Souris
Mise en place d’un modèle d’infection urinaire murin et validation de nouveaux traitements.
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Une partie des 680 souris de ce projet vient des portées surnuméraires du laboratoire, animaux que le porteur décrit comme voués à être tués sans avoir été utilisés. Toutes relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont tuées à l'issue, pour dénombrer les bactéries logées dans leur vessie et leurs reins. Sous anesthésie gazeuse, un cathéter pédiatrique introduit des Escherichia coli dans leur urètre, puis un traitement ou un placebo est injecté par la même voie 24 heures plus tard, en une fois ou pendant trois jours, l'infection pouvant durer deux semaines. Le porteur affirme que ses traitements tuent 100 % des bactéries visées in vitro, et qu'il lui faut malgré tout les valider sur "animal entier".
Objectifs
Les infections urinaires sont un motif très fréquent de consultation et de prescription d’antibiotiques en médecine générale. On estime en France leur incidence à 625 000 cas/an. Environ 50% des femmes adultes font un épisode d’infection urinaire au moins une fois dans leur vie et 20% des femmes ayant une infection urinaire auront un nouvel épisode. En mai 2023, Santé publique France publiait les chiffres des infections liées aux soins (infections nosocomiales), et montrait que les infections urinaires arrivaient en tête (28% des cas). En termes de germes impliqués, la bactérie Escherichia coli, est la cause principale des infections urinaires. Selon les données de l’assurance maladie, en ville, E. coli est la cause de 90% des infections urinaires. En ce qui concerne les infections urinaires nosocomiales, E. coli arrive également en tête des germes responsables. Les infections urinaires se traitent par des antibiotiques, notamment des fluoroquinolones. Cependant, les traitements peuvent être mis en échec par des souches résistantes aux antibiotiques. La Haute Autorité de Santé dans un rapport de 2021 montre qu’en ville près de 13% des souches de E. coli sont résistantes aux fluoroquinolones et ce chiffre monte à 19% en Ehpad. Le but de cette demande d’autorisation d’expérimentation animale est de mettre en place un modèle d’infection urinaire et de tester de nouveaux traitements de décolonisation bactérienne ciblant notamment les souches résistantes aux antibiotiques.
Bénéfices attendus
Le but du projet est de valider notre approche thérapeutique dans le cadre des infections urinaires. Nous espérons montrer une forte décolonisation de l'arbre urinaire suite au traitement. Nous testerons notre traitement sur 4 souches cliniques résistantes aux antibiotiques. Nous espérons pouvoir apporter la preuve de concept que nos traitements sont efficaces et ainsi proposer une solution là où les antibiotiques sont inefficaces.
Procédures
(i) Anesthésie gazeuse des animaux + injection des bactéries dans l'uretère à l'aide d'un cathéter pédiatrique. Cette procédure prendra moins de 10 minutes par animal. (ii) 24h après infection, les animaux recevront le traitement ou le placebo. Pour cela, ils seront de nouveau anesthésiés (anesthésie gazeuse) de manière à injecter le traitement dans l’urètre. Cela prendra au maximum 10 minutes. L'administration du traitement sera unique ou répétés pendant 3 jours au total.
Impact sur les animaux
Nous allons induire une infection urinaire par l’administration dans l’urètre de bactéries. L'infection urinaire causera une nuisance légère à l'animal. Cependant, les animaux infectés vont mettre en place une réponse immunitaire visant à contrôler la prolifération bactérienne. La littérature scientifique ne reporte aucun cas de souffrance animale nécessitant le sacrifice ou l'administration de médicaments lors d'infections urinaires. La durée de l'infection urinaire sera au maximum de 2 semaines.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort. En effet, nous voulons quantifier les bactéries présentes dans la vessie et dans les reins et pour cela, la mise à mort de l'animal est indispensable. Des analyses histologiques seront aussi effectuées pour notamment objectiver le maintien de l'intégrité des tissus grâce à notre traitement.
Remplacement
Le but du projet est de valider de nouveaux traitements dans l'éradication des bactéries responsables d'infections urinaires. Même si des études préalables montrent une très forte capacité à tuer les bactéries ciblées in vitro, il nous faut les valider sur animal entier.
Réduction
Nous avons mené de nombreux travaux in vitro de manière à sélectionner les meilleurs traitements possibles contre des souches d’Escherichia coli responsables d’infections urinaires (leur efficacité est de 100% de bactéries tuées). Nous prévoyons 2 types de traitements (1 dose unique ou 1 dose pendant 3 jours). Nous commencerons par la répétition des administrations car c’est ce traitement qui a le plus de chances de fonctionner. Si nous ne constatons aucun effet du traitement, nous arrêterons les manipulations. Une approche statistique sera effectuée de manière à déterminer si le traitement est réellement efficace. Dans le cadre de la règle des 3R, un maximum de prélèvements sera réalisé sur les animaux (vessie, reins + urine) pour effectuer : par exemple le dosage des protéines impliquées dans l’inflammation, de la microscopie, des dénombrements bactériens... Nous prévoyons d'acheter des souris mais également d'utiliser des animaux surnuméraires issus des reproductions du laboratoire. L'utilisation de ces derniers permettra de limiter le nombre d'animaux achetés et d'utiliser à des fins de recherches des animaux qui auraient été mis à mort sans avoir été utilisés.
Raffinement
Les animaux auront libre accès à la boisson et à la nourriture. Le milieu sera enrichi à l’aide de maisons en plastique. Un suivi quotidien des animaux par des expérimentateurs habitués sera effectué de manière à repérer toute détresse animale. De plus, nous utilisons un système de score dont les paramètres sont : l'apparence, le comportement naturel, l'hydratation, les signes cliniques, et le comportement provoqué.
Choix des espèces
Les souris se sont rapidement imposées comme étant un bon modèle d’infection urinaire dès le début des années 1980. Elles sont considérées comme étant notamment un meilleur modèle que les rats pour plusieurs raisons. Nous pouvons par exemple citer l’absence de reflux vésico-urétéral (la remontée d'urine vésicale vers les uretères et les reins), ce qui est le cas chez l’Homme; ou la présence dans l’arbre urinaire de la souris d’uroplakines (des structures transmembranaires présentent également chez l’Homme) servant de récepteurs aux bactéries E. coli responsables d’infections urinaires. Les animaux seront âgés de 8 à 10 semaines au moment de l'infection. C'est un stade de développement classiquement utilisé dans la littérature.
Etude du rôle des plaquettes dans l’insuffisance cardiaque (2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une souris sur cinq est censée mourir sur la table d'opération, la chirurgie qui rétrécit l'artère en sortie du cœur ayant une mortalité attendue de 20 %, à laquelle s'ajoutent 5 % de pertes pendant le développement de la maladie. 1 260 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'opération dure une demi-heure, la douleur postopératoire est annoncée pour les 24 heures qui suivent, et l'évolution de l'insuffisance cardiaque est ensuite suivie chaque semaine par échographie sous anesthésie. Il n'existe aucun traitement curatif de cette maladie, et le porteur écrit que ses résultats "pourraient par conséquent s'avérer être bénéfiques à la santé humaine".
Objectifs
Cette demande d'autorisation concerne deux laboratoires (EU1 et EU2). L'insuffisance cardiaque est une pathologie évolutive au cours de laquelle le cœur perd progressivement sa capacité à pomper correctement le sang, avec un essoufflement qui apparaît chez les sujets atteints d'abord à l'effort puis au repos. Cette maladie s’installe progressivement le plus souvent suite à la survenue d'un infarctus du myocarde, ou bien en raison de l'hypertension artérielle ou d'un rétrécissement aortique. Elle est due à un changement de morphologie du cœur qui doit s'adapter à de nouvelles contraintes, et qui finit par s'épuiser. Notre étude porte sur l'étude du rôle des plaquettes sanguines dans l'évoluton de cette maladie. Pour ce faire, nous allons utiliser un modèle d'insuffisance cardiaque qui est bien décrit chez la souris, et qui permet d'induire la maladie en quelques semaines. Nous appliquerons dans une 1ère partie ce modèle à des souris modifiées génétiquement chez lesquelles différents déterminants de surface des plaquettes ont été modifiés. En comparant ces souris à des souris non modifiées génétiquement, nous pourrons déterminer si un ou plusieurs de ces déterminants est important dans l'évolution de la maladie du cœur. Dans une 2ème partie, en fonction des données obtenues dans la 1ère, nous testerons différents traitements pharmacologiques susceptibles de freiner le développement de la maladie chez les souris. L'objectif de ce projet est de trouver de nouvelles approches thérapeutiques qui permettrait de traiter l'insuffisance cardiaque.
Bénéfices attendus
Il n'existe actuellement pas de traitement curatif contre l'insuffisance cardiaque. Nous souhaitons par ce projet mieux comprendre l'évolution de cette maladie afin de trouver une nouvelle cible thérapeutique qui permettrait de la combattre. Si un ou plusieurs des déterminants de surface plaquettaire s'avère(nt) être une (des) cible(s) potentielle(s) (Partie 1), nous testerons alors des traitements pharmacologiques dont nous disposons et qui sont capables de les bloquer (Partie 2). Nos résultats pourraient par conséquent s'avérer être bénéfiques à la santé humaine.
Procédures
Tous les gestes techniques sont réalisés sur des animaux analgésiés et anesthésiés à l'aide d'une anesthésie gazeuse. La veille de l'intervention chirurgicale, un prélèvement sanguin (1 min) est prévu ainsi qu'une session d'épilation de la zone opérée. Un prélèvement sanguin final est prévu également au moment de l'euthanasie des animaux. La chirurgie dure environ 30 minutes. Elle consiste en l'exposition de l'artère en sortie du cœur et en son rétrécissement (20 min). L'animal est ensuite recousu (10 min). L'évolution de la pathologie cardiaque est suivie chaque semaine par imagerie en échographie sur les animaux anesthésiés (5 min). Les interventions ont lieu au sein du premier laboratoire (EU1), à l'exception du suivi échographique qui est quant à lui effectué dans les locaux du deuxième (EU2).
Impact sur les animaux
Une certaine mortalité est attendue lors de la chirurgie induisant l'insuffisance cardiaque, estimée de l'ordre de 20%, puis au cours du développement de la maladie (5%). Les autres effets indésirables prévus sur les animaux sont : - une douleur post- opératoire à J0 et pendant 24h - une perte de poids post-opératoire (modérée) - un stress occasionné par les séances d'imagerie
Devenir
Les animaux arrivant à la fin de la procédure sont euthaniasiés afin de pouvoir analyser leur cœur. Nous étudions également leur sang pour analyser des marqueurs de la maladie cardiaque qui peuvent s'y trouver en circulation.
Remplacement
La maladie que nous étudions est complexe et fait intervenir un grand nombre de paramètres différents (inflammation, modification de la paroi cardiaque, dialogue avec d'autres organes comme les poumons et les reins). Il n'est aujourd'hui pas possible de mimer ces phénomènes autrement qu'en utilisant des animaux vivants dont la physiologie est proche de celle de l'être humain.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grâce aux données disponibles dans la littérature du domaine et à notre expérience des modèles animaux. Des tests statistiques permettant de connaître le nombre de souris minimal nécessaire ont aussi été réalisés.
Raffinement
Une grille de score a été mise en place, nous permettant d'agir en cas de souffrance des animaux. Les animaux qui dépassent les points limites que nous avons définis sont euthanasiés. La douleur post-opératoire ou potentiellement occasionnée par les prélèvements sanguins est évaluée et traitée préventivement par l'administration d'un anti- douleur. De la nourriture humide est placée au sol dans leur cage afin de faciliter la prise de nourriture et l'hydratation après la chirurgie. Chaque jour, les animaux sont pesés et leur apparence générale est contrôlée. Du coton est placé dans leur cage pour leur permettre de faire des nids. Le transport des souris entre les deux établissements dure 5 minutes à pied et se fait dans leur cage qui est placée dans un sac de transport.
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont le système cardiovasculaire a un fonctionnement et une organisation très proches de ceux de l'être humain. Ce système est mature lorsque la souris est adulte (à environ 8-10 semaines), raison pour laquelle nous utiliserons des animaux de cet âge, la maladie touchant des êtres humains d'âge adulte. Le patrimoine génétique de la souris est par ailleurs connu depuis de nombreuses années et nous avons à notre disposition des souris modifiées génétiquement qui ne produisent pas un certain nombre de molécules d'intérêt, ce qui permet d'étudier leur rôle (partie 1 du projet), comparativement aux souris qui la produisent normalement. D'autre part, des souris qui ne sont pas modifiées génétiquement seront utilisées dans le cadre du test de nouvelles approches thérapeutiques (partie 2 du projet).
Etude de l’hématopoïèse normale et leucémique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Automutilation, stéréotypie sévère, prostration, perte de plus de 20 % du poids, diarrhée sanglante : la grille de points limites énumère ce qui déclenche la mise à mort des 1 316 souris de ce projet, dont 1 012 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes. Elles subissent des ponctions de moelle osseuse sous anesthésie, jusqu'à une par mois pendant toute leur vie, ainsi qu'une irradiation suivie quelques heures plus tard d'une greffe de moelle, les animaux d'élevage recevant en plus une coupe de queue pour génotypage. Le suivi va de un à trente mois d'âge pour comprendre le rôle d'une enzyme dans les leucémies aiguës, le porteur renvoyant à la littérature pour justifier l'effectif sans donner de calcul.
Objectifs
Notre moelle osseuse produit toutes les cellules du sang (globules blancs, globules rouges et plaquettes) à partir de cellules immatures nommées cellules souches hématopoïétiques (CSH). Notre gène d'intérêt code pour une enzyme essentielle dans la régulation de la stabilité d’un large panel de substrats, l’impliquant ainsi dans un grand nombre de processus physiologiques, de manière directe ou indirecte. Comme dans d’autres cancers, les Leucémies sont la conséquence de dérégulation de l’expression de protéines clés contribuant à la transformation leucémique des cellules sanguines. Des études de la littérature complétées de nos travaux les plus récents ont permis de décrire une expression altérée de la protéine d'interêt chez les patients atteints de Leucémies Aiguës. Notre équipe a ainsi développé des modèles animaux permettant de reconstituer et ainsi d’étudier l’histoire naturelle de la maladie. Précisément, l’objectif de notre projet de recherche est donc de comprendre le rôle de la protéine d'interêt dans le développement normal des cellules sanguines et d’identifier son implication lors de la transformation leucémique. Cette étape majeure nous permettra ensuite de développer de nouveaux médicaments candidats pour le traitement des Leucémies Aiguës. Dans l’ensemble, ce projet devrait permettre de mieux comprendre ainsi que de cibler les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent le développement des Leucémies Aiguës.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de la protéine d'intérêt dans l'hématopoïèse normale et ainsi vérifer si elle pourrait être une bonne cible thérapeutique dans les Leucémies Aiguës.
Procédures
Le prélèvement de moelle osseuse et/ou de sang ainsi que les transplantations de moelle osseuse dans des souris receveuses irradiées au préalable se feront sous anesthésie (animal surveillé jusqu'au réveil). Les prélèvements de moelle osseuse, effectués sous anesthésie générale et locale, durent moins de deux minutes et sont réalisés au maximum une fois par mois au cours de la vie de la souris et sont des procédures de degré de sévérité modérée. Les expériences de transplantation nécessitent une irradiation des souris. Cette procédure de degré de sévérité modérée, réalisée une seule fois au cours de la vie de la souris, dure moins de 2 minutes. Les souris sont transplantées avec de la moelle quelques heures après l'irradiation pour garantir leur survie. Elles sont surveillées attentivement dans les heures qui suivent l'irradiation, et du gel hydratant est ajouté dans la cage durant la première semaine. Les animaux de l'élevage (USP7+/+ et USP7+/-) nécessaires à la préparation des lots expérimentaux, subiront la biopsie de queue pour déterminer leur génotype.
Impact sur les animaux
L'invalidation totale de la protéine d'intérêt est létale donc nous n'utiliserons que les animaux possédant une expression de moitié de la protéine d'intérêt (viables et ayant un développement normal) ainsi que leurs homologues sauvages. Ces souris ne présentent aucun phénotype dommageable. Les animaux de l'élevage (USP7+/+ et USP7+/-) qui ont été nécessaires à la préparation des lots expérimentaux de notre DAP subissent la biopsie de queue pour déterminer leur génotype. Dans ces conditions, le prélèvement pourrait être de douleur légère de courte durée pour les animaux concernées.
Devenir
A l’âge voulu, les souris seront euthanasiées pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Nous avons validé au laboratoire, in vitro, que la protéine d'intérêt impacte la prolifération des cellules leucémiques et contribue à la résistance aux traitements. Afin de déterminer l'impact de cette enzyme sur un organisme entier, nous allons utiliser des souris où le gène de cette enzyme est muté. Nous allons également utiliser les cellules de ces souris pour réaliser les tests de différenciation ex vivo. Les modèles murins sont utilisés majoritairement par la communautéscientifique internationale pour étudier les cellules souches hématopoïétiques dans des pathologies hématologiques.
Réduction
Les études sur l'animal sont réalisées après une étude bibliographique détaillée et sur la base d'expériences réalisées in vitro avec des lignées leucémiques afin d'optimiser nos protocoles pour réduire au maximum le nombre d'animaux. Des études de la littérature nous permettent également de déterminer le nombre minimum de souris nécessaires afin que l'expérience ait une valeur scientifique et n'ait pas besoin d'être reproduite.
Raffinement
En plus des considérations éthiques, nous n'employons que des personnes formées à la manipulation des animaux et soucieux du bien-être de l'animal. Les animaux sont hébergés en cages ventilées, selon les normes de la directive 2010/63/EU, avec un enrichissement dans chaque cage (parmi igloo, batônnets de bois, coton, sizzle nest), et un statut sanitaire contrôlé trimestriellement. Des méthodes alternatives à la préhension par la queue sont utilisées, les procédures (de degré de sévérité modérée de cette DAP) sont réalisées sous anesthésie et analgésie quand cela est possible, et l’utilisation de tapis chauffants limite l’hypothermie lors des anesthésies. Les animaux utilisés sont choisis en bonne santé et sans phénotype dommageable. L’encadrement est réalisé par du personnel compétent, et l’état de santé des animaux contrôlé quotidiennement. Toute altération du bien-être (prostration, perte de poids, piloerection, blessures) des animaux réformés les écarte de toute utilisation de training. Les observations des animaux permettent d'appliquer des points limites précis et des critères d'arrêt des souffrances : APPARENCE GENERALE : Pas de toilette, posture recroquevillée. COMPORTEMENT : vocalisations, automutilation, stéréotypie sévère, souris immobile, prostrée. SIGNES CLINIQUES : perte de poids > 20% ou émacié, difficulté respiratoire sévère. ZOOTECHNIE : propreté cage : diarrhée sévère et sang, cage humide après 2 jours; absence de prise de boisson et alimentation.
Choix des espèces
Nous allons mener des études longitudinales tout au long de la vie des animaux, incluant des périodes à un jeune âge (1, 3, 6 et 12 mois) ainsi que pendant le vieillissement (souris âgées de 24 à 30 mois). Ces différents stades représentent l'évolution de l'hématopoïèse, à la fois chez l'Homme et chez la souris (hématopoïèse jeune, adulte et clonale).
Exploration des troubles cognitifs et corrélation avec l’inflammation après un AVC chez la souris adulte.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un accident vasculaire cérébral provoqué par une chirurgie de 45 minutes, puis jusqu'à quinze jours de test de mémoire quotidien sous restriction alimentaire et en cage individuelle : 340 souris passent par là, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont pesées chaque jour pour ajuster leur ration, l'appât alimentaire servant à les faire circuler dans un dispositif dont le RNT ne donne pas le nom. Le porteur écrit pourtant que la méthode retenue ne s'accompagne pas de symptômes majeurs et qu'elle limite la souffrance animale, moins de 3 % des souris ayant montré des signes de souffrance dans ses études précédentes. Toutes sont tuées par perfusion intracardiaque sous anesthésie, pour des analyses post-mortem du cerveau.
Objectifs
Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont une cause majeure de déficits moteurs à long-terme et de déficits cognitifs. Certains symptômes se manifestent tardivement et ne sont pas forcément liés à la région initialement lésée, suggérant qu’un AVC dans une région spécifique peut aussi causer des modifications dans d’autres régions du cerveau. Des altérations dans des régions directement connectées à la zone lésée ont déjà été corrélées à l’apparition de troubles tardifs. Cependant, les régions associées aux fonctions impactées (les fonctions de mémoire par exemple) ne sont pas toujours directement connectées à la région lésée. Une bonne compréhension des mécanismes qui sous-tendent les troubles de mémoire se manifestant tardivement après l’AVC est donc nécessaire pour le développement de stratégies permettant d’éviter leur survenue. Nous émettons donc l’hypothèse que des modifications pourraient donc ne pas se restreindre aux régions connectées à la zone lésée primaire mais s’étendre spatialement et temporellement dans le cerveau. Dans cette étude, nous voulons induire un AVC limité à une région précise du cerveau d’un modèle de souris afin d’étudier l’impact de la lésion dans d’autres régions cérébrales associées aux toubles de mémoires et pas directement connectées à la zone lésée. Grâce à ce modèle, nous étudierons les déficits de mémoire ainsi que leurs décours temporel. De plus, si notre hypothèse est confirmée, nous pourrons corréler ces éventuels troubles aux mécanismes étudiés dans des zones non-connectées qui pourraient sous-tendre leur apparition.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de valider notre modèle animal d’AVC pour l’étude des mécanismes sous-tendant les troubles de mémoire qui se manifestent tardivement après un AVC, même quand la région initialement lésée n’est pas impliquée dans la mémoire. Nous émettons l’hypothèse que l’altération de mécanismes cellulaires associés à la mémoire pourrait être présente dans des régions non directement connectées à la zone lésée. Si notre hypothèse est confirmée, le modèle pourrait être utilisé pour comprendre les mécanismes sous-jacents les troubles de mémoire qui apparaissent tardivement après l’AVC. Cette compréhension pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche préclinique, et mettre en lumière, à terme, de nouvelles pistes thérapeutiques pour prévenir certains troubles cognitifs après un AVC.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie peu invasive pour induire l’AVC sous anesthésie générale (environ 45 minutes). Un test comportemental sera ensuite réalisé. Pendant la phase d’habituation (2 jours), le test dure entre 2 et 10 minutes et il est répété jusqu’à 3 fois par jour. Ensuite, la durée moyenne du test est de 20-30 minutes (répété une fois par jour jusqu’à stabilisation de la courbe d’apprentissage, jusqu’à un maximum de 15 jours). Enfin, ils seront soumis à une perfusion intracardiaque sous anesthésie générale (20 minutes). Tous les animaux sont concernés.
Impact sur les animaux
La méthode utilisée induit un infarctus cortical limité et ne s’accompagne typiquement pas des symptômes majeurs, rendant le modèle facilement utilisable tout en limitant la souffrance animale. Cependant, suite à l’induction de l’AVC, une perte de poids pourrait être observée. Un effet de stress pendant le test comportemental et pendant l’hébergement entre les répétitions de tests pourrait survenir.
Devenir
A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront mis à mort et des analyses complémentaires post-mortem seront effectuées.
Remplacement
Il n’existe pas encore, à ce jour, de modèle alternatif (cultures cellulaires, organoïde) à l’induction d’AVC chez la souris suffisant pour reproduire les mécanismes complexes présents dans la pathologie humaine, impliquant notamment des structures sophistiquées comme la vascularisation cérébrale. La méthode que nous utilisons est cependant la méthode actuelle connue la moins invasive, permettant l’induction controlée et reproductible d’un AVC limité à une zone d’intérêt. Il n’existe pas non plus actuellement de méthode alternative permettant de remplacer les animaux dans les expériences de comportement, impliquant l’intéraction complexe de différentes structures et systèmes cérébraux
Réduction
Le nombre de souris a été évalué sur la base de travaux précédents, en tenant compte des divers problèmes que nous pourrions rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (au cours de la chirurgie, pendant les tests de mémoire). Le déroulement des expériences est organisé afin de limiter au maximum le nombre d’animaux. Le test comportemental choisi peut être répété sans altérer les résultats. Cela permet une étude longitudinale, et donc une réduction des animaux. Deux tailles de lésions d’AVC seront testées en même temps pour réduire le nombre d’animaux contrôles (n’ayant pas subi d’AVC) pour chaque lot d’animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour comparer les résultats des expériences.
Raffinement
Des mesures de RAFFINEMENT seront mises en place durant toute la durée du projet. Les animaux sont dans des conditions d’hébergement favorisant leur bien-être et observés quotidiennement. Jusqu’à l’expérience de comportement, ils seront placés dans des cages collectives avec un enrichment renforcé par l’ajout d’un tube en carton, au nombre de 4-5 par cage. L’accès à la nourriture et à l’eau est sans restriction et un changement de litière est effectué chaque semaine. Dans des études précédentes, le nombre d’animaux qui ont montré des signes de souffrance dû à l’induction de l’AVC était très limité (moins de 3%). Le test comportemental nécessite une légère restriction alimentaire afin de motiver les animaux à se diriger vers la récompense alimentaire, qui seront donc hébergés individuellement avant le début du test, afin de stabiliser progressivement leurs poids. Pour cela les animaux sont pesés quotidiennement et la quantité quotidienne de nourriture est adaptée. En cas de perte plus importante, la ration alimentaire est augmentée, et si nécessaire de la nourriture en poudre est ajoutée. Les cages sont collées les unes aux autres pour augmenter les intéractions sociales. Dans les deux protocoles, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable.
Choix des espèces
Le modèle envisagé a déjà été induit chez la souris. Sa reproductibilité et le fait de pouvoir induire l'AVC dans une zone confinée du cerveau en font le modèle d’AVC le plus adapté à ce jour selon la littérature pour tester notre hypothèse. Des phénomènes de déconnexion de zones avec des connexions directes à la zone de l’AVC ont déjà été établis dans ce modèle, ainsi que des modifications de l’activité neuronale dans des zones éloignées et sans connexions directes. Ce modèle nous permettra de réaliser des tests comportementaux afin de mettre en évidence des troubles de mémoire après l’AVC. L’âge des souris a été choisi pour étudier les conséquences d’un AVC sur une tâche de mémoire chez un animal adulte.
Caractérisation des mécanismes conduisant à l’apparition spontanée de tumeurs hypophysaires au cours du vieillissement.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Huit incisions au bout de la queue et huit jeûnes de six heures, un par mois, puis l'attente : 1 060 souris sont laissées à vieillir au-delà de vingt mois pour voir apparaître des tumeurs de l'hypophyse, dans des procédures classées en souffrance légère. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, une partie des tissus devant être mise à disposition d'autres équipes travaillant sur le vieillissement. Le porteur attend chez ces animaux âgés des troubles cardiaques, du diabète, de l'obésité, des cataractes, de l'athérosclérose, des troubles neurologiques, des difficultés de mobilité et d'autres tumeurs encore. Cette liste figure au titre des effets attendus, alors que l'ensemble du projet est déclaré en souffrance légère.
Objectifs
Les tumeurs hypophysaires constituent le second type de tumeurs intracrâniennes chez l’adulte. Le traitement des patients est principalement chirurgical, mais leur diagnostic tardif rend difficile leur résection complète. Au-delà des récidives observées chez un grand nombre de patients, près de 15% de d’entre elles sont considérées comme agressives et résistantes aux traitements disponibles. Bien que des progrès aient été faits dans leur compréhension, les mécanismes associés à leur origine restent encore mal compris. Leur fréquence élevée chez l’adulte questionne l’importance des mécanismes associés au vieillissement (accumulation de mutation, perte d’efficacité du système immunitaire) dans leur processus d’apparition. Des analyses réalisées sur des hypophyses de souris âgées révèlent l’existence de lésions tumorales spontanées. Nous souhaitons étudier les mécanismes qui conduisent à leur apparition spontanée, afin : 1- de mieux comprendre les mécanismes précoces qui conduisent à l’apparition de ces tumeurs 2- identifier les mutations qui sont responsables de ces tumeurs et 3- comprendre le rôle du système immunitaire dans l’apparition de ces tumeurs.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes qui conduisent au nombre important de tumeurs hypophysaires retrouvées chez l’homme. Il permettra d’identifier de nouvelles mutations responsables de ces tumeurs, mais également de mieux comprendre le vieillissement de l’hypophyse. Au-delà de ces aspects, le projet permettra de mieux comprendre la biologie hypophysaire chez la souris. Signalons enfin que les échantillons tissulaires de souris vieillissantes seront mis à disposition de la la communauté scientifique afin de lui fournir un matériel biologique indispensable aux études de vieillissement et ainsi limiter des études redondantes.
Procédures
Les animaux seront manipulés par les expérimentateurs lors de leurs pesées et leurs observations (entre 5 et 30 secondes maximum 1 à 2 fois par semaine). Ils subiront une brève incision au bout leur queue (2 secondes, prélèvement mensuel, 8 prélèvements maximum par souris) pour obtenir une goutte de sang nécessaire à l’évaluation du statut diabétique). Ces animaux subiront également une mise à jeun de 6 heures (1 fois par mois, 8 fois maximum).
Impact sur les animaux
Un stress pourrait être généré chez les animaux par leur manipulation et leur contention nécessaire au suivi de leur état de santé. Un stress pourrait également survenir chez les animaux lors de leur mise à jeun de 6 heures. Les animaux pourraient avoir un inconfort lors de l’incision sous l’anesthésie nécessaire aux prélèvements sanguins pour des mesures de glycémie. Ils pourront développer des lésions tumorales hypophysaires qui seront éventuellement associées à des comorbidités (maux de tête, troubles visuels). Ces tumeurs restent néanmoins bénignes chez l’homme et souvent asymptomatiques pendant les 10 à 15 premières années de leur développement. Les animaux pourront développer de nombreuses pathologies liées à leur vieillissement comparable à celles retrouvées chez l’homme (trouble cardiaque, trouble métabolique de type diabète et obésité, cataractes, risque d’accidents vasculaires, troubles neurologiques/comportementaux, athérosclérose, problème de mobilité, autres tumeurs...).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin d’expérimentation, leurs organes seront prélevés pour réaliser des analyses et étudier les tumeurs hypophysaires qui se seraient développées mais aussi d’autres organes au travers de travaux collaboratifs avec la communauté scientifique travaillant sur le la biologie du vieillissement.
Remplacement
La caractérisation du fonctionnement des organes endocrines et des effets des hormones qu’ils produisent ne peuvent pas à l’heure actuelle être étudiés grâce à des modèles cellulaires. Il en est de même pour les mécanismes de vieillissement qui de par leur complexité et leur hétérogénéité entre individus mâles et femelles requièrent l’utilisation de modèle vivant comme la souris.
Réduction
Pour la procédure d’élevage nous ne maintiendrons que les accouplements nécessaires à la production du nombre requis de souris pour la réalisation de nos procédures expérimentales. Une fois ce nombre obtenu, les accouplements seront réduits ou arrêtés pour ne pas générer inutilement d’animaux qui devraient être mis à mort sans raison scientifique. Cette stratégie devrait limiter le besoin en animaux à 60 pour la mise en place de nos accouplements et 800 souris générées. Pour l’étude de vieillissement, nous ignorons l’âge auquel vont apparaître les tumeurs hypophysaires spontanées. Une étude préliminaire faite par des collaborateurs a toutefois permis de déterminer qu’entre 60 et 70% des animaux âgés de plus de 20 mois développaient des lésions. Le nombre de 15 souris par sexe et par âge devrait donc nous permettre de comprendre le rôle du vieillissement sur l’apparition de lésions tumorales hypophysaires. 300 souris devaient être suffisantes pour réaliser la caractérisation des tumeurs mais également l’identification des mutations à leur origine. Nous aurons toutefois besoin d’un nombre total de 60 souris complémentaires pour réaliser un atlas cellulaire de l’hypophyse pour les 2 sexes à chaque âge étudié. Cet atlas permettra à la communauté scientifique de s’affanchir de l’utilisation d’autres animaux pour leurs travaux.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans un environnement enrichi, coton pour le nid, tunnels ou maison en plastique afin de créer un environnement familier et réconfortant. Leur isolement sera évité au maximum, ou limité sur de courtes périodes en cas de blessures liées à des bagarres. Les manipulations des souris seront limitées au maximum tout au long de leur vie, et limitées à la mise en place de leur identification et leur suivi. L'utilisation d'anesthésie et d'analgésique sera mise en place pour limiter la souffrance et le stress des animaux. Un suivi et une pesée sont réalisées chaque semaine afin d’identifier tout signe d’infection ou une perte ou un gain de poids excessif à partir de 2 mois. Tout animal présentant un des signes de souffrance sera mis à mort. Une attention plus importante et plus régulière sera apportée aux souris de plus de 16 mois plus susceptibles de développer des signes de souffrance liés à leur âge (diabète, obésité, arthrose, cataractes...).
Choix des espèces
De nombreux mécanismes endocrines humains ont été identifiés grâce au modèle rongeur souris (reproduction, lactation, régulation endocrine intégré, pathologies diabétiques etc...). Le fonctionnement des hormones hypophysaires y est comparable à celui des hormones humaines. L’utilisation de souris a également permis de mettre en évidence des lésions tumorales spontanées de l’hypophyse, ce modèle nous apparaît donc pertinent pour explorer la tumorigénèse hypophysaire. Les souris immunodéficientes sont, elles indispensables pour explorer la biologie des systèmes dans un contexte d’immunodéficience partielle (absence en lymphocyte T et B mature), ce modèle nous apparaît adapté pour comprendre si les mécanismes de tumorigénèse hypophysaire sont impactés (freinés ou accélérés) par une absence partielle du système immunitaire. Les animaux reproducteurs et ceux dont le vieillissement sera étudié seront issus des 2 sexes, utilisés et suivis à partir de 6 semaines d’âge. La nécessité d’étudier des animaux des 2 sexes se justifie par les différences de l’effets des hormones hypophysaires qui existe entre homme et femmes.
Maintien et génotypage de la lignée GASP1
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souriceaux qui ne portent pas le bon génotype sont tués, les autres deviennent reproducteurs : c'est le sort réservé aux 256 souris de ce projet, qui ne sert pas à produire des résultats mais à entretenir une lignée génétiquement modifiée. Les procédures sont classées en souffrance légère et consistent en une coupe du bout de la queue, pratiquée entre le cinquième et le dixième jour de vie sur l'animal éveillé, après deux minutes de séparation d'avec la mère. Le porteur justifie ce maintien par deux articles à soumettre dans l'année et d'éventuelles expériences futures, et indique qu'il arrêterait l'élevage pour cryoconserver la lignée si elles ne venaient pas. Sur l'espèce, il écrit qu'il lui est "indispensable" de travailler sur un modèle entier et qualifie la souris d'"incontournable" en neurosciences, tout en se disant attentif aux méthodes de génotypage qui éviteraient la coupe de queue.
Objectifs
La douleur chronique représente un enjeu de santé publique majeur, affectant la qualité de vie des patients et engendrant des coûts économiques importants. Malgré des avancées dans la compréhension de la douleur, peu de nouveaux analgésiques ont été développés. Les opiacés demeurent le traitement le plus efficace pour les douleurs modérées à sévères, mais leur utilisation entraîne des effets indésirables, notamment la tolérance analgésique, qui nécessite des doses croissantes pour maintenir l'efficacité. De plus, une consommation prolongée d'opiacés peut provoquer une hypersensibilité à la douleur. Des études sur des modèles murins ont montré que l'utilisation répétée d'opiacés peut inactiver le système analgésique, réduisant ainsi leur efficacité. Cette tolérance pourrait être liée à une dégradation rapide du système par les lysosomes. Dans ce contexte, une nouvelle famille de protéines adaptatrices a été identifiée dans le laboratoire, suggérant leur rôle dans la dégradation du système et la tolérance analgésique. Pour approfondir ces recherches, une lignée spécifique de souris a été créée, permettant de démontrer l'implication de ces protéines dans la tolérance aux opiacés et l'hyperactivité bronchique liée aux traitements de l'asthme. Deux articles scientifiques seront soumis cette année, et il est essentiel de maintenir cette lignée pour d'éventuelles expériences futures.
Bénéfices attendus
Ce projet est essentiel pour la compréhension de la mise en place des mécanismes de la douleur, de la modulation de la nociception et du développement de l’hyperalgésie induite par les opiacés et des douleurs persistantes. Ils pourraient permettre à terme d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de la douleur. Le maintien de lignée permettra donc d'effectuer les projets de recherche sur la compréhension du rôle de ces protéines adaptatrices des récepteurs aux opiacés.
Procédures
Tous les animaux subiront une biopsie de la queue sur animal vigil à l'âge de 5 à 10 jours afin de réaliser leur génotypage. Très exceptionnellement, elle pourrait être refaite à l'oreille sous anesthésie générale gazeuse.
Impact sur les animaux
Au moment de la biopsie, les souriceaux seront séparés de leur mère durant 2 minutes, ce qui peut engendrer un stress chez les animaux. Une douleur peut être ressentie au moment de la biopsie de la queue. Les animaux génétiquement modifiés ne présentent aucun phénotype dommageable.
Devenir
Les animaux présentant le génotype d'intérêt seront utilisés comme reproducteurs. Ceux n'ayant pas le génotype d'intérêt seront mis à mort.
Remplacement
L’étude du rôle de notre protéine d'intérêt dans la modulation de la nociception et de la douleur n’est réalisable que sur l’animal entier car il n’existe pas, à ce jour, de modèles in vitro permettant de réaliser ce travail. De plus, cette étude a pour but de compléter l’évaluation de différentes molécules ciblant les récepteurs à peptide RFamide sur la modulation de la nociception chez la souris. La combinaison des résultats obtenus par les approches génétiques et pharmacologiques permettra ainsi de conclure de manière plus convaincante quant à l’implication des différents récepteurs RF-amide dans la modulation de la douleur.
Réduction
Cette lignée ayant été créée depuis plusieurs années pour notre équipe, nous connaissons très bien les stratégies de maintien afin de ne générer que le nombre utile d'animaux et d'éviter au maximum toute naissance surnuméraire et restreindre le génotypage à son strict minimum. Ce schéma d’accouplement est le plus adapté pour maintenir notre lignée et nous permettra éventuellement de relancer la production d’animaux pour des expériences complémentaires demandées par des rapporteurs. Si ce n’était pas le cas, nous envisageons d’arrêter cet élevage et de cryoconserver la lignée. Bien entendu, nous restons vigilants quant aux nouvelles techniques de génotypage non-invasives possibles sur de jeunes individus sans poils, qui nous permettraient de ne plus pratiquer de caudectomie.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte, dans un milieu enrichi, et observés quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente dans un établissement agréé de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Suite à la biopsie, un point de compression est fait pour éviter toute hémorragie, les instruments sont désinfectés entre chaque geste, la lame de scalpel est changée entre chaque portée.
Choix des espèces
Il nous est indispensable de travailler sur un modèle entier et complexe prenant en compte les cascades de réactions, les voies de signalisation, la communication entre les organes afin d’être dans des conditions au plus proche de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et notamment dans la compréhension des mécanismes de la douleur. La souris possède également une forte homologie génétique faisant d’elle un bon modèle d’étude de la douleur. Pour le génotypage, les souriceaux seront utilisés avant d'avoir 10 jours car la minéralisation des os de la queue ainsi que le développement de la vascularisation ne sont pas encore complets, ce qui minimise la souffrance des petits.
Rôle du récepteur minéralocorticoïde dans la fibrose intestinale chez la Souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Tester si un médicament de l'hypertension déjà sur le marché freine la fibrose intestinale suppose ici d'infliger des colites chroniques à 924 souris, dont 374 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Une semaine d'antibiotiques vide leur microbiote, puis sept jours de gavage quotidien le remplacent par un autre, avant l'administration d'un agent chimique dans l'eau de boisson une semaine sur trois, ou par injection dans le rectum. Les protocoles durent 42 à 59 jours et provoquent, selon le porteur, une hypersensibilité viscérale sévère et une perte de poids, sans qu'aucun analgésique soit administré : il affirme que les quatre molécules disponibles interféreraient toutes avec l'inflammation étudiée. Les souris dont le score dépasse 3 sont mises à mort par surdosage d'anesthésiques.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) regroupent principalement la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique. Ces maladies se caractérisent par la répétition de poussées inflammatoires, entrecoupées de phases de rémission. Une complication fréquente des MICI est la fibrose intestinale. Celle-ci se caractérise par une paroi intestinale plus épaisse en raison d’une réparation excessive. Cela peut conduire à un rétrécissement de la lumière intestinale. Aujourd’hui, aucun traitement spécifique ne permet de prévenir ou d’inhiber le développement de la fibrose intestinale, ce qui conduit les patients à des interventions chirurgicales, d’où l’importance de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir ou inhiber la fibrose intestinale. Nous avons décidé de cibler le récepteur minéralocorticoïde (RM). Ce récepteur est impliqué dans la régulation de la pression artérielle. Or, la suractivation de ce récepteur est impliquée dans le développement de fibroses extra-intestinales. Par exemple, cibler le RM permet de diminuer la fibrose cardiaque induite dans un modèle murin d’hypertension artérielle. Ainsi, nous évaluerons l’effet de l’antagonisme du RM sur le développement de la fibrose intestinale dans des modèles murins de colite. De plus, le RM exprimé au niveau des macrophages joue un rôle dans le mécanisme du développement de fibrose dans différents contextes extra-intestinaux, d’où l’importance d’évaluer spécifiquement l’implication du RM exprimé au niveau myéloïde dans le développement de la fibrose intestinale.
Bénéfices attendus
Même si des progrès thérapeutiques notables ont été réalisés dans le traitement des MICI, il n’existe pas de traitement préventif ou thérapeutique contre le développement de la fibrose intestinale. Comme les antagonistes du RM ne sont pas contre-indiqués chez les patients atteints de MICI, nous pourrions repositionner les antagonistes du RM déjà disponibles sur le marché dans un nouveau champ thérapeutique. De plus, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents sur l’implication du RM dans le développement de la fibrose intestinale et en particulier le rôle du microbiote intestinal.
Procédures
Transfert de microbiote intestinal et induction de la fibrose intestinale. Les souris seront déplétées de leur microbiote par traitement antibiotique dans l’eau de boisson d’une durée d’une semaine. Puis, le transfert de microbiote intestinal se fera par gavage quotidien pendant 7 jours consécutifs et chaque gavage dure environ 1 min par souris. Les protocoles de colite chronique induite chimiquement se feront respectivement soit par administration de l’agent chimique dans l’eau de boisson, soit par une injection intra-rectale sous anesthésie/analgésie. L’administration de l’agent chimique dans l’eau de boisson dure 1 semaine et est répétée 3 fois au cours du protocole expérimental. L’injection rectale dure environ 1min. Les protocoles d’induction de fibrose sont de 59 jours et 42 jours respectivement. La composition corporelle est mesurée par EchoMRI les premiers et derniers jours de protocole de façon non invasive et la procédure dure environ 1 minute par souris. Dans le cadre de certaines procédures, des inhibiteurs pharmacologiques seront administrés dans l’alimentation des souris pendant toute la durée du protocole expérimental.
Impact sur les animaux
Les modèles de colites peuvent entrainer une hypersensibilité viscérale (modérée pour la colite aigue aux doses testées et sévère pour les modèles de colite chronique induite chimiquement) et une perte de poids corporelle chez la Souris
Devenir
A la fin du protocole, l’ensemble des animaux seront mis à mort afin de pouvoir évaluer différents paramètres physiologiques et marqueurs biologiques et collecter un maximum d’informations à partir de ces séries expérimentales.
Remplacement
Avant d’être testés in vivo, nos hypothèses de travail sont validées dans des modèles cellulaires comme des lignées de fibroblastes intestinaux humains ou des lignées de macrophages en conditions de fibrose. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas de rendre compte de la complexité physiologique de la réponse fibrotique ou inflammatoire in vivo. Les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales.
Réduction
Ce projet s’efforce de réduire le nombre de souris au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante et en collectant le maximum d’observations au cours d’une même expérience : (i) données nutritionnelles (composition corporelle, poids des animaux), (ii) inflammation, (iii) fibrose intestinale, (iv) fonction de barrière intestinale et (v) microbiote intestinal. Le nombre d’animaux nécessaires a été évalué selon la sensibilité et la spécificité des procédures utilisées, en fonction de l’expérience acquise lors de nos précédentes études, d’études pilotes pour valider les doses d’agents chimique et des données de la littérature. Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, plusieurs approches combinées ont été prévues : des modèles de colites intestinales induites chimiquement par deux agents différents à des concentrations faibles mais efficaces d’après la littérature. Nous avons fait le choix d’utiliser une dose faible d’inducteur chimique pour limiter au maximum la mortalité, permettant ainsi d’optimiser le bien-être des animaux et de réduire le nombre d’animaux utilisés. - L’utilisation d’espèces d’animaux utilisés à des fins scientifique, caractérisés par une faible variation génétique permet de limiter la variabilité de la réponse biologique et par conséquent le nombre d’animaux. - L’effectif de chaque groupe a été déterminé par une approche statistique en prenant comme critère principal le score histologique. - Nous avons fait le choix de tester l’antagonisme pharmacologique ou génétique du RM uniquement sur les animaux colitiques et par conséquent de limiter les groupes contrôles au strict minimum. Les données obtenues chez des animaux contrôles seront réutilisées autant que possible. Par exemple, des échantillons de colon sont préservés dans le laboratoire et indiqués dans la base de données communes à notre Unité et peuvent ainsi être réutilisés au cours d’un autre protocole par nous ou une personne de l’Unité.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des cages standards (4-5 souris/cage), avec enrichissement. Une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera réalisée avant le début des procédures. - Les conditions de soins et les méthodes utilisées viseront à réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée des procédures, afin de déceler tout éventuel signe de souffrance. Une grille d’évaluation des point limites pour le bien-être animal sera utilisée . Un animal présentant un état de mal être ou de souffrance sera exclu de l'étude et mis à mort en fonction de son score et de la discussion avec les membres de la cellule SBEA. Pour limiter la douleur des animaux avec colite induite chimiquement, l’usage est de ne pas utiliser d’analgésique en raison de leur interaction potentielle avec le processus inflammatoire. Il existe 4 analgésiques potentiels utilisés dans l’inflammation intestinale, qui présentent tous un risque d’interférence avec notre modèle selon la littérature scientifique. Nous ne pourrons donc pas utiliser ces analgésiques dans nos procédures expérimentales. En cas d’atteinte des points limites (score >3), les souris seront mises à mort par surdosage d’anesthésiants.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est le mammifère non primate le plus proche (phylogénétiquement) de l’Homme. La souris est l’animal le plus couramment utilisé pour modéliser la colite expérimentale et les modèles génétiques d’invalidation du récepteur minéralocorticoïde ne sont disponibles que chez la Souris. Cette souche n’est pas résistante à l’induction de colite chronique par le DSS et le TNBS comme d’autres souches de souris et permet ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés. La lignée de souris a été utilisée par notre laboratoire pour la mise en place des techniques de greffe de microbiote intestinal et de déplétion du microbiote endogène des animaux greffés par antibiothérapie.
Étude d’un nouvel agent médicamenteux dans un modèle murin d’athérothrombose induite par rupture de plaque
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Opérées un quart d'heure pour provoquer la rupture d'une plaque de graisse dans une artère, 141 souris nourries au régime gras jusqu'à leurs 28 semaines sont toutes tuées à l'issue. Soixante-quinze d'entre elles ne se réveillent pas de l'intervention, les autres relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec jusqu'à deux injections et une administration orale. Le projet vise à confirmer chez la souris qu'un peptide candidat réduit le caillot plaquettaire sans augmenter le risque de saignement, effet que le porteur dit avoir déjà observé dans un autre modèle murin. Il en attend un "réel bénéfice clinique pour des millions de patients", formule qui repose sur cette seule étape supplémentaire chez l'animal.
Objectifs
Dans le monde, les pathologies cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité (environ 38 % des décès) devant les cancers. Les complications majeures de la thrombose survenant suite à la rupture d’une plaque graisseuse (plaque d’athérome) dans une artère sont l’infarctus du myocarde et les accidents vasculaires cérébraux. À la vue de ce constat, il est aujourd’hui essentiel de découvrir de nouvelles approches thérapeutiques dirigées contre des cibles moléculaires originales impliquées dans ces processus.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de notre candidat peptide sont une diminution de la taille voire une absence de caillot plaquettaire (thrombus) suite à la rupture d’une plaque graisseuse (plaque d’athérome). De plus, comme décrit précédemment des traitements limitant la formation de caillots plaquettaires existent actuellement sur le marché. Cependant, ceux-ci sont fortement corrélés à un risque accru de saignement. Le candidat peptide étudié dans notre procédure n’augmente pas le risque de saignement. Ce candidat peptide pourrait donc conduire à un réel bénéfice clinique pour des millions de patients atteints de pathologies cardiovasculaires. La réalisation de ce projet d’expérimentation animale permettra de valider et de renforcer les résultats obtenus précédemment et ainsi de démontrer l’effet bénéfique de notre candidat peptide dans un modèle murin, et ainsi permettre d'avoir des données se rapprochant des cas cliniques observés. En effet les patients les plus à risque de thrombose développent, au cours du vieillissement ou lors de pathologies chroniques, des plaques graisseuses à l’intérieur de la paroi de leurs artères.
Procédures
- Injection d’anesthésique et d’analgésique (1 fois, temps maximale de l’injection : 30 secondes) - Injection (au maximum 2 fois, temps maximale de l’injection : 30 secondes) - Administration orale (au maximum 1 fois, temps maximale d’administration : 1 minute) - Chirurgie (15 minutes)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables peuvent être un stress physique ou thermique de courte durée, une douleur de courte durée à l’endroit des injections, et une gêne de courte durée lors de l’administration orale.
Devenir
A l'issue de la procédure les animaux seront euthanasiés sans douleur et encore sous anesthésie. Les actes chirurgicaux induits par la procédure sur les animaux ne permettent pas le réveil des animaux.
Remplacement
Nos résultats très encourageants dans différents modèles avec les plaquettes de souris (modèle murin d’occlusion carotidienne induite chimiquement) nous permettent de penser que ce modèle permet de réconcilier les limites de chaque approche, et dans le futur, de se rapprocher de la clinique.
Réduction
Le nombre de souris par expérience est calculé pour permettre le plus faible nombre d'animaux utilisés tout en obtenant des résultats permettant une interprétation fiable basée sur des analyses statistiques adaptées
Raffinement
Une observation quotidienne des souris sera réalisée afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. L’utilisation d’anesthésiques, d’analgésiques et d’antalgiques permettra de prévenir et/ou traiter toute douleur éventuelle. Un soin sera apporté aux conditions d’hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement du milieu de vie, respect de leur vie en groupe, surveillance quotidienne). Puis, au cours de l’anesthésie, les signes vitaux seront surveillés avec une attention particulière portée à la respiration et au rythme cardiaque avec un maintien de la température corporelle grâce à une plaque thermorégulée et une lampe chauffante. Au cours de la phase d’anesthésie, une attention particulière sera également portée aux indicateurs les plus significatifs d’une détérioration irréversible de l’état de l’animal réalisée à l'aide d'une grille d'évaluation de points limites. L’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin du protocole.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé dans ce projet constitue le modèle de référence pour leur capacité à développer des plaques graisseuses dans la paroi des artères. L'utilisation à 28 semaines de ces animaux après un régime riche en graisse permet de se rapprocher des conditions pathologiques retrouvées chez l'homme.
Évaluation du bénéfice thérapeutique anti-tumoral de l’inhibition d’une protéine impliquée dans la régulation du stress nucléolaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
264 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous la peau une greffe de cellules cancéreuses humaines, puis leurs tumeurs sont mesurées trois fois par semaine pendant douze semaines au maximum, pendant qu'elles reçoivent chaque semaine une injection dans l'abdomen doublée d'un traitement contre les nausées. Les souris qui ne développent pas de tumeur sont tuées huit semaines après la greffe, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent servir à aucun autre projet. Il décrit le bénéfice attendu comme une réduction des doses de chimiothérapie chez l'humain, et conclut que seul un "organisme entier" permet de tester le médicament candidat après les essais sur cellules.
Objectifs
Le cancer reste un enjeu clinique d’importance en France, cette pathologie présentant une forte incidence (environ 382 000 nouveaux cas diagnostiqués par an) et mortalité (environ 158 000/an). Bien que le cancer soit mieux pris en charge grâce aux dernières avancées dans le domaine, aucune solution thérapeutique n’est connue pour certains cancers, dont la prise en charge repose alors essentiellement sur les chimiothérapies. Or les chimiothérapies sont associées à des effets secondaires importants ou à de la résistance. Il est aujourd’hui nécessaire de remplacer ces chimiothérapies par des alternatives thérapeutiques ou de limiter les doses de chimiothérapies en les combinant à de nouvelles thérapies. La désescalade thérapeutique pour les chimiothérapies repose sur (1) l’identification de nouvelles protéines qui jouent un rôle dans la réponse aux chimiothérapies et (2) l’évaluation du bénéfice à cibler ces protéines en combinaison avec les chimiothérapies. In vitro, à l’aide d’une lignée cellulaire dérivée du foie, il a été montré que la réduction d’expression d’une protéine impliquée dans le stress nucléolaire induit un arrêt de prolifération des cellules en réponse à une chimiothérapie. A l’inverse, la sur-expression de cette protéine conduit à une résistance à la chimiothérapie. Aujourd’hui, il reste à démontrer que l’inhibition de la protéine d’intérêt améliore la réponse aux chimiothérapies in vivo. Objectif 1. L’objectif principal de ce projet de recherche est d’évaluer l’intérêt de cibler une protéine impliquée dans le stress nucléolaire dans les cancers à l’aide du modèle murin. Il sera déterminé si l'inactivation de cette protéine est suffisante pour augmenter la cytotoxicité des chimiothérapies courantes, démontrant le potentiel d'inhibition de la protéine d’intérêt en tant que thérapie combinée. Objectif 2. L’objectif secondaire correspond à de la recherche fondamentale, qui permettra de comprendre le rôle de cette protéine du stress nucléolaire dans la tumorigenèse. Il sera déterminé si l'inactivation de cette protéine réduit et/ou abolit la croissance tumorale, démontrant le potentiel d'inhibition de cette protéine d’intérêt en tant qu'approche thérapeutique à elle seule. Pour cela une approche de greffes chez la souris de cellules génétiquement modifiée pour permettre la réduction d’expression de la protéine d’intérêt sera utilisée.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de contribuer à valider une nouvelle stratégie thérapeutique anti-cancer en santé humaine. Ce projet permettra d’évaluer le bénéfice thérapeutique de la perte de fonction d’une protéine impliquée dans le stress nucléolaire dans le traitement de cancers par chimiothérapies. Cette stratégie thérapeutique innovante permettra de réduire la dose des chimiothérapies utilisées tout en augmentant leur efficacité et ainsi diminuer les effets indésirables associés aux chimiothérapies.
Procédures
Injection sous-cutanée de cellule humaine sur animal vigile (1x, 15 sec). Mesure des tumeurs (3x/sem, 25 sec, pendant 12 semaines au maximum). Administration de composés stériles par injection intrapéritonéale sur animal vigile (1x/sem, 15 sec, pendant 5 sem), administration d’un traitement anti-nausée par injection sous-cutanée (1x/sem, 15 sec, pendant 5 sem)
Impact sur les animaux
Contentions multiples (greffe, traitement, mesure) qui peuvent engendrer un stress. La tumeur pourrait entrainer, dans de très rares cas, une gêne à la locomotion. Douleur ponctuelle lors de la greffe (injection sous-cutanée) et lors des traitements (injection intrapéritonéale).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs pour des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques. Si des animaux ne développent pas de tumeur, ils seront mis à mort 8 semaines post-greffe. En effet, les animaux ayant subi une injection de cellules tumorales, ne peuvent pas être réutilisés dans un autre projet.
Remplacement
En amont de ces expérimentations in vivo, les chimiothérapies et le médicament-candidat ont été testés sur les cellules in vitro. Les approches in vitro sont nécessaires mais elles restent limitées à des modèles cellulaires ayant une structure en 2D ou en 3D, sans microenvironnement. La deuxième étape de validation du médicament-candidat est in vivo, c’est-à-dire d’étudier son action dans des conditions physiologiques et seul un organisme entier le permet.
Réduction
Une étude préliminaire de validation du modèle est conduite sur un nombre limité de souris (40 souris). Si les résultats de cette étude sont concluants, l’étape 2 sera alors mise en œuvre pour analyser les effets d'un médicaments anti-nausée sur le bien-être animal en lien avec des traitements de chiomiothérapie de référence (30 souris). L’étape 3 déterminera la concentration minimale de chimiothérapie à utiliser pour obtenir un effet. Cette procédure sera également faite sur un nombre limité d’animaux (50) pour 3 chimiothérapies testées (chimiothérapies classiquement administrées chez l’homme). Enfin, à l’issu de cette 3eme étape, la procédure 4 sera conduite en séquentielle (chimiothérapie par chimiothérapie). Le but de cette procédure est d’étudier s’il est possible de réduire les effets indésirables des chimiothérapies en co-administrant un médicament-candidat. Des tests statistiques ont été utilisés pour définir le nombre d'animaux par groupe qui permettent à la fois de réduire le nombre total d'animaux tout en préservant la significativité des résultuts et leur robustesse.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe de 5 individus, la boisson et l’aliment sont à volonté. Dans chaque cage, des boules de coton sont à disposition des souris pour la construction de nid. Avant toute expérience, les animaux seront acclimatés pendant 7 jours. Les analyses de croissance des tumeurs sont non invasives. L'effet des composés sur l'état physiologique des souris est suivi par la pesée des animaux, et la mesure du développement tumoral. Si une nausée est révélée lors des traitements de chimiothérapie, cette dernière sera prise en charge par l'adminstration d'un anti-nauséeux. Des points limites adaptés sont définis de manière objective pour chaque procédure, incluant des critères d'arrêt de l'expérience en cas de souffrance.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour l’analyse de greffes de lignées cellulaires en oncologie. Les expérimentations sont réalisées sur des souris immunodéprimées pour qu’il n’y ait pas de rejet de la greffe des cellules humaines. La greffe est pratiquée sur les souris de 6–8 semaines, pour des raisons d’efficacité et de reproductibilité.
Production de souris humanisées pour le système immunitaire humain par injection de cellules souches humaines.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Fournir à des clients académiques et industriels des souris porteuses d'un système immunitaire humain, par lots pouvant atteindre cent individus : 14 000 souris immunodéficientes vont être utilisées à cette fin, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les nouveau-nées reçoivent une injection de cellules souches humaines trois à quatre jours après leur naissance, après une irradiation ou un traitement qui détruit les cellules de leur moelle osseuse. Des prélèvements sanguins suivent, jusqu'à un toutes les deux semaines, et le porteur indique attendre l'apparition de la maladie du greffon contre l'hôte, avec les lésions tissulaires qui l'accompagnent. Les souris de la phase de validation sont tuées, celles de la phase de production sont expédiées aux partenaires, parfois en avion, sur des lots calibrés selon les "besoins commerciaux".
Objectifs
Les souris immunodéficientes sont depuis plusieurs décennies des modèles de choix pour la transplantation de cellules humaines pour obtenir des souris humanisées car elles sont particulièrement tolérantes à l’implantation de cellules ou tissus. Les souris sont dites « humanisées » lorsqu’elles développent un système immunitaire humain après la greffe des cellules humaines. Le développement et la production de souris humanisées par injection de cellules souches humaines consiste à proposer des modèles expérimentaux pertinents et adaptés en recherche biomédicale sur les maladies inflammatoires aux utilisateurs finaux (académiques et industriels). L’une des particularités de ces modèles est le développement de plusieurs sous populations de globules blancs humains restant présents pendant plusieurs mois chez l’animal injecté, permettant ainsi de réaliser des études plus longues. Ainsi ce type de modèle permet l’étude de nombreuses pathologies dans lesquelles le système immunitaire joue un rôle majeur chez l’Homme dans des domaines tels que la production de cellules du sang, l’immunologie, les maladies infectieuses, la vaccination, l’oncologie et les maladies auto-immunes. Ces modèles permettent également l’amélioration de traitements et des méthodes de diagnostics notamment en oncologie, le cancer étant la première cause de mortalité prématurée ; mais aussi les maladies inflammatoires chroniques et certaines maladies d’origines infectieuses. Parmi les traitements, l’immunothérapie fait partie de ces nouveaux traitements innovants qui a révolutionnée la prise en charge des patients atteints de cancer. L’oncologie n’est pas le seul domaine dans lequel l’immunothérapie a eu des effets prometteurs et encourageants, les maladies inflammatoires chroniques ainsi que certaines maladies d’origines infectieuses sont sensibles à l’immunothérapie. Le recours à ces souris humanisées devrait permettre d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques nécessitant des modèles expérimentaux au plus proche de la situation humaine et permettant l’étude des réactions inflammatoires.
Bénéfices attendus
Le développement des souris humanisées pour le système immunitaire permet d’améliorer la compréhension des mécanismes pathologiques et immunologiques, d’identifier des marqueurs biologiques caractéristiques et de développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour l’Homme. Les modèles de souris « humanisées » sont donc des modèles très pertinents pour le développement de traitements pharmacologiques. Depuis quelques décennies, le modèle humanisé est notamment très présent dans les études de nouvelles thérapies innovantes, dites immunothérapies. Il s’agit de thérapie qui se basent sur le fonctionnement du système immunitaire et de sa compréhension afin de combattre la pathologie du patient. Il n’est plus question de viser directement l’infection ou la tumeur, mais d’activer/booster le système immunitaire. De grand espoirs sont fondés notamment sur la médecine dite « personnalisée », pour laquelle ces modèles permettraient de greffer le système immunitaire et la tumeur d’un patient à des souris pour tester plusieurs thérapies avant l’administration du traitement le plus efficace au patient.
Procédures
Une partie des animaux recevront des injections d’un produit réduisant les cellules de la moelle osseuse ou une dose d’irradiation comme pré-traitement. Pour chacune des procédures dans la phase de validation, une injection unique de cellules humaines sera réalisée dans la veine de la queue ou dans le foie en fonction de l’âge de l’animal. Pour toutes les procédures, des prélèvements sanguins seront effectués à plusieurs reprise jusqu’à 1 fois toutes les deux semaines post-humanisation dans la veine sous-mandibulaire. Pour chacune des procédures dans la phase de production, une injection intraveineuse unique de cellules humaines sera réalisée dans la veine de la queue ou dans le foie en fonction de l’âge de l’animal. Chaque geste sera réalisé en moins d’une minute pour diminuer au maximum le stress et la douleur.
Impact sur les animaux
Après production et validation des contrôles qualités, les souris seront expédiées aux partenaires. Ces déplacements peuvent induire un certain stress par la manipulation et les bruits inhabituels. Lors du protocole d’humanisation les injections ou les rayons X, pourront induire un bref état de stress et/ou de douleur. Un ou plusieurs prélèvements de sang seront réalisés sur de petit volume et ave un écart d’au moins deux semaines entre les prélèvements, ce qui pourra aussi induire un stress et/ou une douleur transitoire. Un effet secondaire connu lié à l’injection de cellules humaines du sang se déclare chez la souris injectée. Il s’agit de l’apparition de la maladie du greffon contre l’hôte, amenant à des lésions tissulaires à travers une réponse inflammatoire.
Devenir
Les animaux de la phase de validation seront mis à mort (points limites atteints ou fin de protocole). Les animaux de la production seront expédiés à nos partenaires pour une utilisation continue ou gardés en fin de validité si un suivi de l’humanisation dans le temps est nécessaire.
Remplacement
Pour le moment, ce type de modèle n’est pas remplaçable car il s’agit d’un modèle complexe et innovant mimant le système immunitaire humain, mélangeant de nombreux mécanismes encore méconnus qui nécessitent encore des avancées en recherche fondamentale. Actuellement, il n’existe pas d’équivalent aussi complet in vitro, ex vivo ou in silico. Par ailleurs, les souris humanisées permettent d’approcher la situation physiologique humaine en limitant le recours aux modèles de primates non-humains.
Réduction
Les modèles testés sont déterminés en fonction des tendances et besoins sur les avancées scientifiques en lien avec les pathologies citées en introduction, par conséquent aux besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux auprès de nos partenaires. Nous avons utilisé un test statistique afin de déterminer le nombre d’animaux à inclure dans nos sous-groupes. Les paramètres utilisés sont tirés de la recherche bibliographique et de nos données internes ou partenariat relatives au processus. Pour la partie mise au point ou amélioration de protocole, nous testerons un ou différents paramètres pour un modèle donné. Pour chaque modèle, le nombre de groupes de souris entrant en protocole pourra varier en fonction des paramètres suivants : •Nouveau-nés versus juvéniles (entre le sevrage et la maturité sexuelle), •Techniques de traitement : produit réduisant les cellules de la moelle osseuse versus irradiation ou absence de traitement (en fonction du modèle), •Dose de traitement : jusqu’à 5 doses différentes testées, •Quantité de cellules souches humaines : jusqu’à 3 quantités différentes, •L’injection d’un mélange de donneurs de cellules souches humaines versus l’injection d’un donneur unique, •L’ajout ou non d’un agent booster du système immunitaire humain. Pour chaque test, un groupe contrôle sera ajouté, compris entre 1 et 10 souris, pour observer l’impact de nos protocoles sur les animaux et servir de témoins dans nos analyses. Pour un modèle donné, les paramètres testés seront choisis en fonction des données bibliographiques, des données internes et des spécificités du modèle, équivalent à 20 souris maximum par sous-groupes. Si les résultats ne sont pas concluants, des tests complémentaires pourront être menés pour évaluer la dose administrées ou l’impact des quantités de cellules humaines injectées lors de l’humanisation. Pour la partie production, des lots de souris produites seront proposées aux partenaires sur des souches préalablement étudiées et connues par notre établissement, répondant aux besoins commerciaux. Un nombre maximal de 100 souris par lot pourront être produites, toute demande supérieure fera l’objet d’une commande spécifique demandée par le client (Les commandes spécifiques seront réalisées dans le respect du protocole de la souche concernée et le bien-être des souris).
Raffinement
Un hébergement sous barrière sanitaire de niveau élevé est appliqué (litière, enrichissement et congénères) associé à une surveillance quotidienne. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Le maintien de conditions d’hygiènes strictes exemptes de pathogènes et d’opportunistes étant la clé pour éviter l’expression du phénotype dommageable des animaux immunodéficients et limiter les nuisances associées. En fonction du pré-traitement choisi, un analgésique pourra être injecté si les animaux présentent des signes de douleur. En cas manipulation répétés sur les nouveaux nés, il sera nécessaire d’imprégner l’odeur de chaque cage par application de sciure souillé sur les gants du manipulateur pour éviter l’abandon des nouveaux nés par la mère. Concernant les prélèvements sanguins, les animaux seront prélevés de manière répétée jusqu’à 1 fois toutes les deux semaines à partir de 2 semaines post-humanisation au niveau de la veine sous mandibulaire pour que le prélèvement soit le moins invasif possible. Le volume maximal prélevé respectera les recommandations de 7,5% du volume sanguin de la souris afin que les souris puissent être prélevées 1 fois toutes les deux semaines en alternant le coté de prélèvement. Si nécessaire, une injection de sérum physio pourra être réalisé après chaque prélèvement pour rétablir la volémie des animaux et leur permettre une récupération plus rapide. Une attention particulière sera apportée à tout animal présentant des signes potentiellement avant-coureurs de la maladie du greffon pour appliquer des points limites. Après production, les souris seront expédiées aux partenaires. Pour limiter le stress occasionné par le transport, des processus d’envoi ont été établi. Pour des transports de moins de 24 heures à 48heures, tous nos colis contiennent de la litière, de l’enrichissement de l’aliment et un gel de transport. Pour les transports plus longs comme ceux en avion, la quantité d’aliment et de gel de transport est doublé.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets de nos partenaires. Les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, relativement peu coûteux à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils représentent un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Le génome des souris est bien caractérisé et très comparable au génome humain, avec 90% des gènes humains qui ont un équivalent chez la souris. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. Que ce soit pour la mise au point ou la production, les souris pourront entrer dans le protocole à des âges différents. Cet âge sera choisi en fonction du protocole le plus pertinent pour une souche donnée. Les souris pourront être humanisées soit à l’état nouveau-né ou soit entre le sevrage et la maturité sexuelle. Pour une humanisation à l’état nouveau-né, les souris recevront une injection de cellules souches humaines entre 3 et 4 jours après naissance. Pour une humanisation entre le sevrage et la maturité sexuelle, les souris recevront une injection de cellules souches humaines entre la 3ème et la 8ème semaine après la naissance.
Effets des domaines Fc d’anticorps sur la déplétion de cellules ou de complexes immuns
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Injectées à une ou deux reprises alors qu'elles sont éveillées, puis piquées cinq à six fois pour des prélèvements sanguins, 5 274 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole prévoit un dernier prélèvement sous anesthésie, et les injections d'anticorps peuvent faire chuter leur température centrale de deux à trois degrés pendant une demi-heure. L'objectif déclaré porte sur l'optimisation d'anticorps thérapeutiques et sur la "bioproduction" de différents formats, la seule répétition des prélèvements suffisant à faire classer l'ensemble en souffrance modérée. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées parce que leur système immunitaire a été modifié de manière pérenne.
Objectifs
Nous cherchons à améliorer et à optimiser les anticorps thérapeutiques pour le traitement de diverses pathologies. Nous cherchons à améliorer la sélection d'anticorps innovants et d'optimiser la bioproduction de différents formats d'anticorps en comparant les choix possibles pour leur activité in vivo. Ceci sera étudié dans des souris humanisées pour des molécules affectants le rôle des anticorps pour une meilleure translation des résultats à l’homme.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à améliorer notre compréhension de la fonction effectrice d'anticorps à visée thérapeutique pour améliorer le traitement de diverses maladies humaines. La comparaison d’anticorps produits sous différents formats avec différentes modalités servira à mieux maîtriser leur développabilité dès les premières phases de développement et d'optimiser la bioproduction de formats d'anticorps.
Procédures
- Injections sous-cutanées, intradermique, intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale et intranasale sur animaux vigiles : quelques secondes. 1-2 injections par animal. - Prélèvement sanguin sur souris vigiles : quelques secondes. 5-6 prélèvements par animal. - Prélèvement sanguin sur souris anesthésiés : quelques minutes. 1 prélèvement par animal.
Impact sur les animaux
Au cours de ces expériences, il n’est pas théoriquement envisagé de douleur ou effet indésirable majeur du fait de la nature des produits injectés (anticorps ou protéine). Les prélèvement répétés de sang représentent la nuisance principale dans ce projet. Il est également possible que les animaux présentent une légère irritation au niveau des sites d'injection, qui sera contrôlée chez la souris. En outre, les souris peuvent souffrir d’une légère hypothermie transitoire (2 à 3°C de perte de température centrale pendant 20-30 min) après les injections d'antigènes et d'anticorps. La température des souris sera surveillée pour détecter toute perte de température anormale et des critères d'évaluation appropriés ont été fixés. Aucun effet à long terme n'est attendu pour cette procédure. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention suivi de l’introduction d’une aiguille. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée. La sévérité globale des procédures est considéré comme modérée uniquement du fait de la répétition des prélèvements sanguins au cours des protocoles.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car leur système immunitaire aura été modifié de manière pérenne durant les procédures, impactant leur capacité de réponse à d’autres stimuli.
Remplacement
Le recours à l’utilisation d’animaux est justifié par le fait que les mécanismes moléculaires du système immunitaire sont difficiles, voire impossible à étudier in vitro, en raison de l'implication de plusieurs organes et de l'absence d'un système circulatoire intact. Les thérapies objets d’investigations, ne peuvent pas être remplacées par des modèles in vitro: nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente.
Réduction
Le recours à des lignées consanguines de souris permet entre autres de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental, et de ne pas prolonger les explorations dès lors que sont initiées et mesurables les conséquences biologiques des interactions entre les anticorps et leurs récepteurs. Les nombres d’animaux utilisés lors des expériences sont minimisés, avec la contrainte d’obtenir des données statistiquement significatives. Une analyse de variances sera réalisée entre les groupes.
Raffinement
Mesures prises pour minimiser les atteintes au bien-être des animaux. Il n’est pas attendu d’effet secondaire délétère pour la santé des animaux. L'état général des animaux et le point d'injection seront surveillés quotidiennement. La procédure sera interrompue si des signes généraux sont observés. Une légère irritation peut survenir au niveau des sites d'injection, qui sera contrôlée chez la souris. En outre, les souris peuvent souffrir d’une légère hypothermie transitoire (2 à 3°C de perte de température centrale pendant 20-30 min) après les injections d'antigènes et d'anticorps. La température des souris sera surveillée pour détecter toute perte de température anormale et des critères d'évaluation appropriés ont été fixés. Aucun effet à long terme n'est attendu pour cette procédure. Si l’animal présente une posture prostrée, un poil hérissé ou une perte de poids de plus de 10-15% le raffinenement sera renforcé avec du gel hydrique ou une réhydratation sous cutanée pour prévenir/traiter les signes cliniques. Si l’animal présente une hypothermie prolongée de plus de 30 min suite à une injection ou un prélèvement, les cages pourront être chauffées avec des chaufrettes. Les soins adéquats à apporter à l'animal seront déterminés par le vétérinaire. L’animal sera mis à mort si aggravation des signes clinique malgré le traitement.
Choix des espèces
L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Les souris de laboratoire restent des modèles dont la pertinence biologique et biomédicale est établie. De plus, l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées permettra d’évaluer plus précisément les mécanismes moléculaires et cellulaires de la pathologie humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente. L’ensemble des animaux expérimentaux seront utilisés au stade « jeune adulte à adulte » : entre 6 et 15 semaines au début de l’expérience, âge à partir duquel le système immunitaire est mature et ne subit plus de changements majeurs. Les animaux ne sont pas utilisés à un âge plus avancé (au-delà de 15 semaines), afin que leur masse ne soit pas trop importante et ne nécessite l’injection de doses d’anticorps plus importantes.
Evaluation pré-clinique dans un modèle murin de l’efficacité anti-tumorale d’anticorps ciblant les tumeurs cutanées et mammaires humaines ou leur microenvironnement
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Les souris de ce projet ont un système immunitaire partiellement déficient, ce qui permet de leur greffer des cellules cancéreuses humaines sans rejet et les rend plus vulnérables aux infections. 600 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des tumeurs et des organes. La tumeur est implantée sous la peau du dos ou dans la glande mammaire, puis chaque souris reçoit trois traitements par semaine, par injection ou par gavage, pendant quatre à six semaines, avec une ponction sanguine hebdomadaire à la veine de la joue sans anesthésie. La croissance de la tumeur peut s'accompagner de prostration, de poil hérissé et d'ulcération, et c'est l'atteinte d'un score limite sur la grille d'évaluation qui déclenche la mise à mort.
Objectifs
Malgré les avancées thérapeutiques majeures de ces 10 dernières années, avec notamment la génération d'anticorps permettant de cibler la tumeur ou de restaurer les fonctions immunitaires anti-tumorales, le pronostic de certains cancers reste sombre voire incertain. C'est le cas pour certains cancers de la peau et du sein. Ce mauvais pronostic résulte essentiellement de la survenue de résistances ou de rechute en cours de traitement ou après traitement, ce qui rend nécessaire la génération de nouveaux agents thérapeutiques ou l'amélioration des thérapies existantes. Dans cette optique, nous avons identifié de nouvelles molécules soit exprimées spécifiquement à la surface des cellules tumorales soit sécrétées par la tumeur et capables d’inhiber le système immunitaire. Les anticorps reconnaissant ces molécules sont d'ores et déjà disponibles au laboratoire et ont montré une efficacité anti-tumorale dans des modèles cellulaires au laboratoire (in vitro). Le projet vise à valider dans un organisme vivant (in vivo) l’efficacité anti-tumorale de ces anticorps, utilisés seuls ou en combinaison avec des thérapies existantes, dans des modèles murins de cancers cutanés ou mammaires bien établis et largement utilisés par la communauté scientifique. La réalisation de ce projet devrait permettre de déterminer si un gain thérapeutique pourrait découler de l’utilisation des anticorps testés en combinaison avec des thérapies ciblées ou des immunothérapies actuellement utilisées pour le traitement des patients.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet doit permettre de valider les résultats obtenus sur des modèles cellulaires in vitro, à savoir la génération d'une réponse immunitaire anti-tumorale efficace en présence des anticorps testés. Les expériences envisagées établiront si l'utilisation d'anticorps thérapeutiques dirigés contre des marqueurs spécifiques des cellules cancéreuses que nous avons identifiés est en mesure de promouvoir une élimination tumorale et/ou de renforcer l'action d'agents thérapeutiques utilisés en clinique (thérapies ciblées et immunothérapies). La validation du mode d'action de ces anticorps dans un modèle murin devrait conduire au développement d'anticorps injectables chez l'Homme et à la conduite d'essais cliniques pour évaluation de leur efficacité anti-tumorale en conditions pathologiques réelles. En cas de résultats probants, ces anticorps représenteraient une nouvelle alternative (ou un complément) thérapeutique pour le traitement des cancers cutanés et mammaires étudiés, cancers pour lesquels les traitements actuels restent peu ou partiellement efficaces
Procédures
Afin de mettre en place le modèle expérimental, les souris seront soumises à une greffe des cellules tumorales en sous-cutanée (sous la peau du dos, sous anesthésie; durée 3 minutes) ou au niveau de la glande mammaire (sous anesthésie; durée: 3 min). Les essais thérapeutiques seront administrés aux animaux non anesthésiés par injection et/ou gavage (3 fois par semaine pendant 4 à 6 semaines; durée du geste: 1 min). Le suivi de l'effet thérapeutique sera évalué par des mesures de la taille des tumeurs et un prélèvement sanguin au niveau de la veine de la joue (sans anesthésie; 1 fois par semaine pendant 4 à 8 semaines; durée 30 secondes).
Impact sur les animaux
Les tumeurs seront obtenues par une greffe sous-cutanée ou intra-mammaire de cellules tumorales. Du fait de la croissance de la tumeur, une perte de poids, , , une altération des fonctions physiologiques normales de l’animal ou de son activité (mobilité, nourrissage, toilettage) ou des signes de douleur (prostration, poil hérissé) pourraient apparaître. Les agents thérapeutiques seront administrés par injection et/ou gavage Elles sont par conséquent susceptibles d'induire stress et/ou agitation pendant la durée de manipulation et d''immobilisation de l'animal. Une ulcération/infection à l'emplacement de la tumeur ou du site d'injection pourrait survenir mais n'est que rarement observée. Enfin, du fait de leur système immunitaire partiellement déficient, les souris utilisées présentent une susceptibilité plus grande aux agents pathogènes.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de protocole. Les tumeurs et les organes pourront être prélevés afin de faire des analyses post-mortem.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative non animale car le but de ce projet est de tester l’activité anti-tumorale d'anticorps dont le mode d'action repose sur la présence de cellules immunitaires fonctionnelles en périphérie d’une tumeur en croissance. Il est par conséquent nécessaire d'utiliser un modèle animal permettant le suivi de la croissance tumorale mais aussi la mobilisation et l'activation des cellules immunes en présence d'anticorps. De plus, un aspect de notre étude requiert de reproduire le microenvironnement créé par la tumeur et impactant l'activité des cellules immunitaires (sécrétion de molécules immunosuppressives) afin de se rapprocher le plus possible du contexte pathologique rencontré chez les patients. Le modèle murin est le seul permettant de reproduire ces caractéristiques spatio-temporelles associées à la présence d’une tumeur solide et à son influence sur la réponse immunitaire.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé par groupe correspond au minimum nécessaire et suffisant pour valider la significativité des résultats sur le plan statistique pour un modèle tumoral. Il prend en compte la variabilité de la prise de greffe et de l'intensité de la réponse immunitaire entre individus au sein d'un même groupe. De plus seuls des anticorps ayant préalablement montré une efficacité dans des tests vitrosur des lignées cellulaires, au laboratoire, seront utilisés afin de limiter les risques de non réponse aux traitements. Un maximum de conditions sera réalisé au sein d’une même expérience afin de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. De même, les expériences visant à tester les combinaisons anticorps/thérapie ciblée ou immunothérapie ne seront entreprises que si des résultats probants auront été obtenus lors de l'utilisation de l'anticorps seul.
Raffinement
Du fait de leur immunodéficience partielle, les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et en portoir ventilé afin de limiter les contaminations avec des organismes pathogènes. Elles auront à disposition des outils de nidification ou d’occupation ainsi qu’eau et aliments à volonté. Dès la greffe tumorale et tout au long du traitement,, les souris seront suivies 3 fois par semaine par l’expérimentateur (mesure de la tumeur, pesée, observation du comportement des animaux et absence de signes douloureux). L'administration des traitements aura lieu 3 fois par semaine et sera précédée par une évaluation de l’état physique et du comportement de chaque animal selon une grille d’évaluation préétablie. Chaque animal se verra ainsi attribuer un score reflétant des dégradations, son inconfort ou tout signe de douleur. L’atteinte d’un score limite conduira à l'euthanasie de l’animal. En marge de la surveillance réalisée par l'expérimentateur, une surveillance quotidienne sera assurée par les animaliers. L’expérimentateur pourra intervenir dans la journée en cas de modification ou d'aggravation de l’état général de l’animal. En cas d'apparition de signe de douleur sans atteinte d'un score limite, la surveillance de l’animal sera augmentée à 2 fois par jour avec une mise à disposition de croquettes humidifiées dans la cage et l'injection d'un analgésique une fois par jour afin de soulager la douleur.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les études de recherche sur le cancer et la réalisation d’expériences thérapeutiques. En effet, c’est un mammifère dont les mécanismes associés à la réponse anti-tumorale sont bien connus et décrits. Le modèle murin est aussi le modèle le plus adéquat pour l’étude du microenvironnement tumoral. Il permet d’avoir recours à des animaux partiellement immunodéficients pouvant développer des tumeurs humaines sans risque de rejet, et une réponse immunitaire médiée par des anticorps. De plus, le système immunitaire de la souris étant proche de celui de l’Homme, l’utilisation de ce modèle permet d’avoir une première preuve de concept pour l’utilisation de nouveaux agents thérapeutiques impactant positivement la réponse anti-tumorale en vue de leur développement clinique pour les patients. Enfin, la souris est un petit mammifère dont le comportement est bien connu ce qui permet une évaluation simple et efficace des modifications physiques et/ou comportementales symptomatiques de souffrance ou de mal-être pouvant être engendrées par la présence de la tumeur ou l’administration des traitements. Des souris adultes âgées de 5 à 6 semaines seront utilisées (âge standard pour l’établissement de modèles murins en oncologie).