Souris

Les souris qui montrent le moindre signe de détérioration de leur santé sont mises à mort sur-le-champ. Toutes les autres le sont à la fin des procédures, pour analyser leurs muscles et d'autres organes comme le foie. 1 144 souris porteuses d'une fibrose musculaire, certaines aussi immunodéficientes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier comment ce tissu cicatriciel modifie la régénération du muscle et l'effet des thérapies génique et cellulaire. Selon les groupes, elles reçoivent dans un muscle une toxine qui l'endommage, des virus, des cellules ou des molécules, subissent une greffe musculaire de 30 minutes sous anesthésie, ou un traitement d'environ 13 semaines par injection dans l'abdomen ou par gavage, jusqu'à deux fois par jour, sans anesthésie. Le porteur justifie le choix de l'espèce par l'usage : la souris est, écrit-il, "le modèle le plus commun utilisé dans des études de régénération musculaire".

Objectifs

Nous nous intéressons aux dystrophies musculaires, un groupe de maladies génétiques qui touchent le muscle squelettique. Elles sont caractérisées par une faiblesse musculaire, une dégénérescence progressive des muscles du corps. Dans certains types de dystrophies musculaires, comme par exemple la dystrophie musculaire de Duchenne (incidence 1 sur 3500 naissances de garçons), la dystrophie musculaire oculo-pharyngée (1 sur 100000) ou la dystrophie musculaire des ceintures (prévalence entre 1 et 3 personnes sur 125000) entre autres, l’apparition de tissu cicatriciel (appelé fibrose) dans les muscles est également observée. Le processus fibrotique représente une réponse progressive qui aboutit, suite à la production excessive de tissu cicatriciel remplaçant le tissu, à une dysfonction de l’organe et à dans certains cas peut amener à la mort de l’individu. Dans le muscle squelettique (comme dans nombreux autres tissus), le processus qui amène l’apparition de tissu cicatriciel reste un processus très peu connu et son impact sur la régénération musculaire et son influence sur certaines des thérapies innovantes utilisées dans des essais cliniques dans le cadre des dystrophies musculaires, reste mal compris. Ce projet consiste à 1) étudier l'impact de la fibrose musculaire sur la régénération musculaire; 2) étudier comment la fibrose musculaire peut influencer certaines approches thérapeutiques comme la thérapie génique et la thérapie cellulaire; 3) tester des approches thérapeutiques visés à diminuer la fibrose et améliorer la fonction musculaire dans des modèles de dystrophie musculaire.

Bénéfices attendus

Ce projet aidera à comprendre comment la présence de tissu cicatriciel (fibrose musculaire) au sein du muscle squelettique est capable de modifier la régénération du muscle. Également, il permettra de comprendre comment la fibrose peut influencer l’efficacité de certaines stratégies thérapeutiques, comme la thérapie cellulaire par transfert de myoblastes et la thérapie génique, qui représentent des thérapies envisageables pour des maladies génétiques comme les dystrophies musculaires. Enfin, il permettra de tester des approches thérapeutiques visés à diminuer la fibrose et améliorer la fonction musculaire dans des modèles de dystrophie musculaire.

Procédures

Différents groupes d’animaux seront soumis à différentes procédures. Un lot d'animaux sera soumis à l'injection d'une toxine musculaire sous anesthésie. Il s'agit d'une intervention de très courte durée (l'injection de la toxine elle-même ne dure que quelques secondes et la manipulation de la souris ne demande que quelques minutes); Un lot d'animaux sera soumis à l’injection intra musculaire (de virus type AAV -virus adéno-associés- ou de molécules thérapeutiques ou de cellules (sous anesthésie/analgésie). Il s'agit également d'une intervention de très courte durée (l'injection elle-même ne dure que quelques secondes et la manipulation de la souris ne demande que quelques minutes); Un lot d'animaux sera soumis alternativement pour une durée de traitement estimé à environ 13 semaines à :i) l’injection en intrapéritonéale d’une molécule thérapeutique (maximum deux fois par jour, sur animaux vigils) ; ii) le gavage d’une molécule thérapeutique (maximum deux fois par jour sur animaux vigils) ;iii) l’administration d’un molécule thérapeutique dans la nourriture (animaux vigils); iv) l’injection intra musculaire de molécules thérapeutiques sous anesthésie. Les manipulations des souris dans ces interventions sont de très courte durée (moins qu’une minute) ; Un lot d'animaux sera soumis à une greffe musculaire, une procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale et analgésie d’une durée de 30 minutes ; Un lot d'animaux sera soumis à une mesure in situ de la contractilité du muscle squelettique (durée de 15 minutes) qui est un acte sans réveil effectuée sous anesthésie et analgésie. Cet acte est suivi de l’euthanasie (réalisée sous anesthésie et analgésie) des tous les animaux afin de permettre le prélèvement des organes d’intérêt.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés présentent une fibrose musculaire à partir de 2 mois (selon le modèle utilisé) sans signe clinique associés. Certains animaux seront également immunodéficients et sont donc plus sensibles aux infections. Dans notre projet, nous injectons des cellules ou des virus de type AAV (virus adéno-associées) ou des molécules à effet thérapeutique en intramusculaire chez la souris. Pour certaines souris cela sera après avoir effectué un dommage musculaire du muscle tibialis anterior. D’autre animaux auront une greffe musculaire. L'effet indésirable qui peut se produire sur les animaux est une inflammation/infection de la peau au site d’injection, l'animal pourrait alors ressentir une douleur locale au niveau du site d'injection. Certains animaux auront un traitement en systémique (par injection intrapéritonéale ou par voie orale). L'effet indésirable qui peut se produire sur les animaux est une inflammation/infection de la peau au site d’injection (pour l’injection intrapéritonéale) ou un des effets secondaires liés à la molécule administrée. Lors des anesthésies effectuées pour l'ensemble des gestes techniques, les risques/contraintes peuvent être les suivants : effets sur les variables physiologiques affectant le maintien de l'homéostasie pendant l'anesthésie (hypothermie, hypotension, hypoxie)

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure. L’analyse des muscles injectés et des autres organes (foie, etc) est indispensable pour ce projet. L'euthanasie de l’ensemble des animaux est donc requise.

Remplacement

La thérapie cellulaire, génique, la régénération musculaire et la fibrose sont des processus qui peuvent être investigués exclusivement in vivo et pour le quel un remplacement in vitro en respect de la règle de 3R n’est pas encore possible.

Réduction

Chaque groupe sera constitué de 8-20 animaux pour obtenir des résultats statistiques. Dans le respect de la règle des 3R, une première série d’ expériences sera réalisée sur 5-12 souris. Le nombre sera incrémenté exclusivement si besoin. En outre, afin de réduire le nombre de souris utilisées (dans le respect de la règle des 3R) pour chaque souris, quand possible, les deux muscles Tibialis Anterior (gauche et droite) seront injectés. Au maximum un total de 1144 souris seront utilisées dans ce projet. Afin de comparer les groupes de sujets, nous réaliserons une analyse statistique.

Raffinement

Pour le raffinent, les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons ou tunnel en carton ou carré de coton compacté. Suite à la procédure chirurgicale, qui est réalisé sous anesthésie/analgésie, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant toute la durée de l’expérience afin de déceler des signes de douleur. Pour l’injection de vecteurs AAV- virus adéno-associés- en intramusculaire, pour l’injection de la myotoxine et l’injection de cellules, les souris sont anesthésiées. Les critères tels que l’activité générale, la prise de nourriture et d’eau, la perte de poids, des plaies au site d’injection, une croissance excessive des dents seront évalués régulièrement. Les animaux qui montrent un signe quelconque de détérioration de leur santé seront euthanasiés immédiatement.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est le modèle le plus commun utilisé dans des études de régénération musculaire et de compréhension des mécanismes physiopathologique du muscle squelettique, ainsi que dans des études pour évaluer la participation des myoblastes humains à la régénération musculaire et de thérapie génique. Nous utiliserons de souris présentant de la fibrose musculaire pour pouvoir étudier l’effet de la fibrose sur la régénération musculaire, la thérapie cellulaire et génique et tester des approches thérapeutiques visés à diminuer la fibrose et améliorer la fonction musculaire dans des modèles de dystrophie musculaire. Nous utiliserons des souris d’âge adulte (2 mois et plus): puisque c’est à partir de cet âge qu’elles présentent de la fibrose au niveau musculaire.

7 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à six injections dans l'abdomen, dix sous la peau, une injection quotidienne au pousse-seringue pendant vingt-huit jours, des chirurgies intracrâniennes, la pose de canules et de pompes osmotiques, un isolement d'une semaine, jusqu'à dix-huit semaines de régime obésogène, trois jeûnes et la coupure de la pointe de la queue pour les prises de sang. Le porteur signale que le régime gras provoque des problèmes de dents, que les chirurgies exposent à l'hypothermie et à des troubles cardiorespiratoires, et que l'enrichissement est retiré pendant l'isolement pour ne pas gêner les lasers qui mesurent l'activité locomotrice. Il écrit que chaque souris sera mise à mort à la fin de chaque procédure "dans le respect des 3R", les tissus de la moitié d'entre elles allant aux analyses moléculaires, ceux de l'autre moitié aux analyses histologiques.

Objectifs

Les hormones permettent à nos organes de communiquer entre eux et jouent ainsi un rôle essentiel au bon fonctionnement et au maintien de nos fonctions physiologiques, notamment celles régulées par le cerveau. Tout comme l’homme, la souris possède des récepteurs aux hormones dans des régions cérébrales essentielles dans la régulation du métabolisme énergétique. La compréhension de ces mécanismes est essentielle pour la mise en place de stratégie thérapeutique contre les troubles du métabolisme comme l’obésité. Notre objectif est de comprendre: 1- le nouveau rôle de récepteurs aux hormones dans la régulation du métabolisme énergétique dans un contexte physiologique et pathologique, 2- tester des nouvelles stratégies thérapeutiques dans la prise en charge de des troubles métaboliques comme l’obésité. Ces deux axes de recherche seront étudiés dans ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les maladies métaboliques tel que l’obésité. De plus, il permettrait de comprend le nouveau rôle, au niveau du cerveau, de récepteurs dans l'intégration des signaux de satiété ou d'appétit venant de la périphérie.

Procédures

Injections intrapéritonéales (6 max par souris; durée

Impact sur les animaux

Les nuisances en lien avec les chirurgies sont 1) pendant les chirurgies, une hypothermie et des problèmes cardiorespiratoires, ainsi que du stress et un déssèchement des yeux 2) en post-chirurgie, des douleurs post-opératoires minorées par des antalgiques ainsi que du stress. Le régime riche en graisse va entrainer une prise du poids au fur et à mesure des semaines, les souris vont devenir un peu moins actives et développer des problèmes de dents à cause de croquettes plus souples que les croquettes standards. Lors des tests métaboliques, les animaux n’auront plus accès à la nourriture pendant plusieurs heures, ils pourront subir une gêne due à la sensation de faim. Le gavage peut entrainer du stress dû à la contention et à la sonde de gavage. La coupure de la pointe de la queue lors de ces mêmes tests entraine une douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure pour prélèvements sanguins. Concernant l’isolement pour la mesure de paramètres métaboliques: l'isolement pendant une semaine chez la souris peut créer du stress. La mesure de composition corporelle nécessite une anesthésie qui peut également engendrer un stress chez la souris, la dose de rayons X nécessaire est faible et non-chronique et n’entraine donc pas de nuisance.

Devenir

Chaque souris sera mise à mort à la fin de chaque procédure, dans le respect des 3R. Une moitié sera dédié à l’étude moléculaire de différents tissus (hypothalamus, tronc cérébral, foie, pancréas, tissu adipeux). La seconde moitié sera dédié à l’étude histologique des mêmes tissus.

Remplacement

Pour réaliser les tests de métabolisme systémique et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables. De plus, pour réaliser les tests de comportements, il n'existe pas d'alternatives à l'utilisation d'animaux décrit actuellement dans la littérature. Des premiers tests ont été effectués in vitro, pour sélectionner les molécules candidates les plus prometteuses comme antagoniste des récepteurs parathyroïdiens, ainsi que les concentrations de toutes les molécules qui seront utilisés pour transposer in vivo. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés (t test si 2 conditions / ANOVA si plus de 2 conditions).

Réduction

Le nombre de souris est réduit à son minimum. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et protéomiques. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Le nombre de souris a été déterminé en accord avec les données de la littérature et d’après notre propre expérience des différents modèles présentés. De plus, afin de réduire le nombre d'animaux, des premiers tests ont été effectués in vitro.

Raffinement

Nous appliquerons strictement les points limites définis dans le projet et la douleur sera limitée à son maximum. Les souris seront sous surveillance journalière de la part de l’équipe professionnelle de zootechnie et une grille de score adaptée à la procédure sera mise en place. Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi, en dehors des phases d’isolement. L’enrichissement se limite à la litière lors des phases d’isolement, pour éviter l’interaction avec les lasers qui détectent l’activité locomotrice des souris. Pour limiter les nuisances/effets indésirables des injection intrapéritonéales, nous utiliserons une aiguille fine. Pour le gavage, nous utiliserons une sonde souple pour limiter les nuisances. De plus, une anesthésie profonde sera réalisée à chaque acte chirurgicale pour limiter la douleur et un analgésique sera également utilisé en pré- et post-opératoire.

Choix des espèces

La souris est un des modèles les plus appropriés pour l'étude de l'obésité. Les souris sont faciles à manipuler. Dans cette étude, certaines souris entreront en suivi (régime spécifique ou standard) à l’âge de 11 semaines. En effet, à 11 semaines les souris, en plus d'avoir passé la maturité sexuelle seront plus robuste et auront atteint un poids qui va leur permettre de subir la prise de poids inévitable due au régime sans que cela n’impacte trop leur organisme.

Une perte de poids dépassant 15 %, une posture ou des expressions faciales associées à la souffrance déclenchent la mise à mort de l'animal. 100 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une injection sous-cutanée de cellules de mélanome, puis une injection intratumorale de microbulles et d'interleukine-12 suivie d'une exposition aux ultrasons, six échographies et un prélèvement de sang. Le porteur décrit une possible ulcération et nécrose de la tumeur, et fixe comme objectif de comparer quatre modes de focalisation du faisceau pour déterminer quel volume tumoral il faut traiter.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de concevoir une approche thérapeutique reposant sur la délivrance locale d’une molécule immunostimulatrice dans le tissu tumoral par sonoporation. La sonoporation, associant les ultrasons (US) et les microbulles (MB), permet une délivrance localisée des molécules thérapeutiques avec une efficacité élevée et un faible taux de toxicité. Grâce à cette biodisponibilité augmentée, l’efficacité thérapeutique de cette molécule se trouverait amplifiée. Dans le cadre de notre précédente étude, nous avons développé et évalué un protocole thérapeutique dans un modèle murin de mélanome par imagerie in-vivo. Dans le cadre de ce projet, deux objectifs restent à atteindre : Objectif 1 – Évaluer la réponse immunitaire par dosage de cette molécule immunostimulatrice dans le sang et la tumeur et par l’étude de l’infiltration des cellules immunitaires, 48 heures après traitement. Objectif 2 – Évaluer 4 modes de focalisation du faisceau ultrasonore afin de déterminer le volume tumoral nécessaire à traiter pour obtenir l’éradication de la tumeur. La croissance tumorale sera évaluée longitudinalement sur notre modèle murin de mélanome par imagerie in-vivo.

Bénéfices attendus

L’immunothérapie et en particulier la vaccination à base de cellules immunitaires, a émergé comme une stratégie thérapeutique prometteuse. Cependant, ces vaccins sont générés ex-vivo et réalisés sur mesure pour chaque patient. Ce processus est complexe et coûteux, empêchant la généralisation de cette immunothérapie. La délivrance in-vivo de molécules immunostimulatrices par sonoporation pourrait ainsi permettre de contourner les procédures laborieuses et coûteuses rencontrées dans le développement de ces vaccins et de généraliser à toutes ces immunothérapies anti-cancéreuses.

Procédures

Sous anesthésie gazeuse : - Injection sous-cutanée des cellules – tous les animaux – 1 fois/animal – 5 min - Injection seule ou coinjection intratumorale du pIL-12 et microbulles et exposition aux ultrasonores – tous les animaux – 1 fois/animal – 12 min - Echographie des tumeurs - 6 fois/animal – 10 min - Prélèvement de sang - 1 fois/animal – 5 min

Impact sur les animaux

Nuisance 1 - Contention des animaux est une source de stress. Nuisance 2 - Le point d’injection des cellules tumorales, des microbulles ou de la molécule immunostimulatrice sont susceptibles d’être douloureux. Nuisance 3 - Les souris peuvent développer des signes cliniques traduisant des effets indésirables liées à la croissance tumorale : 1) Détérioration générale de l'état sanitaire, altération sévère des comportements physiologiques (prostration, refus de se nourrir et de boire, locomotion réduite, poils ébouriffés, dos vouté et yeux enfoncés) ; 2) Cachexie associée à une perte de poids de 15% du poids total de l'animal ; 3) Symptomatologie évocatrice: Saignements, urines ictériques, dyspnées ou sibilances... ; 4) Ulcération et nécrose de la tumeur.

Devenir

Dans le cadre de l’objectif 1, les animaux seront sacrifiés deux jours post-traitement pour prélever du sang et les tumeurs afin de doser l’interleukine-12 sérique et intratumorale, et de mesurer l’infiltration des cellules tumorales. Dans le cadre de l’objectif 2, les animaux seront sacrifiés au 15ème jour post-inoculation avant que les points limites soient atteints.

Remplacement

Dans une première approche expérimentale, nous avons mis en place et validé un protocole de délivrance d’une molécule immunostimulatrice par sonoporation en exploitant des suspensions des cellules de mélanome et des sphéroïdes de mélanome. Cette approche a permis de réduire le nombre de paramètres de ce protocole. Dans la continuité de ce projet, nous souhaitons délivrer cette molécule dans un modèle murin de mélanome afin d’étudier in-vivo la réponse immunitaire induite par ce protocole et les effets de modes de focalisation des faisceaux ultrasonores sur l’efficacité thérapeutique. Le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d'étude in-vitro ou in-silico car à ce jour aucun modèle d’étude in-vitro ou in-silico ne peut reproduire la complexité d’un système immunitaire in-vivo et la réponse immunitaire anti-cancéreuse.

Réduction

Notre précédente étude in-vivo a permis de réviser le nombre de souris par groupe, passant de 15 à 10 souris/groupe. Par conséquent, notre étude nécessite 100 souris. Nous réaliserons une étude statistique pour évaluer la réponse immunitaire de notre protocole et pour déterminer l’efficacité de différents modes de focalisation du faisceau ultrasonore sur l’efficacité thérapeutique de cette immunothérapie dans un modèle murin de mélanome. Par rapport au groupe contrôle, il sera considéré comme significatif : 1) Augmentation de 20% de la molécule thérapeutique dans le sang et la tumeur ; 2) Augmentation de 20% de l’infiltration tumorale des cellules immunitaires ; 3) Diminution de 20% du volume des tumeurs ; 4) Diminution de 15% du poids des animaux.

Raffinement

Le stress des animaux est minimisé par l’implication d’un personnel qualifié pour l’expérimentation animale. Après une phase d’acclimatation, ils seront habitués à être sorties de leur cage. Ils seront hébergés en groupe (5/cage) avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les animaux seront observés une fois par jour. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soins seront mises en œuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par les procédures. Pendant le protocole, si nous constatons des bagarres dans les cages, nous procéderons à une séparation des individus tout en maintenant un contact visuel, auditif et olfactif. En cas de blessures, nous laverons ces dernières et nous les traiteront avec une solution antiseptique jusqu’à la cicatrisation complète. Pendant le projet, les expressions faciales, la posture de l’animal, la réactivité de l’animal à des stimuli externes (bruit…) seront monitorés chaque jour. Une perte de poids de plus de 15%, une réactivité anormale à des stimuli externes (bruits), une posture et des expressions associées à une souffrance de l’animal impliqueront sa mise à mort. Les souris seront placées dans une boîte d'induction d’anesthésie gazeuse. Dès que les souris auront des signes d'endormissement, elles seront sorties de la boîte d'induction et placées sur une paillasse avec couverture chauffante. Les souris seront maintenues sous anesthésie gazeuse. Une protection oculaire sera appliquée. La respiration (capteur électronique), la température (sonde endorectale) et le poids (balance) seront mesurés pendant la procédure. Dès son réveil, l’animal sera remis dans sa cage d’hébergement. Les animaux seront mis à mort par injection intrapéritonéale d’un agent euthanasiant vétérinaire.

Choix des espèces

Dans la littérature et pour la lignée cellulaire de mélanome murin B16F10 choisie pour notre étude, l’implantation se fait généralement dans des souris adultes âgées de 5 semaines, physiologiquement matures.

Tester pour le compte d'un laboratoire pharmaceutique client l'efficacité d'un composé anti-obésité : 40 souris mâles rendues obèses par un régime gras vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reste isolée en cage individuelle pendant 49 jours à 30 degrés, reçoit 35 administrations orales, subit 9 prélèvements sanguins, 13 pesées et des jeûnes de 4 à 8 heures. Le porteur reconnaît que l'isolement constitue une nuisance pour une espèce sociale, et que les traitements par voie orale comme les prises de sang sont "source de douleurs aiguës et de stress". Il indique que le composé a déjà été étudié sur des modèles sans animaux, et présente l'étape sur l'animal entier comme une exigence réglementaire "incontournable" avant une première étude chez l'humain.

Objectifs

Le présent projet sera mené pour le compte d'un laboratoire pharmaceutique client qui développe des thérapies de première classe pour traiter les causes sous-jacentes du dysfonctionnement organique chez les patients atteints de troubles métaboliques graves, notamment l'obésité et le diabète, en ciblant les voies fondamentales du métabolisme énergétique. Parmi ses thérapies en développement, notre client a développé le composé X qui a été développé afin d'augmenter les dépenses énergétiques et d'améliorer la santé métabolique et cardiovasculaire des patients souffrant d'obésité et de troubles métaboliques associés. L'étude faisant l'objet de la présente demande visera à tester l'efficacité du composé X chez un modèle de souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse. Compte tenu du mécanisme d'action du composé X qui conduit à une activation des dépenses énergétiques, les souris seront hébergées en thermoneutralité. La thermoneutralité correspond, pour la souris, à une température de 30 degrés à laquelle l'animal n'a pas besoin de dépenser d'énergie pour lutter contre le chaud ou contre le froid. Il s'agit d'une des conditions les plus favorable à l'observation d'un effet du composé X.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (13 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de véhicule ou du candidat médicament par voie orale (35 administration; durée : 1 minute); 3) Analyse non invasive de composition corporelle (5 mesures; durée : 2 minutes); 4) Prélèvements sanguins (9 prélèvements; durée du prélèvement : 1 à 5 minutes selon le mode de prélèvement); 5) Administration d'une charge orale de glucose (1 administration, durée : 1 min); 6) Anesthésie préalablement à l'euthanasie (1 anesthésie, Durée,15 min); 6) Un hébergement individuel en cage standard (49 jours pour tous les animaux).

Impact sur les animaux

De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle, qui est nécessaire du fait du besoin de mesurer la prise alimentaire individuelle des animaux, constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements par voie orale, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs aiguës et de stress. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins et celle de 8h préalable au test oral de glucose, bien que réalisés en phase diurne, pourront induire une sensation de faim. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultérieures (imagerie, histologie, dosage de protéines impliquées dans les dépenses énergétiques...)

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode alternative n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire, les dépenses énergétiques et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées sur des modèles n'utilisant pas l'animal dans les premières phases de son développement, l'étude sur l'animal entier reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de première étude sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Le groupe témoins non obèse a été réduit à 8 animaux, contre 10 pour les groupes expérimentaux constitués de souris obèses, compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité des paramètres étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genre.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par gavage seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 17 semaines (24 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une pèriode de 14 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur.

1 980 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à vingt-deux injections dans l'abdomen, douze prélèvements de sang à la queue et douze semaines de régime enrichi en graisses. S'y ajoutent une biopsie de la queue, deux jeûnes de six et seize heures, un gavage, une injection dans le sinus rétro-orbitaire et une perfusion intracardiaque sous opioïde, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont mises à mort à l'issue pour prélever les organes. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, mettre en lumière le rôle du système nerveux dans la fonction du pancréas.

Objectifs

Le pancréas est central dans la régulation de la glycémie. Il produit les hormones permettant de réguler la glycémie. Comme tous les tissus, le pancréas est relié au cerveau par le système nerveux périphérique. Cependant, son rôle dans la fonction du pancréas n’est pas bien connu. Dans ce projet nous proposons d’étudier la contribution du réseau nerveux dupancréas, et notamment dans la sécrétion des hormones régulant la glycémie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en lumière le rôle du système nerveux dans la fonction du pancréas.

Procédures

1 biopsie de queue (10s), 1 régime riche en gras (12 semaines), 9 à 22 injections intra-peritonéales (20s), 1 injection sous-cutanée (10s), 2 jeun (6h et 16h), 12 prélèvement de sang à la queue (3s), 1 injection intra-veineuse (5s), 1 chirurgie sans réveil (10min), 1 gavage (1min).

Impact sur les animaux

-Injections intrapéritonéale : douleur légère due à la piqure. -Injection intra veineuse rétro-orbitale : gêne, douleur légère au point d'injection. Les animaux sont sous anesthésie gazeuse au moment de l'injection. -Injection sous- cutanée : douleur légère due à la piqure. -Obésité : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. Perfusion intra-cardiaque : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Mise à jeun : gêne due à la sensation de faim. - Micro-coupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. -Biopsie de queue : douleur modérée.-Gavage : contention soutenue et introduction de la sonde.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure pour permettre le prélèvement des organes d'intérêt.

Remplacement

Cette étude a pour but d'étudier le rôle du système nerveux du pancréas en condition normale et de stress glycémique, tels que l'obésité et la mise à jeun. Le pancréas répond à la prise et la perte de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés. Une étude pilote avec des petits nombres d’animaux a été inclue pour mettre en place des protocoles adaptés et réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Dans les cages les souris bénéficient de coton et de « maisons » afin d’augmenter la diversité de leurs activités et qu’elles puissent se construire un nid. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères. Lorsque nécessaire, la douleur et la gêne des souris sont réduites à un niveau modéré par l’administration d’opioïdes et par l’anesthésie. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles chez la souris. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours (souriceaux) et 22 semaines (adultes).

Dépourvues de thymus, donc incapables de rejeter les cellules cancéreuses humaines qu'on leur greffe, 1 050 souris athymiques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules tumorales mammaires sous anesthésie, puis jusqu'à quatre injections d'anticorps armés dans l'abdomen, réparties sur un mois. La tumeur, dont le volume est plafonné à 1 cm3, peut provoquer des douleurs et réduire leur liberté de mouvement, et toute médication est écartée pour ne pas brouiller la mesure de l'effet du traitement. Ne pouvant être réutilisées, elles sont tuées après deux mois d'observation, le porteur renvoyant à long terme le bénéfice espéré pour les personnes atteintes d'un cancer du sein.

Objectifs

Un conjugué anticorps-médicament ou anticorps armé (antibody-drug conjugate ou ADC) est une chimiothérapie vectorisée, permettant la délivrance sélective d'un agent cytotoxique, ce qui limite la toxicité systémique habituelle. Un anticorps armé résulte du greffage d'un agent cytotoxique puissant (drug) sur un anticorps thérapeutique (vecteur). Les anticorps armés, approuvés actuellement et commercialisés, sont construits à partir d’anticorps entiers. Afin d’améliorer l’efficacité et de réduire la toxicité, les fragments dérivés d’anticorps représentent aujourd’hui une véritable alternative comme vecteur. Le savoir-faire acquis aujourd’hui permet de développer une multitude d’anticorps armés innovants avec des caractéristiques in vitro, propres à chacun, sans pour autant être aujourd’hui capable de prédire leur efficacité in vivo, ainsi que leur niveau toxicité. Les objectifs du projet sont donc d’améliorer nos connaissances sur les caractéristiques d’intérêt des anticorps armés innovants développés, d’identifier le(s) candidat(s) démontrant la meilleure efficacité (régression tumorale) et de maitriser leur posologie afin de limiter les quantités à injecter.

Bénéfices attendus

Les résultats in vivo apporteront un vrai rationnel entre les qualités/quantités des anticorps armés injectés et la régression tumorale mesurée. Une connaissance plus approfondie de la posologie sera très intéressante afin d’avoir le meilleur rationnel dose/régression tumorale, ce qui contribuera, de plus, à réduire la toxicité dû à un traitement par les anticorps armés. Ceci permettra possiblement d’identifier des caractérisations in vitro, prédictifs des résultats in vivo, ce qui permettrait de réduire, par la suite, encore le nombre d’animaux à utiliser. Le bénéfice attendu finalement est l’obtention de candidats médicaments (santé humaine) encore plus efficaces et moins toxiques que les anticorps armés commerciaux, traitements utilisés couramment chez les personnes touchées notamment par le cancer du sein. L’échéance est à long terme, car après l’identification d’un candidat médicament (phase pré-clinique), le temps de développement d’un médicaments prend de nombreuses années (phases cliniques, …).

Procédures

Les animaux sont soumis, lors de la tumorisation, a 1 anesthésie générale (quelques minutes) et 1 injection par voie sous-cutané (quelques secondes). Lors du traitement avec les anticorps armés, les animaux sont soumis au maximum à 4 injections par voie intrapéritonéale (quelques secondes), réparties sur 1 mois et avec plusieurs jours entre chaque injection.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont liées au stress lors de la contention des animaux, voire à une légère douleur au niveau des sites d’injection (injection sous-cutanée de cellules tumorales ; injection intrapéritonéale des anticorps armés). Le développement de tumeurs mammaires peut engendrer des douleurs, une réduction de la liberté de mouvement (néanmoins, le volume tumorale ne dépassera pas 1 cm3).

Devenir

Les animaux ayant subis une tumorisation et un traitement à base d’anticorps armés ne peuvent pas être réutilisés et seront donc euthanasiées après deux mois d’observation après injection des traitements, à condition du respect des points limites. L'observation permet de suivre l’évolution de la taille de la tumeur, et en cas de régression totale, voire si la tumeur se redéveloppe.

Remplacement

Après avoir validé et sélectionné in vitro les anticorps armés, des études d’efficacité in vivo vis-à-vis de tumeurs de cancer du sein est absolument nécessaire. Il n'y a donc pas d'alternatives.

Réduction

La détermination du nombre de groupes et les doses testées sont basées sur les résultats des tests de cytotoxicité in vitro et in vivo préalablement réalisés au laboratoire réduisant ainsi le nombre de souris utilisées. D’après de précédentes données obtenues au laboratoire, utilisant des traitements similaires, le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques, soit 8 souris par lot (soit 10 souris implantées).

Raffinement

Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes sur des portoirs ventilés et dans un environnement enrichi (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger). Le modèle de développement tumoral a été choisi est pour être le moins lourd en termes de procédures pour l’animal. Un enrichissement positif sera mis en place en introduisant un enrichissement permanent de type igloo dès la semaine d’adaptation des animaux. Ainsi que d’un enrichissement ponctuel, à leur entrée dans la structure puis après chaque procédure, de type carré en kraft pendant 48h pouvant être dépouillé et permettant la confection d’un nid. Il n’y a pas de récompenses alimentaires. Les animaux seront surveillés une à deux fois par semaine après l'injection des cellules tumorales. La masse de l'animal sera relevée à chaque passage de l'expérimentateur et une estimation du volume tumoral sera réalisée en mesurant leurs dimensions à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la procédure. Cette procédure est modérée et n’a à ce jour jamais été à l’origine de symptômes nécessitant une prise en charge. Cependant, l’apparition de signes cliniques modérés engendrera une surveillance quotidienne de l’animal et conduira à la mort de l’animal si les signes persistent plusieurs jours. L’apparition de signes cliniques sévères conduira à la mise à mort de l’animal. Toute médication est proscrite, car il est très important d’évaluer uniquement les effets des traitements administrés sur la tumeur.

Choix des espèces

Les immunoconjugués anticancéreux préparés sont un matériel précieux et coûteux car nécessite plusieurs étapes de synthèse. Les volumes injectés doivent être les plus faibles possibles. D’où la nécessité de travailler chez le petit animal comme la souris. Afin de générer des modèles de cancers mammaires (xénogreffes), nous injecterons des cellules cancéreuses humaines. Afin que les cellules puissent se développer, il faut travailler avec des animaux immunodéprimés comme des souris athymiques. Les souris BALB/c-nu seront commandées à l’âge de 10 semaines pour un poids de 20g environ pour optimiser la prise de greffe. Elles seront hébergées en portoirs ventilés et manipulées sous poste de sécurité microbiologique. Il y aura ensuite un délai de 30 à 45 jours pour la prise tumorale avant l’administration des traitements.