Souris
Rôle du microenvironnement stromal dans les lésions musculaires-2/2
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
Un infarctus du myocarde provoqué en trente minutes chez l'adulte et en quinze chez le souriceau d'un jour, une artère fémorale ligaturée ou excisée, un muscle lésé par une anse refroidie appliquée trois fois quinze secondes : 7 110 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin de chaque procédure. Certaines reçoivent en plus une injection quotidienne de toxine. Les échographies obligent à les transporter vers un second établissement, transport que le porteur compte lui-même parmi les sources de stress. Le projet vise à comprendre le rôle des cellules du microenvironnement musculaire dans la régénération, et le porteur justifie le choix de la souris par la disponibilité d'animaux génétiquement modifiés et par la consanguinité des lignées, qu'il présente comme un gage de reproductibilité et donc de réduction des effectifs.
Objectifs
Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs. Ce projet a pour objectif de caractériser les mécanismes cellulaires impliqués dans les pathologies affectant le muscle squelettique et cardiaque, y compris les pathologies cardiovasculaires comme l’infarctus du myocarde, les myopathies et les blessures chroniques du muscle squelettique. Par ailleurs, le manque d’irrigation locale des membres inférieurs sont fréquentes dans différentes pathologies chroniques y compris le diabète. Malgré le succès de certains traitements, ces maladies chroniques restent encore aujourd’hui fréquentes et très peu soignables, elles ont donc un impact majeur sur la qualité de vie des patients. Ce projet a pour but de répondre à un sujet de santé publique et de besoins scientifiques et cliniques afin d’améliorer la compréhension de ces pathologies affectant le muscle et le traitement des patients.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes biologiques menant aux lésions musculaires. Notre étude permettra notamment de comprendre le rôle de certaines cellules dans la régénération ou les lésions chroniques des muscles. Ces avancées pourraient, à terme, permettre de développer de nouvelles thérapies pour réparer ou régnérer les muscles. Ceci pourrait concerner, par exemple, l’infarctus du myocarde, qui est la première cause de mortalité en France.
Procédures
- Infarctus du myocarde chez la souris adulte anesthésiée (1x par souris) durée = 30 minutes. Réalisé par EU1 - Infarctus du myocarde chez le souriceau anesthésié (1x par souris) durée = 15 minutes. Réalisé par EU1 - Échocardiographie chez la souris et le souriceau anesthésié (1x par souris) durée = 15 minutes ainsi que le stress lié au transport vers le site n°2 pour l’échocardiographie. Réalisé par EU2 - Constriction puis excision d’un segment d’artère fémorale sur souris adulte anesthésiée = 15 minutes. Réalisé par EU1. - Ligature de l’artère fémorale chez la souris adulte anesthésiée (1x par souris) durée = 15 minutes. Réalisé par EU1 - Dans certaines expériences, injection de toxine: quotidien, 10 secondes. Réalisé par EU1 - Blessure localisée du muscle par anse refroidie (1x par souris) = 3x 15 secondes. Réalisé par EU1 - Ligature de l’artère fémorale et injection de toxine chez la souris adulte anesthésiée = 15minutes. Réalisé par EU1 - Chirurgie terminale sous anesthésie pour prélèvement d’organes. Réalisé par EU1.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés aux procédures : inconfort lié à la préhension des animaux, douleur aux points d'injections. Effets de la chirurgie cardiaque : douleur modérée post-opératoire de quelques jours. Effets de la chirurgie des membres inférieurs : Douleur, inconfort léger de courte durée liés à la ligature de l’artère fémorale et au point d’injection. Stress lié au transport des souris vers l'EU n°2 pour les échocardiographies. L’induction de l’anesthésie gazeuse pour la réalisation de l’échocardiographie est stressant pour l’animale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour analyse des organes.
Remplacement
Notre projet s’intéresse à l’interaction de différents types de cellules du microenvironnement musculaire, y compris les cellules immunitaires, stromales et endothéliales. Comme l’étude de ces interactions cellulaires est multicellulaire et multi-organes (réponse immunitaire, inflammation, régimes), elle ne peut pas être effectuée sur des cellules isolées in vitro et nécessite un modèle murin in vivo, qui a un système immunitaire similaire à l’homme.
Réduction
Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduire le nombre d’animaux autant que possible tout en assurant des résultats significatifs, qui seront confirmés par des analyses statistiques appropriées, en fonction des questions posées. Ce nombre tient compte d’un minimum de cellules à collecter pour l’analyse et inclut pour chaque série d’expériences le nombre nécessaire de contrôles. Il tient également compte de la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure des artéfacts expérimentaux et ainsi des erreurs d’interprétation. Un grand nombre de données de transcriptomiques étant déjà disponible pour la communauté scientifique, des analyses informatiques pilotes ont déjà été performées pour étayer nos hypothèses.
Raffinement
La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales et la mise en place de points limites spécifiques et précoces. Pour l’ensemble des procédures chirurgicales, une supplémentation hydrique par injection sera effectuée en pré et post opératoire. Une analgésie pré et post opératoire sera réalisée le cas échéant. Pour la procédure d’infarctus du myocarde, le maintien au chaud de la cage sera effectué sur les 48h per-opératoire. Un renforcement de l’enrichissement par de la litière douce (cellulose) et du gel hydrique sera apporté. Le transport des animaux vers le site numéro 2 pour les échocardiographies sera effectué par un transporteur agrée. Les animaux seront dans des boites de transport contenant des croquettes, de l’hydrogel et du coton (ainsi que de la litière).
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour étudier les pathologies musculaires, car des modèles sont bien établis et récapitulent les pathologies chez l’homme. Le choix de l'espèce murine nous permet également d’avoir accès à des animaux génétiquement modifiés cruciaux dans l’étude précise des cellules d’intérêt de ce projet. La consanguinité des modèles utilisés permet une reproductibilité des résultats et une réduction du nombre d’animaux utilisés. Les souris seront âgées de 1 jour à 30 semaines, car nous étudierons ces pathologies chez le souriceau et à l’âge adulte.
Étude de la cardiomyopathie dilatée mitochondriale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Deux échocardiographies de vingt minutes sous anesthésie gazeuse, réparties sur un an : c'est tout ce que subissent, selon le protocole, 420 souris génétiquement modifiées, utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et toutes tuées à la fin pour analyse des tissus. Le projet porte sur la cardiomyopathie dilatée mitochondriale, première cause de transplantation cardiaque en France, et sur le rôle des mitochondries dans l'affaiblissement du muscle cardiaque. Le porteur écrit qu'aucune souffrance n'est attendue dans les modèles utilisés. Les modifications génétiques portées par ces souris ne sont décrites nulle part, pas plus que ce que 420 animaux permettraient d'établir et qu'un effectif moindre n'établirait pas, ce chiffre étant seulement rapporté à des "analyses préliminaires".
Objectifs
La cardiomyopathie dilatée est la cause la plus fréquente d'insuffisance cardiaque chez les sujets jeunes (18-45 ans) et la cause la plus fréquente pour la transplantation cardiaque en France. Il s’agit d’un affaiblissement du muscle cardiaque, résultant en une diminution de la contraction du cœur et donc en un manque d’oxygénation des organes. Malheureusement, il n'y a pas de thérapie efficace pour traiter la cardiomyopathie dilatée. Nous nous intéressons dans ce projet à l'impact des mécanismes de production d'énergie dans les cellules cardiaques par les mitochrondries et à leur impact dans la cardiopathie dilatée pouvant agraver ou améliorer la pathologie. Nous uilitserons pour ce faire des souris génétiquement modifiées.
Bénéfices attendus
Nous espérons mieux comprendre le rôle de différents mécanismes métaboliques impliqués dans la cardiomyopathie dilatée, afin à terme de proposer des thérapies pour cette maladie.
Procédures
Echocardiocardiographie non-invasive (20 minutes par souris, 2 fois maximum par souris sur un an). Anesthésie gazeuse (20 min par souris; 2 fois maximum par souris sur un an)
Impact sur les animaux
L'échocardiographie est réalisée sous anesthésie isoflurane, ce qui engendre un stress lors de l'induction de l'anesthésie et du réveil.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude pour analyser les tissus biologiques.
Remplacement
La caractérisation du rôle des différents gène étudiés chez la souris a d’abord été réalisée dans des modèles cellulaires, mais les modèles cellulaires ne permettent pas de représenter le fonctionnement du cœur dans son intégralité.
Réduction
Des analyses préliminaires ont permis de déterminer le nombre d'animaux par groupes suffisants pour pouvoir conclure en utilisant des tests statistiques adaptés. Un travail a été fait pour réduire les groupes contrôle.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel de l'animalerie, pour détecter un éventuel état de souffrance et/ou d’angoisse. Il n'est pas attendu de souffrance dans les modèles utilisés, toutefois, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Concernant l'échocardiographie, les souris seront anesthésiées, pour être capable de mesurer correctement les différents paramètres du système cardiaque et limiter le stress des animaux. Les souris seront maintenues en groupe, dans un milieu enrichi.
Choix des espèces
La conservation élevée des mécanismes physiopathologiques entre l'humain et la souris a été confirmée par de nombreuses études dans notre domaine de recherche. Les travaux sur souris sont plus largement décrits et les premiers tests que nous avons réalisés l'ont été dans cette espèce. Il apparaît donc plus pertinent de rester sur le modèle murin pour investiguer l’importance de ce processus in vivo et de pouvoir comparer nos travaux à ceux réalisés par d'autres équipes dans cette espèce. Nous étudierons les souris à l'âge adulte, pendant un an pour suivre le développement de la pathologie.
Impact de l’inhibition pharmacologique de la protéine BACH1 pour prévenir les lésions rénales ischémiques chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
La souche C57BL6 a été retenue parce que sa sensibilité à l'insuffisance rénale est jugée adéquate et bien documentée : 32 souris noires de 9 à 10 semaines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère pour 24 d'entre elles. Une chirurgie de 60 à 75 minutes bloque la circulation rénale pour provoquer la lésion. Suivent cinq jours d'administration orale deux fois par jour, deux incisions au bout de la queue pour recueillir quelques gouttes de sang, et 24 heures passées à deux dans une cage à sol grillagé pour collecter l'urine. Le porteur indique que le degré d'insuffisance rénale provoqué peut être incompatible avec la survie de l'animal dans moins de 20 % des cas, et fait dépendre l'ampleur de la lésion d'une mesure stricte de la durée d'ischémie.
Objectifs
La maladie rénale chronique (MRC) touche 3 millions de français(es). Elle se caractérise par une dégradation progressive de la fonction rénale. Chez ces malades, peu de stratégies sont réellement efficaces pour prévenir le déclin de la fonction rénale et éviter le développement d’une insuffisance rénale chronique terminale. La protéine appelée « Nrf2 » est un acteur essentiel des réponses cytoprotective et antioxydante. Un médicament innovant (la methyl bardoxolone), activateur de la voie de signalisation Nrf2 s’est ainsi révélé très efficace pour limiter la dégradation de la fonction rénale chez les sujets atteints de diabète. L’utilisation de cette molécule a toutefois démontré d’importants effets secondaires (tels l’augmentation des événements cardio-vasculaires) ce qui a amené à interrompre tous les essais cliniques en cours. Ces effets secondaires sont sans doute liés au manque de spécificité de la molécule testée. Nous pensons que si nous sommes capables plus sélectivement activer la voie Nrf2, sans activer d’autres voies de signalisation, nous pourrons protéger les reins sans pour autant augmenter le risque cardio-vasculaire. La protéine nommée « BACH1 » bloque en permanence la voie Nrf2 et cette voie seule. Nous souhaitons inhiber la protéine BACH1 pour augmenter de façon très spécifique l’activité de Nrf2. Nous avons choisi de tester un inhibiteur connu de BACH1 qui a déjà démontré son efficacité sur des modèles précliniques de maladies neurologiques. Nous souhaitons donc tester l’effet protecteur de cette molécule sur un modèle murin d’insuffisance rénale aigue.
Bénéfices attendus
La présente étude est une étude à caractère exploratoire. Si l’administration d’un inhibiteur de BACH1 se révèle efficace pour prévenir la défaillance rénale, d’autre études pourront être menées afin de mieux en préciser les déterminants et d’en mesurer le potentiel thérapeutique. Les inhibiteurs de BACH1 s’ils sont efficaces et dénués d’effets secondaires majeurs pourraient être intéressants pour prévenir les lésions rénales dans les situations telles que les chirurgies vasculaires majeures nécessitant l’arrêt de la circulation l’artère rénale, les chirurgies rénales (ablation de cancers rénaux par exemple). Ils pourraient entre outre être utilisés pour améliorer la conservation des greffons rénaux lors des transplantations rénales . Peu de stratégies de protection rénale sont disponibles et les inhibiteurs de BACH1 pourraient étoffer l’arsenal thérapeutique afin de limiter le développement de situations d’insuffisance rénale terminale.
Procédures
Les souris seront soumises à une chirurgie de 60-75 min réalisée sous anesthésie générale et analgésie préventive par administration de morphinique. La drogue testée sera administrée aux souris 2 fois par jours par voie orale. Les souris auront deux prélèvements de quelques gouttes de sang à la queue à J2 et J3 (durée
Impact sur les animaux
La lésion rénale sera induite au cours d’une chirurgie de 60-75 min sous anesthésie générale. Cette chirurgie peut être à l’origine de douleurs post-opératoires qui devront seront contrôlées par l’administration de morphiniques. Le degré d’insuffisance rénale induite par la chirurgie peut être incompatible avec la survie de l’animal (
Devenir
La procédure nécessite à l'issue du protocole la collecte de sang et des reins afin d'en étudier les dommages et ainsi de caractériser l'effet protecteur de la molécule testée. Ceci ne peut se faire qu'après l'euthanasie de l'animal. Tous les animaux seront donc euthanasiés à l'issue de la procédure.
Remplacement
Les mécanismes impliqués dans le développement des maladies rénales sont multifactoriels et mettent en jeu plusieurs tissus et plusieurs systèmes biologiques. Un modèle alternatif ne permettrait pas de répondre à notre question scientifique. Une étude clinique chez l’homme n’est pas envisageable à ce stade, car il est impossible d’administrer la molécule testée, qui pour l’instant aucune autorisation d’utilisation chez l’homme. Nous souhaitons réaliser une étude préclinique afin d’évaluer le potentiel pharmacologique et thérapeutique de cette molécule. L’étude de l’effet l’administration d’inhibiteur de BACH1sur le développement et la progression de la maladie rénale ne peut donc, à ce jour, se faire sans l’aide d’un modèle animal.
Réduction
La molécule que nous souhaitons évaluer dans le présent projet jamais été testée dans le cadre des maladies rénales. Nous avons donc pris les dispositions nécessaires pour éviter le double emploi de notre procédure. Le nombre de souris par groupe a été calculé au plus juste sur la base des données obtenues dans la littérature afin de garantir une puissance statistique maximale. Un seul groupe contrôle (animaux insuffisants rénaux ne recevant pas de traitement) sera utilisé comme comparateur des 2 expériences réalisées (prévention et traitement) afin de limiter le total nombre d’animaux utiliser. La moitié de ce groupe recevra l’administration du véhicule selon les modalités du groupe “traitement” tandis que l’autre moitié le recevra selon les modalités d’administration du groupe “prévention”. Si aucune différence statistique n’est observée entre ces 2 sous-groupes ils seront rassemblés en un groupe contrôle unique. Un maximum de tissus seront récoltés lors de l'euthanasie des animaux puis stockés. Ces tissus seront disponibles pour répondre à d’autres questions qui pourront émerger suite à l’obtention des premiers résultats et pourront également être partagés avec d’autres équipes. Nous avons choisi un modèle animal qui permet d'évaluer l'efficacité de ce médicament sur un délai très court (6 jours) et de choisir la meilleure modalité de traitements (prévention ou traitement). Les meilleures conditions d’utilisation pourront être appliquées à des études ultérieures de plus longue durée étudiant par exemple de la transition de l’insuffisance rénale aigue à l’insuffisance rénale chronique.
Raffinement
La randomisation et répartition en cage seront effectuées à la réception des animaux afin de ne pas remanier les groupes sociaux constitués par cage et de limiter l'agressivité entre mâles d'une même cage (maintien des hiérarchies). Une période d'acclimatation de 2 semaines sera mise en place avant le début la procédure expérimentale afin de permettre un temps d'habituation aux conditions d’hébergement et de diminuer le stress lié au transport et/ou aux changement des conditions d'hébergement. La chirurgie sera réalisée selon un protocole optimisé associant anesthésie générale, analgésie préventive à l'aide d'un morphinique et anesthésie locale des sites opératoires. Un système de scoring sera mis en place pour l'évaluation post-opératoire des animaux. Une inversion de l'anesthésie sera réalisée à l'issue de l'intervention afin de favoriser la récupération des animaux anesthésiés. Afin de limiter le stress lié à l’immobilisation pour les administrations orales, les animaux seront préalablement habitués pendant 2 jours à la contention (J-2 et J-1). Les souris recevront le médicament testé par voie orale, 2 fois par jour (à 9h00 et 14h00). Le médicament sera administré à l'aide d'une pipette préalablement trempée dans une solution sucrée (pour la rendre appétissante pour l’animal et favoriser la déglutition). Un volume faible (0.1 mL) sera administré à chaque administration en accord avec les recommandations en vigueur. L’administration orale n’étant pas scientifiquement indispensable dans le groupe contrôle, les animaux de ce groupe n’y seront pas soumis. Les souris seront placées deux par deux dans des cages métaboliques pour réduire le stress lié à l’isolement et au changement d’environnement. Une période d’habituation de 30 minutes à ce nouvel environnement sera réalisée un ou deux jours auparavant pour limiter encore davantage le stress des animaux. Les prélèvements de sang à la queue de l'animal seront réalisés en contention légère après application d’une pommade anesthésique.
Choix des espèces
Les expériences seront réalisées chez la souris car il s'agit d'un modèle classique d'insuffisance rénale. Le degré d'insuffisance rénale atteinte est directement lié à la durée du clampage (fermeture) des pédicules rénaux et est très bien documenté dans la littérature, ce qui nous permet de parfaitement calibrer nos expériences. Il existe de grandes différences de sensibilité à l'insuffisance rénale entre les différentes souches de souris. Les différentes souches de souris sont plus ou moins sensibles à l'insuffisance rénale. Nous avons donc choisi de travailler sur une souche de souris (C57BL6, souris noires) qui présente une sensibilité adéquate et dont le développement d’une insuffisance rénale est très bien documenté. La plupart des études sur l’ischémie rénale utilisent de jeunes souris adultes de 8-12 semaines. Des différences d'âge de plus d'une semaine peuvent entraîner des différences détectables dans les lésions rénales. Nous utiliserons donc des animaux adultes de 9-10 semaines en limitant la différence d’âge à l’induction de l’insuffisance rénale (différence
Biodistribution de resvératrol marqué à l’oxygène
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
440 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour que leurs organes soient prélevés, et 165 d'entre elles subiront dix gavages étalés sur douze jours quand d'autres n'en subiront qu'un seul. Chaque gavage dure moins d'une minute et peut irriter l'œsophage au point de faire perdre du poids à l'animal. L'objet est de savoir où va le resvératrol une fois ingéré et comment l'organisme le transforme, le porteur affirmant devoir travailler sur un "organisme entier". Le bénéfice qu'il annonce reste méthodologique et conditionnel, la technique de marquage "pourrait être appliquée à d'autres composés".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de savoir dans quels organes se retrouve un composé dont les propriétés de neuroprotection ont déjà été démontrées une fois qu’il a été ingéré par l’animal. Ce projet nous permettra aussi de comprendre comment ce composé est dégradé, transformé par l’organisme et comment il agit ce qui, à ce jour, n’est pas complètement identifié.
Bénéfices attendus
Le développement de la nouvelle méthode de marquage associée à l’imagerie que nous proposons permettrait de déterminer la nature et la localisation du resvératrol et de ses métabolites. Cette méthode pourrait être appliqué à d’autres composés.
Procédures
Gavage sur animal vigile : 165 souris, 1 fois. Gavage sur animal vigile : 55 souris, 1 fois par jour sur 2 jours. Gavage sur animal vigile : 55 souris, 1 fois par jour sur 5 jours, pause de 2 jours, puis 1 nouveau gavage. Gavage sur animal vigile : 165 souris, 1 fois par jour sur 5 jours, pause de 2 jours, puis 1 fois par jour sur 5 jours. Un gavage dure moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Possible perte de poids liée à une irritation de l’œsophage à cause du gavage. Stress lié à la contention au moment du gavage.
Devenir
Les animaux seront mis à mort car nous souhaitons ensuite analyser les organes prélevés.
Remplacement
Les composés seront vérifiés et validés avant d’être administrés aux animaux. Cependant nous souhaitons connaitre le comportement des composés une fois ingéré par l'animal (où va-t-il ? dégradation ?), pour cela nous devons travailler sur un organisme entier.
Réduction
Seuls les composés validés in vitro seront testés. Si les résultats obtenus avec les premiers composés testés ne sont pas concluants, nous n'irons pas plus loin. Sur les échantillons prélevés nous prévoyons de faire des analyses qui nous permettront de mieux comprendre le mécanisme d’action des molécules.
Raffinement
Les souris seront suivies quotidiennement par le personnel de l’animalerie ainsi que par les expérimentateurs en suivant des critères bien définis. En cas de souffrance des mesures conservatoires seront mises en place pour soulager l'animal. Si l'état de l'animal ne s'améliore pas alors il sera euthanasié. Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel, maison, paille) sur un portoir filtrant.
Choix des espèces
Des travaux précédents ont déjà été réalisés avec ce composé. Afin d’avoir un point de comparaison et positionner la méthode que nous avons développer nous travaillerons dans les mêmes conditions que nos prédécesseurs. Pour cela nous utiliserons la souris à l’âge adulte de 8 semaines. A cet âge les souris ont une taille raisonnable qui facilite leur manipulation diminuant ainsi le stress lié à leur manipulation.
Administration d’un agoniste de l’hormone de libération de l’hormone lutéinisante (LHRHa) pour la synchronisation de l’oestrus chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
Toute femelle dont l'inconfort ne pourra pas être soulagé rapidement sera mise à mort, le point limite est posé d'emblée. 40 souris femelles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour la moitié et modéré pour l'autre, 20 tuées à l'issue et 20 réutilisées après quinze jours de repos. Elles reçoivent deux injections hormonales à 24 heures d'intervalle pour synchroniser leur cycle, et 20 d'entre elles subissent une chirurgie de transfert d'embryons de cinq minutes sous anesthésie. Les souriceaux qui naîtront de ces transferts seront tués à dix jours, le porteur indiquant ne pas pouvoir s'en servir. La finalité est logistique : valider une méthode qui diviserait par sept ou huit le nombre de femelles gardées en stock pour les activités de service de l'animalerie.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de tester une nouvelle méthode, appelée synchronisation, afin de générer des femelles souris en pseudogestation. Nous avons besoin de femelles en pseudogestation pour effectuer des transferts d'embryons. Cette technologie de reproduction est essentielle pour la production de nouvelles souches animales et le maintien des ressources génétiques. Le transfert d'embryons est couramment utilisé dans nos laboratoires et animaleries dans diverses applications : redérivation de souches de souris, revitalisation d'embryons congelés et de spermatozoïdes congelés par fécondation in vitro (FIV). Pour générer ces futures mères-porteuses, l'accouplement des femelles est possible uniquement dans la phase d'acceptation du mâle, une phase bien précise du cycle de reproduction de la souris. Il faut donc pouvoir identifier cette période. Actuellement, la technique utilisée pour générer de futures mères-porteuses c'est le tri visuel. Elle est très connue, mais chronophage et nécessite l'utilisation de nombreux animaux. On regarde chaque souris individuellement pour déterminer la période de son cycle et ainsi déterminer les femelles prêtes à s'accoupler. Tous les centres de recherche utilisent cette technique pour obtenir des mères-porteuses. La nouvelle technique que nous souhaitons tester consiste à injecter aux souris femelles une hormone pour synchroniser leur cycle. Ainsi, quatre jours après l'injection, toutes les femelles seront en phase d'acceptation du mâle, propice à l'accouplement. Ces femelles seront accouplées avec des mâles vasectomisés pour générer des femelles en pseudogestation. On souhaite valider cette technique afin de la mettre en application en routine dans notre laboratoire, ce qui nous permettrait sans altérer la qualité de nos prestations de réduire drastiquement le nombre d'animaux en stock.
Bénéfices attendus
Nos objectifs sont d'évaluer la technique de synchronisation dans un lot de souris femelles, en déterminant l'efficacité de celle-ci dans nos procédures de routine par rapport au tri manuel et visuel des femelles dans un grand groupe de femelles. On cherche à valider cette technique dans notre laboratoire pour considérablement réduire le nombre de femelles nécessaires en stock (de l'ordre de 7-8 fois moins). De plus, le nombre de mâles vasectomisés nécessaire sera aussi,considérablement réduit car les rendements attendus seront meilleurs. La technique contribue donc aux 3R en réduisant le nombre d'animaux et en affinant la technique d'obtention de pseudo-gestantes.
Procédures
Les souris recevront 2 injections sous contention rapides de 5 secondes, à 24h d'intervalle, visant la synchronisation. Puis certaines, (maximum 20) auront une chirurgie de transfert d'embryons (5 minutes) sous anesthésie et analgésie. Ces dernières recevront 3 injections pour induire l'anesthésie/analgésie, dont 2 sous contention rapide de 5 secondes et une lorsqu'elle dormiront encore afin de limiter le stress de l'animal.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent présenter un léger stress de courte durée lors de la contention pour pratiquer les injections. Une petite douleur peut être ressentie par l'animal lors des injections (hormone de synchronisation, antalgique et anesthésique). Les points de surveillance pour les injections sont les suivants (cas très rares) : rougeur, gonflement, traces de griffures si l’animal se gratte au site d'injection. Les animaux opérés pour le transfert d'embryons (acte chirurgical), sont anesthésiés et reçoivent un traitement antalgique efficace pour limiter au maximum les nuisances. Les points de surveillance pour ce type de chirurgie sont l'apparence de l'animal (état du poil, mimiques faciales...), son comportement (mobilité, éveil...), l'aspect du site de chirurgie (rougeur, gonflement, écoulement, automutilation...). Ce sont, là encore, des cas très rares, car nous avons une grande expérience de ce type de procédures.
Devenir
Les femelles pseudogestantes sur lesquelles sera pratiqué un transfert d'embryons par chirurgie seront mises à mort à l'issu des tests afin d'enregister les données nécessaires à l'analyse de cette étude. Les animaux nés issus des transferts d'embryons, seront mis à mort à 10 jours puisque nous ne pouvons pas nous en servir pour nos diverses activités de service. Les femelles pseudogestantes qui ne présentent pas de bouchon vaginal ou non utilisées en transfert d'embryons seront remises en stock afin de les utiliser pour d'autres activités de service après une période de repos de 15 jours.
Remplacement
Pas d’autre possibilité que le recours à l’animal vivant pour l'analyse de la synchronisation du cycle oestral sur le bon déroulement de la production de la pseudogestation, puis sur la chirurgie de transfert d'embryons, de la gestation et des naissnces de nouveaux-nés.
Réduction
La production de souris femelles pseudogestantes avec le tri manuel des femelles en proestrus et les transfert d'embryons sont des techniques bien connues. Il existe bon nombre de données témoins. Ainsi, nous avons uniquement besoin de faire des groupes expérimentaux pour la production de femelles pseudogestantes avec la synchonisation. Nous avons choisi un effectif de 40 femelles réparties en 4 lot de 10 femelles pour chaque expérience de synchronisation. Parmi ces 40 femelles, seulement 5 maximum par lot, soit 20 femelles au total seront anesthésiées et subiront un transfert d’embryons par chirurgie. Ces effectifs ont été calculés afin d'obtenir des résultats suffisamment robustes pour l'analyse de l'effet de la synchronisation.
Raffinement
Le personnel en charge de cette étude est habitué à ces gestes techniques car ils sont pratiqués en routine depuis des années dans notre laboratoire. Les femelles restent sous surveillance après leurs injections afin d’observer aucune apparence physique externe de souffrance. Lors de la chirurgie de transfert d'embryons, les animaux sont anesthésiés et reçoivent un traitement antalgique adapté à ce type de procédure. Du gel oculaire est placé systématiquement sur les yeux des animaux anesthésiés afin de prévenir tout dommage de la cornée de l’animal. De plus, les animaux anesthésiés sont placés sur une plaque chauffante pour pallier toute déperdition de chaleur liée à l’anesthésie. Une injection conjointe de sérum physiologique tiédi sera réalisée pour compenser les éventuelles pertes hydriques liées à la chirurgie et limiter la déperdition de chaleur. Cette compensation a pour objectif de permettre aux animaux une récupération idéale post chirurgie. Les animaux opérés restent en observation jusqu’à leur complet réveil en bonne forme. Des enrichissements sont mis à disposition dans la cage des futures mères lors de leur convalescence et gestation (nids et croquettes). Les femelles en stock seront hébergées en groupe pour leur permettre de garder un lien social. Comme il s'agit ici d'un test de validation d'une technique, si une douleur ou un inconfort est détecté sans pouvoir la soulager rapidement et efficacement, la femelle sera mise à mort.
Choix des espèces
Les rongeurs sont de petits mammifères à reproduction rapide qui sont très largement utilisés par la communauté scientifique. Ils sont de très bons modèles expérimentaux puisque 99% de leurs gènes présentent un gène homologue chez l'Homme. Nous voulons générer des souris pseudo-gestantes pour être mères-porteuses. Il faut donc des femelles et qu'elles soient en âge de procréer soit entre 9 semaines et 6 mois. Pour chaque lot, les femelles auront un âge variable, comme lors de nos activités de service, sans incidence sur les expériences.
Mise au point de techniques d’imagerie et de spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire in vivo chez le rongeur sain
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Rats : 50
Trois à quatre séances d'IRM de deux heures chacune, sous anesthésie gazeuse, avec injection d'un produit de contraste : 50 souris et 50 rats en bonne santé passent par ce protocole, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le projet ne porte sur aucune maladie, il sert à mettre au point des séquences d'imagerie, et le porteur annonce comme retombée de "faire progresser les recherches de nos partenaires et de nos clients". Il décrit cette imagerie comme non invasive, indolore et sans nuisance attendue, tout en programmant la mise à mort de chaque animal. Le seuil qui la déclenche n'a rien de médical : les rats sont tués quand ils atteignent 500 grammes et les souris 45 grammes, poids au-delà desquels ils ne rentrent plus dans l'appareil disponible en routine.
Objectifs
Un modèle animal permet d’étudier dans des conditions contrôlées de laboratoire les causes, les processus et les traitements éventuels d’une pathologie. Il doit présenter des similitudes avec la pathologie humaine correspondante en termes de symptômes et de mécanismes physiopathologiques. Une grande partie des connaissances en biochimie, physiologie ou pharmacologie ont été acquises grâce à l’étude des modèles animaux. Dans ce contexte, l’imagerie et la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) sont des techniques d’investigation non irradiantes, non invasives, n’entrainant pas de douleur ou de souffrance chez l’animal anesthésié. L’application de ces méthodes in vivo chez le petit animal permet la caractérisation et la compréhension de modèles de pathologies, tant d’un point de vue anatomique que fonctionnel. Elle permet également la validation préclinique de nouvelles molécules à visée thérapeutique et l’étude des mécanismes d’action de médicaments actuellement utilisés. Le premier avantage de l’imagerie RMN in vivo est la possibilité de suivre des phénomènes biologiques complexes chez un animal au décours de sa pathologie et donc d’utiliser moins d’animaux que lors d’approches in vivo invasives. Le second avantage de l’imagerie RMN in vivo tient au fait que les technologies utilisées (aimants RMN, produits de contraste) sont identiques à celles utilisées chez l’Homme, permettant ainsi une recherche biomédicale translationnelle. Or la mise au point de cette approche nécessite régulièrement de nouvelles séquences d’acquisition et méthodologies qui doivent être développées, évaluées et optimisées sur des animaux avant d’être applicables dans des projets de recherche. Ainsi les objectifs principaux du projet mené sur des rongeurs sont : • d’optimiser les paramètres d’acquisition de séquences existantes afin de les adapter au mieux au modèle biologique et à ses spécificités ; • de développer et mettre au point de nouvelles techniques d’imagerie et de spectroscopie RMN.
Bénéfices attendus
Le développement et la validation de nouvelles méthodes en imagerie et spectroscopie RMN contribuent à faire progresser les recherches de nos partenaires et de nos clients
Procédures
L’examen RMN est effectué sur un équipement dédié aux investigations chez le rongeurs sous anesthésie . Les animaux sont placés dans un système permettant de les réchauffer et de suivre leurs constantes physiologiques (température, fréquence respiratoire) pendant les 2h que dure l’IRM. Nous estimons que 3-4 examens RMN sous anesthésie seront réalisés sur un animal au cours du projet, avec un intervalle minimum d'une semaine entre 2 anesthésies.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont celles liées à l'injection d'un produit de contraste (réduites car l'injection est effectuée sous anesthésie). Aucune nuisance liée à l'imagerie in vivo n'est attendue.
Devenir
Les animaux seront utilisés pour plusieurs examens IRM, ils seront mis à mort lorsqu'ils auront atteint un poids de 500 G pour les rats et 45 G pour les souris (poids limite compatible avec nos équipements RMN disponibles en routine).
Remplacement
Avant d’être appliqués dans le cadre de pathologies d’intérêt, les développements méthodologiques et instrumentaux dédiés à l’imagerie in vivo du petit animal doivent être validés in vivo.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux: - dans la mesure du possible, un maximum d’étapes nécessaires au développement méthodologique et instrumental sera réalisé sur fantôme ; - les animaux ayant subi une anesthésie gazeuse seront utilisés pour plusieurs examens RMN. Chaque examen sera espacé d’au moins 1 semaine. Un animal pourra être évalué plusieurs fois jusqu’à ce qu’il ait atteint un poids de 500g pour les rats et 45g pour les souris, poids limites compatibles avec les équipements RMN disponibles en routine. Aucune analyse statistique n’est envisagée en routine pour les validations des développements méthodologiques. Cette validation sera appréciée par la capacité à répondre à la question posée et la reproductibilité de la méthode sera évaluée chez 3-5 animaux.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés pendant une période suffisante lors de leur arrivée. Ils seront hébergés en milieu enrichi (social et environnemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress, dans une pièce thermorégulée ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; changement de litière 1 fois par semaine. Il faut considérer que les animaux seront habitués à être manipulés par l’expérimentateur et observés quotidiennement, ce qui permet de déceler des signaux de stress, de douleur ou d'inconfort. L’IRM est non invasive et effectuée sous anesthésie et suivi physiologique continu : installation de l'animal dans un berceau dédié avec suivi en continu de la température corporelle (utilisation d’un système de chauffage intégré dans le berceau dont la température est contrôlée et adaptée en fonction de la température de l’animal) ; monitoring de la fréquence respiratoire pendant toute la procédure (ce qui permet d'adapter la profondeur d'anesthésie). Ce monitoring permet de déceler un problème (fréquence respiratoire irrégulière et en baisse, température en baisse malgré le chauffage), ainsi l'acquisition peut être interrompue avant l'atteinte des points limites définis pour l'imagerie, l'anesthésie arrêtée et l'animal réveillé sous surveillance de l'expérimentateur.
Choix des espèces
Un modèle animal permet d’étudier dans des conditions contrôlées de laboratoire les causes, les processus et les traitements éventuels d’une pathologie. Il doit présenter des similitudes avec la pathologie humaine correspondante en termes de symptômes, de mécanismes physiopathologiques et/ou de traitements. Le rat et la souris sont très souvent utilisés comme modèle. Les modèles rongeur de pathologies sont obtenus par des méthodes physiques, chimiques et pharmacologiques ou par sélection de lignées spécifiques. De nombreux modèles génétiquement modifiés ont également été obtenus par ajout ou retrait de gènes (souris knock-in ou knock-out). Finaliser le développement et/ou la mise au point les méthodes RMN in vivo chez l’animal permettra de réaliser les expérimentations dans des conditions similaires aux futures études. Travailler chez le rat ou la souris offre la possibilité de confronter nos résultats avec une littérature abondante. Au début des expérimentations, les rats et les souris sont utilisés au stade de jeune adulte avec des poids de 200-250 g et 16-20g, respectivement. Au vu du caractère non invasif de la RMN, les animaux anesthésiés pourront être utilisés plusieurs fois et serviront à la validation de plusieurs procédures. Cependant, pour des contraintes matérielles (optimisées pour des rats d’un poids < 500 g et des souris d’un poids < 45 g) et pour nous affranchir des biais dus à des changements dans le métabolisme qui se développeraient plus tard dans la vie de l’animal, les rats seront utilisés jusqu’à ce qu’ils atteignent un poids de 500g et les souris un poids de 40-45g. Avant l'atteinte de ces poids limites, nous estimons à 3-4 anesthésies à l’isoflurane par animal avec un intervalle d’au moins 1 semaine entre chaque évaluation.
Exploration génétique de tumeurs dérivées de patient (PDX) en vue de déterminer la réponse thérapeutique
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour identifier les gènes dont l'inactivation freine le cancer du sein triple négatif, 180 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse post-mortem. Des cellules tumorales prélevées sur une patiente, modifiées par CRISPR, leur sont greffées dans la glande mammaire pendant une anesthésie d'une heure, puis la tumeur est mesurée au pied à coulisse au fil de sa croissance. Une partie reçoit en plus une combinaison de chimiothérapies. Le porteur annonce une douleur qui peut persister à mesure que la tumeur se développe et une perte de poids pouvant atteindre 20 % du poids normal, avec mise à mort dès l'atteinte d'un point limite fixé sur la taille de la tumeur.
Objectifs
Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent et la première cause de décès par cancer chez la femme en France. Bien que la prévention et de nouvelles options thérapeutiques aient amélioré son prognostique, des phénomènes de résistance aux traitements et l’évolution métastatique de cette pathologie justifient la recherche de nouveaux traitements. Il est aujourd’hui possible de déterminer quels sont les gènes qui sont essentiels à la viabilité d’une cellule et d’en déduire ainsi quelles sont les protéines dont la manipulation par de petits composés chimiques pourrait constituer une approche thérapeutique. Cette investigation repose sur l’outil CRISPR/Cas9 (Prix Nobel de chimie 2020 à J. Doudna & E. Charpentier) qui permet d’interroger si un gène est nécessaire pour la survie d’une cellule dans le contexte d’intérêt. Notre objectif est d’appliquer cette technique aux transplantations de tumeurs humaines (PDX). Les PDXs sont actuellement parmi les modèles les plus proches des tumeurs des patients et permettent ainsi la réalisation d’études dont le potentiel prédictif clinique est très élevé. Ce projet devrait donc permettre de prédire la réponse thérapeutique des cancers du sein.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de déterminer les gènes dont le ciblage pourrait présenter un intérêt thérapeutique sur une variété de modèles de cancer du sein. Nos premiers efforts se concentreront sur le sous-type de cancer du sein pour lequel les besoins thérapeutiques sont les plus importants (tumeur triple négative) mais sera ensuite étendu à d’autres sous-types si les résultats sont prometteurs. Les gènes seront initialement identifiés par un criblage génétique, cette technique permet de questionner l’essentialité (contribution à la viabilité) de nombreux gènes en une seule expérience. Les candidats les plus intéressants seront ensuite validés un par un. Cela ouvrira potentiellement la voie à une étude clinique.
Procédures
Dans le lot d’animaux concerné par cette demande, un ensemble de cellules tumorales issues du cancer du sein d’une patiente et modifiée génétiquement pour avoir un gène unique inactivé sera injecté dans la glande mammaire d’animaux anesthésiés et sous traitement analgésique (durée de l’anesthésie estimée à 60 min ). Les animaux seront ensuite suivis et la taille de la tumeur sera mesurée grâce à un pied à coulisse . Pour un sous-ensemble des animaux inclus dans cette étude, les animaux seront traités par une combinaison d’agents chimio-thérapeutiques à des doses n’entrainant pas d’effet adverse chez la souris.
Impact sur les animaux
Les principaux gestes qui seront effectués sur les animaux impliquent la greffe de cellules humaines dans la glande mammaire. Les nuisances attendues sont la douleur liée à l’intervention chirurgicale au niveau de la glande mammaire L'ensemble de la procédure peut entraîner une douleur modérée, qui peut persister au stade suivant du développement de la tumeur et une perte de poids ne dépassant pas 20 % du poids corporel normal.
Devenir
Les souris seront mises à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Nous effectuons des criblages génétiques sur lignées cellulaires et organoïdes afin de limiter au maximum le recours aux animaux. Toutefois, en raison de l’importance des interactions avec le microenvironnement, l’étude de la progression tumorale dans un contexte aussi proche que possible de celui du patient reste une phase indispensable pour passer rapidement aux essais cliniques impliquant des patients.
Réduction
Nous avons fait des expériences pilotes avec nos collaborateurs pour déterminer le nombre minimum de souris nécessaire pour obtenir des résultats significatifs et reproductibles . En pratique, une expérience pilote a été menée pour déterminer le nombre de souris nécessaire à ce que la représentativité de la librairie soit maintenue. En d’autres termes, c’est le nombre minimum de souris pour qu’aucun gRNA soit aléatoirement perdu. Nous avons pu établir que 5 souris par réplica sont nécessaires pour la librairie que nous souhaitons utiliser. La librairie a été réduite au maximum pour ne cribler que les gènes susceptibles d’être pertinent thérapeutiquement.
Raffinement
Pour le bien-être des animaux, les procédures techniques seront limitées au strict nécessaire. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et avec recours aux analgésiques. Dans le cas où un animal présenterait des signes d'inconfort ou de douleur au cours de l'expérience, des analgésiques seront administrés. De plus, nous avons établi des points d'arrêt très précoces pour chaque expérience, en terme de taille de tumeurs, qui nous permet néanmoins de répondre à notre question scientifique. Une grille de score permettra d’évaluer de façon objective, l’état des animaux. Dès l’atteinte d’un point-limite, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Un des problèmes du traitement des cancers est l’existence de cellules résistantes aux traitements et leur apparition en cours de traitement. Le projet a pour but d’identifier les gènes nécessaires au développement tumoral pouvant être des cibles thérapeutiques. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours (culture in vitro, organoïdes), l’utilisation du modèle souris, espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie, reste indispensable pour récapituler pleinement l’environnement tumoral. Les lignées murines immunodéficientes permettent la transplantation de cellules d’un individu d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris), sans provoquer de rejet de la greffe. Ces xénogreffes de tumeurs de patients récapitulent remarquablement bien les tumeurs humaines et constituent donc un modèle idéal pour l’étude des gènes impliqués dans la progression tumorale Des souris adultes pubères de 6 à 10 semaines seront incluses dans les procédures expérimentales, après le développement du tissu épithélial mammaire. Ce choix est justifié par le fait que le cancer du sein touche principalement la femme adulte (99%).
Elevage et maintien d’une lignée murine à phénotype dommageable
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Poinçonnage des phalanges puis amputation de l'extrémité de la queue, à dix jours de vie et à quelques secondes d'intervalle : 375 souris nées porteuses d'une mutation de la sclérose latérale amyotrophique passent par là, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 347 d'entre elles et sévère pour 28. Ces 28 souris deviendront paralysées d'un ou plusieurs membres vers 110 jours et vivront entre 130 et 150 jours. Il s'agit de croiser deux lignées existantes pour obtenir un modèle où certaines zones du cerveau se voient en imagerie. Le porteur écrit que tous les animaux seront gardés en vie à la fin de la procédure, puis détaille le contraire : 84 souris partent vers une autre animalerie, les 291 restantes sont exploitées pour l'élevage et tuées à 100 jours au plus tard.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), également appelée maladie de Charcot, provoque chez les patients atteints une atrophie musculaire et/ou des contractions musculaires involontaires. A ce jour, il n'existe aucun traitement qui guérit de la SLA, ils prolongent uniquement le temps de vie du patient. L'objectif du projet est de créer une lignée de souris atteinte de la SLA avec des marqueurs du cerveau visibles au colorant en imagerie afin d’explorer les altérations observées aux stades précoces de la maladie et de découvrir de nouveaux marqueurs de cette maladie. Nous produirons donc cette nouvelle lignée de souris en croisant 2 autres lignées existantes : la lignée présentant les symptomes de la maladie et une lignée permettant de marquer des zones du cerveau au colorant. Ce croisement permettra d'étudier un modèle de la maladie avec des zones du cerveau observable en imagerie à trois stades de développement précoces.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'identifier des altérations au niveau de plusieurs zones du cerveau à un stade précoce de la SLA et de voir à quel stade de la maladie ces altérations apparaissent et à quel niveau. Ces résultats pourraient permettre de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques prometteuses pour le traitement de la SLA.
Procédures
375 souris seront porteuses de la maladie à leur naissance mais seulement 28 développeront certainement les premiers symptômes de la maladie. Elles deviennent paralysées d'un ou plusieurs membres vers 110 jours et ont une durée de vie d'environ 130 à 150 jours. Ces animaux devront être identifiés par tatouage et prélevé à la queue à 10 jours pour vérifier la présence de la maladie. L'identification et le prélèvement sont réalisés sur l'animal vigile, composées de deux actes techniques invasifs : - Le tatouage par poinçonnage des phalanges et/ou des coussinets : réalisé une fois, durée d'une minute maximum - La biopsie de queue qui consiste en l’amputation de l’extrémité de la queue : réalisée une fois, durée de 3 secondes maximum.
Impact sur les animaux
Les souris seront porteuses de la maladie à leur naissance. Ces animaux vont présenter des altérations motrices : ils deviennent paralysés d'un ou plusieurs membres à partir de 110 jours. Les mâles atteints de la maladie sont plus agressifs que la moyenne. Une procédure de génotypage et d'identification est nécessaire pour connaitre le génotype des animaux produits. L'identification est réalisée par tatouage des phalanges, et le génotypage par biopsie de queue. Chacun de ces actes à lui seul n'induit pas de douleur, mais le cumul des 2 actes de manière très rapprochée (quelques secondes d'intervalle) peut induire un inconfort léger et transitoire pour l'animal âgé de 10 jours.
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de la procédure (sauf ceux présentant des points limites). 84 animaux seront transférés dans une autre animalerie pour observer les altérations dans le cerveau : 28 animaux à 40 jours, 28 à 70 jours et 28 à 110 jours. Le reste des animaux (291 animaux) seront utilisés pour l'élevage et mis à mort par la suite à 100 jours maximum.
Remplacement
Il n’existe actuellement pas de méthode alternative permettant de remplacer l’utilisation de souris car ce projet repose sur l’évolution de la maladie (SLA), à des stades pré-symptomatiques. Les mécanismes de cette maladie ne sont pas encore suffissamment connus pour permettre d'autres modelisations.
Réduction
Les plans d'élevage sont prévus au plus précis afin de ne pas surproduire d'animaux. La majorité des animaux sont utilisés soit en expérimentation soit en renouvellement de géniteur. De plus, le nombre d'animaux optimal utilisé pour chaque lot a été déterminé à l'aide de test statistiques. Ce nombre a été réduit au minimum afin de pouvoir produire suffissamment pour l'expérimentation tout en pouvant obtenir des résultats exploitables, et comparable avec des travaux antérieurs.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cages collectives. Les identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel approprié, stérile, permettant de limiter les infections et d’effectuer un geste rapide et précis. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle calme loin des autres animaux afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les animaux sont remis en présence de leur mère dans des cages collectives enrichies : maison rouge, nid, baton à ronger. Le personnel effectue un contrôle visuel des animaux identifiés et génotypés dans l’heure qui suit la réalisation des gestes, le lendemain puis quotidiennement. Les mâles atteints de la maladie sont connus pour être agressifs envers leurs congénères, nous les hébergerons donc par 3 maximum au lieu de 4 avec un bâton à ronger chacun. Des critères pour évaluer la souffrance des animaux sont mis en place au sein de l'animalerie. Une grille de critères a été établie spécifiquement pour les signes cliniques de la SLA à partir de 3 mois.
Choix des espèces
La souris est un modèle dont le génome est parfaitement connu. Le choix de l'espèce est lié au fait que le modèle de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) n'existe que chez la souris, tout comme le modèle permettant le marquage de différentes zones du cerveau. Afin d'observer les caractéristiques des altérations précoces au sein de la SLA, des animaux vont être utilisés à différents stades de développement : - entre 35 et 45 jours - entre 65 et 75 jours - entre 100 et 110 jours : apparition des premiers symptômes.
Etude de l’expression d’un gène impliqué dans la régulation de l’autophagie après induction d’une inflammation
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection unique de composé pro-inflammatoire, dès le huitième jour de vie pour une partie d'entre elles, ce qui suppose de les séparer de leur mère, et certaines subissent une chirurgie sous anesthésie sans jamais se réveiller. État fébrile passager, hypothermie légère et baisse de mobilité sont attendus. Le lien annoncé avec les troubles du spectre autistique reste lointain, le porteur renvoyant à de futurs tests précliniques l'évaluation de molécules modulant l'autophagie, et il affirme sur le remplacement que l'étude du comportement "ne peut se faire autrement" qu'in vivo.
Objectifs
Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 44 aux Etats-Unis pour l'année 2018 et 1 enfant sur 89 en Europe. Les troubles du spectre autistique se caractérisent notamment par une perturbation du comportement social. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. L’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Par ailleurs, la complexité des troubles neurodéveloppementaux suggère l’implication de combinaison de type « gènes x environnement ». La littérature scientifique indique ainsi qu’une exposition à des composants environnementaux, notamment pro-inflammatoires, à des stades précoces du développement du cerveau, est impliquée dans la survenue de troubles du développement. Parmi les facteurs environnementaux potentiellement à risque, nous étudions les conséquences d’une stimulation inflammatoire auquel l’individu serait exposé dans les premières semaines de vie, par la mise en place d’un protocole pro-inflammatoire classiquement décrit dans la littérature. Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier entre autres l’expression d’un gène impliqué dans la régulation de l’autophagie et de l’inflammation. Notre projet est complémentaire du travail en cours et permettra d’obtenir des données originales.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie en combinaison avec une exposition précoce à des composés pro-inflammatoires dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale (les troubles du spectre autistique concernent 1 enfant sur 36 aux USA en 2020, 1/44 en 2018, 1/69 en 2012). A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant l’autophagie pour atténuer la survenue de ces troubles.
Procédures
Une injection unique de composé pro-inflammatoire (durée du geste d’environ 10 secondes). Une chirurgie sans réveil (sous anesthésie et analgésie) de moins de 5 minutes sera réalisée sur une partie des animaux du projet.
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables de stress et de légère hypothermie sont attendus, en lien notamment avec la séparation mère-petits lors des injections, la réalisation de contention, l’induction d’un état fébrile passager suite aux injections. L’injection de l’agent inflammatoire est classiquement utilisée pour induire un état inflammatoire, au-delà de la légère douleur provoquée par l’aiguille. Elle est donc susceptible d’entrainer un état fébrile passager chez l’animal. La manifestation d’une gêne peut se traduire par un animal moins mobile. Une détresse respiratoire et une hypothermie sont possibles lors de l’anesthésie liée à la chirurgie sans réveil.
Devenir
L’ensemble des 864 animaux sera euthanasié en fin de projet afin de prélever les tissus d’intérêt pour traitement par biologie molécule ou histologie.
Remplacement
L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie combiné à une perturbation inflammatoire précoce, sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.
Réduction
Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 864 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les échantillons prélevés seront envoyés à différentes équipes dans le cadre de collaborations. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement de manière classique. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.
Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés plusieurs fois par semaine et à la suite de tout signal d’alerte une grille de suivi est mise en place. Comme défini dans l'agrément de notre établissement, les paramètres environnementaux contrôlés comprennent une humidité de 50 plus ou moins 20 pour cent, une température constante (20-24 degrés celsius). L’éclairage est circadien (8h-20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et disposent de matériel de nidification (Sizzle square et/ou coton) et d’une maison rouge. Des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de troubles moteur ou comportements aberrants, les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue pendant 12h, à l’aide d’une grille de suivi Si l’état général de l’animal atteint les points limites (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), les animaux seront euthanasiés immédiatement. Le stress induit par la séparation au moment de l’injection des animaux au 8ème ou 20ème jour de vie est minimisé en réduisant au maximum le temps de séparation avec la mère. Les données de la littérature indiquent que l’injection intrapéritonéale de molécules pro-inflammatoires n’induit pas de trouble majeur évident chez la souris. Les injections sont susceptibles d’entrainer un état fébrile passager chez l’animal. La manifestation d’une gêne peut se traduire par un animal moins mobile. Les animaux seront particulièrement observés après les injections. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique est souvent complexe et long à mettre en œuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle qui nous intéresse existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement. Plusieurs stades de développement seront analysés pour comprendre les conséquences de la réponse inflammatoire précoce sur l’expression du gène et sur d’autres marqueurs inflammatoires. Plusieurs stades de développement, seront étudiés : néonatal (injection à 8 jours de vie), jeune (injection à 20 jours de vie), adolescent (injection à 34 jours de vie) et adulte (injection à 89 jours de vie).
Rôle de facteurs sécrétés ou intracellulaires dans l’immunogénicité des chimiothérapies anticancéreuses chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
9 132 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse, puis, selon les groupes, jusqu'à cinq injections intrapéritonéales sur animal vigile ou quatre injections directement dans la tumeur, ses tumeurs étant mesurées tous les deux à trois jours. Le porteur indique que les sites d'injection peuvent s'infecter et que la croissance tumorale peut faire maigrir les souris, et justifie la mise à mort par les analyses menées sur les organes prélevés. L'objectif déclaré est de confirmer chez la souris des gènes repérés lors d'un criblage in vitro, une vérification pour laquelle il écrit qu'il n'existe "pas de modèles alternatifs" et que le recours à un "organisme entier" est une "nécessité".
Objectifs
La chimiothérapie demeure aujourd’hui le traitement de référence pour la majorité des cancers. Un nombre limité d’agents tels que les anthracyclines ou encore l’oxaliplatine ont la capacité de déclencher des signaux de stress pre-mortem qui induisent la mort cellulaire immunogène (ICD, de l’anglais « Immunogenic cell death »). Cette dernière permet la stimulation d’une réponse immunitaire antitumorale, tout en conférant une protection à long terme. Nous avons effectué une étude de criblage multi-omique in vitro qui nous a permis d’identifier des gènes associés à l’ICD, en particulier des gènes codant pour des cytokines et chimiokines. L’objectif de ce projet est de confirmer in vivo l’implication de ces gènes et de leurs voies de signalisation dans l’ICD et plus globalement dans l’immunité antitumorale et leur contribution à l’efficacité thérapeutique. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes par lesquels les chimiothérapies stimulent l’immunité antitumorale et identifiera de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les molécules qui induisent la mort cellulaire immunogène sont très utilisées en clinique pour le traitement des cancers (anthracyclines, oxaliplatine, cyclophospamide, etc). Les expérimentations précliniques prévues visent à confirmer les effets antitumoraux des nouvelles cibles thérapeutiques identifiées in vitro et à approfondir notre compréhension des effets antitumoraux du système immunitaire. Ces études permettront d’explorer plus en profondeur les mécanismes sous-jacents à ce processus. De plus, nous pourrons évaluer si les voies de signalisations identifiées présentent également des propriétés immunogènes afin d’ouvrir le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour l’immunothérapie anti-cancéreuse. Ces travaux permettront d’une part d’induire l’immunogénicité dans le cadre de traitements non inducteurs de mort immunogène et d’autre part d’améliorer l’efficacité des molécules inductrices de ce type de mort cellulaire.
Procédures
Une première partie des animaux subira une expérience de vaccination antitumorale qui impliquera 2 injections sous cutanées sous anesthésie gazeuse (3 min /souris/injection). Une seconde partie des animaux sera soumise à une expérience de croissance tumorale qui impliquera 1 injection sous cutanée sous anesthésie gazeuse (3 min /souris/injection) et 1 injection intrapéritonéale (animal vigile, 2 min/souris/injection). Une 3éme partie des souris sera soumise à une expérience de croissance tumorale qui impliquera 1 injection sous cutanée sous anesthésie gazeuse (3 min /souris/injection), 1 injection intrapéritonéale (animal vigile, 2 min/souris/injection), 4 injections intratumorales sous anesthésie gazeuse (2 min/souris/injection). La dernière partie des animaux sera soumise à une expérience de croissance tumorale qui impliquera 1 injection sous cutanée sous anesthésie gazeuse (3 min /souris/injection), 5 injections intrapéritonéales (animal vigile, 2 min/souris/injection). Tous les animaux seront manipulés brièvement (moins d’1 min) tous les 2-3 jours pour mesurer les tumeurs.
Impact sur les animaux
Certains effets indésirables peuvent être observés chez la souris lors des expérimentations, notamment la manipulation et la contention régulière peuvent leur engendrer un certain stress. De plus, lors des injections une légère douleur (équivalente à une piqure) peut survenir, éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection. Les sites d’injections peuvent s’infecter. L’anesthésie peut induire un stress thermique. Par ailleurs, la croissance tumorale et l’administration de traitements peuvent entrainer une baisse ou perte d’appétit qui peut causer une perte de poids des animaux.
Devenir
Tous les animaux à la fin des procédures seront euthanasiés. Chaque procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.
Remplacement
Nous avons effectué une étude de criblage à haut débit in vitro qui nous a permis d’identifier des gènes associés à l’implication du système immunitaire dans la morte cellulaire des cellules cancéreuses. Nous souhaitions valider ces data in vivo, car il n’y a pas de modèles alternatifs permettant d’étudier l’efficacité des traitements anticancéreux et de confirmer leur action via l’activation du système immunitaire. Il est donc essentiel d’utiliser un model reproduisant au mieux l’environnement tumoral et le fonctionnement du système immunitaire. Cela se traduit par la nécessité d’utiliser un organisme entier dans lequel les cellules et les composants du système immunitaire peuvent circuler, permettant ainsi une représentation plus fidèle des interactions biologiques complexes à l’intérieur du corps.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons un maximum de 9132 animaux sur 5 ans. Des groupes de 15 souris seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés. Nous appliquerons des tests statistiques pour comparer l’effet étudié entre les groupes, pour suivre la croissance tumorale et la survie des animaux. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lors que cela est possible. L’étude sera interrompue si les expériences initiales ne confirment pas l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque procédure.
Raffinement
Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress. Pour minimiser leur stress, les souris seront logées ensemble (un maximum de 5 souris par cage), offrant un environnement social, au calme et un espace vital suffisant. Les conditions d’hébergement respecteront les normes conventionnelles et les animaux auront accès en permanence à l’alimentation et à l’eau. Un milieu enrichi adapté est prévu : dans les cages il y aura des nids et des tunnels en carton. Le comportement général des animaux sera surveillé régulièrement et leur poids sera mesuré avant le début des traitements, ainsi qu’une fois par semaine tout au long de l’expérience de croissance tumorale. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie, tapis chauffants...). Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteint de ces points limites préétablis.
Choix des espèces
Le choix d'utiliser la souris dans cette étude repose sur plusieurs raisons. Tout d'abord, la souris est un modèle complet et fonctionnel, offrant des similitudes intéressantes avec le système immunitaire humain, ce qui en fait un modèle utile pour cette recherche. De plus, nous connaissons bien sa génétique, ce qui facilite les études moléculaires et génétiques. Nous disposons d'installations adaptées pour ces animaux, d’une solide expertise dans les techniques d'expérimentation animale ainsi que dans le suivi vétérinaire et microbiologique. Nous utilisons des souris adultes âgées à partir de 7 semaines, car elles possèdent un organisme avec un développement complet et un système immunitaire fonctionnel.
Effet d’une immunothérapie cellulaire sur des modèles murins de différentes tumeurs humaines (cancer du sang, cancer des poumons, du foie et du sein).
- Recherche appliquée
- Cancers
750 souris vont être utilisées, 600 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 150 un niveau sévère, chacune pouvant subir jusqu'à quatre mois de suivi avec deux imageries sous anesthésie et un prélèvement de sang à la mandibule chaque semaine. Dépourvues de système immunitaire et irradiées au préalable pour favoriser la greffe, elles reçoivent des cellules cancéreuses humaines dans le sang, ou dans la rate ou le foie par chirurgie abdominale. Le porteur indique que la croissance des tumeurs peut provoquer des douleurs, une paralysie ou une insuffisance respiratoire, et que les souris seront tuées avant l'apparition de ces signes lorsque l'imagerie montre une propagation trop étendue. Toutes sont tuées au plus tard quatre mois après l'injection, pour un projet dont la validation espérée doit "servir de base" au développement de futures stratégies thérapeutiques.
Objectifs
L’immunothérapie, une avancée majeure en médecine, a bouleversé la façon dont nous luttons contre le cancer et d’autres maladies. Contrairement aux traitements traditionnels, tels que la chimiothérapie ou la radiothérapie, qui ciblent directement les cellules cancéreuses, l’immunothérapie tire parti du système immunitaire du patient (système de défense de l’organisme contre les infections) pour combattre la maladie. Dans notre projet, nous nous concentrons sur plusieurs types de cancers hématologiques (leucémie et lymphome) et de cancers « solides », notamment les cancers du poumon, du sein et du foie. Notre objectif est de trouver une nouvelle approche qui pourrait être utilisée pour traiter ces cancers de manière plus efficace. L’une de nos stratégies consiste à utiliser des cellules du système immunitaire appelées lymphocytes T. Ces cellules sont des gardiens du système immunitaire qui patrouillent dans notre corps pour détecter et éliminer les menaces, y compris les cellules cancéreuses. Cependant, il existe deux types de lymphocytes T : les lymphocytes « conventionnels » et les lymphocytes T « non conventionnels ». Les lymphocytes T « conventionnels » sont des guerriers spécialisés qui sont parfois difficiles à obtenir chez les patients, en particulier s’ils ont déjà reçu des traitements agressifs. De plus, ils peuvent causer des effets secondaires indésirables, comme la destruction de cellules saines de notre corps. Nous explorons donc une approche novatrice en utilisant des lymphocytes T « non conventionnels ». Ces cellules proviennent de donneurs en bonne santé et pourraient être utilisées pour stimuler le système immunitaire du patient afin de lutter contre les cellules cancéreuses. Ce serait une sorte de traitement universel, efficace pour différents types de cancers, indépendamment du patient. Notre travail vise à rendre ces thérapies plus accessibles, moins coûteuses et à réduire les effets secondaires, tout en offrant un nouvel espoir à ceux qui luttent contre le cancer du poumon, du sein, du foie et d’autres types de cancer.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à démontrer la possibilité d’utiliser une autre population de cellules du système immunitaire permettant de traiter les patients atteints de cancer. Cette nouvelle stratégie thérapeutique éviterait les problématiques actuellement rencontrées avec des traitements similaires. La validation de nos hypothèses dans un modèle animal servira de base au développement de stratégies thérapeutiques innovantes pour améliorer les taux de guérison de pathologies cancéreuses graves.
Procédures
Notre projet consiste à développer une nouvelle immunothérapie cellulaire « universelle » applicable à différents cancers (cancer du sang, du poumon, du sein, du foie). Pour cela, nous utiliserons plusieurs modèles expérimentaux consistant tous en l’injection de cellules cancéreuses soit par voie intraveineuse (veine de la queue, durée moins d’une minute sur souris éveillée) soit par injection dans la rate ou dans le foie (par chirurgie sous anesthésie et analgésie, durée 15 minutes) dans des souris dépourvues de système immunitaire et préalablement irradiées (cela permet d’augmenter la greffe des cellules cancéreuses et leur multiplication). Après l’établissement de la tumeur (en quelques jours), notre thérapie cellulaire sera injectée (par voie intraveineuse dans la veine de la queue sur souris éveillées ; durée 1 minute). La progression de la tumeur et donc l’efficacité de notre immunothérapie cellulaire seront suivis par imagerie sous anesthésie générale (durée de la session : 15 min) 24h après le début l'injection du traitement puis deux fois par semaine pendant toute la durée de l'étude, soit 4 mois maximum. Afin de compléter l’étude sur l’utilisation de cette population de cellules particulière en thérapie des cancers, nous serons également amenés à traiter un lot de souris avec la molécule connue pour activer nos cellules d’intérêt thérapeutique (administration par injection dans l’abdomen ou dans la veine de la queue au maximum tous les 2 jours, sans anesthésie ; durée de l’injection moins d’une minute). Nous testerons aussi la nécessité d’une 2e voire d’une 3e injection de nos cellules « médicament » pour éradiquer la tumeur. Nous évaluerons également la capacité de nos cellules à rester dans l’organisme et à prévenir une rechute en administrant une seconde dose de cellules tumorales. Chaque semaine, une prise de sang (1 à 2 gouttes prélevées au niveau de la veine de la joue sur souris éveillée) sera effectuée pour suivre la présence des cellules thérapeutiques (durée du prélèvement: 30 s; sur une période de 4 mois maximum).
Impact sur les animaux
Dans les différents modèles de cancer utilisés dans ce projet, l’étape d’irradiation rend la souris fragile aux infections et peut favoriser la présence d’une diarrhée et induire une perte de poids. Le développement des tumeurs peut lui aussi entraîner des nuisances telles que la douleur, une paralysie, une perte de poids, ou une insuffisance respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires). L’injection intraveineuse de cellules tumorales peut également causer du stress et de la douleur au moment de l’injection. En revanche, l’imagerie, bien que non invasive peut provoquer du stress lié à la manipulation. Pour cette procédure, les souris sont préalablement anesthésiées avec de l’isoflurane. L’anesthésie gazeuse peut perturber la régulation de la température corporelle des souris, et la répétition fréquente de ces anesthésies (deux fois par semaine pendant toute la durée de l’étude et à 24h d'intervalle au moment du début du traitement) peut avoir un impact sur leur bien-être. Les prélèvements de sang à la mandibule (réalisés une fois par semaine pendant toute la durée de la procédure) peuvent provoquer une légère douleur temporaire et du stress. Comme leur nom l’indique, ces prélèvements peuvent entraîner un saignement mineur au site de ponction, généralement contrôlé en appliquant une légère pression. La chirurgie nécessaire à l’injection des cellules cancéreuses au niveau de la rate ou du foie implique l’ouverture de la paroi abdominale. Cela peut entraîner des douleurs post opératoires, des problèmes de cicatrisation de la plaie chirurgicale et des effets secondaires tels qu’une infection, une hypothermie, une réaction inflammatoire locale et une altération temporaire du comportement alimentaire.
Devenir
Tous les animaux seront systématiquement euthanasiés au maximum 4 mois post-injection si pas d’atteinte du point limite. Les organes liés au système immunitaire, ainsi que ceux associés à notre population thérapeutique d’intérêt (comme le poumon et les muqueuses intestinales), seront prélevés en post-mortem pour une analyse au niveau cellulaire.
Remplacement
Pour tester l’efficacité de nos différentes thérapies, nous avons d’abord réalisé de nombreuses expériences en laboratoire (in vitro). Ces expériences nous ont permis de valider certaines réponses des cellules aux traitements, en utilisant différentes techniques dont des modèles en trois dimensions appelés sphéroïdes. Cependant, pour obtenir des résultats plus proches de ce qui se passe dans le corps humain, nous devons passer à des tests dans des modèles vivants (in vivo). Ces modèles intègrent des caractéristiques importantes des tumeurs humaines, telles que l’hétérogénéité des cellules tumorales, la présence de tissus sains et des barrières qui peuvent limiter l’efficacité des traitements. Il est donc impossible de poursuivre la validation de notre nouvelle approche thérapeutique sans utiliser un modèle animal entier vivant.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. L’utilisation de l’imagerie in vivo permet également de réduire le nombre d’animaux utilisé grâce à l’analyse d’une même souris sur toute la durée de l’expérience.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes procédures. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, un enrichissement sera mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux, en utilisant deux fois par semaine une grille d'évaluation prenant en compte l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. De plus la mesure bi-hebdomadaire par imagerie in vivo, nous permettra d'évaluer la propagation tumorale et euthanasier les animaux si celle-ci devient trop invasive et avant que les signes cliniques n’apparaissent (paralysie par exemple). Les imageries seront réalisées sous anesthésie. Lors de cette mesure de bioluminescence, nous effectuerons un suivi clinique des souris et établirons un score selon des critères de poids, d’apparence des poils, de mobilité, de comportement ainsi que de rythme respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires) et des observations post-opératoires telles que l’état de la plaie et les déplacements de la souris après l’opération (pour la tumeur du foie, nécessitant une chirurgie).La chirurgie sera réalisée sur des souris anesthésiées et ayant reçu au préalable l’administration d’anti-douleur, administration qui sera poursuivie dans les jours qui suivent.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont le comportement est bien connu et proche de l’humain. Ainsi, l’évaluation du bien-être et de la douleur liée à l’expérimentation peut être effectuée aisément (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, isolement) permettant une prise en charge rapide et adapté. De plus, les modèles murins de cancers du sang, du poumon, du sein ou encore du foie sont bien décrits dans la littérature scientifique. Les souris utilisées dans ce projet sont des animaux adultes de 2 à 3 mois au début de la procédure (injection des cellules tumorales), les pathologies étudiées se développant chez les individus adultes.
Modélisation des maladies inflammatoires de l’intestin au TNBS chez les rongeurs et évaluation prophylactique et thérapeutique de molécules thérapeutiques.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Cinquante études sur cinq ans, commandées par des laboratoires académiques, des biotechs et des industriels du médicament : 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour faire tourner un modèle de maladie inflammatoire de l'intestin. L'inflammation est déclenchée par une administration intra-rectale de TNBS dilué dans l'éthanol sous anesthésie, suivie de gavages, de prélèvements de sang et d'endoscopies par sonde caméra. Une partie des souris est immunodéficiente et porte un système immunitaire humanisé. Le porteur classe l'ensemble en souffrance modérée tout en décrivant une diarrhée pouvant être sévère, une déshydratation, une anémie, une prostration et une perforation de l'intestin.
Objectifs
La maladie inflammatoire chronique des intestins (MICI) est une pathologie caractérisée par une inflammation de la paroi du tube digestif entrainant une dégradation significative de la qualité de vie des patients. Les MICI les plus courantes sont la colite ulcéreuse (ou rectocolite hémorragique) et la maladie de Crohn. A l’heure actuelle, les mécanismes d’apparition de cette pathologie sont peu connus et aucun traitement curatif n’est disponible sur le marché. L’objectif de ce projet est de développer un modèle d’étude fiable des MICI pour permettre d’en accroitre la compréhension et d’évaluer les propriétés immunitaires, thérapeutiques et toxicologiques de molécules issues de laboratoires académiques, biotechnologiques et pharmaceutiques.
Bénéfices attendus
Les MICI sont des maladies inflammatoires. En basant notre modèle sur des souris ayant un système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les MICI et des potentiels traitements avec davantage de spécificité pour l’espèce cible de ces recherches : l’Homme.
Procédures
Administration intra-rectale sous anesthésie générale, durée de l'intervention 4 à 5 minutes. Administration des composés à visées thérapeutiques par voie enterale (gavage ou incorporation dans l'eau de boisson) ou parentérale (intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire ou sous-cutanée). Leur nombre est à déterminer, leurs durées seront de 10 à 15 secondes chacune. Prélèvements sanguins pour le suivi de la pathologie et des effets des traitements selon un schéma établis par le vétérinaire et le comité de bien-être. Chaque prélèvement aura une durée de 15 à 30 secondes, environ. Insertion de sonde caméra intrarectale sous anesthésie pour analyse des intestins, 3 à 4 minutes par analyse.
Impact sur les animaux
Les MICI se caractérisent par une diarrhée pouvant être sévère et entrainer une perte de poids, une déshydratation, des coliques ou une une anémie. Des nuisances peuvent également être induites par l'injection intra-rectale de TNBS solubilisé dans l'éthanol ainsi que par les prélèvements sanguins, l'administration des composés de recherche et les effets potentiellement toxiques de ces composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique ainsi que par l'endoscopie. Ces nuisances et effets indésirables peuvent se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer, une perforation de l'intestin.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure.
Remplacement
Il n’est à l’heure actuelle pas possible de recréer in vitro un modèle étudiant les interactions complexes qui peuvent exister entre le système immunitaire et un système digestif fonctionnel qui permettrait de reproduire les MICI tout en objectivant les effets thérapeutiques et toxicologiques de composés médicamenteux destinés à leurs traitements. Les modèles murins constituent donc une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et à la mise à disposition de thérapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total de 1500 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet sur une durée de 5 ans, permettant de réaliser 50 études afin de mettre en place le modèle et de réaliser les premières études précliniques. Chaque étude comprendra un minimum de 4 groupes (contrôle négatif, contrôlé positif, plusieurs doses ou traitements à comparer) avec 5 à 10 animaux par groupe afin d’obtenir des résultats fiables malgré la variabilité intrinsèque liée au modèle. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus de la série et sur base des données historiques collectées.
Raffinement
En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 6 heures par semaine. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est de 200µL pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8mL/kg. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction des scores cliniques et de la perte de poids. Les administrations intra-rectales seront réalisées sous anesthésie générale à l'isoflurane et le volume d'injection ne pourra dépasser 200 μL. L’endoscopie sera réalisée sous anesthésie.
Choix des espèces
Le séquençage complet du génome de la souris a démontré la proximité phylogénétique des souris et des hommes : 90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes orthologues produisent des effets différents entre souris et homme, le remplacement dans le génome du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. Ainsi, les souris SCID (Severe Combined ImmunoDeficiency), leurs dérivées et leurs analogues, toutes immunodéficientes, ont permis le développement des modèles humanisés. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur système immunitaire. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.