Souris
Développement par imagerie d’une méthode d’expression de protéines bioluminescentes via l’injection de vecteur ADN dans les cellules musculaires de la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Les souris utilisées sont immunodéficientes, dépourvues de défenses efficaces au point qu'une contamination bactérienne ou virale les tuerait, ce que le porteur qualifie de phénotype dommageable. Elles sont 180, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvements post-mortem. Chacune subit jusqu'à cinq injections, dix anesthésies à l'isoflurane, quatre séances d'imagerie de bioluminescence et jusqu'à cinq prises de sang à la mandibule sur animal vigile, l'injection intramusculaire étant couplée à des décharges électriques pour faire entrer un plasmide dans le muscle. L'objectif est de transformer ce muscle en ce que le porteur appelle une "usine de production" d'anticorps, preuve de concept dont il annonce les débouchés chez les espèces domestiques, contre l'arthrite ou le psoriasis.
Objectifs
Le présent projet vise à développer, grâce à l’imagerie, une méthode permettant de faire exprimer par un muscle un anticorps ou fragment d’anticorps à partir d’un plasmide contenant leur gène. Le plasmide est injecté dans les cellules musculaires de souris afin d’induire une sécrétion à une dose supérieure ou égale à la dose minimale efficace de l’anticorps. L'objectif est donc double : 1/ mettre en place une méthode d’expression d‘anticorps par les cellules musculaires 2/ induire une expression qui soit suffisante pour être détectée dans le sang des animaux et agir sur des cibles présentes à distance des muscles sécréteurs. Ce projet fait suite à de nombreux tests cellulaires de vérification de la fonctionnalité des plasmides ADN utilisés. Sa réussite ouvrira la voie à des études plus approfondies et à visée thérapeutique chez des espèces domestiques. En bref, nous aurons une preuve de concept de l’utilisation de vecteurs ADN injectés dans les muscles des animaux, qui fonctionneront alors comme des « usines de production » d’anticorps dirigés contre des cibles. La niche d’utilisation de cette stratégie clinique concerne les maladies chroniques, dans notre cas, les maladies chroniques inflammatoires articulaires (ex : arthrite) et cutanées (ex : psoriasis ou pelade).
Bénéfices attendus
Une fois abouti, le présent projet a pour vocation de mettre en place une méthode de production de biomédicament par les cellules musculaires de souris via l’injection d’un vecteur ADN. Celle-ci ouvrira de nombreuses perspectives thérapeutiques et vétérinaires.
Procédures
Les souris de ce projet subiront au maximum : - 5 injections d’une durée total de 12 min (1 IM couplée ou non à l’électroporation, soit 10min ; 4 IP pour l’imagerie, soit 2 min) - 10 anesthésies à l’isoflurane pour une durée totale de 70 minutes (5 rasages, soit 10min ; 1 IM couplée ou non à l’électroporation, soit 10 min ; 4 imageries de bioluminescence, soit 50 minutes) - 2 à 5 prélèvements de sang sur souris vigile, soit 2 à 5min au total.
Impact sur les animaux
Les injections intramusculaires et l’application de courants électriques pour l’électroporation peuvent potentiellement induire des douleurs. Ils seront réalisés sous anesthésie générale. Une prise de sang au niveau submandibulaire sera également réalisée sur animaux vigiles dans les deux premières procédures. Les souris seront suivies grâce à nos grilles de scoring pour surveiller l’apparition de signes de souffrance tel que la perte de poids, la modification de la physiologie ou du comportement (dont la locomotion suite à l’injection intramusculaire avec ou sans électroporation). Nous utiliserons des souris immunodéficientes qui sont à phénotype dommageable car elles présentent une absence de défenses immunitaires efficaces. Si elles sont contaminées par des bactéries et/ou virus, cela entrainerait leur décès. Elles seront donc hébergées en portoir ventilé où il y a une très haute protection contre ces agents pathogènes empêchant ainsi l’expression de ce phénotype. Ce statut est également garanti durant les différentes séances d’imageries durant lesquelles des procédures strictes sont respectées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris dans l’imageur…).
Devenir
Mise à mort de tous les animaux à la fin de chaque procédure pour prélèvements post-mortem.
Remplacement
Une première sélection des meilleurs plasmides d’expression a été réalisée en amont par nos collaborateurs par des études in vitro. L’étude de la production d’un anticorps ou d’une protéine recombinante par un tissu musculaire et sa sécrétion dans la circulation sanguine générale n’a pas de méthode alternative que l’utilisation d’animaux vivants à l’heure actuelle.
Réduction
Nos protocoles expérimentaux ont été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en injectant des vecteurs exprimant des protéines bioluminescentes, qu’il est possible de suivre par imagerie de bioluminescence et par luminométrie. Le suivi par bioluminescence in vivo permettra de suivre l’expression de la luciférase au cours du temps sur un seul et même animal et d’éviter de multiplier les groupes. C’est donc un double bénéfice au niveau scientifique et au niveau de l’utilisation d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans toutefois compromettre les objectifs. Sur 5 ans, nous prévoyons l’utilisation au maximum de 180 souris qui seront réparties ainsi : - Mise en place des protocoles de transfert de vecteur ADN au sein de notre laboratoire : 40 souris - Étude du contrôle du système immunitaire : 40 souris - Étude des méthodes de transfert du vecteur ADN dans les cellules musculaires en utilisant soit différents polymères, soit différents produits de transfection : 100 souris.
Raffinement
La modalité d'imagerie mise en œuvre est non invasive et est réalisée sous anesthésie gazeuse. Les injections intramusculaires sont également effectuées sous anesthésie gazeuse. Le matériel stérile à usage unique adapté aux rongeurs, ce qui limite le risque d’infection et la douleur infligés au cours de l'expérimentation. Enfin, les souris auront 1 semaine minimum d’acclimatation avant le début de l’expérimentation. Elles seront 2 à 6 souris maximum par cage de 530 cm² selon leur poids. Ces cages seront en portoir ventilé, ce qui empêchera l’expression du phénotype dommageable des souris immunodéficientes. Ce statut est également garanti durant les différentes séances d’imageries durant lesquelles des procédures strictes sont respectées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris dans l’imageur…). Les souris immunocompétentes seront également hébergées en portoir ventilé. Les cages sont enrichies avec du matériel pour la fabrication d’un nid et des granulés pour ronger et jouer avec ses congénères. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation. Des grilles de scoring avec des points limites prédictifs seront mis en place et le personnel assurera l’observation des animaux quotidiennement afin d'anticiper leur souffrance. Néanmoins, en cas de douleur observée en post injection du plasmide, une injection sous-cutanée d’un analgésique) sera effectuée. Une injection intramusculaire peut provoquer une douleur liée à un hématome. Pour les prises de sang, un crayon hémostatique sera appliqué à la fin du prélèvement afin d’arrêter le saignement.
Choix des espèces
Le présent projet vise à développer, grâce à l’imagerie, une méthode permettant de faire exprimer par un muscle un anticorps ou fragment d’anticorps à partir d’un plasmide contenant leur gène. La souris est une espèce animale très largement employée dans la littérature pour ce genre d’étude de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d'utiliser des techniques d'imagerie in vivo. C'est ainsi le modèle animal de choix. La méthode mise en place dans ce projet a pour vocation de faire produire notre anticorps d’intérêt dans un système complètement fonctionnel et développé. Les animaux employés seront donc adultes, entre 7 et 10 semaines au moment de l'arrivée des animaux et leur entrée dans le protocole.
Etude du rôle du récepteur aux œstrogènes dans la tumorigenèse hépatique dans un modèle murin de maladie métabolique (EU2/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Génotypées par prélèvement au bout de la queue, injectées cinq jours de suite à six semaines, puis nourries neuf mois durant avec un régime riche en graisses et en sucre, 72 souris atteignent l'âge de onze mois dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ce régime provoque une obésité et un diabète, et chez les souris porteuses de la glycogénose des tumeurs hépatiques millimétriques apparaissent après six mois, pouvant s'accompagner d'une ascite, d'un ictère et d'une prostration. À partir du sixième mois, un scanner sous anesthésie est réalisé chaque mois puis tous les quinze jours le dernier mois, avec cinq prises de sang sur animal vigile et une injection de produit de contraste dans la veine de la queue. Le porteur signale par ailleurs que 1 à 2 % des souris meurent d'hypoglycémie, le plus souvent la nuit. Après six heures de jeûne, toutes sont tuées pour prélever le foie, l'hypophyse, l'hypothalamus, les ovaires et les testicules.
Objectifs
Les cancers du foie se développent souvent sur un foie gras (stéatose) qui est souvent associé à l’obésité et/ou au diabète de type 2. La pathologie peut évoluer vers une cirrhose, et/ou vers un cancer du foie. Il a été noté que ces maladies métaboliques apparaissaient plutôt chez les hommes, alors que les femmes sont protégées jusqu’à la ménopause. Ces différences pourraient s’expliquer en partie par le rôle protecteur des œstrogènes, hormones féminines, contre l’accumulation de graisses dans le foie. Cet effet passerait par la liaison des œstrogènes sur leurs récepteurs spécifiques localisés sur les cellules du foie. Dans une autre maladie métabolique rare, appelée glycogénose, le développement de tumeurs du foie est observé avec la même incidence entre les femmes et les hommes. Cette maladie se caractérise par la perte de la capacité à produire du sucre par le foie, les reins et les intestins, engendrant des hypoglycémies pouvant causer la mort du patient. De plus, les patients développent aussi un foie gras mais qui ne va pas évoluer vers la cirrhose. L’accumulation de graisses dans le foie va toutefois entrainer le développement de tumeurs du foie qui sont généralement bénignes. Ces tumeurs ont cependant un fort taux de transformation en cancer. Ce schéma de développement tumoral est encore mal caractérisé, et a aussi été décrit chez certains patients diabétiques et/ou obèses. Grâce au développement d’un modèle de souris viables reproduisant toute la pathologie du foie de la glycogénose, il a été montré une augmentation de la quantité de récepteurs aux œstrogènes dans le foie des souris mâles et femelles atteintes de cette maladie. Nous proposons d’étudier l’effet de la perte de ces récepteurs dans le foie de souris atteintes de glycogénose sur le développement de tumeurs du foie. Les souris seront produites puis élevées pendant 5 mois après l’induction de la maladie dans un premier établissement utilisateur (EU1), et le suivi du développement des tumeurs sera ensuite réalisé dans un 2ème établissement (EU2).
Bénéfices attendus
A terme ce projet devrait permettre de mieux caractériser le rôle des œstrogènes et de leur récepteur dans la pathologie du foie de la glycogénose, notamment son rôle dans le développement tumoral au stade tardif de la pathologie. Ainsi, cette étude pourrait mettre en évidence une nouvelle cible thérapeutique, les récepteurs aux œstrogènes, dans la prévention et le traitement des cancers hépatiques du foie dans la glycogénose. Ces récepteurs sont déjà ciblés dans le cadre de cancers œstrogéno-dépendants (cancer du sein notamment). Ces traitements pourraient par la suite être testés sur le modèle animal reproduisant la glycogénose pour valider leur efficacité sur la prévention de tumeurs. Ces avancées pourraient éviter la transplantation hépatique car, en absence de traitement curatif, seule la transplantation hépatique permet de contrôler la glycémie et prévenir les dommages du foie.
Procédures
Dans l’établissement 1 (EU1) : Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un petit morceau (
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques sont obtenues après une série d’injections pouvant engendrer une légère douleur. L’immobilisation de la souris ne nécessite pas de contention en main mais peut induire un léger stress. Ces souris peuvent développer des hypoglycémies sévères si elles ne s’alimentent pas régulièrement. Actuellement, la gestion de l’élevage permet de limiter les décès liés aux hypoglycémies sévères, mais 1 à 2% de décès peuvent être rencontrés généralement durant la nuit. Il est à noter que sous régime riche en graisses et en sucre, aucune souris ne développe d’hypoglycémie si elles ont accès à la nourriture. Ce régime est connu pour induire le développement d’une obésité et d’un diabète, environ 4 à 5 mois après l’introduction du régime, chez les souris non transgéniques. L’obésité peut entrainer une réduction de la mobilité des souris. Les souris diabétiques boivent en général plus et urinent plus. Les souris atteintes de glycogénose développent des tumeurs hépatiques millimétriques après 6 mois de régime riche en graisses et en sucre. Un produit de contraste sera injecté une seule fois en veine caudale pour réaliser les analyses d’imagerie du foie chez des animaux immobilisé dans un tube ; cette injection peut engendrer une légère douleur, un léger saignement au niveau de la piqure et un stress dû à la contention en tube. L’apparition de tumeurs hépatiques peut entrainer une altération du comportement et de la prise alimentaire, avec une perte de poids, une diminution de la mobilité, ou une prostration des animaux. Elle peut s’accompagner du développement d’une ascite (accumulation de liquide dans l'abdomen) et éventuellement d’un ictère (jaunissement). La pathologie hépatique devrait être impactée par la suppression des récepteurs aux œstrogènes avec le développement probable de dommages cellulaires. Pour évaluer ces dommages (dosages des transaminases), toutes les souris subiront des prélèvements sanguins (5 prélèvements = 1 par mois à partir du 5ème mois), ce qui peut engendrer une légère douleur lors de la piqure et un stress lié à la contention de l’animal.
Devenir
`Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement du foie, de l’hypophyse, du cerveau (hypothalamus) et des organes reproducteurs (ovaires, testicules) afin de réaliser des analyses anatomo-pathologiques et moléculaires.
Remplacement
Même s’il est maintenant possible de produire des petits organes en culture qui intègrent les différents types de cellules du foie, la pathologie hépatique de la glycogénose de type 1a met en jeu un dialogue complexe entre ces cellules du foie et les cellules du système immunitaires de la circulation sanguin ainsi que des régulations hormonales. La sécrétion des hormones sexuelles comme les œstrogènes dépend de signaux passant par le cerveau. Ces régulations ne peuvent pas être reproduites en culture cellulaire. Ce projet nécessite de travailler avec un modèle animal permettant de maintenir les interactions inter organes. Dans le cadre de cette étude, l’hypothalamus, l’hypophyse, les ovaires/testicules et le foie seront prélevés pour étudier en détail l’ensemble des régulations à l’échelle de l’organisme.
Réduction
-Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances de la pathologie étudiée, des modèles animaux, du métabolisme et grâce aux connaissances acquises par les études précédentes. Afin de réaliser une analyse statistique, des groupes de 12 souris maximum par sexe et par génotype, permettront de réaliser à la fois l’étude du développement tumoral hépatique et des études moléculaires et histologiques. Des tests statistiques permettront de comparer les différents groupes de souris entre eux. -Au total, ce projet réalisé sur 3 ans nécessitera l’obtention de 48 souris transgéniques et 24 souris contrôles (mâles et femelles).
Raffinement
-La pathologie est induite uniquement dans le foie des souris à l’âge adulte ; ceci permet d’éviter les hypoglycémies sévères qui peuvent être fatales et de passer la période néonatale. -Contrôle des risques d’hypoglycémie en limitant les efforts des souris pour accéder à la mangeoire (croquettes dans la cage et tétines de biberon longue). En cas d’hypoglycémie, une solution de sucre sera administrée à la souris et une partie de la cage sera placée sur une plaque chauffante pour maintenir sa température corporelle. - Lors des prises de sang, l’arrêt du saignement sera rapidement maitrisé par un point compressif. -Afin de limiter la douleur, une crème anesthésiante sera appliquée sur les zones qui peuvent être douloureuses. -Lorsque les animaux deviennent diabétiques (après 5 mois de régime gras), la litière sera changée plus régulièrement pour assurer leur bien-être car les souris peuvent uriner plus. -Le suivi du développement tumoral par des imageries sera réalisé sous anesthésie. -La mise en place d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés a permis de déterminer les critères d’arrêt de souffrance à tout moment du projet. -Le transfert des animaux entre le 2 établissements situés à moins de 1 km sera effectué en voiture. Et une période d’adaptation de 15 jours sera respectée avant le début de l’expérimentation.
Choix des espèces
En ce qui concerne la régulation de la glycémie, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson, montrent que les régulations ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux, comme la souris, dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le modèle de souris transgéniques reproduit toute la pathologie humaine de la glycogénose, y compris le développement de tumeurs. Par ailleurs, le modèle souris est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et de nombreux outils d’analyse disponibles (anticorps, kits biochimiques…). Le protocole sera réalisé chez des souris adultes âgées d’au minimum 6 à 8 semaines, après l’induction de la glycogénose hépatique ce qui permet d’éviter l’apparition de retard de croissance dû à la maladie et de passer la période périnatale sans dommages. Les animaux seront mis à mort à l’âge de 11 mois.
TUSHI imaging pour comprendre le rôle des cellules microgliales dans le développement de l’obésité
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une perfusion intracardiaque de trois minutes sous anesthésie profonde, précédée d'une ouverture du thorax : c'est le seul acte que la rubrique des procédures décrit pour les 96 souris de ce projet, classées en souffrance légère et toutes tuées. Leur cerveau est prélevé pour être découpé en tranches et imagé au microscope, afin de caractériser la forme et la mobilité des cellules microgliales de l'hypothalamus. La moitié des animaux passe à huit semaines à un régime riche en graisses, élément qui n'apparaît pas dans la description des procédures mais dans la justification du choix de l'espèce. Le porteur mentionne aussi l'usage d'un appareil de stéréotaxie et un stress lié à l'injection, sans préciser quelle injection est pratiquée ni à quel moment.
Objectifs
Afin d'envisager de nouvelles thérapies pour lutter contre l'obésité et ses comorbidités, il est nécessaire de mieux comprendre les phénomènes biologiques qui régulent la prise alimentaire et le poids corporel. Les neurones du groupe de l'hypothalamus (partie assurant un double rôle de contrôle des sécrétions hormonales et de contrôle de l'activité du système nerveux végétatif tel que les organes viscéraux) sont sensibles aux signaux de la périphérie qui les informent du statut énergétique de l'organisme. La consommation d'un régime riche en graisses et en calories (HFD: High Fat Diet) entraîne une neuroinflammation (inflammation des neurones) dans l'hypothalamus. La microglie, une population de cellules immunitaires dans le cerveau, est également connue pour être impliquée dans la régulation du poids corporel. En effet, elles participent à la neuroinflammation dans l'hypothalamus suite à un régime HFD. Leur activation varie en fonction de la période d'exposition au régime HFD (entre les premiers jours et plusieurs semaines). Des publications récentes ont montré que la limitation de l'activation de la microglie en réponse à l'HFD limite la neuroinflammation. Cependant, les recherches sur la dynamique morphologique microgliale (vitesse des processus, etc.) à l'état de base chez des souris exposées au HFD pendant une période aiguë sont encore insuffisantes. Dans ce projet, nous visons à clarifier le rôle de la microglie dans le développement de l'inflammation hypothalamique en réponse à un régime alimentaire riche en calories et à caractériser les changements dans la microglie ainsi que son effet sur la dynamique de l'interaction microglie-neurone. Pour cette étude, nous utiliserons une approche génétique (utilisation d'animaux transgéniques), une technique de microscopie récemment développée et l'emploierons sur des tranches de cerveau frais de l'hypothalamus dérivées de souris nourries au HFD pour quantifier la morphologie microgliale, les vaisseaux sanguins, etc.
Bénéfices attendus
Les informations obtenues grâce à ce projet nous permettront de mieux comprendre le rôle de la microglie de l'hypothalamus dans le développement de l'obésité et les caractéristiques morphologiques de la microglie.
Procédures
La réalisation d'une perfusion intarcardiaque sur animal anesthésié sera induite durant 3 minutes
Impact sur les animaux
L'effet indésirable attendu sur les animaux est le stress durant l'injection. Après l'induction la souris sera anesthésiée et endormie (en vérifiant la profondeur d'anesthésie sur l'animal grâce à l'abscence de réflexe, vérifié par pression sur les pattes arrières).
Devenir
A la fin de la procédure, toutes les souris seront euthanasiées afin de récupérer le cerveau et réaliser des tranches pour être imagées au microscope
Remplacement
La souris est l'espèce de choix pour l'étude du système nerveux des vertébrés, qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. L'objectif de ce projet étant de caractériser la réponse microgliale à l'HFD par microscope dans les conditions les plus naturelles possibles. Cette étude ne peut être réalisée de manière pertinente avec des modèles informatiques (in silico) ou sur des micro-organismes, organes ou cellules hors de leur contexte naturel (in vitro). Le microscope sera dans un premier temps validé par l'imagerie de très petites particules fluorescentes (nanoparticules) afin d'avoir les bons réglages au niveau du microscope et ainsi utiliser moins de souris. Cependant, ces échantillons ne permettent pas réellement de reproduire tous les paramètres optiques observés dans les échantillons biologiques.
Réduction
La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes et la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé grâce à des outils statistiques par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique.
Raffinement
A chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naîtront dans notre animalerie dans un haut niveau sanitaire, logés dans des cages collectives, garnis de litière leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouille et d'enrichissement avec une régulation de la température et de l'humidité. Leur prise en charge est confiée à un personnel qualifié et expert. Ils surveillent tous les animaux quotidiennement et l'expérimentateur dispose d'une solide expérience pour la procédure proposée. Nous avons défini différents points permettant de meilleurs conditions tout au long de l'étude : 1) Les animaux arriveront dans la salle d'hébergement à l'âge de 3 semaines et seront habitués pendant 1 semaine. Cette période d'accoutumance réduira le stress des animaux en réponse à l'expérimentateur. 2) Pour supprimer le stress et la douleur liés à la thoracotomie pendant la perfusion intracardiaque, les souris recevront une dose profonde d’anesthésiques par injection intrapéritonéale. Ces doses induisent une perte de conscience rapide et une anesthésie profonde. Nous vérifierons l’efficacité de l’anesthésie par la méthode du pincement du coussinet plantaire avant de commencer l’incision des tissus. Cette procédure sera effectuée par un personnel formé et compétent, ce qui garantira la précision et limitera le stress de l’animal avant la perte de conscience.. 3) L'enrichissement des cages consiste en des carrés de cellulose pour la nidification, un tunnel en carton pour la cachette et des bâtons de bois pour le rongement. 4) Des critères d'évaluation précoces et terminaux appropriés ont été définis : ces critères concernent l'apparence, le changement de poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect des plaies (le cas échéant). Des mesures conservatrices sont prévues pour chaque critère, afin de gérer rapidement tout changement dans l'état de l'animal comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée. Lorsqu'un critère précoce est atteint, nous demanderons l'avis d'un vétérinaire afin d'envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec la poursuite de la participation de l'animal à l'étude. En cas d'échec ou d'atteinte d'un critère terminal, l'animal sera retiré de l'étude et sacrifié, afin d'éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.
Choix des espèces
La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le metabolisme glucidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. La souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Toutes les souris de cette étude seront adultes A l'âge de 8 semaines, la moitié des souris sera nourrie au HFD, tandis que l'autre moitié sera nourrie au régime standard. Cet âge est celui où la croissance du crâne est considérée comme achevée, ce qui nous permet d'utiliser l'appareil de stéréotaxie et d'utiliser les coordonnées stéréotaxiques des atlas de référence habituels. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le controle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modele prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, l'inflammation des neurones de l'hypothalamus induite par un régime obésogène est retrouvé à la fois chez la souris et chez l’Homme.
Caractérisation de l’effet d’un pesticide sur les cellules d’origine d’un cancer pédiatrique musculaire dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour vérifier si des cellules neuronales embryonnaires transformées donnent des tumeurs du muscle, et si un pesticide favorise ce basculement, 250 souris de six semaines reçoivent une greffe dans la patte. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées à l'issue, sans possibilité d'être réutilisées. L'épaisseur de la patte greffée est mesurée deux fois par semaine sur animal vigile, jusqu'à seize fois, et le porteur indique que la croissance de la tumeur peut provoquer une douleur modérée. La mise à mort est déclenchée par l'atteinte de points limites décrits comme précoces et prédictifs d'un mal-être, et le porteur annonce l'ajout de nourriture humidifiée au fond de la cage au cas où les souris auraient des difficultés à se déplacer.
Objectifs
Les cancers touchent chaque année plus de 2500 enfants en France. On estime qu’un enfant sur 440 sera atteint par un cancer avant l’âge de 15 ans. Malgré des essais cliniques internationaux, leur taux de survie ne s’améliore plus depuis 20 ans. Il est donc indispensable de mieux comprendre leurs origines et leurs particularités moléculaires pour développer des traitements plus efficaces et moins toxiques. Ce projet a pour objectif de déterminer si des cancers du muscle observés chez les enfants et les adolescents peuvent dériver non seulement de la transformation de cellules du muscle mais aussi d’une autre population de cellules neuronales, sous l’effet de facteurs environnementaux et/ou génétiques. Cette question est importante, car la réponse aux chimiothérapies peut varier en fonction de la cellule à l’origine des tumeurs. Il a été montré que lorsqu’on exprime des gènes mutés chez les patients atteints par ces cancers du muscle dans les cellules neuronales, celles-ci prolifèrent et expriment des marqueurs de ces cancers. Par ailleurs, l’exposition de ces cellules aux pesticides favorise leur potentiel tumoral. Il faut maintenant vérifier que les cellules neuronales transformées donnent des tumeurs dans les muscles. Ce projet permettra de fournir de nouvelles pistes pour comprendre l’origine de ces cancers.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de déterminer si un type de cellules embryonnaires peut être l’origine de certains cancers pédiatriques.
Procédures
Injection anti-douleur / analgésie avant la greffe (Nombre : 1 fois maxi - Durée : 30 s). Anesthésie lors de la greffe (Nombre : 1 fois au moment de la greffe tumorale - Durée : 5 min) Pesée en début de procédure puis 1 fois par semaine (Nombre : 8 fois maxi - Durée : 30 s). Mesure de l’épaisseur de la patte greffée et de la patte controlatérale avant la greffe puis 2 fois par semaine (Nombre : 16 fois maxi - Durée : 1 min).
Impact sur les animaux
Avant l’implantation intra-musculaire (IM), l’injection en sous-cutanée d’un anti-douleur engendre une douleur légère. L’implantation IM sous anesthésie quant à elle entraîne une douleur légère. Le suivi de la prise tumorale va engendrer un stress léger lors de la mesure de l’épaisseur de la patte greffée et de la patte car ces mesures sont réalisées sur animaux vigiles. Le développement de tumeurs peut engendrer une douleur modérée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure ou en cas d'atteinte de points limites. Les animaux ne pourront pas être réutilisés pour d'autres expériences.
Remplacement
Le modèle animal est le seul permettant de prendre en compte de nombreux facteurs physiologiques susceptibles d'intervenir dans le potentiel tumorigénique de ces lignées cellulaires embryonnaires. Des études in vitro précédemment réalisées ne permettent pas de répondre aux objectifs.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des études précédentes ont permis de sélectionner les mutations d’intérêt. D’après les données de la littérature et notre expérience, le taux de prise de greffe sera de minimum 50%. Ces données ont été prises en compte afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux permettant de s’assurer de la reproductibilité et de réaliser une analyse statistique des résultats. De plus, les procédures prévues dans ce projet sont séquentielles, ce qui permettra de réduire au maximum le nombre de souris impliquées dans le projet.
Raffinement
Au cours de ce projet, les précautions seront prises pour stresser au minimum l’animal. Une fiche de scoring sera également mise en place. Dès leur arrivée, les souris seront hébergées par groupe de 5 animaux par cage. Une période d’acclimatation sera respectée avant l’entrée des animaux dans l’une des procédures. L'administration d’antidouleur, d'anesthésique, un suivi adapté des animaux et la définition précise des points limites précoces et prédictifs d'un mal être, permettent de limiter au maximum la souffrance animale. Post greffe, de la nourriture humidifiée sera ajoutée au fond de la cage au cas où les animaux présentent des difficultés à se déplacer.
Choix des espèces
L’utilisation de ce modèle souris est nécessaire pour étudier le potentiel tumoral des cellules embryonnaires modifiées car ces dernières sont issues du même modèle murin, permettant de s’affranchir du risque de rejet de greffe par le système immunitaire. Les cancers musculaires sont des tumeurs pédiatriques rares, pour lesquels autant de jeunes femmes que de jeunes hommes sont touchés. Par conséquent, nous utiliserons des souris mâles et femelles dans cette procédure afin de ne pas introduire de biais liés au sexe. Les greffes seront réalisées sur des souris de 6 semaines, âge optimale pour la prise de greffe d'après la littérature.
Autophagie et Cellules endothéliales : études préliminaires de l’utilisation de Virus Adéno Associés (AAV) spécifiques des cellules endothéliales pour caractériser l’autophagie endothéliale dans un modèle murin d’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) ischémique.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
30 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour analyses immunohistochimiques. Elles subissent la pose d'un cathéter caudal, puis une craniotomie de soixante-dix minutes qui suppose de dissocier le muscle masséter pour atteindre l'artère cérébrale moyenne et provoquer un accident vasculaire cérébral, avant une imagerie par résonance magnétique quatre ou vingt-quatre heures plus tard. Il s'agit d'une étude préliminaire, destinée à vérifier qu'un virus adéno-associé permet de visualiser l'autophagie dans les cellules des vaisseaux cérébraux, le porteur avançant qu'une telle mise au point limiterait ensuite l'utilisation d'animaux transgéniques. Sur le remplacement, il écrit que les techniques sans animaux ne sont "pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information" et retient la souris comme le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l'espèce.
Objectifs
Ce projet vise à caractériser les processus autophagiques mis en place par les cellules endothéliales lors d’un stress induit lors d’un accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique. Cette étude est une étude préliminaire afin d’évaluer la faisabilité de l’utilisation de Virus Adéno Associés (AAV) pour permettre la transduction des cellules endothéliales in vivo et ainsi visualiser les flux autophagiques dans les cellules endothéliales à la suite d’un modèle d’AVC ischémique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'apporter de nouvelles connaissances sur l'autophagie endothéliale lors des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. De plus, la validation de l'utilisation de Virus Adéno Associés (AAV) pour transduire les cellules endothéliales in vivo permettre de développer de futurs outils pour monitorer l'autophagie et ainsi limiter l'utilisation d'animaux transgéniques
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie permettant une pose de cathéter caudal d'une durée de 15 minutes et un chirurgie permettant l'accès à l'artère cérébrale moyenne par craniotomie sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 70 minutes par animal. Les animaux seront également soumis à des acquisitions par imagerie par résonnance magnétique (IRM) à 4h ou 24h après l’induction de l’AVC, sous anesthésie générale pour une durée totale de 14 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'apparaître chez les animaux seraient des douleurs postopératoires après l’induction de l’AVC ischémique, notamment dû à la dissociation du muscle masséter pour procéder à la craniotomie. Les animaux sont susceptibles de perdent de la masse corporelle et de ressentir un stress après les anesthésies et l'induction du modèle d’AVC.
Devenir
Tous les animaux utilisés au cours de ce projet (30 animaux) seront mis à mort. Les tissus récupérés seront necessaires pour les futures analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation et l’ischémie cérébrale. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 30 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, et l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettant de mesurer les lésions cérébrale permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Différents points limites ont été mis en place, évaluables à tout moment après l’injection d’AAV, ou évaluables après la chirurgie. De fait, nous veillerons à l’absence de signe de douleur extérieure, d’une respiration laborieuse, de roulements et de convulsions. Nous veillerons également à l'absence de toutes complications chirurgicales inattendues. Pour les animaux mis à mort à 24h post chirurgie, nous veillerons à ce que leur poids ne diminue pas de plus de 15% sur cette période. Nous veillerons à ce que l’animal réagisse correctement après la fin de l’anesthésie générale. 6h après la chirurgie nous effectuerons un rappel de buprénorphine (0.1mg/kg). Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Après le réveil des animaux à l'issu de la chirurgie, les animaux seront observés jusqu'à l'obtention d'un comportement animal normal. La moitié de la cage des animaux sera placée sur une couverture chauffante leur donnant le choix quant à la température de la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l'alimentation après la chirurgie. Le transport des animaux en salle d'expérimentation sera réalisé en limitant les secousses et le bruit. La température en salle d'expérimentation est contrôlée et adaptée au bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce de référence pour l’étude de l’autophagie et de l’ischémie cérébrale. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les AVC ischemiques. Les souris utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ceci se justifie par le fait que les AVC touchent principalement les adultes. De plus, les études antérieures sur les AVC concernent également des modèles murins adultes.
Étude du rôle de récepteurs spécifiques dans le traitement de l’information par les cellules cérébrales dans le modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
5 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, chacune pouvant enchaîner jusqu'à vingt séances d'habituation puis trente-deux séances d'enregistrement d'une heure trente, tête immobilisée, et vivre en cage avec une plaque métallique fixée sur le crâne. L'implantation se fait sous anesthésie générale, après une injection dans une zone du cerveau, et le porteur indique que le dispositif peut gêner l'animal par son encombrement et limiter son comportement habituel. Toutes sont tuées, une partie pour les analyses post-mortem et les autres parce que leur modification génétique interdit de les réutiliser. L'objet immédiat est de comprendre comment des récepteurs NMDA participent au traitement de l'information visuelle, alors que les retombées annoncées, de nouvelles pistes contre la schizophrénie, l'autisme, la dépression ou la douleur chronique, sont renvoyées au long terme.
Objectifs
Notre projet de recherche vise à comprendre comment le cerveau traite les informations visuelles. Nous étudions des récepteurs spéciaux dans le cerveau, appelés récepteurs NMDA, qui jouent un rôle crucial dans le traitement de l'information par les cellules cérébrales. Notre hypothèse est que les différences dans le fonctionnement et le nombre de ces récepteurs sur divers types de neurones, en particulier les interneurones, influencent grandement la façon dont notre cerveau traite ce que nous voyons. Nous pensons que ces variations sont essentielles au bon fonctionnement de nos réseaux cérébraux et à notre capacité à percevoir et comprendre le monde visuel qui nous entoure. Cette recherche pourrait nous aider à mieux comprendre certains problèmes de vision et potentiellement ouvrir de nouvelles pistes pour les traiter.
Bénéfices attendus
Les maladies du cerveau ont des répercussions majeures sur la santé des individus, leur autonomie, leur éducation, leur emploi, leur mobilité et leurs relations personnelles, ce qui représente un lourd fardeau social et économique. Il est d'une importance fondamentale de comprendre les propriétés de base qui régissent la force, le dynamisme, l'étendue spatiale, la localisation anatomique et les composants moléculaires des connexions synaptiques entre des types de neurones spécifiques formant un réseau neuronal dans des états normaux et pathologiques. Plus précisément, nous pensons que le dysfonctionnement du néocortex est à l'origine de déficiences cognitives et de troubles tels que la schizophrénie, l'autisme, la dépression, ou encore de symptômes de douleur chronique. Cependant, nous ne comprenons pas encore comment les circuits du cortex fonctionnent normalement ni comment ils se dérèglent dans ces troubles. Nous espérons que ces études nous permettront d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces troubles. Grâce à l'utilisation d’animaux génétiquement modifiés, nous serons en mesure de cibler des types de cellules et des réseaux spécifiques afin de fournir un cadre physiopathologique permettant de comprendre les maladies du cerveau et à long terme améliorer nos connaissances dans ce domaine afin d’améliorer également la prise en charge des patients.
Procédures
Un petit prélèvement du bout de la queue sera fait sur une partie des jeunes animaux vigiles (1 fois, moins d’1min). Durant une procédure chirurgicale menée sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée, une partie des animaux recevra une injection dans une zone du cerveau (1 fois, durée 45minutes maximum). Une autre partie des animaux aura en plus de l’injection une implantation d’un dispositif sur leur tête lors de la même procédure chirurgicale, toujours sous anesthésie générale et analgésie adaptée (1 fois, durée 1h maximum). Ils seront ensuite habitués au dispositif expérimental pendant 5 jours, avec 1 à 2 sessions quotidiennes en commençant par quelques minutes et en augmentant progressivement jusqu'à 1h30 maximum . L’habituation pourra être prolongée d’1 semaine si nécessaire, soit 20 sessions maximum par animal avec 1h30 maximum par session. Puis pour une partie de ces animaux des enregistrements quotidiens de 1h30 sont effectués, sur animal vigile, pendant 4 jours consécutifs, pendant 3 mois avec 1 semaine de repos entre chaque période d’enregistrements de 2 semaines, soit 32 sessions maximum par animal avec 1h30 maximum par session. Pour l’autre partie, un protocole d'enregistrement similaire sera mis en œuvre mais précédé d’une courte anesthésie générale pour implanter un dispositif d’enregistrement cérébral (60 minutes, une fois). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire, avec une partie d’entre eux euthanasiée lors d’une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie adaptée (sans réveil, durée 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir un stress dû aux manipulations et contentions nécessaires au cours du projet. L'implantation d'une plaque métallique sur la tête des animaux pour l'imagerie biphotonique nécessite une procédure chirurgicale qui pourra générer une douleur et un inconfort pendant quelques jours ainsi qu’un risque d’infection. Une telle procédure implique une anesthésie générale qui entrainera une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque de dépression cardio-respiratoire. De plus, après l'implantation de la plaque métallique, l'animal devra vivre dans la cage avec cette plaque métallique sur la tête, ce qui peut provoquer une gêne due à l’encombrement et limiter son comportement habituel. Afin d'imager l'animal sous un éclairage à deux photons et réaliser des enregistrements neurophysiologiques, les animaux seront éveillés mais leur tête sera immobilisée, ce qui limitera les mouvements de la tête et génèrera un stress pour les animaux. Pour connaitre le patrimoine génétique des animaux nous prélèverons un petit fragment de la queue pouvant générer une brève et légère douleur.
Devenir
À la fin des procédures, une partie des animaux sera euthanasiée afin de réaliser des analyses post-mortem et les autres seront euthanasiés car il ne pourront pas être réutilisés en raison de leur modification génétique.
Remplacement
Il n’y a malheureusement pas d’alternatives à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car l'objectif est de découvrir le fonctionnement de zones spécifiques dans le cerveau intact. Il s'agit d'une question empirique qui nécessite l'examen de circuits intacts pour y répondre. Il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie neuronale des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact, ces expériences ne seraient pas possibles en culture cellulaire. Il est important de noter que notre projet scientifique global comporte une composante alternative à l’expérimentation animale: l’analyse de modèles in silico (création d’un modèle numérique du circuit neuronal étudié incluant les résultats de notre caractérisation expérimentale). Ce modèle sera diffusé publiquement et constituera une alternative à l’expérimentation animale pour l’étude du rôle fonctionnel de certaines cellules cérébrales spécifiques.
Réduction
Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (5160) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Le nombre d'animaux utilisés dans les procédures sera réduit en effectuant différentes procédures sur un seul animal : les animaux recevront des injections virales et l’imagerie simultanément afin de maximiser les mesures longitudinales multiples sur le même animal. Nos compétences chirurgicales permettront également de réduire le nombre de complications chez les animaux et de minimiser les dommages durables. En outre, notre expertise dans l'entraînement des animaux à être fixées par la tête dans l'installation d'imagerie réduira également la variabilité et, dans une large mesure, les nombres globaux nécessaires pour obtenir une signification statistique dans les cohortes. Enfin, notre choix de la taille de l'échantillon est basé sur des études précédentes et est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille de chaque groupe sera déterminée par l'utilisation de tests statistiques appropriés, y compris le calcul de puissance. La taille réelle de l'échantillon dépendra de la variabilité de la lecture biologique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et qu’il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Il est également important de noter que le projet comporte un plan de partage de données. Les données expérimentales seront disponibles en libre accès sur la plateforme ebrains.eu (la plateforme de partage de données neuroscientifiques financées par l’U.E.) ce qui permettra à d’autres équipes de profiter de ces données, leur évitant ainsi de reproduire ces expériences, et réduira donc le nombre d’animaux utilisés à terme.
Raffinement
Les méthodes utilisées et la manière de traiter les animaux pendant les expériences et dans l’animalerie assureront à ces derniers un minimum de contraintes et un maximum de bien-être. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les procédures expérimentales sont les plus appropriées pour minimiser toute douleur, souffrance, anxiété/détresse ou dommage que les animaux pourraient subir. Des mesures telles que la formation du personnel, l'habituation, l'acclimatation et le temps de récupération sont prises pour réduire tout au maximum l’impact physique et psychologique potentiel des procédures expérimentales. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton et maison) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. Les animaux auront à manger et à boire à volonté. Ils seront observés quotidiennement. La préférence pour les procédures non invasives par rapport aux procédures invasives est prise en considération et, lorsque des interventions invasives sont nécessaires, les directives appropriées en matière d'anesthésie/analgésie seront suivies, en accord avec la structure chargée du bien-être animal. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera le plus petit possible et réalisé sur de jeunes animaux (cicatrisation rapide). Nous vérifierons ensuite la bonne reprise en charge des petits par leur mère. Toutes les interventions chirurgicales seront effectuées sous anesthésie générale et des analgésiques seront administrés avant et après les interventions pour limiter la douleur. Un soutien nutritionnel et hydrique ainsi qu’une surveillance étroite seront mis en place à la suite des chirurgies pour s’assurer de la bonne récupération des animaux. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Les propriétés de base des microcircuits de cellules du cerveau chez la souris sont similaires à celles des autres mammifères, y compris l'homme, ce qui rend les résultats obtenus avec un tel modèle éventuellement transposables à la médecine humaine. Actuellement, seuls les modèles murins nous permettent de visualiser les types de cellules spécifiques que nous étudions. Les souris peuvent être génétiquement modifiées révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. Le développement du cerveau chez la souris est très bien caractérisé, ce qui facilite les études anatomiques et fonctionnelles. Dans ce projet, nous prévoyons d'étudier les mécanismes cellulaires aux stades précoces et tardifs du développement. C'est pourquoi nous prévoyons d'utiliser des animaux pour certaines procédures dès leur naissance et pour d'autres jusqu'à plusieurs mois. Les animaux reproducteurs seront mis en accouplement à partir de l’âge de 2 mois environ jusqu’à l’âge de 12 mois maximum. Dans le cadre de notre étude, nous prévoyons de déterminer le patrimoine génétique des animaux avec un petit prélèvement de l’extrémité de la queue à l’âge de 7 à 10 jours.
Rôles de protéines associées à la neuroinflammation dans les traumatismes de la moelle épinière [EU 2/2]
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux souches de souris génétiquement modifiées pour ne pas exprimer une protéine du système nerveux central fournissent les 192 animaux de ce projet, utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. La moitié subit une hémisection de la moelle épinière sous anesthésie, opération de trente minutes qui paralyse une patte arrière, altère le contrôle du sphincter urinaire et peut provoquer des escarres. Les tests sont détaillés : activité motrice spontanée pendant huit minutes, marche et coordination pendant dix minutes, force d'agrippement, qualité du nid sur vingt-quatre heures, temps de toilettage et latence à rejoindre la nourriture, répétés jusqu'à six semaines après la lésion. Toutes les souris sont tuées pour prélever les tissus destinés aux analyses histologiques, les animaux utilisés étant les surnuméraires issus des croisements menés pour un autre projet.
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière touchent 2.5 millions de patients dans le monde (dont 40 000 en France) et induisent des symptômes allant de troubles neurologiques minimes à la tétraplégie complète souvent associés à des douleurs chroniques. Bien que les lésions de la moelle épinière touchent des personnes relativement jeunes (moyenne d’âge à 40 ans), le nombre de patients plus âgés est en nette croissance dans les pays industrialisés. L’étude de cette pathologie représente un enjeu majeur. Il n'existe aucun traitement curatif efficace pour aucun des symptômes induits par une lésion de la moelle épinière. Il est donc de grand intérêt de mettre en place des stratégies thérapeutiques visant à augmenter la récupération motrice et sensitive suivant une lésion de la moelle épinière. Après une lésion de la moelle épinière une cicatrice se forme et constitue un obstacle à la transmission des informations depuis le cerveau au reste du corps ainsi que du corps vers le cerveau. Les cellules immunitaires du système nerveux central jouent un rôle prépondérant dans les réponses neuroinflammatoires suite à une lésion de la moelle épinière. Nous voulons étudier si l’absence d’expression de protéines spécifiques qui sont modulées après lésion de la moelle épinière et associées à la neuroinflammation favorise une meilleure récupération. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les lésions de la moelle épinière induisent des symptômes allant de la paraplégie partielle à la tétraplégie complète. Il n’y aucun traitement permettant de soigner les patients. Développer des travaux visant à favoriser la récupération après lésion de la moelle épinière représente donc un enjeu majeur tant sur le plan de la santé individuelle que sur le plan économique et social. Nous cherchons à caractériser les conséquences de l’absence d’expression de deux protéines spécifiquement dans un type de cellule du système nerveux au niveau de la moelle épinière dans un contexte pathologique tant sur le plan cellulaire et tissulaire que comportemental. Nous obtiendrons des informations importantes sur le rôle de ces protéines qui restent méconnues à ce jour dans les lésions de la moelle épinière lors de la mise en place et le maintien de l’inflammation. Cette étude permettra de déterminer précisément leur importance après lésion moelle épinière chez les deux sexes et d’envisager des stratégies appropriés pour une approche visant à développer des thérapies adaptées.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions. Les animaux recevront des injections quotidiennes (moins d’1 minute) en intra-péritonéal durant 5 jours à l’âge de 5-8 semaines sur le site 1 . Les animaux seront transférés du site 1 vers le site 2 selon la réglementation et avis du vétérinaire. Sur le site 2, les animaux subiront des lésions de la moelle épinière sous anesthésie générale et analgésie (30 min ; n=96). Les animaux seront évalués au niveau comportemental pour déterminer les fonctions motrices et évaluer l’anxiété avant et après lésion de la moelle épinière. L’évaluation comportementale analysera l’activité motrice spontanée durant 8 minutes, la marche et la coordination des animaux durant 10 minutes et la force d’agrippement des animaux (2 minutes par animal par session). Les manipulations peuvent engendrer un stress léger. Les tests seront faits 7 jours et 24 heures avant la lésion, puis à J3, J5, J7, J10 et J14 postopératoire puis 1 fois par semaine jusque 6 semaines post-opératoires. Les comportements de type anxieux seront évalués par des tests qui évaluent la qualité du nid fait par un animal durant 24 heures, le temps de toilettage durant 5 minutes, et le temps que met l’animal à aller au contact de la nourriture durant 5 minutes. Ces tests seront effectués deux fois, au début et à la fin de la procédure. Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d’organes post-mortem.
Impact sur les animaux
Une anesthésie peut induire une hypothermie transitoire et un dessèchement de la cornée. Les injections quotidiennes en intra-péritonéal peuvent induire un stress pour l’animal. Le transport et le changement de site peut induire un stress pour l’animal. Nuisances motrices : paralysie de la patte arrière du côté de la lésion de la moelle épinière (hémisection). Une récupération spontanée du support de poids est observée dès le 5ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection. Nuisance urinaire : le contrôle du sphincter urinaire est altéré après une hémisection, une récupération spontanée est observée dès le 7ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection. Suite à la chirurgie les animaux sont observés quant au développement de signes légers relatifs à la détérioration de l’état de santé de l’animal. 24-48hrs suivant la lésion, les animaux peuvent présenter des signes de douleurs. Suite à la chirurgie, une perte de poids est observée pendant 1 à 2 jours après la lésion. A cause de la paralysie des escarres peuvent se former. Suite à la lésion, des comportements de dominance peuvent être observés. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.
Devenir
A la fin des expériences, les animaux seront euthanasiés afin collecter les tissus d’intérêt pour faire des analyses post mortem histologiques et cellulaires.
Remplacement
Pour éviter l'expérimentation animale, on encourage l'utilisation de cultures de cellules nerveuses. Cependant, ces cultures ne peuvent pas reproduire entièrement la complexité des organismes vivants. Les modèles animaux de traumatisme de la moelle épinière sont actuellement considérés comme la méthode la plus adaptée pour étudier cette pathologie, car ils reproduisent de manière fidèle les différents aspects pertinents chez l'humain. Ces modèles permettront d'explorer les changements provoqués par l'absence d’expression de 2 protéines du système nerveux de manière spécifique dans un type de cellule et faciliteront l'évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. L'utilisation d'animaux est nécessaire à cette étape préclinique et demeure cruciale pour envisager des applications cliniques.
Réduction
Les animaux sont utilisés pour plusieurs analyses, les deux sexes sont utilisés. Pour estimer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment au laboratoire. Nous avons également calculé le nombre d'animaux avec un logiciel de biostatistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant des effectifs pertinents pour répondre à notre hypothèse biologique. Ces animaux sont générés et aussi utilisés dans le cadre d’une autre demande de projet et nous utiliserons les animaux surnuméraires issus des croisements effectués sur le site 1. De plus, cela évitera de développer cette lignée en doublon dans l'animalerie du site 2.
Raffinement
Les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages de transport agréées sous condition d’autorisation pour le statut sanitaire (distance 2,7km). Puis période d’acclimatation pour les animaux d’une période de 7 jours sur le site d’accueil. Afin de réduire le stress, les expérimentateurs seront toujours les mêmes au cours de l’étude et les animaux seront habitués aux tests. Une attention particulière sera portée à l’enrichissement de l’environnement (hutte, coton). Pour la gestion de la douleur, utilisation d’anesthésiants et d'analgésiques adaptés mais compatible avec les lésions de la moelle épinière et le type de données analysées. Afin de réduire la souffrance : soins quotidiens spécifiques. L'absence de signes anormaux sera vérifié 2 fois par jour après la lésion. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux le plus utilisées dans le cadre de la recherche sur les lésions de la moelle épinière, en particulier avec le développement de plusieurs modèles chirurgicaux différents (section, compression, contusion). Ces 2 souches de souris génétiquement modifiées n’expriment pas une protéine du système nerveux central dans un type de cellules associé à la neuroinflammation. Cela en fait donc des modèles de choix pour déterminer les conséquences de l’absence de ces protéine après une lésion médullaire sur l’inflammation. Les animaux sont opérés à 3 mois et observés pendant 6 semaines. Nous utilisons des animaux adultes car les souris plus jeunes présentent des phénomènes de récupération spontanée non seulement plus importants mais surtout non homogènes. Ceci n’est ni compatible avec des analyses statistiques fiables ni avec notre optique de transposition à la clinique.
Traitement du diabète de type 1 par administration intranasale combinée d’antigènes modifiés et d’anticorps chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Anesthésiées pour recevoir un produit dans le nez une à quatre fois par semaine, les souris de ce projet subissent aussi une injection intraveineuse, un prélèvement de sang et un recueil d'urine hebdomadaire pendant six à vingt-cinq semaines. Elles sont 1 530, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que les femelles développent un diabète, perdent du poids et s'affaiblissent jusqu'au décès en trois semaines environ, la mesure du sucre dans les urines servant de seuil pour déclencher la mise à mort. L'objectif déclaré est de prévenir le diabète de type 1 chez de jeunes enfants au stade prédiabète, et l'effectif de 1 530 souris n'est appuyé par aucun calcul, le porteur écrivant seulement qu'il sera "réduit au minimum".
Objectifs
Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune résultant de la destruction des cellules bêta du pancréas, productrice d’insuline, par le système immunitaire. Son incidence est en constante augmentation et touche des enfants et adolescents de plus en plus jeunes. Actuellement, on ne guérit pas du diabète. Son traitement est uniquement palliatif, et implique des injections pluriquotidiennes d’insuline, impactant gravement la qualité de vie des patients et n’empêchant pas des complications à long terme. De nombreuses thérapies ont été testées dans le diabète de type 1, avec des succès souvent très mitigés, probablement dus à une intervention trop tardive, c’est-à-dire chez des patients déjà diabétiques alors qu’une grande majorité des cellules bêta est détruite. Les efforts se concentrent maintenant sur la possibilité d’arrêter ou du moins freiner le développement de la maladie au stade « prédiabète ». Cette approche préventive, ciblant principalement de jeunes enfants, implique la mise en place de thérapies avec une grande spécificité d’action et l’utilisation d’une voie d’administration non invasive pour faciliter leur application clinique. Dans ce projet, l'effet de nouvelles thérapies et combinaisons thérapeutiques sera testée dans un modèle de souris qui développe un diabète de type 1 de manière très similaire à l’homme. Des molécules produites par la cellule bêta (telles que l’insuline), modifiées pour augmenter leur efficacité, ainsi que des anticorps qui agissent en s'attaquant à la cause immunologique du diabète de type 1, seront administrés par voie intranasale. Ce choix est motivé par un intérêt clinique grandissant pour cette voie d'administration simple pour délivrer des anticorps, combattre l'inflammation et bénéficier des mécanismes de tolérance immunitaire associés aux muqueuses.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter la preuve de concept des effets thérapeutiques de nouvelles molécules innovantes administrées seuls ou en combinaison par voie intranasale pour moduler les réponses immunitaires et prévenir la maladie chez les enfants au stade de prédiabète. En cas de succès, ces recherches pourraient permettre d’envisager un premier essai clinique de prévention de la maladie qui touche principalement les enfants et adolescents. Cette stratégie, combinant une grande spécificité d’action et l’utilisation d’une voie d’administration non invasive, remplit les exigences de sécurité sanitaire inhérentes au ciblage de populations pédiatriques.
Procédures
*Administration intranasale sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée 1 à 4 fois par semaine (1/jour). *Injection intraveineuse sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée seule 1 fois. *Prélèvement de sang sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectué 1 seule fois. *Prélèvement d’une goutte d’urine pour mesure du taux de sucre sur souris vigile, 10 secondes, 1 fois/semaine, pendant 6 à 25 semaines.
Impact sur les animaux
Les souris femelles développent un diabète (taux anormalement élevé de sucre dans le sang). Elles perdent alors du poids et s’affaiblissent jusqu’au décès en environ 3 semaines. Les souris peuvent également subir un léger stress lié à l’anesthésie et ressentir des douleurs modérées liées à l’injection intraveineuse et au prélèvement sanguin.
Devenir
Les souris sont mises à mort pour récupération de différents organes nécessaires pour répondre à la question scientifique.
Remplacement
Des tests cellulaires appropriés seront utilisés pour répondre à des questions mécanistiques précises visant à analyser l’impact des protéines sur les réponses immunitaires. Cependant l’expérimentation animale est indispensable pour évaluer sur modèle vivant l’efficacité thérapeutique de la stratégie proposée pour la prévention du diabète de type 1 et comprendre les mécanismes immunitaires responsables de la pathologie et de l’effet thérapeutique observé.
Réduction
Le nombre de souris utilisé sera réduit au minimum tout en permettant une analyse statistique fiable des résultats. Pour chaque souris traitée, plusieurs organes seront prélevés, incluant le tissue nasal, poumons, rate, ganglions et pancréas pour de multiples analyses afin d’obtenir le maximum d’information biologiques et mécanistiques. Aussi, afin de diminuer le nombre de souris utilisé, le protocole donnant le meilleur effet thérapeutique sera déterminé avant de lancer de nouvelles expériences pour comprendre les mécanismes responsables de cet effet.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus (groupes sociaux) dans un environnement enrichi. Des points limites adaptés ont été établis (notamment la mesure du sucre dans les urines pour diagnostiquer un diabète) permettant de mettre à mort l’animal en cas de signes de souffrance ou de développement d’un diabète.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix dans les études sur le diabète de type 1 étant donné la bibliographie existante sur le sujet et la caractérisation des réponses auto-immunes chez cette espèce, et leur similitude avec les observations chez l'homme. Les expériences seront réalisées chez des souris adultes à partir de 6 semaines d’âge afin que les souris aient un système immunitaire mature mais suffisamment jeune pour impacter le développement du diabète.
Dynamique et plasticité cérébrale lors de l’anesthésie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
336 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement histologique. Chacune reçoit un implant posé au cours d'une chirurgie d'une heure, la moitié recevant en plus une injection de virus directement dans le cerveau, avant d'être maintenue la tête fixée pendant trois heures d'anesthésie. Les tests de mémoire durent environ une heure et encadrent l'anesthésie, deux jours avant et jusqu'à trois jours après, l'objectif étant de relier les tracés d'électroencéphalogramme aux activités neuronales profondes du cortex et du thalamus pour mieux piloter l'anesthésie humaine. Le porteur reconnaît que certains aspects de la mémoire spatiale peuvent être altérés, et écrit ignorer ces troubles dont la caractérisation est justement l'objet du projet. Sur le remplacement, il affirme que l'étude des dynamiques cérébrales et de leurs conséquences comportementales ne peut se faire que sur des animaux.
Objectifs
Chez l’humain, l’électroencéphalogramme (EEG) est actuellement le meilleur moyen utilisé pour suivre et piloter l’état de l’anesthésie des patients qui subissent une chirurgie ou une endoscopie en milieu hospitalier et pour lesquels une grande variabilité de réponse à l'anesthésie existe selon l'âge, le sexe et la condition physique. La lecture des marqueurs EEG pour le pilotage peut être ambigüe si une grille de lecture des marqueurs EEG n'est pas associée, pouvant conduire ainsi à un surdosage ou sousdosage. De plus, il est parfois difficile de prévenir sans les identifier certains des marqueurs EEG associés à des troubles cognitifs post-opératoires et de comprendre d'où ces troubles peuvent venir. Pour surmonter ces inconvénients de l'anesthésie clinique et comprendre les changements de plasticité cérébrale à l'origine des troubles cognitifs, ce projet vise à caractériser les activités neuronales sous-jacentes des marqueurs EEG au cours des différentes phases de l’anesthésie générale : induction, maintenance et réveil et mesurer si une plasticité s'opère pendant ces états anesthésiés selon la profondeur de ceux-ci. Cette caractérisation indiquera quelles structures sont impliquées dans les marqueurs EEG et expliquera les transitions entres les états cérébraux de l'anesthésie. Ces transitions pourront ainsi être mieux prédites et maitrisées par le dosage de l'anesthésique en amont de l'avènement des états non souhaitables de l'anesthésie. Le projet s'effectuera chez la souris afin d'enregsitrer les neurones de structures profondes du cortex et du thalamus notamment impliqués dans les marqueurs EEG les plus caractéristiques. En tant que mammifère la souris a essentiellement la même structure cérébrale ainsi que la même architecture temporelle de l'EEG que l'humain en réponse à l'anesthésie. L’enregistrement de l’activité des neurones en même temps que l’EEG visera à mieux comprendre le caractère prédictif de certains états sur le comportement et la plasticité et de prévoir des troubles cognitifs post-anesthésie. L'utilisation d'animaux transgéniques dans ce projet permettra d'induire des stimulations optogénétiques qui sont essentielles pour mesurer les changements de force de la connectivité dans le réseau et donc la plasticité induite par l'anesthésie. L’application médicale du projet est de prévenir de façon personnalisée les causes des troubles cognitifs observés chez certains patients subissant une anesthésie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes cérébraux de l’anesthésie et d’altération de la mémoire par celle-ci. Nous nous intéresserons en particulier au réseau thalamo-cortical et à l’hippocampe, des structures qui chez l’homme jouent un rôle clef dans la mémoire des souvenirs personnels (mémoire épisodique) et des faits généraux (mémoire sémantique), et qui est particulièrement impactée lors de troubles post-anesthétiques réalisés en conditions hospitalière. À ce titre, l'amélioration des méthodes du pilotage de l'anesthésie a déjà été entamée dans le cadre de la collaboration (hôpital-entreprise-laboratoire) financée par ce projet. Le projet permettra d'encore mieux prédire les états non désirables de l’anesthésie mais aussi de remédier aux troubles cognitifs induits par celle-ci. Le projet aura des bénéfices pour la recherche médicale, pour les connaissances sur la plasticité cérébrale et des conséquences de l’anesthésie chez les personnes fragiles notamment ayant des dégénérescences cérébrales.
Procédures
Ce projet utilisera 336 souris. Les animaux seront implantés (durée d'intervention : 1h) au préalable de toute tâche comportementale ou enregistrement afin de pouvoir enregistrer leur activité cérébrale (EEG et neuronale) au cours du processus d’anesthésie. La moitié sera aussi préalablement injectée d’un virus de façon intracérébrale, de façon à pouvoir stimuler certaines populations neuronales. Pendant l’anesthésie (durée totale prévue 3h) les souris seront maintenues en tête fixée ce qui est un protocole classique pour l’étude électrophysiologique en conditions vigile et anesthésiée. Des tests comportementaux (durée de test environ 1 heure) où la souris doit explorer son environnement motivée ou non par l'obtention d'une récompense, permettront de mesurer ses capacités de mémoire (à court terme et long terme, un test de chaque type) avant et après la phase anesthésiée. Ces tests durent une heure environ de 2 jours avant l'anesthésie et jusqu'à 3 jours après l'anesthésie.
Impact sur les animaux
Certains animaux, qui subissent une chirurgie longue (pour la pose de l'implant), peuvent souffrir d'effets indésirables comme l'hypothermie, la déshydratation et les douleurs post-opératoires. De plus les anesthésies longues et trop profondes sont le sujet de notre étude pour savoir si l'anesthésie peut avoir un impact sur les performances cognitives à long terme. Il est donc possible que comme indiqué chez l'humain que certains aspects de mémoire spatiale soient altérés. Cependant nous ignorons ces troubles et le but est de les caractériser.
Devenir
À l'issue de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort. La validation des enregistrements nécessite un prélèvement histologique.
Remplacement
Certains mécanismes cellulaires et moléculaires de l'anesthésie peuvent être abordés in vitro. Certaines propriétés computationnelles de réseaux de neurones peuvent être testées sous forme de simulation numérique. Mais in fine, l’étude des dynamiques cérébrales au cours de l’anesthésie et ses conséquences comportementales nécessite de faire des liens corrélationnels et causaux précis entre activité neuronale à grande échelle et comportements d’apprentissage et de mémoire. Elle ne peut se faire que sur des animaux au cours même de l’apprentissage, du sommeil et du rappel. Une partie des mécanismes de plasticité sera testé in vitro dans un projet séparé afin d’étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents des observations de plasticité observés in vivo.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons des systèmes d'acquisition haute densité, permettant d'enregistrer >100 neurones simultanément ou sur plusieurs sites au travers du cortex, l’hippocampe et le thalamus, ce qui maximisera la quantité d'information apportée par chaque animal. Les études utilisant ce type d’approches permettent de publier avec des résultats statistiquement significatifs une vingtaine d’animaux. Nous utiliserons les mêmes animaux pour tester les performances cognitives (test de mémoire spécifique) et les expériences de mesures de plasticité afin de diminuer le nombre d’animaux.
Raffinement
Après les chirurgies, les souris seront surveillées et les points limites évalués quotidiennement pendant une semaine afin de déceler des signes de douleur sur la base de la grille d'évaluation de la douleur validée pour éviter toute souffrance des animaux. Les soins post-opératoires incluront des traitements antibiotiques, analgésiques, ainsi qu'une surveillance quotidienne des animaux. Les systèmes d’enregistrement sont miniaturisés au maximum pour s’assurer que les animaux implantés aient un comportement tout à fait normal. Nos expériences s'effectueront sur des animaux soit anesthésiés pour les besoins de l’expérience, soit vigiles, en tête fixée afin d’optimiser les conditions d’enregistrement des transitions entre l’état d’éveil et l’état éveillé. Ils peuvent s’alimenter et se nettoyer librement la face avec leurs pattes. L'ajustement des électrodes est indolore et ne nécessite pas d’opération particulière lorsque l’animal est tête fixée. Les animaux peuvent être hébergés par deux afin de favoriser les échanges sociaux.
Choix des espèces
Le rongeur est l’espèce standard pour toutes les études des bases neurophysiologiques de la mémoire. Ce sont les modèles pour lesquels les outils expérimentaux sont les plus développés. De plus les souris sont faciles à habituer dans un système de contention nécessaire pour le protocole expérimental utilisé. Nous utiliserons des adultes (à partir de 3 mois jusqu'à 14 mois) de façon à mesurer si les effets de l’anesthétique sont semblables selon l'age. En effet chez l’humain la sensibilité est plus élevée chez les patiens agés. Sur chaque groupe de 12 animaux, 3 tranches d'âge seront sélectionnés : 3 à 6 mois, 7 à 12 mois et 13 à 15 mois afin de mesurer et corréler l'effet de l'âge avec les effets de l'anesthésie.
Evaluation de l’efficacité de traitements par radiothérapie interne vectorisée chez la souris porteuse de tumeur EU 2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
Jusqu'à six séances d'imagerie sous anesthésie de cinquante-cinq minutes, une irradiation du corps entier et deux injections intraveineuses par semaine sur trois semaines : 5 490 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie reçoit une greffe de cellules ou de fragments tumoraux sous la peau ou dans la graisse mammaire, avec des nécroses et une perte de poids possibles, et les femelles des modèles hormonodépendants peuvent être mises sous estradiol au risque de calculs rénaux. L'objet est d'évaluer l'efficacité antitumorale de traitements par radiothérapie interne vectorisée et de mesurer les doses de radioactivité reçues par la tumeur comme par les organes sains, pour les extrapoler ensuite à l'être humain. Le porteur retient la souris parce que son génome est connu, que la prise tumorale est homogène sur un fond génétique stable et qu'elle est compatible avec les appareils d'imagerie du laboratoire, proches de ceux de la clinique.
Objectifs
Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. Dans ce contexte, l’objectif de nos projets est le développement de nouvelles thérapies utilisant la radiothérapie interne vectorisée (RIV). Cette dernière repose sur le principe suivant : « attacher » une molécule radioactive à une molécule biologique qui joue le rôle de transporteur et va reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales. Pour la thérapie, on utilise de la radioactivité Beta- ou Alpha qui est très vite arrêtée par la matière mais possède une grande énergie. Elle va ainsi détruire les cellules à proximité immédiate de l’endroit où elle est transportée. Pour que le traitement par RIV soit efficace, il faut d’abord s’assurer qu’il se lie bien aux cellules tumorales, c’est pourquoi le développement de ces nouveaux traitements est souvent associé au développement d’un examen diagnostique (qui fait l’objet d’une autre DAP). Il est également nécessaire de bien valider que le traitement ne va pas se fixer et endommager les organes sains et qu’il exerce une action antitumorale. Nos objectifs sont donc doubles : * Evaluer l’efficacité antitumorale de traitements RIV visant la même cible. * Evaluer précisément les doses de radioactivité reçues à la tumeur mais également aux autres organes pour les extrapoler à l’homme lors de travaux nommés études dosimétriques afin de s’assurer que le traitement sera efficace sur la tumeur et sans danger sur les organes sains. Ce projet est un projet multisite entre deux Etablissements Utilisateurs différents.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de caractériser précisément des nouveaux composés de RIV pour proposer un traitement parfaitement personnalisé aux patients en utilisant la radiothérapie interne vectorisée, modalité thérapeutique actuellement en plein essor.
Procédures
*Induction tumorale : Sous anesthésie
Impact sur les animaux
- Certaines souris seront immunodéficientes et pourraient développer des pathologies du fait de leur manque de défenses immunitaires si elles n’étaient pas hébergées dans des conditions sanitaires protégées. - L’irradiation corps entier chez certains animaux va éliminer les défenses immunitaires et fragiliser l’animal qui pourrait développer des infections s’il n’était pas maintenu sous des conditions sanitaires protégées. - L’implantation sous cutanée ou dans la graisse mammaire de cellules tumorales ou des fragments de tumeurs va mener à une masse sous cutanée qui pourrait si elle est menée trop loin, gêner l’animal dans ses mouvements et impacter son état général. De plus, des nécroses peuvent apparaitre. Il est aussi possible, que la progression tumorale entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. - Pour les études sur modèles hormonodépendants, les animaux pourront être mis sous estradiol qui peut induire des calculs rénaux. - Afin d’observer des effets de composé sur l’évolution de la tumeur, les animaux recevront des traitements de composés dans différents schémas d’administration qui pourront induire un stress léger. - La contention des souris pour manipulation lors de la mesure de la taille des tumeurs et de la mise sous anesthésie pourrait provoquer un léger stress. - A la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress de 1 à 2 jours. - L’injection intraveineuse pourrait également provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les produits administrés pour la thérapie peuvent provoquer une perte de poids transitoire.
Devenir
Différentes mesures de radioactivité et analyses complémentaires réalisées sur les organes prélevés post-mortem sont nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques de nos études. La totalité des animaux seront donc euthanasiés en fin d’étude.
Remplacement
Pour étudier le devenir d’une molécule dans l’organisme et évaluer l’efficacité d’un traitement anticancéreux, il n’est pas possible de se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes et donc d’études sur animaux. Des études préliminaires réalisées in vitro nous permettrons néanmoins de valider que la molécule étudiée atteint bien sa cible et que le traitement envisagé est bien efficace sur la lignée étudiée.
Réduction
Une sélection des composés avec la meilleure activité sera réalisée in vitro en amont de toute utilisation in vivo et permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaire à son strict minimum. L’effectif d’animaux dans les groupes expérimentaux a été adapté pour chaque type d’étude afin de mener à des résultats scientifiquement pertinents tout en réduisant l’effectif à son maximum. Par expérience, les groupes de n=10 souris sont suffisamment robustes pour les études d’efficacité pour prendre en compte les variabilités de réponse au traitement et de pousse tumorale sur le long terme. Enfin, les 1ères données obtenues sur les études dosimétriques permettent d’optimiser les groupes avec n=7 souris pour s’assurer l’obtention de résultats interprétables. Enfin, la bonne connaissance de la pousse tumorale pour chaque modèle, permet d’optimiser le nombre d’animaux pour chaque étude et d’implanter uniquement le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des groupes porteurs de tumeurs de tailles homogènes.
Raffinement
La majorité des procédures (injection intraveineuse, intratumorale, et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit / plaque chauffant(e) réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. La fréquence de mesure des volumes tumoraux sera adaptée à la vitesse de croissance du modèle. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Les animaux sont observés quotidiennement. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître tout signe de souffrance. La SBEA (Structure chargée du Bien Être des Animaux) de l’établissement a mis en place une grille détaillée de suivi des animaux et identification des signes de douleur / souffrance permettant d’identifier au plus tôt les signes et de les prendre en charge. Les animaux seront hébergés par groupes de 2 à 10 individus en fonction de la taille des cages et du nombre d’animaux par groupes. L’eau et la nourriture seront données ad libitum. Au minimum une sorte d’enrichissement sera placé dans chaque cage (sizzle-dry ou tubes en polycarbonate ou bâton de bois). La greffe de tumeur est réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Lorsque l’implantation nécessite l’incision de la peau (cas de l’implantation des fragments de tumeurs ou dans la graisse mammaire), la chirurgie est réalisée de façon aseptique et les animaux reçoivent une injection de buprénorphine, des soins opératoires (maintien de la température), surveillance post opératoire et soins post opératoires adaptés si nécessaires. Le transport vers la plateforme d’irradiation sera réalisé par un transporteur agréé, et le trajet ne dépassera pas 2h. Les animaux seront irradiés directement dans leur cage et leur environnement (cage, litière, enrichissement et nourriture) ne sera pas modifié. Les biberons seront remplacés par de l’eau gélifiée déposée dans leur cage. A leur retour dans l’animalerie, les animaux seront changés de cages. Les animaux seront transportés par un transporteur agréé de l’EU1 vers l’EU2 (environ 1km de trajet) dans des cages avec litière, enrichissement et nourriture. Les biberons seront remplacés par de l’eau gélifiée déposée dans leur cage. A leur arrivée dans l’animalerie de l’EU2, les animaux seront changés de cages.
Choix des espèces
Les souris constituent un modèle de choix en pharmacologie car leurs génomes sont connus et leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). Enfin, elles sont compatibles avec nos systèmes d’imagerie utilisés pour la caractérisation préalable des traceurs eux-mêmes très proches des appareillages d'imagerie, facilitant par là même le transfert à la clinique (recherche translationnelle). Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études d’oncologie. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant une assez bonne reproductibilité. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Toutefois, ils pourraient être reçus à partir de 5 semaines mais ne seront pas manipulés avant 7 semaines minimum. Les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés chez les patients adultes. Il est donc justifié de travailler sur des animaux adultes possédant des fonctions physiologiques proches de la future cible humaine
Enseignement de techniques chirurgicales chez le Porc, le Mouton, le Lapin, le Rat et la Souris
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 4000
Lapins : 100
Cochons : 750
Moutons : 100
Former des internes en chirurgie, des vétérinaires et des scientifiques aux gestes de base mobilise ici 5 950 animaux non-humains, dont 4 000 rats, 1 000 souris, 750 cochons, 100 moutons et 100 lapins. 4 950 d'entre eux sont opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil, les 1 000 autres étant utilisés pour l'apprentissage du gavage, des injections et de la contention, dans des procédures classées en souffrance légère. Chaque animal peut rester une demi-journée à une journée entière sous anesthésie pendant que se succèdent laparotomies, thoracotomies, sutures et anastomoses digestives ou vasculaires, le porteur indiquant faire passer le maximum d'étudiants sur chacun. Les souris viennent de l'élevage maison, écartées pour n'avoir pas le bon génotype, et les rats sont achetés "réformés" chez des fournisseurs, c'est-à-dire déjà destinés à être tués.
Objectifs
Le but est d'aider à la formation médicale pratique initiale des étudiants en médecine (internes des spécialités chirurgicales essentiellement, externes) et des étudiants en sciences (dès le Master 2). Nous assurons également la formation chirurgicale continue auprès des chirurgiens, des vétérinaires et des scientifiques dans le cadre des formations à la chirurgie expérimentale ainsi que pour concevoir ou réaliser des procédures expérimentales obligatoires pour toute personne pratiquant un acte chirurgical chez l'animal de laboratoire.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont que les étudiants en chirurgie soient formés aux techniques chirurgicales de bases afin d'avoir toutes les compétences nécessaires à leur activités en fin de cursus, que les chirurgiens ou vétérinaires en activité se forment aux nouvelles techniques chirurgicales et que les scientifiques apprennent les bonnes pratiques et gestes avec les différents modèles animaux (contention, gavage, injection intrapéritonéale, intraveineuse,...) encadrés par des personnes compétentes afin de pouvoir poursuivre leurs recherches dans les meilleures conditions pour eux et pour l'animal (Raffinement).
Procédures
Une partie des petits mammifères (rats et souris) serviront à l'enseignement des gestes de base tels que gavage, injection intrapéritonéale, intraveineuse, contention. Pour les autres et les grands mammifères, les formations visent à former les futurs chirurgiens, gynécologues, vétérinaires et toute personne réalisant des procédures expérimentales chez l'animal. Ces enseignements sont axés sur la maîtrise des gestes chirurgicaux de base tels que la suture ou l'hémostase pour les scientifiques. Les internes des spécialités chirurgicales seront davantage formés sur les sutures, l'hémostase, les anastomoses digestives, les anastomoses vasculaires ainsi que la coelioscopie. En fonction du geste à acquérir, l'animal pourra rester d'une demi journée à une journée sous anesthésie générale (avec vérification des constantes en permanence).
Impact sur les animaux
Pour les gestes réalisés de classe légére (procédure 1), une contention de courte durée sera pratiquée (moins de 1 minute). Lors des injections, une douleur légère de très courte durée est possible au site d'administration. Un léger saignement après les injections, très vite contenu par simple pression digitale, est également possible sans douleur associée. Une couverture analgésique locale sera appliquée pour réduire la douleur qui pourrait être engendrée par les injections (xylocaïne en spray 5%). Pour les procédures 2 et 3 (sans réveil), les interventions chirurgicales consisteront en des laparotomies/thoracotomies essentiellement avec techniques chirurgicales digestives et thoraciques. Les animaux seront tous sous traitement analgésique avec utilisation de dérivés morphiniques (buprénorphine et fentanyl) pour optimiser la prise en charge de la douleur jusqu'à leur mise à mort.
Devenir
A la fin de la procédure 1, étant une procédure légére, les animaux sont réutilisés pour les procédures 2 et 3 (sans retour à l'hébergement entre les deux). Les animaux des procédures 2 et 3 seront anesthésiés puis systématiquement euthanasiés à la fin des procédures. Etant des procédures chirurgicales nécessitant l'apprentissage de l'euthanasie ou des procédures chirurgicales trop importantes ne permettant pas leur réutilisation, l'euthanasie a été décidé comme l'issue la plus favorable.
Remplacement
Dès que possible et en 1ère intention, nous aurons recours à des peaux artificielles, des pelvi-trainers, des mannequins rats et souris, à la technique de la double horloge pour la microchirurgie ainsi qu'à des simulateurs de chirurgie afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour certaines formations nous sommes également en contact avec des abattoirs qui nous livrent des pièces anatomiques (pieds de porc pour les sutures, périnée de truie pour les sages femmes) afin d'éviter de commander des animaux.
Réduction
Toutes les souris utilisées lors des formations sont des souris provenant de l'élevage de l'animalerie Eops destinées en temps normal à l'euthanasie car elles n'ont pas le génotypage souhaité. En ce qui concerne les rats nous essayons dès que possible de réutiliser des rats en fin de protocole ou nous commandons des rats dits "réformés" chez les fournisseurs, c'est à dire des rats voués à l'euthanasie car incompatibles avec les protocoles de recherche. Enfin, nous faisons passer le maximum d'étudiants sur chaque animal pour réduire au maximum le nombre d'animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement favorable à leur bien-être et répondant à leurs besoins physiologiques et éthologiques (cycle jour/nuit - 12h/12h ; nourriture et eau ad libitum; enrichissements) les animaux seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Une période de 10 jours d'adaptation sera appliquée à chaque animal. Les manipulations seront effectuées ou encadrées par du personnel formé et habitué à ce genre de geste. Si une anesthésie est nécessaire les animaux seront systématiquement prémédiqués en intra-musculaire ou en intra-péritonéale. Le relais anesthésique est assuré par un gaz anesthésiant (0,5 à 2,5%). Seuls les grands animaux (porcs et brebis) seront intubés. Dès l'anesthésie maintenue, les animaux recevront un analgésique par voie sous-cutanée ou intra-péritonéale. Si nécessaire, pour les procédures de classe légère, un traitement à base d'anesthésique local sera pratiqué pour lutter contre la douleur in situ.
Choix des espèces
Le porc et le mouton ont été choisis pour des raisons anatomiques (similarités avec l'homme). Les rats, souris et lapins ont été choisis pour la formation à la chirurgie expérimentale (espèces utilisées par les étudiants dans leurs recherches) ou pour l'apprentissage des anastomoses vasculaires en ce qui concerne les rats (similarité avec l'homme). Nous prendrons des porcs charcutiers juvéniles et des miniporcs adultes pour une raison de taille. En ce qui concerne les moutons, rats, souris et lapins, nous prendrons des individus adultes pour des raisons anatomiques et de taille étant manipulés lors de travaux pratiques. Cela permet aussi de faciliter cette manipulation des petits mammifères par les étudiants.
Effets de dérivés de peptides naturels sur la sensibilité douloureuse cutanée chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
9 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, et chacune commence par une coupe du bout de la queue à quatre semaines. 6 760 d'entre elles sont ensuite exposées à une douleur thermique ou mécanique sur une patte ou la queue, dont 5 400 toutes les quinze minutes pendant deux heures, tandis que 900 subissent une douleur modérée d'une patte pendant 45 minutes et 3 600 une inflammation d'une patte durant de quatre heures à sept jours. 9 000 reçoivent en plus une à cinq injections d'un composé dérivé de venins d'anémone de mer, de mygale ou de serpent. Aucune ne reçoit d'analgésique, le porteur écrivant qu'il ne peut pas en envisager l'emploi dans des procédures qui ont pour objet l'étude de la douleur.
Objectifs
Notre équipe étudie les mécanismes de la perception douloureuse, et en particulier le rôle de détecteurs joué par des protéines membranaires des neurones sensoriels innervant la peau, les canaux ioniques, en développant leur pharmacologie. A partir d‘une bibliothèque de venins animaux, nous avons déjà identifié plusieurs peptides (d‘anémone de mer, de mygale et de serpents) qui ont donné lieu à des publications de haut niveau scientifique. Dans le cadre d'un projet collaboratif, des dérivés de peptides naturels que nous avons découverts doivent être testés dans la perspective d’un prochain développement clinique.
Bénéfices attendus
Ces études précliniques chez l’animal, qui permettent seule l'étude de la réalité physiologique dans un contexte intégré, sont nécessaires à la poursuite d’études cliniques pour développer de nouveaux composés anti-douleur, ce qui est crucial face à la crise mondiale des opioïdes et à l'augmentation des addictions et morts par overdoses.
Procédures
Toutes les souris (9500) subiront à l'age de 4 semaines le prélèvement du bout de queue pour déterminer leur génotype (30’’) et le stress de contentions répétées pendant les tests comportementaux. A l'age de 7 à 15 semaines dans le cadre des tests comportementaux, 6760 souris seront exposées à une douleur légère thermique ou mécanique sur une patte ou la queue de durée < 2 minutes et de laquelle elles pourront s'échapper (mesure d'un seuil de douleur), dont 5400 de façon répétée toutes les 15 minutes pendant 2h. 900 souris subiront une douleur modérée d'une patte pendant 45 minutes et 3600 souris subiront une inflammation d'une patte ne s’accompagnant d’aucun comportement traduisant une douleur spontanée (de 4h à 7 jours). 9000 souris subiront de 1 à 5 injections d’un agent pharmacologique (30’’), dont 3000 sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Nuisance légère pour prélèvement de bout de queue pour génotypage, stress léger de la contention après habituation pour les tests comportementaux et l'anesthésie gazeuse, nuisances légères des injections pharmacologiques, nuisance modérée de l'inflammation induite sur une patte arrière et de la douleur ou de l'hypersensibilité inflammatoire ressentie sur la queue ou une patte arrière.
Devenir
Les souris impliquées dans la production des souris expérimentales (500 souris) seront mises à mort à l'issue de leur période physiologique de reproduction (8 mois pour les femelles, 15 mois pour les mâles). Ils permettront des prélèvements d'organes post-mortem pour des analyses biochimiques. Ce sont de plus des animaux OGM qu’il est interdit de disséminer hors des établissements de recherche. C’est aussi le cas pour les animaux ayant suivi les procédures expérimentales (9000) qui ont de plus subi des injections pharmacologiques, des tests invasifs et certains une hypersensibilité douloureuse chronique qui empêche aussi toute réutilisation. Toutes les souris seront donc mises à mort à l'issu des procédures et permettront des prélèvements post-mortem.
Remplacement
Au préalable, nous avons réalisé le maximum d'expériences in vitro sur les canaux ioniques dans des lignées cellulaires en culture, puis sur des cultures primaires de neurones sensoriels de rongeurs. Mais, pour savoir si ces peptides peuvent avoir un intérêt thérapeutique, des expériences de comportement et de pharmacologie chez la souris sont nécessaires, pour avoir accès à la complexité physiopathologique de l'intégration du message douloureux et de la pharmacologie in vivo. Utiliser la souris comme modèle permet d’utiliser des modèles pathologiques de référence, ainsi que d’étudier des animaux transgéniques chez lesquels un gène d’intérêt, codant pour une protéine cible du composé pharmacologique à tester, a été invalidé (knock-out). Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de Remplacement à notre connaissance, et les études précliniques chez l’animal sont nécessaires à la poursuite d’études cliniques pour développer de nouveaux analgésiques.
Réduction
Le design des méthodes de reproduction a été optimisé pour pouvoir produire sur les 5 ans de la durée du projet les souris expérimentales ainsi que d’inclure un croisement pour maintenir le fond génétique. Le projet s’étalant sur 5 ans, le nombre réel des reproductions et des animaux reproducteurs pourra être réduit en fonction des portées déjà produites et étudiées auparavant. Les animaux reproducteurs pourront être aussi utilisés pour produire des souris dans le cadre d’autres projets du laboratoire, ou pour renouveler les lots de reproducteurs, et seront mis à mort à la fin de leur période de reproduction pour permettre des prélèvements de tissus post-mortem. L‘objectif de Réduction a également été pris en compte en réduisant le nombre d‘animaux prévisionnel au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs tout en intégrant des aléas expérimentaux. Le nombre d’animaux expérimentaux sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile ou redondante par des résultats précédents obtenus par nous ou d’autres groupes (veille bibliographique mondiale permanente) ne sera pas conduite. Les expériences prévues sur les souris transgéniques ainsi certaines procédures testant la capacité motrice ne seront conduites qu’avec les composés et par les voies d’injection induisant un effet analgésique. De plus, la réalisation d’une procédure est conditionnée par le résultat préalable d’une autre. Ainsi, le nombre d’expériences ainsi que le nombre maximal de souris prévues pourra être réduit.
Raffinement
Toute souris qui présenterait des signes d'infection au niveau de la queue dans la semaine qui suit le prélèvement pour génotypage sera traitée par des soins vétérinaires adaptés jusqu'à guérison. Si la plaie persiste au-delà d’une semaine, la souris sera mise à mort. Dans le cadre de l'objectif de Raffinement, la longue expérience de notre groupe dans les études des mécanismes de la douleur chez l'animal nous permet de proposer des tests comportementaux complémentaires mettant en jeu différentes modalités douloureuses ou motrices avec une sévérité légère à modérée. Les animaux sont habitués aux tests de façon à réduire leur stress et obtenir des mesures reproductibles et fiables. Les protocoles prévoient parfois un suivi des effets pharmacologiques sur 5 jours, mais cette durée sera réduite en cas d’absence d’effet ou d’effet transitoire. Les animaux sont mis à mort dès la fin de l’expérience de comportement associée à de la pharmacologie in vivo. Grâce à un suivi quotidien de chaque animal tout au long de chaque procédure, tout animal qui présenterait des signes de comportement anormal ou d‘une pathologie quelconque serait mis à mort. Nous ne pouvons en effet pas envisager l’emploi d’analgésique dans nos procédures qui ont pour objet l’étude de la douleur.
Choix des espèces
Les expériences de comportement et de pharmacologie in vivo sont réalisées chez la souris pour pouvoir utiliser des animaux transgéniques (knock-out) pour déterminer la spécificité de l’effet des composés testés et en utilisant des modèles pathologiques de référence. Au sevrage, à 4 semaines, un prélèvement de tissus (extrémité de la queue) permettra une analyse génétique. Les expériences comportementales seront conduites sur des adultes entre 7 et 15 semaines. Cet âge permettra aussi la comparaison avec des expériences déjà publiées.