Souris

Opérées sous anesthésie gazeuse pour provoquer un lymphœdème du membre par la technique employée en chirurgie du cancer du sein, 256 souris femelles reçoivent ensuite une injection quotidienne cinq jours par semaine, pendant deux, quatre, six ou huit semaines. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Un transfert entre deux établissements précède la lymphographie finale, injection intradermique dans la patte saine et dans la patte gonflée sous anesthésie générale, à l'issue de laquelle les souris sont tuées sans réveil pour récolter les tissus. Le porteur annonce que le seul effet indésirable attendu est un gonflement de 10 à 15 % de la patte opérée, présent dès la première semaine et jusqu'à la mort de l'animal.

Objectifs

Le lymphoedème secondaire touche environ 15% des femmes ayant eu un cancer du sein, soit près de 1600 nouveaux patients chaque année en France. Malgré la grande prédominance de cette pathologie, aucun traitement n’est actuellement disponible hormis des massages et bandages de contention. Ce manque est en partie dû à l’absence de modèles expérimentaux permettant d’étudier cette pathologie. La mise au point d’un modèle de lymphoedème secondaire par l’utilisation des techniques de chirurgie du cancer du sein revêt donc un enjeu majeur pour déterminer des cibles afin de lutter contre cette pathologie. Les vaisseaux lymphatiques dépendent de leur environnement, notamment de la matrice qui les entoure. Si cette matrice se modifie, cela peut bloquer leur fonctionnement. Nous étudions comment la fibrose (une accumulation anormale de cette matrice) se développe, quels mécanismes la contrôlent et comment ces changements influencent la santé des vaisseaux lymphatiques. L'objectif est de trouver des solutions pour réparer cette matrice et traiter le lymphœdème. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce protocole a pour but 1/ de reproduire la pathologie humaines ou lymphoedème qui fait intervenir le microenvironement fibreux et adipeux et nécessite donc un modèle intégré, 2/d'identifier les acteurs cellulaires et moléculaires de la fibrose associée au lymphoedème afin de 3/ proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour cette pathologie. Ce projet permettra d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de restaurer la fonction lymphatique défaillante en normalisant le microenvironnement.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 interventions au total. Une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire (réalisée sous anesthésie gazeuse) durée : 20-30 minutes/animal, réalisée dans le premier établissements utilisateur. Une administration de substance sur animal vigil : injection quotidienne 5 jours par semaine pour 4 temps d'étude différents: 2,4,6 et 8 semaines post-opératoire, durée : 1min/animal, réalisé dans le premier établissements utilisateur. Enfin les animaux seront soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence, durée : 15 minutes/animal. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure réalisée dans le second établissements utilisateur.

Impact sur les animaux

Le seul effet indésirable attendu est un gonflement (10 à 15% d'augmentation par rapport au diamètre moyen de la patte non opérée) de la patte opérée, à partir d'une semaine post-chirurgie et ce jusqu'à la mise à mort des animaux en fin de procédure.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet

Remplacement

Le lymphoedème est une pathologie où le tissu touché est drastiquement modifié et où de nombreux types cellulaires différents interagissent entre eux (cellules endothéliales, fibroblastes, adipocytes...), seul l'utilisation d'un modèle murin peut apporter une relevance physiologique à nos résultats. Néanmoins une fois les acteurs de la fibrose associée au lymphoedème identifiés dans ce modèle, leurs régulations seront etudiées dans différents modèles in vitro disponibles au laboratoire afin de limiter l'usage des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide de logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif et donc de ne pas utiliser plus d'animaux que necessaire.

Raffinement

Durant l'ensemble du projet les animaux sont hebergés selon la reglémentation européenne et les recommandations du Service Bien-Etre Animal (SBEA) de la zootechnie.5 souris maximum sont hebergées par cage, dans des cages enrichies et aucun animal n'est isolé dans aucune des procédures afin de ne pas induire de stress. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse et des analgésiques sont administrés avant et après les opérations. Dès le lendemain de la chirurgie, un suivit post-opératoire est mis en place afin de détecter la douleur mais également une éventuelle absence de : 1/reprise de poids, 2/nidification, 3/toilettage. L'évolution de la plaie et de sa cicatrisation sera également surveillée afin de détecter rapidement une éventuelle infection. Ce suivi sera effectué en conformité avec les grilles de scoring établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). En résumé, ce suivi aura pour but de détecter si l'animal est capable de répondre à ses besoins physiologiques de base, dans le cas contraire tout animal en souffrance sera euthanasié en conformité avec les procédures établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

L’expérimentation sera effectuée sur des souris femelles. Le modèle murin est le modèle experimental d'induction de lymphoedème le plus étudié et le mieux caractérisé dans la littérature et il a été prouvé que les modèles murins sont relevants par rapport à la pathologie humaine. Cette étude porte sur la mise au point d’un modèle de lymphoedème et l’impact de la fibrose sur la fonction endothéliale lymphatique. Pour ces raisons, nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 à 8 semaines. Cet âge est classiquement utilisé pour générer des modèles de lymphoedème dans la littérature. Nous nous interessons plus particulièrement au lymphoedème secondaire après cancer du sein, c'est pourquoi nous utiliserons des souris femelles.

Les souriceaux visés ont 1 à 3 jours, âge auquel l'os du crâne reste assez souple pour y enfoncer une aiguille sans incision. 972 souris nouveau-nées sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées, soit en cours d'étude si les points limites sont franchis, soit à la fin pour prélever leurs tissus. Chacune reçoit une injection intracérébrale de composé candidat sous anesthésie gazeuse, avec pour risques déclarés un retard de croissance, une absence de prise de poids jusqu'au sevrage, un rejet par la mère et une atteinte des mouvements spontanés ou du comportement de recherche de la tétée. Les mères et les souriceaux non traités, qui ne comptent pas dans les 972, sont soit utilisés pour la formation à des gestes techniques, soit basculés vers un autre projet d'évaluation de composés.

Objectifs

En France, le nombre de personnes atteintes de maladies rares (moins d’une personne atteinte sur 2000) est estimé à 3.5 millions. Plus de 7000 maladies rares, dont 800 neurologiques, sont décrites, et de nouvelles sont identifiées chaque semaine. Les maladies rares sont généralement sévères, chroniques et handicapantes. L’atteinte pour certaines d’entre elles peut provoquer des signes cliniques pathologiques dès la naissance ou l’enfance (entre 3 mois et 6 ans), comme les encéphalopathies épileptiques et/ou développementales (Developmental Epileptic Encephalopathies ou DEEs). Les DEEs sont des maladies neurodéveloppementales rares, génétiques et syndromiques, caractérisées par une déficience intellectuelle, des troubles du langage, un développement moteur potentiellement altéré et des crises d'épilepsie d'apparition précoce, souvent accompagnées d'une régression du développement. Les traitements actuels (médicaments antiépileptiques) sont peu efficaces pour les formes rares, et les interventions chirurgicales sont lourdes et risquées chez les jeunes enfants. Il est nécessaire d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie et l’apprentissage des patients. Les composés étudiés, sélectionnés après des tests in silico et in vitro, sont testés chez la souris adulte afin d’évaluer leur tolérabilité et leur efficacité sur une cible d’intérêt. Les meilleurs candidats sont retenus et testés chez la souris nouveau-née (phases de développement cérébral similaire entre un souriceau de 3 jours et un nourrisson humain de 3 mois) afin d’évaluer leur effet dans le cadre du traitement des maladies épileptiques rares, et destinés à être administrés à de jeunes enfants (à partir de 3 mois). Il est essentiel d’évaluer l’effet de nos candidats médicaments pendant les stades de développement du cerveau où les crises épileptiques se manifestent le plus dans le cadre des DEEs. Les traitements pharmacologiques peuvent avoir des effets différents sur un cerveau en développement (nouveau-né) par rapport à un cerveau plus mature (souris sevrée, jeune adulte ou adulte). L’objectif de ce projet est de définir un modèle permettant d’administrer nos candidats médicaments dans des zones spécifiques du cerveau de souris nouveau nées âgées de 1 à 3 jours par voie intracérébrale. En effet, les candidats médicaments ne passant pas la Barrière Hémato-Encéphalique, nous sommes obligés de les administrer par voie intra-cérébrale.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la stratégie de recherche en neurosciences. Les traitements de la DEE reposent sur la prescription de médicaments antiépileptiques, qui ne sont pas toujours efficaces pour les formes rares d’épilepsie, et sur des interventions chirurgicales curatives (ablation de la zone épileptogène, radiochirurgie cérébrale ou thermocoagulation) qui peuvent être lourdes et risquées notamment chez les jeunes enfants. Les futurs candidats médicaments évalués dans ce projet sont connus pour ne pas passer la Barrière Hématoencéphalique (barrière naturelle qui sépare le cerveau du reste du corps). Ils seront donc administrés directement dans le système nerveux central (SNC) des patients afin de permettre un ciblage direct de celui-ci, augmentant ainsi l’efficacité des traitements, et diminuant les effets secondaires qui pourraient survenir après une administration orale ou intraveineuse, améliorant ainsi grandement la qualité de vie des patients. Les bénéfices attendus de ce projet sont de caractériser les potentiels candidats médicaments et de déterminer leur efficacité sur une cible donnée dans le cadre de maladies rares neurologiques infantiles. Chez la souris, afin de mimer au mieux la voie d’administration humaine, les composés seront administrés par voir intracérébrale.

Procédures

- Administration de composés étudiés par voie intracérébrale sous anesthésie générale gazeuse et couverture analgésique (durée maximale de 15 minutes – 1 seule fois en début d’expérience) - Administration sous-cutanée des médicaments vétérinaires analgésiques (contention d’une durée maximale de 30s) et administration intra-péritonéale des médicaments vétérinaires analgésiques (contention d’une durée maximale de 30s) avant l’euthanasie en fin d’étude.

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress ou douleur peut provenir lors : - Des administrations d’anesthésique Intra péritonéales en amont de la perfusion intra-cardiaque. La contention de 30s et l’administration d’environ 10s peuvent également générer un léger stress. - De la phase d’anesthésie gazeuse (durée maximale de 20min) et du suivi post-anesthésie qui peuvent générer un stress modéré. - De l’administration de composés par voie intra-cérébrale sous anesthésie générale, d’une durée maximale de 30s qui peut générer un stress modéré. Une potentielle source de nuisance peut survenir lors : - D’une non prise de poids des souriceaux jusqu’au sevrage pouvant être induite par l’administration du composé ainsi qu’un retard de croissance (nuisance modérée) - Du rejet de la mère (nuisance modérée) Les composés administrés peuvent également induire des effets cliniques (par exemple atteinte des mouvements spontanés, retard du comportement de recherche de la tétée) et provoquer une nuisance pour l’animal (durée maximale de l’étude : 60 jours).

Devenir

Tous les souriceaux inclus dans les procédures sont soit euthanasiés en cours d’étude si des points limites éthiques sont atteints, soit euthanasiés en fin d’étude afin de réaliser des prélèvements de tissus qui permettront d’effectuer des analyses biochimiques (effet des composés sur l’expression de la protéine d’intérêt par exemple). De plus, les mères ainsi que les souriceaux non-traités, non inclus dans les procédures de cette demande de projet seront soit utilisés pour de la formation à des gestes techniques, soit utilisés dans des études d’évaluation d’efficacité de composé faisant l’objet d’un autre projet autorisé.

Remplacement

La recherche de nouveaux médicaments dans le domaine des maladies neurologiques rares repose sur une première étape d’identification de molécules efficaces sur leur cible au moyen de tests in vitro (cultures de neurones primaires, cellules souches…) et in silico. Toutefois l’efficacité thérapeutique d’une molécule ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal. Il est donc nécessaire que les molécules les plus abouties dans leur développement soient administrées in vivo. Plus spécifiquement pour ce projet, seul l’animal sain possède de façon intégrée un répertoire comportemental et des caractéristiques neurophysiologiques permettant d’évaluer l’activité de candidats médicaments pour le traitement de maladies neurologiques rares.

Réduction

Un premier filtre in vivo est effectué via une autre autorisation de projet afin d’identifier les meilleurs candidats médicaments pharmacologiquement intéressants. En effet, des études préalables permettront d’évaluer la tolérabilité des composés sur des souris adultes ainsi que leur efficacité sur une cible d’intérêt, afin de pouvoir sélectionner les candidats médicament les plus puissants. A l’issue de ce premier filtre, les administrations chez la souris nouveau-née pourront être réalisées sur un nombre restreint d’animaux (6 souris maximum par groupe) et sur des animaux des deux sexes (la détermination sexuelle ne pouvant être sûre qu’à partir de 21 jours) dans le cadre de l’évaluation pharmacologique des composés. Une consultation du service de Biostatistique sera effectuée après la réalisation des premières études afin de réduire au maximum le nombre d’animaux par groupe mais en assurant l’obtention de résultats exploitable et reproductibles. Au cas par cas, en fonction du projet de recherche concerné et des questions posées, une consultation statistique sera programmée pour réajuster le nombre d’animaux nécessaire ainsi que pour travailler sur le design expérimental le plus adapté. Lors des prélèvements effectués à la fin des études après euthanasie des souris, un maximum de tissus seront collectés sur un même animal. Chaque tissu, cérébral ou périphérique, sera séparé en plusieurs échantillons permettant ainsi la multiplication des analyses biochimiques et/histologiques potentiellement réalisables. Ce processus nous permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisé par projet de recherche.

Raffinement

Les souriceaux seront stabulés avec leur mère jusqu’au sevrage (21 jours) puis maintenus en groupes sociaux une fois retirés de leur mère, dans un environnement adapté limitant au maximum les facteurs de stress (bruits, manipulations fréquentes …) et en séparant les mâles des femelles pour les études de plus de 21 jours. Phase d’administration (20 min max de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal) sous anesthésie générale gazeuse sur couverture chauffante. Aucune incision ne sera nécessaire pour insérer l’aiguille d’injection dans les ventricules – l’os du crâne étant encore souple chez un souriceau de 1-3 jours. Observation des souriceaux effectuée durant la phase de réveil et lors du replacement dans la cage avec la mère après un réveil complet. Une grille de score spécifique réalisée par une analyse comportementale (1h, 3h, 6h et 24h après administration) établira un score de tolérabilité des candidats médicaments. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites définis par la grille de score, sera euthanasié. Suivi de l’état général des animaux réalisé quotidiennement (durée max de 60 jours). Le suivi du poids sera réalisé 1 à 2 fois par semaine pendant les 10 premiers jours post-administration afin de limiter au maximum le rejet de la mère. Une estimation visuelle de la bonne croissance des souriceaux administrés sera effectuée en regard d’un animal contrôle non-administré. Pour diminuer les risques de rejet: - Mise en contact de la femelle gestante, dès son arrivée et jusqu’au début des études, avec les odeurs qu’elle rencontrera sur les nouveau-nés (solutions désinfectantes, gants…) - La cage d’une femelle qui vient de mettre bas ne devra pas être nettoyée pendant 2 semaines. Si un nettoyage ou un changement de litière est nécessaire au cours des premiers jours, le nid entier sera transféré dans la nouvelle cage. - Les administrations seront faites sur une première moitié de la portée puis sur la seconde afin que la mère ait toujours des nouveau-nés avec elle - Avant la réintroduction des souriceaux dans la cage de la mère après administration, ils seront frottés avec le nid souillé afin d’en être réimprégnés de l’odeur. L’hébergement sera enrichi : bâtonnet de coton et sizzle pad pour le nid en plus d’un tube en plexiglass et d’un bâtonnet en bois La phase de prélèvement se déroulera sous analgésie (buprénorphine 0.1ml/10g ou méthadone 10mg/kg en SC) et anesthésie profonde (kétamine 120mg/ml et de xylazine 12mg/ml en IP).

Choix des espèces

La souris saine présente une forte homologie génétique, physiologique et comportementale avec l’homme et apporte ainsi une forte valeur translationnelle. 90% des gènes humains ont un équivalent chez la souris saine, permettant d’évaluer l’efficacité des composés sur les cibles génétiques sans avoir systématiquement recours à des souris génétiquement modifiées. Afin d’évaluer l’effet de nos composés dans le cadre des DEEs, il est important de développer des modèles vivo adaptés au stade de développement cérébral et physiologique des patients atteints. Ainsi, il s’avère nécessaire de réaliser les études sur des souris nouveau nées. Les procédures d’évaluations décrites dans ce projet s’appuient sur une littérature scientifique et une expertise interne robustes. Les administrations seront réalisées sur des souriceaux âgés de 1 à 3 jours. Afin d’évaluer l’effet de nos composés dans le cadre des épilepsies rares infantiles, il est important de développer des modèles vivo adaptés au stade de développement cérébral et physiologique des patients atteints. Ainsi, il s’avère nécessaire de réaliser les études sur des souris nouveau-nées.

216 souris reçoivent une ou deux injections intrapéritonéales de psychédéliques agissant sur le récepteur 5-HT2A, puis sont tuées une heure plus tard. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, et l'ensemble des animaux est mis à mort pour analyser la neurochimie de trente régions cérébrales. Le porteur écrit qu'aucun effet indésirable n'est attendu et qu'aucun point limite n'est rapporté pour ces composés, tout en prévoyant le cas d'une respiration altérée, d'une prostration, d'une immobilité en posture anormale ou de convulsions. Il précise alors que l'animal sera retiré du dispositif puis tué dans une chambre à dioxyde de carbone, rapidement s'il ne récupère pas, ou en fin de journée si les signes persistent.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer l’effet d’agents pharmacologiques psychédéliques agissant sur le récepteur à la sérotonine 5-HT2A (psychédéliques classiques). Les agonistes de ce récepteur sont considérés comme des antidépresseurs et anxiolytiques potentiels, mais ils sont aussi des composés hallucinogènes. Compte tenu de l’expression diffuse de l’expression du récepteur 5-HT2A dans le cerveau, nous postulons que les effets de ces composés altèrent l’activité de nombreux systèmes de neurotransmissions et de réseaux neurobiologiques. Cette information n’existe pas. C’est la raison pour laquelle nous avons lancé ce projet de recherche en neuropharmacologie et qui s’insère dans le champ de la neurobiologie intégrative. Par ailleurs, ce projet vise aussi à inclure dans la question posée le rôle de l’environnement dans le mécanisme d’action de ces composés. Une analyse de la littérature montre en effet que ces composés ne sont pas évalués dans des protocoles d’exploration forcée, en d’autres termes, des protocoles qui mettent en jeu le comportement exploratoire de l’animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes d'action des agents pharmacologiques psychédéliques sur l’activité des systèmes de neurotransmissions classiques dans le cerveau. Ces systèmes de neurotransmission jouent un rôle essentiel dans le traitement de l’information et les comportements. La réalisation de banque de données neurochimiques sur 30 régions cérébrales permettra de concevoir pour une première fois l’organisation fonctionnelle des systèmes de neurotransmission seuls ou en interaction sur plusieurs réseaux neurobiologiques dans le cadre du mécanisme d’action de ces composés. Cette permettra aussi de définir le rôle du récepteur cible des psychédéliques dans les effets neurochimiques de ces composés hallucinogènes, associés à des effets comportementaux (principalement le comportement exploratoire).

Procédures

Il y aura une voire 2 injections intrapéritonéales chez les souris qui seront réalisées par des expérimentateurs aguerris. La durée totale nécessaire à la préhension de la souris et à l'injection est estimée à moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Il n'y a à priori aucun effet indésirable attendu en dehors des effets de la préhension de l'animal et de l'injection sur les animaux qui sont euthanasiés 1 h après l'unique injection intrapéritonéale. Néanmoins, les effets des substances sont ambivalents nécessitant des études en dose réponse. Ils induisent des effets non toxiques sur la physiologie générale et ont des propriétés plutôt analgésiques. Il n’y a pas de points limites reportés pour ces composés dans la gamme des doses que nous avons déterminée. L’antagoniste MDL100907 a été caractérisé comme un antipsychotique de seconde génération, et est parfois administré chez l’homme. Il n’a pas d’effets secondaires connus. Les solvants contiennent parfois des composés potentiellement agressifs (Tween, DMSO), mais pas aux concentrations utilisées. L’utilisation de ces composés (Tween, DMSO) est nécessaire pour dissoudre les composés. Il n’y a pas de points limites mais il faut être vigilant. Dans le cas où une injection serait associée à des effets néfastes inattendus (respiration altérée, prostration, immobilité associée à une posture anormale, convulsions), l’animal sera retiré de la cage en plexiglas, et placé dans une cage d’hébergement classique contenant de la litière. L’animal sera euthanasié dans une chambre à dioxyde de carbone ultérieurement, c’est-à-dire rapidement si l’animal ne recouvre pas de la souffrance apparente, ou en fin de journée si les points limites ne disparaissent pas rapidement.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure en vue d'une analyse neurochimique de différentes structures cérébrales.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé que chez l'animal, le modèle murin étant un des plus classiquement utilisé pour ce type d'étude. En effet il s'agit d'évaluer des effets pharmacologiques sur des paramètres comportementaux et neurochimiques dans plusieurs régions cérébrales.

Réduction

Les groupes expérimentaux sont conçus avec le minimum d’individu pour pouvoir réaliser des études statistiques valables. Ces analyses tiennent compte de comparaison de moyennes ou d’analyses plus complexes (analyses en corrélations, analyse multivariées).

Raffinement

Pour limiter au maximum le stress des animaux, ceux-ci sont habitués à l'expérimentateur (le même pendant toute la durée de l'expérience) dès leur arrivée dans l’animalerie agrée du laboratoire. Le temps d’acclimatation des animaux aux lieux sera d’au moins 10 jours. Les animaux seront hébergés dans des cages par 4 en présence de litière favorisant l’absorption des liquides vers le bas. Ces cages sont transparentes afin de favoriser le contact visuel. Ils auront également à leur disposition des formes d’enrichissement afin de réduire l’ennui et le stress comme des carrés de coton, un cylindre rigide en carton, jusqu’au jour de l’expérience. Les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler d'éventuelles souffrances entrainant des comportements particuliers: respiration anormale, agressivité vis à vis des congénères, auto-mutilation, diminution d'activité ainsi qu'un suivi de poids, une perte de poids anormale étant un indice de souffrance. Si un animal présentait des signes de souffrance, il sera isolé de ses congénères, la procédure sera arrêtée et il sera surveillé sur tous les paramètres précédemment cités. S’il ne récupère pas des paramètres normaux, le vétérinaire sera contacté pour évaluation de son état. En cas de lésions, un traitement analgésique local à la lidocaine pourra être envisagé.

Choix des espèces

La majorité des études sur le sujet sont réalisées sur des rongeurs de laboratoire, particulièrement chez la souris. L'utilisation de souris C57/ Bl6 permettra d'analyser nos résultats en se basant sur les données de la littérature de façon plus pertinente. Souris adultes de 3 à 6 mois

756 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune passant entre 5 et 74 séances d'imagerie sous anesthésie, d'une durée pouvant atteindre 1 h 30, sur une période allant jusqu'à 18 mois. Un nerf ciliaire leur est coupé pour léser l'innervation de la cornée, opération de 10 à 15 minutes, et un filament de nylon est posé sur leur œil une fois par mois pour déclencher le réflexe de clignement. Toutes sont tuées à la fin de la période de maintien, les yeux prélevés et les cornées disséquées, pour une étude qui cherche à comprendre comment les nerfs de la cornée se régénèrent, sans traitement candidat à ce stade. Le porteur justifie le choix de la souris en affirmant que "plus de 98 pourcent de son génome est identique à celui de l'Homme".

Objectifs

Les maladies de la cornée sont la deuxième cause de cécité dans le monde après la cataracte. Leur origine peut être génétique, dégénérative (vieillissement, diabète) et/ou environnementale. Il est donc essentiel de mieux comprendre la physiologie de la cornée pour proposer de nouvelles options thérapeutiques aux patients souffrant de défauts de la cornée. L'atteinte de l'innervation cornéenne se traduit par des symptômes allant d'une diminution de la sensibilité oculaire sans lésion cornéenne au syndrome de l'oeil sec. Actuellement, il n'existe aucun traitement disponible en routine pour la gestion de l'innervation cornéenne. Dans ce projet, nous souhaitons étudier la régénération de l’innervation cornéenne en temps réel dans des modèles murin de lésion de l'innervation de la cornée. Nous avons ainsi pour objectifs d’étudier différents mécanismes lors de la régénération axonale (interactions entre les nerfs et les cellules immunitaires ; interactions entre les nerfs et les cellules gliales ; mécanismes de dégénérescence nerveuse ; implication des molécules de guidage axonale). Afin de comprendre l’ensemble de ces mécanismes ainsi que leur modulation en fonction de l’âge des animaux, nous souhaitons réaliser cette étude sur populations d’âges différents (comparaison groupe jeune et groupe agé. ).

Bénéfices attendus

Aucun traitement n’est actuellement disponible en routine malgré le nombre important de patients atteints (estimé à 1 personne sur 2000). Les causes du développement de la maladie sont diverses : d'origine virale ou bactérienne, mais également des affections secondaires dues à d'autres pathologies telles que le diabète ou encore à des atteintes traumatiques ou chirurgicales. Cette étude permettra de mieux comprendre l'innervation de la cornée et les mécanismes sous-jacents impliqués dans sa plasticité, son remodelage et sa régénération à la suite de lésions; et ainsi d’identifier de nouvelles voies thérapeutiques pour le traitement de la kératite neurotrophique.

Procédures

Un partie des animaux recevra un traitement par gavage (réalisé une seule fois, sur animal vigile, l'acte dure moins de 1 min par animal). Les animaux subiront une chirurgie (lésion d'un nerf ciliaire) ; cet acte dure environ 10-15 min par animal et il est réalisé sur animal anesthésié et analgésié. Une fois par mois (soit 18 fois maximum selon les groupes), nous réaliserons un test de sensibilité de la cornée (réalisé sur animal vigile, l'acte dure environ 3 min par animal). Ce test est rapide et consiste à poser un filament de nylon sur l'oeil pour provoquer un reflexe de clignement de la paupière. Chaque animal sera imagé 1x par semaine pour une durée allant de 1 mois jusqu'à 18 mois selon les objectifs du projet (soit entre 5 et 74 sessions d'imagerie, selon la procédure, réalisées sous anesthésie d'une durée maximale de 1h30 chacune).

Impact sur les animaux

Une partie des animaux recevront un traitement par gavage (une seule fois). La contention au moment de sa réalisation peut être source de stress chez les animaux. L'introduction de la canule peut quelques fois provoquer des microlésions. Les animaux recevront deux injections par voie sous-cutané. Au moment de la réaliser, la contention et l'introduction de l'aiguille peut être source de stress pour les animaux. Une légère douleur au moment de l’insertion de l’aiguille peut aussi être ressentie. Pour réaliser ce projet, nous allons induire une lésion de l’innervation cornéenne par ablation d’un nerf ciliaire. La contention de l'animal pour la réalisation du test de sensibilité de la cornée peut également être source de stress. Ce test est rapide et consiste à poser un filament de nylon sur l'oeil pour provoquer un reflexe de clignement de la paupière. La répétition des sessions d'imagerie peut également être source de stress pour les animaux. L'anesthésie peut dans de rare cas amener un stress thermique ou une potentielle détresse respiratoire chez les animaux.

Devenir

A la fin de la période de maintien prévue, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses histologiques complémentaires (les yeux seront prélevés et l'ensemble des cornées des animaux sera disséqué).

Remplacement

Du fait de la complexité de l'oeil, de l’innervation cornéenne et des interactions entre les nerfs et les cellules, il n'est pas possible de modéliser les mécanismes de la pathologie que nous étudions par des modèles in vitro. L'utilisation de l'animal nous est donc indispensable pour étudier de façon complète les mécanismes du développement de la pathologie que nous étudions ainsi que les processus de régénération de l'innervation de la cornée.

Réduction

Ce projet impliquera au maximum 756 souris. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables (nous utiliserons dans notre étude un test statistique adapté pour l'analyse de nos études) et atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. Le nombre d'animaux requis pour ce projet a été déterminé à l'aide d'un logiciel.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation standard avec enrichissement (bâtons en bois, coton), avec un cycle jour-nuit de 12h. La température et l’hygrométrie sont régulés. Les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Des points limites ont été définis (tels que la surveillance du poids des animaux, l'absence de locomotion, l'état du pelage, la prostration). Pour les étapes chirurgicales et les analyses par imagerie, les rongeurs bénéficieront d'une analgésie ainsi que d'anesthésie générale complémenté par une anesthésie locale de la cornée.

Choix des espèces

La souris présente l’avantage d’être très similaire à l’homme que ce soit anatomiquement, physiologiquement et génétiquement. En effet plus de 98 pourcent de son génome est identique à celui de l’Homme. Par ailleurs, ce modèle permet la transgénèse et donc de pouvoir étudier in vivo les conséquences de la délétion d’un gène. La souris est un modèle utilisé depuis de très nombreuses années pour l’étude du système nerveux et de l’innervation cornéenne. De ce fait de nombreuses données sont déjà disponibles sur lesquelles notre étude peut se reposer. Nous réaliserons les expérimentations sur 2 groupes d’âges différents. Un premier groupe nommé jeune (animaux âgés d’environ 3 mois) et un groupe agé (animaux âgés d’environ 15 mois). Cela nous permettra de comparer les processus et capacités de régénération en fonction de l’âge.

La récompense qui fait tenir la tâche repose sur une restriction d'eau de moitié, laquelle fait perdre aux souris jusqu'à 10 % de leur poids, et leur tête reste immobilisée jusqu'à 45 minutes par séance. 480 souris sont utilisées dans ce premier volet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, après 49 jours d'introduction de congénères inconnus dans leur cage pour installer un état anxieux. Le porteur qualifie pourtant la tâche de "non aversive et non douloureuse" et classe la restriction hydrique parmi les effets indésirables "mineurs". Toutes sont tuées à l'issue, leur cerveau prélevé pour des analyses post-hoc.

Objectifs

La phobie sociale, ou trouble de l'anxiété sociale (TAS), est une forme de trouble anxieux définie récemment, actuellement classée parmi les troubles psychiatriques les plus fréquents. Ce trouble se caractérise par une peur intense et persistante d'une évaluation négative potentielle par les autres lors d'interactions sociales, ce qui conduit souvent à l'évitement social et au repli sur soi. L'une des principales altérations du TAS, souvent considérée comme une cause sous-jacente, est une perturbation du traitement de l'information sociale. En effet, les individus socialement anxieux présentent des réponses exagérées et ont du mal à contrôler leur attention face aux stimuli socialement menaçants. Le toucher est une forme essentielle d'interaction sociale, et il a été observé que la perception tactile est altérée chez les personnes socialement anxieuses, qui semblent ne pas tirer profit de ses bienfaits et manifestent une aversion pour le toucher social. Cependant, les réponses neuronales et les processus attentionnels nécessaires pour filtrer les informations tactiles, lorsqu'elles deviennent non pertinentes, n'ont pas encore été étudiés. Dans cette étude, nous visons à caractériser la perception des stimuli tactiles, qu'ils soient sociaux ou non-sociaux, ainsi que le contrôle attentionnel dans le contexte du TAS. Nous proposons de développer et d'utiliser une nouvelle tâche de prise de décision perceptive, combinée à des mesures physiologiques de l'activité neuronale dans un modèle murin du TAS. Le projet est un multisite, et se déroulera dans deux EU differents. Nos résultats permettront d'approfondir la compréhension de la perception tactile et du contrôle de l’attention face aux stimuli tactiles dans le TAS, tout en révélant les mécanismes neuronaux sous-jacents. En utilisant une tâche adaptable pour des études humaines mesurant les réponses tactiles chez les individus socialement anxieux, nous espérons obtenir des résultats susceptibles d'améliorer la qualité de vie des personnes souffrant de TAS.

Bénéfices attendus

Le trouble d'anxiété sociale (TAS) est un trouble psychiatrique chronique qui peut constituer un véritable handicap au quotidien. La prévalence estimée du TAS au cours de la vie est d'environ 4 %. Dans le trouble d'anxiété sociale (TAS), les personnes réagissent souvent de manière exagérée aux situations sociales perçues comme négatives et éprouvent des difficultés à contrôler leur attention face aux stimuli sociaux. Ces caractéristiques sont bien connues et pourraient être une des causes de ce trouble. Egalement, les individus socialement anxieux semblent ne pas tirer profit des bienfaits de l’interaction sociale. Comprendre les altérations neuronales à l'origine de ces difficultés sociales pourrait fournir des informations cruciales sur les modifications du fonctionnement cérébral dans le TAS. Ces recherches pourraient révéler de nouvelles cibles pour le développement de traitements pharmacologiques visant à améliorer les symptômes du TAS, ou encore identifier des biomarqueurs permettant d'évaluer l'efficacité de traitements expérimentaux dans un cadre préclinique. Ces types d'études nécessitent cependant des approches invasives et des manipulations qui ne peuvent être réalisées dans un cadre clinique. Nous pensons que notre étude contribuera à une meilleure compréhension des types de cellules et des circuits impliqués dans l'altération de la perception sociale dans le TAS. Il s'agit de la première étude à caractériser ces altérations neuronales en utilisant une tâche adaptable aux études humaines, et elle a le potentiel de fournir des informations qui, à terme, amélioreront la qualité de vie des personnes diagnostiquées avec un trouble d'anxiété sociale.

Procédures

Pour étudier le trouble de l’anxiété sociale, les animaux soumis à un protocole d'instabilité sociale pendant 49 jours au cours de l'adolescence et de l'âge adulte, similaire à celle des personnes qui se déplacent fréquemment (EU 1). Leur anxiété, réponses sensorielles et interactions sociales seront évaluées par les taches comportementales (EU 1). Tous les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : la première durera environ 45 à 90 minutes, et la deuxième durera de 90 à 120 minutes (EU 1). Pour comprendre les mécanismes neurobiologiques du control de l’attention, les animaux apprendront à effectuer une tâche comportementale non aversive et non douloureuse, basé sur les récompenses, pendant 45 minutes par jour (EU 2). En même temps, nous effectuons des mesures physiologiques afin d'enregistrer l'activité des neurones du cerveau (EU 2). Afin de permettre cet enregistrement, les animaux sont entraînés à accepter une contention partielle (immobilisation de la tête) (EU 2). Pour s'assurer que les animaux ne ressentent ni stress ni anxiété, ils seront progressivement habitués à l'installation et à l’immobilisation de la tête d’une minute à 45 minutes, pendant 5 jours. Cela permet aux animaux apprendre que cette immobilisation est réversible et pas douloureuse. Lorsqu'ils seront à l'aise dans le dispositif (pas de signes de détresse, capables de manger et boire), l'entraînement à la tâche comportementale commencera (EU 2).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables mineurs pouvant être rencontrés dans cette étude seront liés à : 1. Induction du trouble d'anxiété sociale : Le paradigme du stress d'instabilité sociale (SIS49D) qui consiste à introduire des partenaires inconnus du même sexe dans la cage d'accueil (deux fois par semaine) sera mis en œuvre et provoquera du stress. 2. Immobilisation partielle : Une fixation au niveau de la tête pendant la tâche de prise de décision n'est pas douloureuse mais va entrainer du stress aux animaux pendant les premières séances. 3. Restriction hydrique : La mise en place d’une récompense hydrique implique une restriction d'eau (50 % de la consommation ad libitum) qui va entrainer une perte de poids maximale de 10 %.

Devenir

Toutes les souris seront euthanisiées et leurs cerveaux seront prélevés pour des analyses post-hoc.

Remplacement

Les expériences proposées dans cette étude nécessitent des circuits intacts et des mesures à la fois physiologiques et comportementaux. Un modèle animal est absolument nécessaire pour reproduire la complexité de ces interactions neuronales et ne peut pas être remplacé par les études in vitro ou in silico. Les études cliniques ne sont pas adaptées à notre objectif expérimental car il s’agit d’une population clinique fragile et car les approches invasives sont nécessaires pour répondre à notre question scientifique. Les circuits neuronaux sont bien conservés chez les différentes espèces mammifères et sont donc susceptibles d'être fonctionnellement similaires chez les rongeurs et les humains. Utiliser des modèles plus simples, comme la mouche du vinaigre, n’est pas adaptée à notre projet, car cet organisme n’a ni les structures du cerveau ni les comportements nécessaires pour étudier le contrôle de l’attention.

Réduction

Une conception expérimentale soignée garantira la reproductibilité des résultats et, avec des techniques d'analyse statistique appropriées, l'utilisation d'animaux sera réduite au minimum. Partie des protocoles comportementaux, physiologiques, et pharmacologiques ont déjà mis en place pour une étude précédente sur la perception tactile. Cette première étude nous a permis de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour réaliser ces expériences et avoir des résultats statistiquement valides. Cela nous a permis d'assurer la crédibilité de nos résultats avant de procéder à l'étude principale. Les données comportementales, physiologiques, et pharmacologiques seront recueillies auprès des mêmes animaux. Les neurones pyramidaux et inhibiteurs seront suivis simultanément et distingués par l'expression de rapporteurs spécifiques. Les injections du traitement seront suivies des injections contrôles dans les mêmes animaux. Ces mesures nous permettront de réduire le nombre d'animaux utilisés dans l'étude et de mesurer simultanément plusieurs paramètres.

Raffinement

Tous les résultats scientifiques concernant les facteurs influençant le bien-être des animaux, ainsi que leur capacité à ressentir et à exprimer la douleur, la souffrance, l'angoisse et les dommages durables, seront pris en compte. Les expériences seront conçues et réalisées de la manière la plus éthique possible. Le matériel adéquat sera mis à disposition des personnes autorisées, compétentes et dûment qualifiées, qui respecteront rigoureusement les procédures mises en place. Tous les animaux seront manipulés en utilisant les techniques les moins stressantes possibles, conformément à la littérature : l'utilisation d'un tunnel ou des mains en forme de coupe. L’hébergement en cages collectives garantira des interactions sociales pendant et après l’induction du TAS. Le paradigme pour l’induction du TAS débutera pendant l’adolescence, car il est souvent associé à une plus grande agressivité lorsqu'il est appliqué à des souris adultes. Deux tubes en carton et du matériel de nidification seront placés dans chaque cage afin de garantir la poursuite de tous les comportements normaux des animaux et de réduire les incidents d'agression. La nourriture sera également disposée dans la cage pour diminuer les conflits pendant l’induction du TAS, et les animaux seront surveillés quotidiennement. Les animaux seront transférés entre les deux sites dans leurs cages d'origine, pendant leur phase active, et placés dans l'obscurité à l'intérieur d'un chariot. Ils disposeront d’une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement. Pendant la restriction en eau, les animaux seront pesés chaque jour, et leur alimentation en eau sera ajustée afin de s'assurer qu'ils ne dépassent jamais une perte de poids de 10 %. L'hydrogel, fourni comme source d'eau, est considéré comme un enrichissement, car les animaux peuvent le manipuler avec leurs pattes avant. Avant les tâches comportementales, les animaux seront habitués à la pièce d’expérimentation. Pour la tâche de prise de décision, ils seront progressivement familiarisés avec la fixation de la tête pour garantir un stress minimal. Des stimulations tactiles non douloureuses seront utilisées pendant la tâche perceptuelle. L'anxiolytique sera administré par voie orale, dissous dans la boisson des animaux. Pour euthanasier les animaux, les souris seront d’abord anesthésiées. Des points limites spécifiques et des mesures conservatoires seront définis pour chaque phase de la procédure.

Choix des espèces

La souris a été choisie afin de rester cohérente avec les études antérieures sur le stress chronique induit par les interactions sociales. Les souris soumises au modèle de stress chronique d'instabilité sociale, qui sera utilisé dans cette étude, présentent une augmentation de l'anxiété et des perturbations dans les interactions sociales. Les rongeurs possèdent un système sensoriel très développé et sont considérés comme une espèce modèle pour l'étude du traitement de certains types d'informations sensorielles. De plus, les souris sont capables d'apprendre et d'exécuter des tâches de prise de décision perceptive, indispensables pour mieux comprendre les réponses tactiles. Conformément aux études précédentes, le protocole d’induction du TAS débutera à l’adolescence et se terminera à l’âge adulte. Toutes les autres étapes de l’expérience seront menées chez les souris adultes.

Deux chirurgies cérébrales, l'une de 45 à 90 minutes et l'autre de 90 à 120, une tête maintenue fixe jusqu'à 45 minutes par jour, une ration d'eau réduite de moitié : 480 souris subissent ce protocole dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. L'anxiété sociale leur est induite par 49 jours d'introduction répétée de congénères inconnus dans leur cage, de l'adolescence à l'âge adulte. Le projet vise à mesurer comment ces souris filtrent des stimuli tactiles, sociaux ou non, dans une tâche de décision récompensée par de l'eau. Le porteur annonce que l'anxiété, les réponses sensorielles et les interactions sociales seront évaluées par des tâches comportementales, sans dire lesquelles, et range la perte de poids de 10 % liée à la restriction hydrique parmi les effets indésirables "mineurs".

Objectifs

La phobie sociale, ou trouble de l'anxiété sociale (TAS), est une forme de trouble anxieux définie récemment, actuellement classée parmi les troubles psychiatriques les plus fréquents. Ce trouble se caractérise par une peur intense et persistante d'une évaluation négative potentielle par les autres lors d'interactions sociales, ce qui conduit souvent à l'évitement social et au repli sur soi. L'une des principales altérations du TAS, souvent considérée comme une cause sous-jacente, est une perturbation du traitement de l'information sociale. En effet, les individus socialement anxieux présentent des réponses exagérées et ont du mal à contrôler leur attention face aux stimuli socialement menaçants. Le toucher est une forme essentielle d'interaction sociale, et il a été observé que la perception tactile est altérée chez les personnes socialement anxieuses, qui semblent ne pas tirer profit de ses bienfaits et manifestent une aversion pour le toucher social. Cependant, les réponses neuronales et les processus attentionnels nécessaires pour filtrer les informations tactiles, lorsqu'elles deviennent non pertinentes, n'ont pas encore été étudiés. Dans cette étude, nous visons à caractériser la perception des stimuli tactiles, qu'ils soient sociaux ou non-sociaux, ainsi que le contrôle attentionnel dans le contexte du TAS. Nous proposons de développer et d'utiliser une nouvelle tâche de prise de décision perceptive, combinée à des mesures physiologiques de l'activité neuronale dans un modèle murin du TAS. Le projet est un multisite, et se déroulera dans deux EU differents. Nos résultats permettront d'approfondir la compréhension de la perception tactile et du contrôle de l’attention face aux stimuli tactiles dans le TAS, tout en révélant les mécanismes neuronaux sous-jacents. En utilisant une tâche adaptable pour des études humaines mesurant les réponses tactiles chez les individus socialement anxieux, nous espérons obtenir des résultats susceptibles d'améliorer la qualité de vie des personnes souffrant de TAS.

Bénéfices attendus

Le trouble d'anxiété sociale (TAS) est un trouble psychiatrique chronique qui peut constituer un véritable handicap au quotidien. La prévalence estimée du TAS au cours de la vie est d'environ 4 %. Dans le trouble d'anxiété sociale (TAS), les personnes réagissent souvent de manière exagérée aux situations sociales perçues comme négatives et éprouvent des difficultés à contrôler leur attention face aux stimuli sociaux. Ces caractéristiques sont bien connues et pourraient être une des causes de ce trouble. Egalement, les individus socialement anxieux semblent ne pas tirer profit des bienfaits de l’interaction sociale. Comprendre les altérations neuronales à l'origine de ces difficultés sociales pourrait fournir des informations cruciales sur les modifications du fonctionnement cérébral dans le TAS. Ces recherches pourraient révéler de nouvelles cibles pour le développement de traitements pharmacologiques visant à améliorer les symptômes du TAS, ou encore identifier des biomarqueurs permettant d'évaluer l'efficacité de traitements expérimentaux dans un cadre préclinique. Ces types d'études nécessitent cependant des approches invasives et des manipulations qui ne peuvent être réalisées dans un cadre clinique. Nous pensons que notre étude contribuera à une meilleure compréhension des types de cellules et des circuits impliqués dans l'altération de la perception sociale dans le TAS. Il s'agit de la première étude à caractériser ces altérations neuronales en utilisant une tâche adaptable aux études humaines, et elle a le potentiel de fournir des informations qui, à terme, amélioreront la qualité de vie des personnes diagnostiquées avec un trouble d'anxiété sociale.

Procédures

Pour étudier le trouble de l’anxiété sociale, les animaux soumis à un protocole d'instabilité sociale pendant 49 jours au cours de l'adolescence et de l'âge adulte, similaire à celle des personnes qui se déplacent fréquemment (EU 1). Leur anxiété, réponses sensorielles et interactions sociales seront évaluées par les taches comportementales (EU 1). Tous les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : la première durera environ 45 à 90 minutes, et la deuxième durera de 90 à 120 minutes (EU 1). Pour comprendre les mécanismes neurobiologiques du control de l’attention, les animaux apprendront à effectuer une tâche comportementale non aversive et non douloureuse, basé sur les récompenses, pendant 45 minutes par jour (EU 2). En même temps, nous effectuons des mesures physiologiques afin d'enregistrer l'activité des neurones du cerveau (EU 2). Afin de permettre cet enregistrement, les animaux sont entraînés à accepter une contention partielle (immobilisation de la tête) (EU 2). Pour s'assurer que les animaux ne ressentent ni stress ni anxiété, ils seront progressivement habitués à l'installation et à l’immobilisation de la tête d’une minute à 45 minutes, pendant 5 jours. Cela permet aux animaux apprendre que cette immobilisation est réversible et pas douloureuse. Lorsqu'ils seront à l'aise dans le dispositif (pas de signes de détresse, capables de manger et boire), l'entraînement à la tâche comportementale commencera (EU 2).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables mineurs pouvant être rencontrés dans cette étude seront liés à : 1. Induction du trouble d'anxiété sociale : Le paradigme du stress d'instabilité sociale (SIS49D) qui consiste à introduire des partenaires inconnus du même sexe dans la cage d'accueil (deux fois par semaine) sera mis en oeuvre et provoquera du stress. 2. Immobilisation partielle : Une fixation au niveau de la tête pendant la tâche de prise de décision n'est pas douloureuse mais va entrainer du stress aux animaux pendant les premières séances. 3. Restriction hydrique : La mise en place d’une récompense hydrique implique une restriction d'eau (50 % de la consommation ad libitum) qui va entrainer une perte de poids maximale de 10 %.

Devenir

Toutes les souris seront euthanisiées et leurs cerveaux seront prélevés pour des analyses post-hoc.

Remplacement

Les expériences proposées dans cette étude nécessitent des circuits intacts et des mesures à la fois physiologiques et comportementaux. Un modèle animal est absolument nécessaire pour reproduire la complexité de ces interactions neuronales et ne peut pas être remplacé par les études in vitro ou in silico. Les études cliniques ne sont pas adaptées à notre objectif expérimental car il s’agit d’une population clinique fragile et car les approches invasives sont nécessaires pour répondre à notre question scientifique. Les circuits neuronaux sont bien conservés chez les différentes espèces mammifères et sont donc susceptibles d'être fonctionnellement similaires chez les rongeurs et les humains. Utiliser des modèles plus simples, comme la mouche du vinaigre, n’est pas adaptée à notre projet, car cet organisme n’a ni les structures du cerveau ni les comportements nécessaires pour étudier le contrôle de l’attention.

Réduction

Une conception expérimentale soignée garantira la reproductibilité des résultats et, avec des techniques d'analyse statistique appropriées, l'utilisation d'animaux sera réduite au minimum. Partie des protocoles comportementaux, physiologiques, et pharmacologiques ont déjà mis en place pour une étude précédente sur la perception tactile. Cette première étude nous a permis de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour réaliser ces expériences et avoir des résultats statistiquement valides. Cela nous a permis d'assurer la crédibilité de nos résultats avant de procéder à l'étude principale. Les données comportementales, physiologiques, et pharmacologiques seront recueillies auprès des mêmes animaux. Les neurones pyramidaux et inhibiteurs seront suivis simultanément et distingués par l'expression de rapporteurs spécifiques. Les injections du traitement seront suivies des injections contrôles dans les mêmes animaux. Ces mesures nous permettront de réduire le nombre d'animaux utilisés dans l'étude et de mesurer simultanément plusieurs paramètres.

Raffinement

Tous les résultats scientifiques concernant les facteurs influençant le bien-être des animaux, ainsi que leur capacité à ressentir et à exprimer la douleur, la souffrance, l'angoisse et les dommages durables, seront pris en compte. Les expériences seront conçues et réalisées de la manière la plus éthique possible. Le matériel adéquat sera mis à disposition des personnes autorisées, compétentes et dûment qualifiées, qui respecteront rigoureusement les procédures mises en place. Tous les animaux seront manipulés en utilisant les techniques les moins stressantes possibles, conformément à la littérature : l'utilisation d'un tunnel ou des mains en forme de coupe. L’hébergement en cages collectives garantira des interactions sociales pendant et après l’induction du TAS. Le paradigme pour l’induction du TAS débutera pendant l’adolescence, car il est souvent associé à une plus grande agressivité lorsqu'il est appliqué à des souris adultes. Deux tubes en carton et du matériel de nidification seront placés dans chaque cage afin de garantir la poursuite de tous les comportements normaux des animaux et de réduire les incidents d'agression. La nourriture sera également disposée dans la cage pour diminuer les conflits pendant l’induction du TAS, et les animaux seront surveillés quotidiennement. Les animaux seront transférés entre les deux sites dans leurs cages d'origine, pendant leur phase active, et placés dans l'obscurité à l'intérieur d'un chariot. Ils disposeront d’une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement. Pendant la restriction en eau, les animaux seront pesés chaque jour, et leur alimentation en eau sera ajustée afin de s'assurer qu'ils ne dépassent jamais une perte de poids de 10 %. L'hydrogel, fourni comme source d'eau, est considéré comme un enrichissement, car les animaux peuvent le manipuler avec leurs pattes avant. Avant les tâches comportementales, les animaux seront habitués à la pièce d’expérimentation. Pour la tâche de prise de décision, ils seront progressivement familiarisés avec la fixation de la tête pour garantir un stress minimal. Des stimulations tactiles non douloureuses seront utilisées pendant la tâche perceptuelle. L'anxiolytique sera administré par voie orale, dissous dans la boisson des animaux. Pour euthanasier les animaux, les souris seront d’abord anesthésiées. Des points limites spécifiques et des mesures conservatoires seront définis pour chaque phase de la procédure.

Choix des espèces

La souris a été choisie afin de rester cohérente avec les études antérieures sur le stress chronique induit par les interactions sociales. Les souris soumises au modèle de stress chronique d'instabilité sociale, qui sera utilisé dans cette étude, présentent une augmentation de l'anxiété et des perturbations dans les interactions sociales. Les rongeurs possèdent un système sensoriel très développé et sont considérés comme une espèce modèle pour l'étude du traitement de certains types d'informations sensorielles. De plus, les souris sont capables d'apprendre et d'exécuter des tâches de prise de décision perceptive, indispensables pour mieux comprendre les réponses tactiles. Conformément aux études précédentes, le protocole d’induction du TAS débutera à l’adolescence et se terminera à l’âge adulte. Toutes les autres étapes de l’expérience seront menées chez les souris adultes. Conformément aux études précédentes (Saavedra-Rodríguez et Feig, 2013), le protocole SIS49D commencera pendant l’adolescence (P27) et finira quand les souris sont adultes (P76). Tous les autres étapes de l’expérience seront réalisées chez les souris adultes. Les premières tâches comportementales seront réalisées à P78 et P105. Les chirurgies seront réalisées à P115 et l’entrainement dans la tâche de décision sera réalisé depuis P132. Conformément aux études précédentes (Saavedra-Rodríguez et Feig, 2013), le protocole SIS49D commencera pendant l’adolescence (P27) et finira quand les souris sont adultes (P76). Tous les autres étapes de l’expérience seront réalisées chez les souris adultes. Les premières tâches comportementales seront réalisées à P78 et P105. Les chirurgies seront réalisées à P115 et l’entrainement dans la tâche de décision sera réalisé depuis P132.

Dix séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse par animal, plus un gavage, une injection intramusculaire, une injection intrapéritonéale et un marquage des oreilles à l'entaille : 640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever cavité nasale, ganglions, rate, poumons et intestin. Le projet vise à suivre où se répartissent huit formulations vaccinales administrées par le nez ou par la bouche, puis à n'en retenir que deux. Les retombées annoncées, des vaccins muqueux contre des virus respiratoires ou des pathogènes digestifs, sont renvoyées au long terme. Sur le remplacement, le porteur affirme n'avoir "pas d'autre solution que d'utiliser l'animal dans son entier" et qualifie le recours à la souris d'"incontournable" puis de "nécessaire".

Objectifs

La vaccination représente une approche essentielle dans le domaine de la santé comme l’ont montré les épisodes pandémiques liés au Covid-19. Dans ce domaine, le développement de vaccins non-injectables dans le muscle du bras constitue un axe de recherche crucial. D’une part puisque cela permettrait d’améliorer la protection immunitaire associée au vaccin mais également puisque cela permettrait de s’affranchir de l’utilisation d’aiguille. Cette approche, appelée vaccination par voie muqueuse est au cœur des projets de recherche de notre laboratoire. En effet, notre laboratoire de recherche développe de nouvelles formulations vaccinales qui pourrait être admintrées par voie orale ou par voie nasale. Afin d’améliorer l’efficacité de ces potentiels vaccins, l’imagerie in vivo est une technique clé puisqu’elle permet de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de la réponse immunitaire. En effet, l'utilisation de techniques d’imagerie dites non-invasives offre la possibilité de suivre des phénomènes biologiques complexes comme la mise en place d’une réponse immunitaire et de suivre la distribution de formulations vaccinales par des mesures répétitives tout en évitant la mise à mort régulière de grands effectifs d’animaux, en comparaison d’une approche in vivo invasive. L’objectif de ce projet est de développer des formulations vaccinales et d’identifier les meilleures compositions grâce au suivi par imagerie de ces formulations après leur administration par voie orale ou nasale chez le petit animal. Cette approche permettra de mieux comprendre les mécanismes de la réponse immunitaire et d’améliorer l’efficacité des vaccins.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet concernent majoritairement la compréhension des mécanismes de la réponse immunitaire dans le cadre de la vaccination. Le bénéfice majeur du projet à long terme est le développement de formulation vaccinale orale ou nasale qui pourra s’appliquer à différents virus respiratoires ou des pathogènes gastro-intestinaux.

Procédures

- Pour l’identification des souris, le marquage des animaux par des entailles sur les bords des oreilles, sera réalisé sur l'animal anesthésié (1 fois/animal, durée : 1 minute). - Les administrations par voie intramuculaire sont des actes induisant une douleur légère. Nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie gazeuse (1 fois/animal, durée : 3 minutes) et un analgésique sera utilisé 30 minutes avant l’administration. Il pourra être renouvelé 6h après la première dose. - Les administration orale par gavage peuvent entrainer un leger inconfort pour l'animal (1 fois/animal, durée : 1 minute). Ce geste pourra être effectué après avoir trempé la canule de gavage dans une solution sucrée - Les injections intrapéritonéales sont des actes induisant une douleur légère et ne nécessitant pas d’anesthésie au préalable (1 fois/animal, durée : 5 minutes). - Les acquisitions d’images doivent se faire sur des animaux immobiles et seront donc réalisées sous anesthésie gazeuse (10 fois/animal, durée : 10 minutes).

Impact sur les animaux

- Marquage aux oreilles : ce geste peut entrainer un bref incorfort. - Administration intramusculaire : ce geste sera réalisé sur l’animal anesthésié et peut induire un inconfort léger après leur réveil). - Acquisition d’images : ces gestes seront réalisés sur l’animal anesthésié et peuvent induire un inconfort léger après leur réveil).

Devenir

A l’issue des deux procédures de ce projet, l’ensemble des animaux seront mis à mort. Cette mise à mort est nécessaire car elle permet de prélever différents organes d’intérêt (cavité nasale, ganglions lymphatiques, rate, poumons, intestin, etc ...) et de pouvoir ensuite les étudier plus en détails par d’autres techniques.

Remplacement

Avant d’utiliser sur l’animal les différentes formulations vaccinales développées dans ce projet, des études de toxicité et de réponse inflammatoire ont été menées à l’aide d’autres techniques (cultures cellulaires épithéliales et immunitaires) afin de vérifier leur non dangerosité sur l’animal. De manière générale, la vaccination repose sur la mise en place d’une réponse immunitaire faisant appel à l’ensemble des organes lymphoïdes, dont les ganglions lymphatiques et la rate, et dans différents organes ciblés. Le recours à l’animal est donc incontournable et le choix du modèle souris est le plus adapté afin d’évaluer l’efficacité de la dissémination de ces formulations vaccinales. Nous n’avons donc pas d’autre solution que d’utiliser l’animal dans son entier. L'étude de la biodistribution des formulations vaccinales nécessite une approche in vivo. Aucune méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation des animaux pour la réalisation de notre projet car il requiert l’analyse dans un organisme entier. De plus, nous souhaitons identifier et prélever les organes ciblés selon la voie d'administration (nasale ou orale). C’est pourquoi le modèle murin, qui est un modèle bien caractérisé et facilement manipulable, est nécessaire. Le nombre de souris nécessaires à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’analyse statistique de nos résultats. Une définition précise des points limites et une surveillance adaptée des animaux par un personnel compétent permet de limiter au maximum toute souffrance animale. Nous prévoyons d’utiliser au maximum 640 animaux sur une période de 5 ans.

Réduction

Dans l’ensemble, le nombre d’animaux utilisé a été réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet tout en permettant d’obtenir des résultats fiables (réalisation d’études statistiques). D’autre part, un choix restreint de groupes expérimentaux (8 formulations) a été fait grâce à des tests réalisés en amont par d’autres techniques d’analyses (criblage in vitro). Enfin, la première étape du projet permet de sélectionner les 2 meilleures formulations (sur les 8 initiales) et donc de réduire drastiquement le nombre de formulations testées dans un deuxième temps.

Raffinement

Différentes mesures seront prises tout au long des expérimentations pour limiter la souffrance et le stress des animaux : - l’environnement des souris sera enrichi (igloo, coton, morceaux de bois). - à la réception des souris, elles seront acclimatées durant une semaine dans l’établissement utilisateur. - Le marquage des souris sera effectué grâce à des entailles au bord de l’oreille, moins sensible et réalisé sous anesthésie. - Les administrations intramusculaires se feront sous anesthésie. - Les acquisitions d’image par tomographie par fluorescence ou par bioluminescence s’effectueront après anesthésie et l’anesthésie sera maintenue tout au long de l’acquisition - Après chaque anesthésie, les souris seront placées dans une cage disposée sur un tapis chauffant et le bon réveil des souris sera vérifié (mouvement de la souris, comportement, prise de boisson ou de nourriture, etc) avant de les replacer dans leur pièce d’hébergement.

Choix des espèces

La recherche préclinique chez l’animal est devenue indispensable avant toute application clinique de nouvelles thérapies. L'utilisation de souris permet d'observer les effets sur un organisme entier et la biodistribution dans sa globalité. De plus, l'outil de visualisation par tomographie est dédié à la souris. A la réception, les souris seront âgées de 6 semaines afin de s’assurer que le système immunitaire est mature.