Souris

Les souris utilisées ici sont génétiquement modifiées pour que l'ARN LincPint soit inactivé dans leurs vaisseaux lymphatiques, une lignée qui n'existe que dans cette espèce selon le porteur. 280 femelles de cinq semaines vont ainsi être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intrapéritonéales sur cinq jours consécutifs, puis une greffe de cellules tumorales, une chirurgie provoquant un lymphœdème ou l'application d'une molécule inflammatoire, avant une lymphographie de moins de cinq minutes. Toutes sont tuées au terme de cette imagerie, pour récolter les tissus.

Objectifs

Le système lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener à la circulation sanguine au niveau de la veine sous-clavière. Il est impliqué dans le transport des graisses et des macromolécules et joue un rôle important dans l’immunité en transportant les cellules de l’inflammation. Le réseau lymphatique est également impliqué dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedème, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde et dans la dissémination métastasique. Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence qu’un Long Acide Ribo Nucléique (ARN) non traduit en protéine, LincPint, était fortement surexprimé dans vaisseaux lymphatiques au niveau les lésions. De plus, des données de la littérature ont montré que cette molécule jouait une rôle prédominant dans la croissance tumorale. Ce projet aura pour but de déterminer quel est le rôle de LincPint dans la fonction lymphatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre certains aspects de la physiopathologie du système vasculaire lymphatique non étudiés à ce jour. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre quels sont les mécanismes de régulation génique qui contrôlent l’apparition et le développement du lymphoedème.

Procédures

Les animaux seront soumis à jusqu'à 3 procédures au total. D'abord, une injection intraperitonéale par jour pendant 5 jours consécutifs est réalisée. Ensuite, ils seront soumis à une injection de cellules tumorales ou à une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire sous anesthésie générale (durée

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

Les effets des long Acides Ribo Nucléiques (ARN) font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de ces molécules dans la fonction endothéliale lymphatique. De même, la croissance tumorale et le développement de lymphoedème secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide d'un logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif et donc de ne pas utiliser plus d'animaux que necessaire.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Cette surveillance permet d'appliquer des points limites précis. Les paramètres contrôlés sont le dos vouté/courbé, yeux plissés/mis-clos, poil herissé et absence de toiletage, diminution des mouvements d'activité, ainsi que la perte de poids. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce.Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car il n'existe que dans cette espèce des individus génétiquement modifiés afin d'avoir les caractéristiques nécessaires à notre étude. Cette modification génétique a conduit à l'invalidation de notre molécule d'intérêt dans les vaisseaux lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.

Mesurer l'effet d'une enzyme sur le drainage des vaisseaux lymphatiques et sur la dissémination des métastases : 360 souris femelles de six semaines vont être utilisées dans ce but, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie de vingt à trente minutes qui lui provoque un lymphœdème, un gavage, une injection de cellules tumorales, puis une lymphographie sous anesthésie au terme de laquelle elle est tuée sans réveil. La patte opérée gonfle de 10 à 15 % à partir d'une semaine après l'intervention, et reste ainsi jusqu'à la mise à mort. Un score évalue l'apparence, le poids, le comportement naturel et le comportement provoqué sur une échelle de 0 à 12, tout animal atteignant 10 étant tué immédiatement.

Objectifs

Le systeme lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener a la circulation sanguine au niveau de la veine sous-claviere. Il est implique dans le transport des graisses et des macromolecules et joue un role important dans l’immunite en transportant les cellules de l’inflammation. Le reseau lymphatique est egalementimplique dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedeme, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoide et dans la dissemination metastasique. Le lymphoedeme est le resultat d’une obstruction ou d’une perturbation dusysteme lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedeme est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient apres la chirurgie du cancer, cependant aucune therapie visant la regulation du dysfonctionnement de ce reseau lymphatique n’est proposee. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence un remodelage pathologique de la matrice extracellulaire promouvant la fibrose induit par une augmentation de l'expression d'une enzyme. Dans cette étude, nous proposons d'étudier l'impact de cette enzyme sur la matrice extracellulaire entourant les vaisseaux lymphatiques et l'impact sur leur fonction de drainage, paramètre critique pour le développement du lymphoedème. Des études ont par ailleurs suggéré que cette enzyme jouait un rôle dans la carcinogenèse, nous étudierons donc également si elle peut influencer la lymphangiogenèse tumorale et avoir des conséquences sur la dissémination métastatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs

Bénéfices attendus

Le lymphoedème secondaire touche environ 15% des femmes ayant eu un cancer du sein, soit près de 1600 nouveaux patients chaque année en France. Malgré la grande prédominance de cette pathologie, aucun traitement n’est actuellement disponible hormis des massages et bandages de contention. Ce projet permettra d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de restaurer la fonction lymphatique défaillante en normalisant le microenvironnement

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur, les animaux seront soumis à 3 interventions au total. Une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire (réalisée sous anesthésie gazeuse) durée : 20-30 minutes/animal. Une administration de substance sur animal vigil : gavage oral, durée : 1min/animal. Les animaux seront égalements soumis à une procédure d'injection de cellules tumorales (10min/animal). Enfin; dans le second établissement utilisateur, les animaux seront soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence, durée : 15 minutes/animal. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure

Impact sur les animaux

L'induction chirurgicale du lymphoedème ne touche aucun organe vital et n'impacte donc pas la survie des animaux. Cette chirugrie a déjà été utilisée dans de précédentes études validées dans la littérature scientifique et n'a révélé aucun impact sur la mobilité des animaux y compris dans l'utilisation du membre touché par la chirurgie. Le seul effet indésirable attendu est un gonflement (10 à 15% d'augmentation par rapport au diamètre moyen de la patte non opérée) de la patte opérée, à partir d'une semaine post-chirurgie et ce jusqu'à la mise à mort des animaux en fin de procédure. Un scoring des signes de douleur et de stress sera effectué suivant la grille de scoring mise en place par le service du bien-être animal de la zootechnie. Cette grille évalue 4 paramètres : apparence, prise de poids/alimentation, comportement naturel, comportement provoqué et permet d’établir un score de douleur/stress sur une échelle de 0 à 12. Tout animal obtenant un score égal ou supérieur à 10 sera immédiatement euthanasié.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet

Remplacement

Le lymphoedème est une pathologie où le tissu touché est drastiquement modifié et où de nombreux types cellulaires différents interagissent entre eux (cellules endothéliales, fibroblastes, adipocytes...), seul l'utilisation d'un modèle murin peut apporter une relevance physiologique à nos résultats. Néanmoins une fois les acteurs de la fibrose associée au lymphoedème identifiés dans ce modèle, leurs régulations seront etudiées dans différents modèles in vitro disponibles au laboratoire afin de limiter l'usage des animaux. Le laboratoire est par ailleurs activement engagé dans le développement de microvaisseaux lymphatique in vitro de type "organe sur puce" pour améliorer la relevance physiologique des modèles in vitro et limiter au maximum l'utilisation des animaux

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide de logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif. Nous reduirons donc au maximum l'utilisation d'animaux dans ce protocole

Raffinement

Durant l'ensemble du projet les animaux sont hebergés selon la reglémentation européenne et les recommandations du Service Bien-Etre Animal (SBEA) de la zootechnie.5 souris maximum sont hebergées par cage, dans des cages enrichies et aucun animal n'est isolé dans aucune des procédures afin de ne pas induire de stress. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse et des analgésiques sont administrés avant et après les opérations. Dès le lendemain de la chirurgie, un suivit post-opératoire est mis en place afin de détecter la douleur mais également une éventuelle absence de : 1/reprise de poids, 2/nidification, 3/toilettage. L'évolution de la plaie et de sa cicatrisation sera également surveillée afin de détecter rapidement une éventuelle infection. Ce suivi sera effectué en conformité avec les grilles de scoring établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). En résumé, ce suivi aura pour but de détecter si l'animal est capable de répondre à ses besoins physiologiques de base, dans le cas contraire tout animal en souffrance sera euthanasié en conformité avec les procédures établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espece s’est oriente vers la souris car l'invalidation genique de l’enzyme étudiée a ete generée seulement dans cette espece. Nous utiliserons en particulier dans ce projet des souris conduisant a une invalidation de cette enzyme de maniere tissu-specifique dans les cellules endotheliales lymphatiques et dans les fibroblastes. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberte, l'ensemble des procedures sera realisee chez des souris femelles a l'age de 6 semaines. Les procedures seront realisees de 6 a 12 semaines

2 352 souris subissent soit une chirurgie du genou de vingt minutes, soit une injection intra-articulaire, pour leur provoquer une arthrose. Toutes vont être tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et une partie d'entre elles est exposée au froid une heure par jour, deux fois par semaine. Le projet porte sur la douleur arthrosique et teste des antiarthrosiques, et le porteur écrit qu'après l'induction "aucune douleur n'est attendue après 24h", que les souris "ne boitent pas" et que le froid n'entraîne "pas de stress particulier". L'effectif se décompose en 144 animaux par étude, trois études par an pendant cinq ans, plus 192 souris pour le volet froid, le chiffre de 24 animaux par groupe reposant sur les habitudes du laboratoire.

Objectifs

L’arthrose est une maladie détruisant le cartilage, remodelant l’os sous chondral et entrainant une inflammation de la synoviale. Ces changements, qui touchent l’ensemble de l’articulation, entrainent notamment chez le patient des douleurs chroniques et une impotence fonctionnelle (diminution de la mobilité et raideur). L’objectif de ce projet est de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie invalidante et de tester et comparer plusieurs médicaments anti arthrosiques sur la souris afin de déterminer leur efficacité sur la destruction du cartilage et sur la douleur induite par la maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de tester et comparer des médicaments anti-arthrosiques en terme d’évaluation de la douleur et de dégradation du cartilage via deux modèles d’arthrose : un modèle mécanique (lié à un traumastime) et un modèle chimique mimant une arthrose à forte composante inflammatoire. Ces données permettront l’avancée de la recherche pour le traitement de l’arthrose chez les patients.

Procédures

L’arthrose est induite chez les souris par deux moyens : une chirurgie rapide (environ 20min) pratiquée sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée, soit par une injection intra-articulaire pratiquée sous anesthésie générale. Le traitement aura lieu soit par injection soit par prise orale 1 à 5 fois par semaine selon le protocole. Des tests de comportements auront lieu 3 à 4 fois par semaine et dureront 1h maximum par test. Certains animaux seront exposés au froid 1h par jour, 2 fois par semaine.

Impact sur les animaux

L’induction de l’arthrose chirurgicale peut entrainer des douleurs sur les souris liées à la chirurgie et à l’ouverture des différents plans (peau et muscle). Après les différents protocoles d’induction de l’arthrose, aucune douleur n’est attendue après 24h. D’après l’expérience du laboratoire, les souris ne boitent pas, n’ont pas de difficultés particulières à se déplacer et peuvent donc avoir des interactions sociales normales et se nourrir normalement. En cas de traitement par gavage régulier (pour l’administration de traitements), il existe un risque de fausse route ou de perforation de l’œsophage. D’après la littérature, l’exposition des souris au froid pendant une durée relativement courte (moins de 4h) n’entraine pas de stress particulier chez les animaux. D’autres études ont montré que les souris sont capables de s’habituer à une situation stressante, notamment un bain d’eau froide en fonction du temps et de la fréquence d’exposition. Les expositions au froid prévues étant relativement courtes et régulières, nous n’attendons de dégradation particulière de l’état des animaux après les expositions au froid.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue des procédures afin de pouvoir procéder à l’analyse des tissus et notamment des articulations.

Remplacement

Les expériences in vitro de cultures cellulaires ne permettent pas de mimer parfaitement la pathologie en raison de multiples interactions cellulaires et tissulaires au sein de l’articulation. De plus, l’influence de la composante mécanique est fondamentale dans cette pathologie. Le modèle murin combine les avantages d’intégrer les différents tissus de l’articulation avec les possibilités de modifications génétiques. Par ailleurs les procédures comportementales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité visant à étudier les aspects fonctionnels de l’arthrose que sont la douleur chronique. De fait, les expériences ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différente de l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires dans chaque procédure a été défini sur la base des études réalisées historiquement dans le laboratoire. Pour chaque étude, deux modèles d’arthrose seront prévus car ils sont complémentaires : le modèle chimique permet de mesurer la dégradation du cartilage et d’évaluer la réponse à la douleur, tandis que le modèle chirurgical permet d’évaluer la dégradation du cartilage et le remodelage de l’os sous chondral (avec une réponse moindre à la douleur). De plus, cela permet de reproduire l’hétérogénéité de la pathologie « arthrose » observée chez les patients. Le nombre d’animaux par groupe a été porté à 24 : 12 souris mâles et 12 souris femelles. L’évaluation de la douleur nécessite un minimum de 12 animaux afin de produire des résultats significatifs. L’utilisation des animaux des deux sexes permettra la comparaison des données, car d’après la littérature, les modifications biochimiques et histologiques sont plus importantes suite à l’induction de l’arthrose chez les mâles comparées aux femelles. Dans chacun des modèles, les animaux seront distribués en 3 groupes, un groupe contrôle traité au véhicule, un groupe traité avec le médicament test et un groupe traité avec une molécule de référence. Ainsi un nombre de 72 animaux par modèle est nécessaire (modèle chimique et modèle chirurgical), soit un nombre de 144 animaux par étude. 3 études seront réalisées par an pour l’étude de nouveaux traitements anti-arthrosiques, ce qui porte le nombre total d’animaux à 144*3*5 = 2160 animaux pour 5 ans. Pour le projet froid, un nombre de 192 animaux sera nécessaire : les deux modèles d’arthrose seront comparés pour 4 lots de 24 animaux (12 mâles et 12 femelles). Soit un total d’animaux de 2160 + 192 = 2352.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux, dans un environnement enrichi (matériel pour nidification) avec l’eau et la nourriture ad libitum. Les animaux participant aux tests comportementaux seront hébergés en cycle inversé. Pendant les 10 à 12 semaines d’hébergement, la surveillance des souris sera effectuée quotidiennement, avec un intérêt particulier pour le comportement : état du poil, vocalisations, boiterie. Au moment de l’induction de l’arthrose chirurgicale, une injection d'un analgésique sera réalisée, 15min avant l’intervention. Si la souris montre des signes de douleur dans les heures suivant l’intervention, une seconde dose d'analgésique sera administrée. La procédure chirugicale ainsi que l’induction de l’arthrose par injection intra-articulaire se font sous anesthésie volatile (environ 20 min pour la chirurgie et 10 min pour les injections intra-articulaires).

Choix des espèces

L’induction de l’arthrose dans le modèle murin (C57BL/6) est un modèle reconnu dans la littérature et parfaitement accepté pour tester l’efficacité de nouveaux traitements anti-arthrosiques. De plus, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différente de l’homme. Les modèles d’arthrose seront induits sur des animaux âgés de 8 à 10 semaines, ce qui correspond à des animaux adultes, en fin de croissance.

Cinq jours d'injections intrapéritonéales consécutives, puis au choix une greffe de cellules tumorales, une chirurgie destinée à provoquer un lymphœdème de la patte ou l'application d'une molécule inflammatoire, et pour finir une lymphographie après laquelle l'animal est tué. 280 souris femelles vont être utilisées de cette façon, toutes tuées à l'issue pour récolter les tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet vise à établir le rôle d'un ARN non codant, LincPint, dans le fonctionnement des vaisseaux lymphatiques. Pour l'ensemble de ces atteintes, le RNT tient en une phrase sur les effets attendus, les chirurgies et les tumeurs devant engendrer "des douleurs modérées et un léger stress".

Objectifs

Le systeme lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener a la circulation sanguine au niveau de la veine sous-claviere. Il est implique dans le transport des graisses et des macromolecules et joue un role important dans l’immunite en transportant les cellules de l’inflammation. Le reseau lymphatique est egalement implique dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedeme, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoide et dans la dissemination metastasique. Le lymphoedeme est le resultat d’une obstruction ou d’une perturbation du systeme lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedeme est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient apres la chirurgie du cancer, cependant aucune therapie visant la regulation du dysfonctionnement de ce reseau lymphatique n’est proposee. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence qu’un Long Acide Ribo Nucléique (ARN) non traduit en protéine, LincPint, était fortement surexprimé dans vaisseaux lymphatiques au niveau les lésions. De plus, des données de la littérature ont montré que cette molécule jouait une rôle prédominant dans la croissance tumorale. Ce projet aura pour but de déterminer quel est le rôle de LincPint dans la fonction lymphatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre certains aspects de la physiopathologie du système vasculaire lymphatique non étudiés à ce jour. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre quels sont les mécanismes de régulation génique qui contrôlent l’apparition et le développement du lymphoedème.

Procédures

Les animaux seront soumis à jusqu'à 3 procédures au total. D'abord, une injection intraperitonéale par jour pendant 5 jours consécutifs est réalisée. Ensuite, ils seront soumis à une injection de cellules tumorales ou à une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire sous anesthésie générale (durée

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le developpement de tumeurs vont engendrer des douleurs moderees et un leger stress sur l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

Les effets des long Acides Ribo Nucléiques (ARN) font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modelisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours a l’experimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de ces molécules dans la fonction endothéliale lymphatique. De meme, la croissance tumorale et le developpement de lymphoedeme secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endotheliale lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune strategie de remplacement pour l'etude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune strategie de remplacement du modele animal qui permet de repondre aux questions adressees par ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide d'un logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif et donc de ne pas utiliser plus d'animaux que necessaire.

Raffinement

Les animaux sont places en piece d'acclimatation lors de leur arrivee a la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie competent qui verifie leur etat et place de l'enrichissement (carre de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de differents cartons de transport ne sont jamais melanges lors de la repartition dans les cages d'hebergement. Les animaux seront heberges en cage de 4 ou 5 et seront acclimates pendant une periode de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-etre de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillees quotidiennement selon les directives europeennes relatives a l'hebergement des animaux de laboratoire. Cette surveillance permet d'appliquer des points limites précis. Les paramètres contrôlés sont le dos vouté/courbé, yeux plissés/mis-clos, poil herissé et absence de toiletage, diminution des mouvements d'activité, ainsi que la perte de poids. De plus, pour chaque procedure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthesie generale avec analgesique sont realisees pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris a euthanasier seront placees dans une salle isolee du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront realisees dans une troisieme piece. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espece s’est oriente vers la souris car il n'existe que dans cette espèce des individus génétiquement modifiés afin d'avoir les caractéristiques nécessaires à notre étude. Cette modification génétique a conduit à l'invalidation de notre molécule d'intérêt dans les vaisseaux lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberte, l'ensemble des procedures sera realisee chez des souris femelles a l'age de 5 semaines. Les procedures seront realisees de 5 a 12 semaines.

Une tumeur laissée croître jusqu'à 1 300 mm3 avant que la mise à mort soit programmée dans les jours qui suivent : 118 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit sous anesthésie la greffe d'un fragment de tumeur mammaire humaine, puis un traitement à l'olaparib, avec une pesée deux fois par semaine et une mise à mort immédiate à 20 % de perte de poids. L'objet déclaré est de comprendre pourquoi les cancers du sein triple négatif rechutent sous ce médicament. Le porteur retient la souris immunodéprimée parce que la croissance des tumeurs humaines y est "facilitée", et greffe des animaux de cinq semaines pour la même raison.

Objectifs

Le cancer du sein appelé triple négatif ne représente que 15% des cancers du sein, mais en constitue la forme la plus agressive et touche fréquemment les femmes jeunes. Il est associé à un risque élevé de métastases et à un pronostic défavorable. La chimiothérapie restait jusque récemment la seule option thérapeutique disponible dans des formes localisées de la maladie. Les alternatives étaient limitées en cas de récidive et faisaient toujours face à de rapides problèmes de résistances aux traitements. Ces cas de récidives restent encore un problème clinique non résolu dont le pronostic reste sombre pour les cancers du sein métastatiques. Aux stades avancés de la maladie, une sensibilité initiale au traitement fait fréquemment place à l’émergence d’une résistance. L’administration d’une chimiothérapie spécifique pendant un an a été récemment démontrée comme efficace pour améliorer la survie sans récidive de patientes porteuses. Cette amélioration est synonyme de guérison chez une partie des patientes reste partielle ou récidive pour d’autres. Ce qui nécessitant d’identifier les mécanismes de résistance afin de mieux prendre en charge ces patientes. L’une de nos hypothèses repose sur le concept de l’existence de populations de cellules capables de résister sous traitement et qui prolifèrent après l'arrêt du traitement.

Bénéfices attendus

Nous chercherons à établir l’existence de populations cellulaires associées aux rechutes après traitement à une molécule appelée "olaparib" de manière à déterminer si celles-ci sont préexistantes dans la tumeur initiale ou si elles sont induites par le traitement. Dans les deux cas, ces études ouvriraient la voie à des essais précliniques, préliminaires et indispensables à la mise en place d’études cliniques.

Procédures

Chaque animal subira une intervention chirurgicale sous anesthésie général et sous anti-douleur. La durée de l’intervention est en moyenne de 5 à 10 minutes anesthésie, chirurgie et réveil compris.

Impact sur les animaux

La chirurgie de greffe de fragments tumoraux peut engendrer chez les animaux : - Douleurs - Faibles pertes de poids - Déshydratations - Risque d’infection au site d’incision Tous les animaux seront surveillés quotidiennement avec une attention particulière quant à l’apparition de signes cliniques pouvant être caractéristiques de la tumeur : - Nécrose tumorale cutanée - Diarrhées - Déshydratations - Dos courbé - Prolapsus anal - Masque de la douleur - Perte de poids Concernant les animaux qui développent une tumeur, il est possible qu’ils ressentent une faible gêne lors de la locomotion suite à l’encombrement que la tumeur peut engendrer. Si tel est le cas, des croquettes seront aussi mises à disposition dans un coin de la cage afin de faciliter l’accès à la nourriture. Cependant, si nous voyons que l’animal est trop gêné ou que la tumeur empêche l’accès total à la nourriture ou à l’eau, l’animal sera euthanasié. Enfin, en ce qui concerne les traitements, dans le cadre de nombreuses études précédentes, il a été démontré qu’aucune toxicité n’était associée au traitement par l’Olaparib, contrairement à ce qui peut être observé pour les sels de platines. Grâce à la réalisation de mesures deux fois par semaine du poids des animaux nous serons alertés en cas de toxicité liée aux traitements. Si nous observons des pertes de poids : - de -5% à -10% de perte de poids par rapport au jour de greffe : surveillance, ajout de nourriture gélifiée et mesure de poids tous les jours - de -10% à -15% de perte de poids à partir du jour de greffe : en plus de la surveillance et de la mise en place de nourriture gélifiée, les animaux recevront une injection en sous-cutanée de NaCl car cette perte de poids est souvent associée à une déshydratation. Si l’animal ne reprend pas de poids dans les 24h alors il sera euthanasié. - 20% de perte de poids ou plus : euthanasie immédiate de l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l'étude. Au cours de l’étude les animaux ayant atteint les points limites ou présentant des signes inadmissibles de souffrance seront euthanasiés.

Remplacement

Pas de possibilité de remplacement. Au sein de ce projet, l'utilisation d'animaux à des fins expérimentales est indispensable. Il n'existe en effet pas d'alternative permettant de reproduire aussi fidèlement les caractéristiques histologiques et moléculaires des tumeurs de patients, mais aussi celles de l'environnement tumoral.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux par la mise en pratique de greffes sous-cutanées en multisite pour les étapes de pré-amplification des modèles. Nous considérons une prise de greffe de 30% lors de la décongélation pour la première partie et de 70% lors des passages de tumeurs fraiches (c’est-à-dire sans passer par une étape de congélation/décongélation). Ces % ont été déterminés sur la base de probabilités issues de précédentes études de prise de greffe menées dans notre équipe. Aussi, aucune approche statistique supplémentaire ne sera réalisée.

Raffinement

Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées sera assurée. Les greffes sont réalisées sous anesthésie gazeuse et sous analgésie, afin de réduire à son strict minimum le stress et la souffrance de l’animal. Les antalgiques ou anti-inflammatoires non stéroïdiens pourront être utilisés si nécessaire. Les animaux sont hébergés dans une animalerie agréée où les paramètres physiques sont contrôlés. Les tumeurs seront mesurées 2 fois par semaine afin de suivre leur progression et/ou l'apparition de zones de nécrose. A partir de 1300 mm3, les sacrifices seront programmés dans les jours suivants. Les animaux traités par le carboplatine bénéficieront d'une alimentation gélifiée en vue de prévneir les pertes de poids.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus est un mammifère suffisamment proche de l’espèce humaine d’un point de vue physiologique et la souris immunodéprimée est un bon modèle pour l’évaluation de la croissance des tumeurs d’origine humaine dans la mesure où cette croissance y est facilitée. Les animaux, âgés de 4 semaines, seront réceptionnés par l’animalerie et utilisés seulement après une période d’acclimatation d’une semaine. Les greffes pourront donc être réalisées sur des animaux âgés de 5 semaines, car la prise de greffe est facilitée sur des animaux de cet âge.

12 812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir huit prélèvements sanguins à la queue, trente semaines de gavage quotidien et trente semaines d'injections intrapéritonéales bihebdomadaires. S'y ajoutent une chirurgie d'implant d'œstrogène, une injection de cellules tumorales humaines, une ligature vasculaire, une biopsie de la queue à six jours de vie et des transports entre cinq sites pour les séances d'imagerie. Les souris des procédures expérimentales sont tuées pour exploration anatomique et histologique, celles de l'élevage restant en vie pour la reproduction, à l'exception des mâles immunodéficients. Le porteur justifie l'effectif par un calcul de puissance mené "en utilisant un logiciel de statistique", sans autre indication sur la façon dont on parvient à 12 812 individus.

Objectifs

Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.

Bénéfices attendus

Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)

Impact sur les animaux

Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.

Devenir

Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.

Raffinement

Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.

360 souris femelles subissent une chirurgie de vingt à trente minutes destinée à leur provoquer un lymphœdème de la patte, puis un gavage, une injection de cellules tumorales et une lymphographie sous anesthésie. Toutes vont être tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour récolter les tissus. Un score de douleur et de stress noté de 0 à 12 est relevé, la mise à mort immédiate étant déclenchée à partir de 10. Le porteur qualifie le lymphœdème chez les patientes de pathologie "douloureuse et handicapante", et écrit que la même atteinte, provoquée chirurgicalement chez la souris, n'a "aucun impact sur la mobilité des animaux".

Objectifs

Le systeme lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener a la circulation sanguine au niveau de la veine sous-claviere. Il est implique dans le transport des graisses et des macromolecules et joue un role important dans l’immunite en transportant les cellules de l’inflammation. Le reseau lymphatique est egalementimplique dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedeme, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoide et dans la dissemination metastasique. Le lymphoedeme est le resultat d’une obstruction ou d’une perturbation dusysteme lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedeme est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient apres la chirurgie du cancer, cependant aucune therapie visant la regulation du dysfonctionnement de ce reseau lymphatique n’est proposee. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence un remodelage pathologique de la matrice extracellulaire promouvant la fibrose induit par une augmentation de l'expression d'une enzyme. Dans cette étude, nous proposons d'étudier l'impact de cette enzyme sur la matrice extracellulaire entourant les vaisseaux lymphatiques et l'impact sur leur fonction de drainage, paramètre critique pour le développement du lymphoedème. Des études ont par ailleurs suggéré que cette enzyme jouait un rôle dans la carcinogenèse, nous étudierons donc également si elle peut influencer la lymphangiogenèse tumorale et avoir des conséquences sur la dissémination métastatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le lymphoedème secondaire touche environ 15% des femmes ayant eu un cancer du sein, soit près de 1600 nouveaux patients chaque année en France. Malgré la grande prédominance de cette pathologie, aucun traitement n’est actuellement disponible hormis des massages et bandages de contention. Ce projet permettra d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de restaurer la fonction lymphatique défaillante en normalisant le microenvironnement

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 interventions au total. Dans le premier établissement utilisateur ,une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire (réalisée sous anesthésie gazeuse) durée : 20-30 minutes/animal. Une administration de substance sur animal vigil : gavage oral, durée : 1min/animal également dans le premier établissement utilisateur . Les animaux seront égalements soumis à une procédure d'injection de cellules tumorales (10min/animal) dans le premier établissement utilisateur. Enfin, dans le second établissement utilisateur, les animaux seront soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence, durée : 15 minutes/animal. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure

Impact sur les animaux

L'induction chirurgicale du lymphoedème ne touche aucun organe vital et n'impacte donc pas la survie des animaux. Cette chirugrie a déjà été utilisée dans de précédentes études validées dans la littérature scientifique et n'a révélé aucun impact sur la mobilité des animaux y compris dans l'utilisation du membre touché par la chirurgie. Le seul effet indésirable attendu est un gonflement (10 à 15% d'augmentation par rapport au diamètre moyen de la patte non opérée) de la patte opérée, à partir d'une semaine post-chirurgie et ce jusqu'à la mise à mort des animaux en fin de procédure. Un scoring des signes de douleur et de stress sera effectué suivant la grille de scoring mise en place par le service du bien-être animal de la zootechnie. Cette grille évalue 4 paramètres : apparence, prise de poids/alimentation, comportement naturel, comportement provoqué et permet d’établir un score de douleur/stress sur une échelle de 0 à 12. Tout animal obtenant un score égal ou supérieur à 10 sera immédiatement euthanasié.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet

Remplacement

Le lymphoedème est une pathologie où le tissu touché est drastiquement modifié et où de nombreux types cellulaires différents interagissent entre eux (cellules endothéliales, fibroblastes, adipocytes...), seul l'utilisation d'un modèle murin peut apporter une relevance physiologique à nos résultats. Néanmoins une fois les acteurs de la fibrose associée au lymphoedème identifiés dans ce modèle, leurs régulations seront etudiées dans différents modèles in vitro disponibles au laboratoire afin de limiter l'usage des animaux. Le laboratoire est par ailleurs activement engagé dans le développement de microvaisseaux lymphatique in vitro de type "organe sur puce" pour améliorer la relevance physiologique des modèles in vitro et limiter au maximum l'utilisation des animaux

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide de logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif. Nous reduirons donc au maximum l'utilisation d'animaux dans ce protocole

Raffinement

Durant l'ensemble du projet les animaux sont hebergés selon la reglémentation européenne et les recommandations du Service Bien-Etre Animal (SBEA) de la zootechnie.5 souris maximum sont hebergées par cage, dans des cages enrichies et aucun animal n'est isolé dans aucune des procédures afin de ne pas induire de stress. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse et des analgésiques sont administrés avant et après les opérations. Dès le lendemain de la chirurgie, un suivit post-opératoire est mis en place afin de détecter la douleur mais également une éventuelle absence de : 1/reprise de poids, 2/nidification, 3/toilettage. L'évolution de la plaie et de sa cicatrisation sera également surveillée afin de détecter rapidement une éventuelle infection. Ce suivi sera effectué en conformité avec les grilles de scoring établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). En résumé, ce suivi aura pour but de détecter si l'animal est capable de répondre à ses besoins physiologiques de base, dans le cas contraire tout animal en souffrance sera euthanasié en conformité avec les procédures établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espece s’est oriente vers la souris car l'invalidation genique de l’enzyme étudiée a ete generée seulement dans cette espece. Nous utiliserons en particulier dans ce projet des souris conduisant a une invalidation de cette enzyme de maniere tissu-specifique dans les cellules endotheliales lymphatiques et dans les fibroblastes. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberte, l'ensemble des procedures sera realisee chez des souris femelles a l'age de 6 semaines. Les procedures seront realisees de 6 a 12 semaines