le modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, les réponses cérébrales et comportementales étudiées nécessitent un système nerveux complet et un animal entier, vivant et vigile. L’existence et la localisation de la structure cérébrale étudiée n’ont pour l’instant été établies que chez les mammifères, ne permettant donc pas en l’état actuel des connaissances d’utiliser un autre modèle animal.
Réduction
Les expériences sont menées en cherchant à limiter le nombre d'animaux, tout en obtenant l’information scientifique recherchée. Les animaux surnuméraires possédant un génotype recherché sont réutilisés dans les projets d’autres équipes. Pour les diverses expériences, ce nombre d'animaux nécessaire pour tirer des conclusions scientifiques statistiquement fiables est défini sur la base de notre expertise, de l'analyse de la littérature et de calculs de power analyse.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans des cages enrichies (bâton et frisure) favorisant leur comportement naturel (ronger et faire des nids). Ils sont acclimatés aux conditions d’hébergement et habitués aux expérimentateurs. Ils seront suivis pour déceler tout signe de mal-être. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont utilisées, la température maintenue (tapis chauffant) et les yeux protégés par du gel oculaire. Après la chirurgie, une grille d’évaluation est utilisée pour le suivi des animaux. Des soins, une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire et/ou une séparation des animaux seront réalisés si besoin après concertation avec le vétérinaire ou la cellule chargés du bien-être animal. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures pour limiter ou soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement pour cibler sélectivement les neurones de la structure cérébrale étudiée. Ceci implique l'utilisation de souris spécifiques et ne permet pas l'utilisation d'autres espèces. Étant donné que les études nécessitent des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés. Le génotypage est prioritairement effectué entre 6 et 8 jours (12 jours maximum), et la chirurgie à partir de 8 semaines d’âge.
Modèle murin d’immuno- thrombocytopénie (ITP)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Jusqu'à 21 prélèvements sanguins par animal sur douze semaines, plafonnés à 15 % du volume sanguin total sur 28 jours : 2 500 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une maladie auto-immune leur est déclenchée par jusqu'à quatorze injections d'anticorps dirigés contre leurs plaquettes, ce qui peut provoquer pétéchies, anémie, hématomes et saignements mal contrôlés. La plupart sont tuées pour prélèvement d'organes, 300 d'entre elles pouvant être réutilisées si elles n'ont reçu qu'une administration unique et n'ont montré aucun signe clinique. Le porteur, prestataire de services en recherche préclinique, range ce modèle dans le panel qu'il propose à ses clients pour évaluer des candidats médicaments avant les essais chez l'humain.
Objectifs
La thrombocytopénie immunitaire (ITP) est une maladie auto-immune hétérogène, caractérisée par la déplétion plaquettaire médiée par des cellules immunitaires. Cette pathologie est invalidante et potentiellement mortelle et résulte de la production d'anticorps antiplaquettaires entraînant une destruction accélérée des plaquettes et par conséquent un taux de plaquettes faible (thrombocytopénie). L’objectif de ce projet est d’utiliser un modèle murin permettant de reproduire les phénomènes de la thrombocytopénie le plus prédictif possible afin de refléter la pathologie chez l’homme et de pouvoir évaluer de nouveaux traitements. Le modèle consiste en l’injection d’anticorps dirigés contre des protéines plaquettaires chez des souris. Un suivi de la concentration plaquettaire dans le sang périphérique est fait pour confirmer le déclenchement de la maladie.
Bénéfices attendus
Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveaux composés thérapeutiques pour la recherche, spécifiquement dans des maladies médiées par le système immunitaire (inflammation, maladies auto-immunes, etc). Ce projet a pour finalité la mise au point d’un modèle chez la souris qui récapitule les aspects clés de l’ITP chez l’homme, et l’évaluation de l’efficacité de candidats médicaments. Ce modèle permettra de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à un modèle préclinique prédictif permettant de transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin résoudre ou réduire la pathologie.
Procédures
Les animaux seront pesés avant induction et l’étude durera au maximum 12 semaines. L’ITP est induite par un seul ou plusieurs traitements consécutifs (maximum 1 fois par jour pendant 7 jours consécutifs, pouvant être répété après une semaine de repos entre les différentes périodes d’induction, ou une fois toutes les 48h pendant maximum 4 semaines). Des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par différentes voies. Le nombre, le volume et la fréquence d’administration suivront les recommandations de SBEA (Structure du bien-être animale). Des prélèvements de sang, d’urine ou de fèces pourront être réalisés (3 minutes sur animal vigile, 15 minutes si anesthésie). Le nombre et la fréquence des prélèvements seront adaptés à la durée de la procédure et suivront les recommandations du comité d’éthique. Le volume et le nombre de prélèvements sanguins seront ajustés de manière à ne pas dépasser 10% du volume sanguin total (VST) de l'animal par prélèvement. Sur 28 jours consécutifs, le volume total prélevé sera limité à 15% du VST (ou 20% si les animaux sont réhydratés), avec un maximum de 7 prélèvements. Pour les études de durée maximale de 12 semaines, jusqu'à 21 prélèvements seront faits (soit 7 prélèvement maximum sur 28 jours consécutifs). La technique la plus éthique sera systématiquement privilégiée, et ces recommandations pourront être adaptées en fonction des effets observés sur les animaux lors de la première expérience pilote.
Impact sur les animaux
Pour déclencher la maladie, les animaux recevront l’anticorps d’induction par voie IP ou IV en une seule injection ou plusieurs injections (maximum 14 injections d’induction de la maladie) ) espacées d’au minimum 24h, et des prélèvements de sang seront réalisés, ce qui pourrait induire une douleur et un stress léger à modéré. La douleur générée sera limitée à la piqure d’une aiguille. Les animaux pourront recevoir un traitement ce qui pourra générer une douleur et un stress modéré de très courte durée. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress de 1-2 jours. Bien qu’il ne soit pas décrit de signes cliniques dans la littérature, nous ne pouvons pas exclure que des signes cliniques seront constatés sur les animaux suite à l’induction de la maladie (pertes de poids modérées, pétéchies, anémie modérée, tendance aux hématomes, saignements moins contrôlés) . Le protocole sera affiné lors de l’étape pilote afin de trouver une dose ne générant pas de signes cliniques invalidants.
Devenir
Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération de différents organes, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt. Pour les animaux ayant reçu une administration unique de composé ou uniquement des injections de véhicule, n’ayant pas eu de signes cliniques, et n’ayant pas besoin de prélèvements terminaux pour atteindre l’objectif de l’étude pourront être réutilisés (Avec l’accord du vétérinaire).
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments car les étapes nécessaires au développement d’un médicament, pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global, ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales.
Réduction
Le nombre minimum suffisant permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt est systématiquement utilisé. En pratique, ces nombres ont été déterminés sur la base de la littérature sur le sujet et d’expériences préalables dans nos laboratoires. En moyenne, une étude comprendra 50 animaux (au moins 20). Nous estimons effectuer environ 10 études par an sur 5 ans. Dans le modèle, il a été démontré que 5 à 10 animaux sont nécessaires en fonction des paramètres d’intérêt, afin d’observer des différences sur ces paramètres. Le nombre élevé d’animaux prévu est lié au nombre d’études élevé prévues pour tester un grand nombre de composés et de schémas d’administration et prélèvements et au nombre d’animaux par étude. Dans la mesure du possible, le maximum d’analyses compatibles sera effectué sur les mêmes tissus afin d’éviter de multiplier les animaux nécessaires. Afin d’éviter de multiplier les groupes contrôles, dans la mesure du possible si plusieurs composés doivent être testés ils le seront au cours de la même étude.
Raffinement
Le suivi des animaux (signes cliniques transitoires éventuels pendant l’induction de la thrombocytopénie immunitaire) sera documenté et détaillé dans la procédure. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en fonction de l’évolution de la connaissance du modèle. Si l’un les signes de douleurs persistent l’animal sera mis en observation et si nécessaire un traitement antalgique opioïde mis en place. Les actes peu stressants (administrations et prélèvements) seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress. Ces administrations/prélèvements sont réalisées par des techniciens formés dont les compétences ont été validées et suivant les recommandations vétérinaires et du comité d’éthique Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité du modèle est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans la procédure. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction des maladies et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux. Après les prélèvements sanguins, une compression sur le site de prélèvement sera effectuée pour favoriser la coagulation ; les animaux seront remis dans leurs cages après vérification de la bonne coagulation. De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages dès l’arrivée des animaux dans l’animalerie.
Choix des espèces
- L’induction de l’ITP chez des souris est bien documentée dans la littérature. - Les modèles d’administration d’anticorps en intrapéritonéale ou intraveineuse pour l’induction de l’ITP chez des souris sont les plus utilisés dans le domaine et ressemblent le mieux à la maladie chez l’homme. - Pour ce modèle, diverses souches de souris immunocompétentes seront utilisées. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (au moins 6 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient un poids et un système immunitaire mature pour faciliter l’induction de la maladie.