Souris

Les souris de ce projet portent des modifications génétiques qui leur permettent de recevoir un anticorps humain sans le rejeter. 144 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections intrapéritonéales par semaine pendant quatre semaines, subissent quatre prélèvements sanguins et un régime enrichi en graisse qui peut provoquer des lésions cutanées par hypertoilettage. La mise à mort sert à prélever le foie et d'autres tissus, pour un anticorps que le porteur décrit comme déjà testé en oncologie clinique chez l'être humain.

Objectifs

Les maladies chroniques du foie (MCF) sont des affections inflammatoires touchant entre un et deux milliards de personnes dans le monde et constituent un risque majeur de progression vers la cirrhose, puis vers une maladie du foie non alcoolique, une étape fréquente avant le développement d’un cancer du foie. Au cours des dix dernières années, la charge de santé publique associée aux MCF a connu une augmentation significative et durable. L’identification de nouveaux marqueurs impliqués dans le processus inflammatoire hépatique est cruciale. Une protéine spécifique, aux propriétés anti-inflammatoires potentielles, pourrait constituer une cible prometteuse pour réduire cette inflammation dans le contexte des MCF. Cette étude a pour objectif d’inverser l’inflammation hépatique in vivo dans deux modèles représentatifs de cette pathologie, en utilisant un anticorps dirigé contre cette protéine, déjà testé en oncologie clinique. Une analyse approfondie du foie et des marqueurs sanguins sera réalisée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'évaluer, de manière préclinique, la capacité d’une protéine ciblée à interférer avec l'inflammation dans des modèles murins pertinents d’inflammation chronique du foie. Les résultats devraient aider à identifier les voies de régulation par cette protéine (et, potentiellement, de nouvelles cibles thérapeutiques) impliquées dans l'inflammation chronique hépatique. Plus important encore, en cas de succès, ce projet offrira des perspectives concrètes pour un plan de traitement anti-inflammatoire innovant en hépatologie clinique. Le régime enrichi en graisse peut entrainer la présence de lésions cutanées dues à un hypertoilettage. Celles-ci seront traitées localement.

Procédures

Durant ce projet, les animaux subiront 3 prélèvements sanguins par contention et 1 sous anesthésie gazeuse et des injections intrapéritonéale du médicament 2 fois par semaine pendant 4 semaines. Ces deux gestes ne durent que quelques minutes.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les animaux recevront deux injections intrapéritonéales par semaine pendant 4 semaines. La piqûre de l'aiguille provoque une douleur légère et de courte durée. Des prélèvements sanguins seront effectués toutes les deux semaines, ce qui entraîne un stress physique et une douleur légère et passagère. L’accumulation des injections et des prises de sang justifie le classement de la procédure en catégorie modérée.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de l'inhibition d'une protéine sur des fonctions métaboliques complexes en situation d'inflammation chronique. Ces fonctions ne sont modélisables que dans un organisme complet capable d'exprimer l'ensemble des mécanismes de régulation physiologique, incluant l’homéostasie glucidique et lipidique, ainsi que la fonction hépatique. Une approche sur un mammifère est donc nécessaire pour obtenir des données préliminaires concernant les mécanismes physiologiques complexes en jeu dans cette étude (régulation des lipides et des glucides, déséquilibres biochimiques, balance inflammatoire). Ces données fourniront une base solide pour une approche translationnelle, afin de mieux comprendre la physiologie humaine

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été determiné au fur et à mesure de notre expérience. Les groupes expérimentaux comprendront 6 ou 12 animaux selon les conditions : 6 pour les groupes contrôles et 12 pour les groupes avec inflammation chronique du foie. Ces effectifs sont suffisants pour obtenir des résultats statistiquement interprétables dans le cadre des analyses prévues. Au total, 144 souris seront nécessaires pour ce protocole, permettant de comparer les effets de l'inflammation chronique et de l’inhibition de la Nétrine-1.

Raffinement

Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entraîner l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. Les animaux seront maintenus en groupes dans des conditions d'animalerie optimales. Ils disposeront sans restriction de nourriture, d'eau et d'un milieu enrichi (nids en quantité suffisante, bâtons et balles à ronger). Le cas échéant, des soins locaux par spray de dermidine seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. Le site d’injection sera surveillé afin d’éviter toute infection/inflammation, l'animal sera soigné en cas de lésion.

Choix des espèces

La souris est l’animal modèle de choix pour cette étude préclinique. La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement d'un modèle porteur de modifications génétiques capable d'accepter l'injection d'anticorps humain, fournissant ainsi un modèle unique pour tester in vivo les anticorps humains. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Enfin, dans le cadre d'atteintes de la fonction hépatique, le modèle souris constitue la meilleure approche disponible à ce jour. Les animaux démarreront leur protocole en tant que jeune adulte, à partir de 8 semaines. À ce stade, ils ont déjà une régulation métabolique et immunitaire qui est mise en place.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune passant une semaine avec une roue d'activité, jusqu'à 45 minutes sur un tapis roulant menant à l'épuisement musculaire, et vingt à trente minutes sous anesthésie pour la mesure de la force de ses muscles. Les procédures, d'un niveau de souffrance modéré, comprennent aussi des tests de marche, de coordination et d'agrippement sur animal vigile, et l'enregistrement de l'activité électrique du nerf vers le muscle par piqûre d'aiguilles de stimulation, avec un risque de détresse respiratoire, d'hypothermie et de douleurs au réveil. Les muscles et les autres tissus sont prélevés après la mise à mort, sur des souris alors âgées de trois à neuf mois. Le porteur annonce de nouvelles cibles thérapeutiques "utilisables chez l'homme" contre la fonte musculaire, quand l'objet immédiat du projet est d'identifier des mécanismes chez la souris.

Objectifs

Le système neuromusculaire joue un rôle essentiel dans les fonctions motrices de l'organisme, incluant la respiration, la locomotion, la mastication et d'autres activités quotidiennes. Cependant, diverses situations telles que le vieillissement, les périodes d'hospitalisation prolongée, les pathologies chroniques (les maladies cardiovasculaires, le diabète, etc…), le cancer, ainsi que les maladies neuromusculaires génétiques comme par exemple la dystrophie musculaire de Duchenne, peuvent entraîner une perte de masse musculaire. Les cellules souches musculaires, nichées dans le tissu, jouent un rôle crucial dans le processus de régénération pour réparer les fibres musculaires endommagées, en réponse à l'exercice intense ou au cours de maladies neuromusculaires. La compréhension des mécanismes sous-jacents à la formation des muscles et de leurs cellules souches associées, ainsi que des processus d'appariement des nerfs (motoneurones) sur les fibres musculaires en croissance, est essentielle pour envisager des interventions thérapeutiques ciblées sur l'axe neuromusculaire. Il existe une diversité de types de fibres musculaires, chacune dotée de propriétés de contraction et d'endurance distinctes, et présentant une vulnérabilité variable dans différentes conditions pathologiques ou lors du vieillissement. La complexité de ces interactions rend difficile leur étude in vitro ou ex vivo. Cependant, l'utilisation de modèles murins génétiquement modifiés offre une opportunité précieuse pour approfondir notre compréhension des propriétés des différentes fibres musculaires et des motoneurones, ainsi que de l'interaction entre les différents types cellulaires dans l’équilibre du système neuromusculaire. L'objectif de cette étude est d'identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans le maintien de cet équilibre à la fois dans les éléments contractiles musculaires et dans les motoneurones, et pouvant potentiellement être perturbés dans diverses conditions pathologiques. Ce travail de recherche pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques visant à préserver la fonction neuromusculaire et à traiter des pathologies associées.

Bénéfices attendus

Le système neuromusculaire nous permet de nous mouvoir mais est aussi associé à des fonctions vitales comme la respiration et la déglutition. Les muscles squelettiques et les motoneurones associés s’atrophient au cours du vieillissement, lors d’hospitalisation prolongée, au cours du cancer, et dans de nombreuses myopathies d’origine génétique. La compréhension de la physiologie et de la physiopathologie neuromusculaire liée à de nouveaux acteurs, comme les protéines spécifiques étudiées dans ce projet, pourrait aboutir à la mise en évidence de nouvelles voies ou cibles thérapeutiques utilisables chez l’homme.

Procédures

Pour une première partie des animaux : L’évaluation des paramètres de la marche, de la respiration, de la coordination et de la force d’agrippement se réalisent sur animaux vigiles, elles seront faîtes 1 seule fois par animal et dure de 5 à 25 minutes. L’évaluation de la fonction musculaire des muscles fléchisseurs et l’enregistrement de l’activité électrique vers le muscle en passant par le système nerveux se réalisent sous anesthésie et analgésie adéquat, 1 fois par animal et elles durent de 10 à 20 minutes. Pour la seconde partie des animaux : Le test de l’activité volontaire s’effectue par les animaux de manière volontaire, la roue est maintenue pendant 1 semaine. Le test de tolérance à l’effort avec le tapis roulant est réalisé par les animaux eux-mêmes, 1 seule fois par animal et dure environ 45 minutes au maximum. Les mesure de force musculaire (sans réveil) s’effectuent sur animaux anesthésiés et sous analgésie adéquat, 1 fois par animal et durent 20 à 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues pour les tests fonctionnels sur animaux vigiles (cages à roue, tapis de course, test d'équilibre, test d'agrippement) sont le stress lié à la manipulation momentanée de l’animal par l’expérimentateur, au changement d’environnement et à l’isolement de courte durée des souris dans les appareillages de mesure. Une fatigue musculaire peut survenir pour le tapis de course. Pour certains tests, seul un léger stress dû aux changements d’environnement est à prévoir comme pour le test d’activité volontaire et l’évaluation des paramètres respiratoires. Les effets indésirables pouvant survenir pour les actes sous anesthésie sont la détresse respiratoire et l’hypothermie puis des douleurs post opératoires lors du réveil dues aux stimulations et à la contraction musculaire involontaire. . Les principales nuisances attendues pour les tests fonctionnels sur animaux vigiles (mesure de l’activité volontaire, test d’effort sur un tapis roulant, test d'équilibre, test d'agrippement) sont la peur liée à la manipulation momentanée de l’animal par l’expérimentateur, au changement d’environnement et à l’isolement des souris dans les appareillages de mesure qui peuvent générer un léger stress. Un épuisement musculaire peut survenir pour le tapis de course. L’évaluation de la marche et l'évaluation des paramètres respiratoires ne nécessitent aucune contention, les souris se déplacent librement dans les équipements. Seul un léger stress dû aux changements d’environnement est à prévoir. Les effets indésirables pouvant survenir pour l'évaluation non invasive de la fonction musculaire des muscles fléchisseurs et de l’activité électrique du système nerveux périphérique sont le réveil spontané, l’hypothermie, la détresse respiratoire, les douleurs post opératoires lors du réveil dues aux piqûres des aiguilles de stimulation et à la contraction involontaire, et du stress au réveil de l’anesthésie. Pour les mesures de force, les risques sont le réveil spontané, l’hypothermie et la détresse respiratoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures en suivant la réglementation en vigueur. Tous les tissus et échantillons musculaires seront prélevés pour des analyses histologiques et moléculaires réalisés ultérieurement en laboratoire de recherche.

Remplacement

Il existe une diversité de type de fibre musculaire, chacune dotée de propriétés de contraction et d'endurance distinctes, et présentant une vulnérabilité variable dans différentes conditions pathologiques ou lors du vieillissement. Malheureusement, la complexité de ces interactions rend difficile leur étude in vitro ou ex vivo. Cependant, l'utilisation de modèles murins génétiquement modifiés offre une opportunité précieuse pour approfondir notre compréhension des propriétés des différentes fibres musculaires et des motoneurones, ainsi que de l'interaction entre les différents types cellulaires dans le maintien de l'homéostasie neuromusculaire. Il est donc indispensable d’utiliser un modèle animal. Néanmoins, nous utilisons en parallèle des approches in vitro, notamment des cultures cellulaires de myoblastes et de myotubes contrôles et mutants pour étudier l’impact de la délétion des protéines d'intérêt dans la différenciation, le typage et le métabolisme des cellules musculaires, ainsi que pour l’étude les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents.

Réduction

640 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Pour limiter le nombre d’animaux, les animaux seront analysés de manière longitudinale (un même animal pour plusieurs tests et donc plusieurs résultats).

Raffinement

Lors du transport entre les deux animaleries, les animaux pourront subir du stress dû aux mouvements des cages de transport, dû au transfert dans les nouvelles cages ou encore dû au changement d’environnement et d’alimentation, une période d’acclimatation d’une semaine minimum sera réalisée. Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérées par les techniciens de l’animalerie. Elles consistent à un contrôle quotidien des cages, de la température et de l’hygrométrie. Ces pièces sont équipées de cycle jour/nuit permettant un cycle de réveil et de sommeil constant et sain pour l’animal. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. Les cages sont placées sur un portoir ventilé. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum (abreuvement automatique). Pour que les animaux puissent faire leur nid, des lanières de papier kraft seront utilisées comme enrichissement ainsi que des bâtons à ronger ou des maisonnettes pour se cacher (ou équivalent) afin d’éviter le stress. Le nombre d’animaux par cage est réduit à 2 minimum et à 5 maximum. Si nécessaire, la nourriture pourra être placée sur le plancher de la cage. Afin de permettre une interprétation fiable des résultats avec le respect du bien-être animal, une surveillance quotidienne sera réalisée pour détecter tout signe d'inconfort. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs ont été définis. En vue de réduire au maximum le stress des animaux, un exercice d’habituation sera réalisé 2 jours avant les tests. A l’exception de l’évaluation des paramètres respiratoires dont le stress doit être réduit au maximum, une session par jour pendant 5 jours sera nécessaire. Pour les actes le nécessitant les souris recevront l’anesthésie et l’analgésie adéquat afin d’éviter toute douleur et stress.

Choix des espèces

L’espèce souris Mus musculus a été choisie car elle représente un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris est un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements musculaires car de nombreuses voies de régulation dans le système neuro-musculaire sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, l'utilisation de modèle de souris transgéniques permet une étude approfondie de de protéines d’intérêts dans la fonction neuromusculaire. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiologie et la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes à partir âgées de 2 à 8 mois chez lesquelles le système neuromusculaire est complètement développé. A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés et seront âgés de 3 à 9 mois environ.

Une ulcération de la peau de 8 à 10 millimètres est provoquée chez 384 souris par l'injection du parasite responsable de la leishmaniose cutanée. Toutes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 120 d'entre elles recevant en plus un gavage, une injection dans l'abdomen ou une application locale des composés à tester. Le porteur décrit cette ulcération comme survenant "sans douleur ni autre signe local", tout en reconnaissant qu'aucune étude toxicologique n'a été faite sur cette nouvelle famille de molécules et qu'il est donc impossible de prévoir leurs effets indésirables. Toutes sont tuées à l'issue, aucune ne pouvant selon lui être réutilisée ni adoptée puisque rien ne garantit que l'infection soit jugulée.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans une étude validée et financée par l’ANR et se déroulant sur 4 ans. Il s’agit de découvrir de nouveaux traitements contre les leishmanioses cutanées. Ces traitements devront avoir une faible toxicité et permettre, en priorité, une administration par voie orale. Les premières étapes ont été de démontrer l’activité sur le parasite en culture et la faible nocivité sur des cellules mammifères. Ces 2 critères ont permis de sélectionner les molécules y répondant. Des critères supplémentaires de sélection ont permis de choisir les composés entrant dans la dernière phase de notre étude, sur la souris. Les procédures décrites dans ce projet ont donc pour but de répondre à un double objectif. Le premier est de confirmer l’efficacité de nouveaux traitements contre les leishmanioses cutanées. Le second est de déterminer la meilleure voie d’administration pour obtenir la meilleure efficacité. Le suivi clinique des animaux permettra de surveiller la survenue d’effets indésirables.

Bénéfices attendus

Les bénéfices sont de valider l’efficacité de nouveaux traitements contre la leishmaniose cutanée contre laquelle actuellement très peu de médicaments sont efficaces. Cette pathologie atteint les humains mais aussi d’autres espèces animales. L’accès à un nouveau traitement permettrait de lutter plus efficacement contre cette infection parasitaire. Par ailleurs, cette étude finaliserait la validation de la nouvelle cible du médicament.

Procédures

Les animaux sont soumis : - 384, à des injections sous-cutanéees, 5 secondes / - 120, injection intrapéritonéale, 5 secondes / - 120, gavage, 5-10 secondes / - 120, application locale du traitement, 1 minute /- 384, mesure du diamètre de la lésion, 1 minute

Impact sur les animaux

La leishmaniose cutanée provoque une ulcération de la peau (8-10 mm) sans douleur ni autre signe local. Une surveillance quotidienne permettra de vérifier l’état de la lésion pour prévenir toute surinfection bactérienne. L’administration de nouveaux traitements, bien qu’ayant été sélectionnés pour leur faible/absence de toxicité sur des cellules d’origine humaine et de souris, est toujours à risque d’engendrer des effets indésirables. Comme il s'agit d'une nouvelle famille de molécules, aucune étude toxicologique n'a encore été faite. Il est donc impossible de prévoir les effets indésirables et s'il y en aura. C'est pour cela que les animaux seront surveillés quotidiennement pour observer leur comportement individuel et collectif. Tout comportement anormal sera être le signe d'apparition d'un effet indésirable. Au fûr et à mesure de l'avancée de l'étude, les informations glanées sur les effets indésirables rencontrés permettront d'ajuster les doses administrées pour les procédures suivantes, si nécessaire. L'effet attendu est la guérison des ulcérations cutanées ou, à défaut, une diminution de leur diamètre.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. Ces animaux étant infestés par un parasite pour aucun d'entre-eux il ne peut être garanti que l'infection soit entièrement jugulée. Ils ne peuvent donc pas être réutilisés pour d'autres expériences, ni adoptés.

Remplacement

Les modèles in vitro de peau ne possèdent pas les cellules hôtes du parasite ni les régulations immunitaires associées. Ils ne permettent pas non plus d’évaluer la répartition de traitement administrés. Il n’existe donc pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant d’évaluer l’effet de nouveaux traitements potentiels sur l’évolution de cette pathologie au niveau cutanée.

Réduction

Le nombre d’animaux choisis l’a été en fonction de l’étude de la littérature scientifique, de l’expérience du laboratoire dans l’utilisation de ce modèle. Ce nombre d'animaux a été ajusté en utilisant le logiciel de statistiques. Afin d'améliorer le raffinement, une première expérience sera réalisée pour déterminer le meilleur paramètre d'infestation. Le nombre d'animaux a donc été réduit au strict nécessaire pour conduire à des résultats interprétables. Les données recueillies ont permis de déterminer un nombre d’animaux minimum pour que le test statistique soit interprétable.

Raffinement

Les mesures effectuées sur les animaux (pesée, diamètre de la lésion), analyse des prélèvements de peau permettront d’avoir une étude la plus complète de l’efficacité du traitement. L'expérience a été conçue pour éviter toute souffrance inutile des animaux, en optimisant sa durée (intérêt de l'étude préliminaire, des méthodes d'analyse des prélèvements permettant une meilleure détection de la charge parasitaire) et en suivant ces animaux quotidiennement afin d'intervenir au plus tôt pour les soulager (antalgiques => euthanasie). pour guider notre décisison, des points limites précis ont été définis. En cas d'atteinte de ces points limites, les animaux seront euthanasiés. En cas d'identification de signes de souffrance, en plus de l'administration d'un antalgique, un petit dôme en carton sera inséré dans la boite. Par ailleurs, l'environnement des animaux est enrichi avec des frisottis (quantité suffisamment importante pour qu'ils puissent s'y cacher, créer un nid...), un tube en plastique rouge transparent (pouvant servir de refuge, de jeu, de moyen de transport des animaux pour les expérimentateurs).

Choix des espèces

La lignée de souris Balb/c a démontré sa réceptivité pour les leishmanies. L’étude de la littérature et l’expérience du laboratoire dans l’utilisation de ce modèle confirment la pertinence de ce choix. Les animaux auront 5 à 6 semaines. L’utilisation de jeunes adultes permet d’avoir une bonne zone d'observation pour mesurer le diamètre des lésions et ils possèdent un système immunitaire fonctionnant normalement.

Une chirurgie de cinq heures au maximum ouvre le crâne pour y implanter des électrodes, puis les souris sont enregistrées pendant leur sommeil 48 heures par mois, de l'âge de deux mois à quinze mois. Certaines parcourent un labyrinthe ou apprennent à associer un indice visuel à une action pour obtenir une récompense, sous contrôle alimentaire. D'autres reçoivent une injection dans l'abdomen chaque jour pendant trois mois. Le porteur présente le maintien des animaux pendant plus d'un an comme un moyen d'obtenir un maximum de données par animal. 220 souris transgéniques mimant la maladie d'Alzheimer vont ainsi être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau.

Objectifs

Les objectifs de cette étude sont 1- d’évaluer simultanément le décours temporel de l’apparition des altérations du sommeil d’une part et des altérations cognitives d’autre part dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer, 2- de tester si moduler l’activité des neurones du thalamus, une structure profonde du cerveau, en amont de l’apparition des symptômes cognitifs pourrait permettre de retarder l’apparition des symptômes cognitifs et de diminuer la charge d’Amyloïde Béta dans le cerveau des souris, 3- d’évaluer l’évolution de la connexion entre le thalamus et le cortex au cours du vieillissement, 4- d’évaluer le fonctionnement du thalamus et du cortex cours du vieillissement et en relation avec le sommeil, et enfin 5- de tester si activer les neurones du thalamus permet de réduire la charge en Amyloïde Béta chez les souris Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet est un projet de recherche fondamental dont l’impact pour les familles et les patients ne sera pas immédiat. Néanmoins, la recherche fondamentale est indispensable à l’identification de nouvelles pistes de traitement et ce projet pourrait donner des pistes thérapeutiques à relativement brève échéance pour deux raisons : Tout d’abord, ce projet vise à proposer le sommeil comme piste de réflexion dans la prise en charge des patients. Le sommeil est souvent très dégradé chez les patients âgés et ce sommeil est indispensable pour le bon fonctionnement de notre mémoire et pour notre récupération. Améliorer la qualité du sommeil des patients pourrait avoir des conséquences immédiates sur l’amélioration des capacités de consolidation de la mémoire et sur les capacités d’attention. Ceci pourrait être très rapidement mis en place car il existe déjà un arsenal thérapeutique pour le traitement des problèmes de sommeil. D’autre part, ce projet va permettre de chercher à comprendre si la stimulation du thalamus, un ensemble de noyaux profonds du cerveau, pourrait permettre d’améliorer les performances cognitives dans un modèle de souris transgéniques mimant les symptômes de la maladie d’Alzheimer. On sait que la stimulation de ces noyaux permet de diminuer les micro-réveils qui sont très communs chez les patients et qui contribuent à une mauvaise qualité de sommeil. Les neurones qui composent ces noyaux présentent des signatures biochimiques très particulières qui leur permet d’être ciblés par des molécules médicamenteuses. Si les résultats de cette étude sont positifs, il serait alors assez facile et rapide de lancer une étude clinique qui permettrait d’évaluer si les résultats obtenus chez la souris sont aussi prometteurs chez l’homme.

Procédures

Les animaux subiront des chirurgies invasives pour l'implantation des électrodes d'enregistrement intra-cranienne. Cette chirurgie dure un maximum de 5 heures. Ils seront ensuite enregistrés pendant leur sommeil 48h tous les mois de 2 à 15 mois dans des caissons d’enregistrements spécifiques. Certains animaux effectuerons aussi différentes tâches de comportement comme un labyrinthe et une tâche d’association où l’animal doit associer un indice visuel avec une action à effectuer pour obtenir une récompense. Enfin, certains animaux subiront des injections intra-péritonéales tous les jours pendant 3 mois.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées sont un animal modèle transgénique de la maladie d’alzheimer. Ces animaux ont des troubles mnésiques qui se développent progressivement au cours du vieillissement mimant ainsi les troubles cognitifs des humains souffrant de la maladie d’Alzheimer. Toutes les procédures faites sur ces souris seront de degré́ de sévérité modéré du fait de la chirurgie nécessitant l’insertion d’électrodes dans le cerveau. Les douleurs péri- et post-opératoires sont minorées par l’administration d’antalgiques puissants. Les animaux effectueront des tests comportementaux qui impliquent une brève contention pour connecter l'implant au système d’enregistrement et un contrôle alimentaire, qui peuvent provoquer un stress chez l’animal. Ces paramètres sont minorés par une précautionneuse habituation des animaux à la manipulation par l’expérimentateur.

Devenir

Toutes les expériences seront terminées par la mise à mort des animaux pour prélèvement d’organes pour des études post mortem.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce projet. En effet, ce projet combine étude de plusieurs paramètres comportementaux chez la souris et enregistrement de plusieurs aires corticales simultanément pendant le sommeil. Il est à ce jour impossible de mimer un apprentissage mnésique dans aucun modèle vivant complexe tels que les organoïdes qui de plus ne sont pas encore assez aboutis pour reproduire les connections entre les différentes aires corticales.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit grâce à l’utilisation de tests statistiques avancés qui permettent de prendre en compte à la fois les mesures qui sont prises plusieurs fois sur le même animal et les mesures effectuées entre les animaux. Ces tests permettent d'inclure des animaux qui n’auraient pas faits toutes les étapes du protocole et de réduire le nombre d'animaux grâce aux mesures répétées. Enfin cette étude comporte deux procédures pendant lesquelles les animaux seront gardés pendant plus d’un an, permettant d’obtenir un maximum de données par animal et de pouvoir comparer l’évolution chez le même animal de différents paramètres.

Raffinement

Dans ce projet, les enregistrements électrophysiologiques seront combinés à des tâches comportementales ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux. Dans la grande majorité des études, les animaux implantés sont isolés. En effet, le stress induit par les contentions et les enregistrements conduit souvent les animaux à devenir agressif et à se battre. Néanmoins, l’isolement est également un stress majeur pour les souris, les étapes d’habituation et de contention ont donc été raffinées afin de limiter le stress des animaux, et ceci me permet de maintenir les animaux au minimum par deux. Les animaux implantés sont souvent isolés pour protéger les implants. Dans cette étude, les souris seront soit maintenues en groupe soit maintenues dans des cages spécifiques développées qui, grâce à une cloison avec des larges trous, permet aux animaux de se sentir et se côtoyer sans pour autant pouvoir ronger le connecteur de son compagnon de cage. La prise en charge de la douleur pendant la chirurgie et en post-chirurgie est optimisée pour que les animaux ne ressentent aucune douleur et une habituation lente et progressive est effectuée afin de réduire au maximum le stress de l’animal. Enfin, un arbre décisionnel d’évaluation du bien-être de chaque souris a été mis en place comportant différents points limites afin d’abréger les souffrances de l’animal en cas de complications post-opératoires et tout au cours du protocole expérimental.

Choix des espèces

Ce projet requiert l’utilisation de souris car nous comparerons ici l’évolution des performances cognitives et de la qualité du sommeil chez les individus sains et dans un modèle de souris transgénique de la maladie d’Alzheimer. D’autre part, les stratégies de transduction virale sont largement utilisées chez la souris ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec ceux de la littérature. Il n’existe pas de méthode alternative pour étudier un phénomène physiologique aussi complexe que la synchronisation des oscillations cérébrales. Les souris possèdent une architecture du sommeil très similaire à celle de l’humain avec l’alternance de phases de sommeil profond et paradoxal. Pendant le sommeil profond, on observe des phases de haut niveau de synchronisation très proches de celles observées chez l’humain. Les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines pour les injections et 8 semaines pour les implantations quand la boîte crânienne a atteint sa taille adulte. Les chirurgies seront effectuées à 8 et les enregistrements entre 9 et 60 semaines. En effet, ce projet vise à étudier l’évolution au cours du vieillissement des performances cognitives et de la qualité du sommeil chez des animaux sauvages et modèles murins de la maladie d’Alzheimer.

Fournir un modèle expérimental pour tester des traitements des complications oculaires du diabète : 2 180 souris et 2 180 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils sont rendus diabétiques par une injection de streptozotocine qui détruit les cellules du pancréas produisant l'insuline, puis une kératopathie leur est provoquée sur un œil après huit à seize semaines de diabète. Le porteur indique qu'au bout d'un mois les rats malades pèsent 50 à 60 % du poids des rats témoins du même âge, et décrit les examens oculaires comme semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet. Les gouttes peuvent être administrées six à huit fois par jour et les injections dans l'œil une à deux fois par semaine, pour des études d'efficacité relevant en partie de l'usage réglementaire.

Objectifs

Le taux élevé de sucre dans le sang entraine une cascade d’évènements impliquant des médiateurs de l’inflammation qui conduisent à la dégradation des cellules neuronales et des capillaires sanguins de la rétine.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est de proposer un modèle expérimental pour évaluer l'efficacité de nouveaux traitements des complications du diabète au niveau de la rétine et de la cornée qui sont invalidantes pour les patients et peuvent aboutir à la cécité. La recherche de traitement est en constante évolution, pour intervenir à différents stades de la maladie et preserver au mieux la visions des patients.

Procédures

L’induction du diabète chez les rats et les souris se fait par injection intrapéritonéale d’une molécule qui rend les animaux diabétiques. Le taux de glycémie sera contrôlé sur bandelette une à trois fois dans l'étude par le prélèvement d'une goutte de sang à la queue de l'animal ou au niveau de la mandibule. L'induction de la kératophatie se fera uniquement sur un œil et par un acte unique après une période de 8 et 16 semaines de diabète, la procédure ne durera pas plus de 10 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont d’ailleurs réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ces examens sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens au biomicroscope) mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ces examens sont rapides et ne dureront pas plus de quelques minutes. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par voie sous cutanée, soit par voie intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les animaux sont rendus diabétiques par injection de Streptozotocine. La streptozotocine détruit les cellules du pancréas qui ne produit plus d’insuline et ne peut plus controler la glycémie. L’hyperglycémie altère vaisseaux et nerfs avec une répercussion sur différents organes, comme la neuropathie, les troubles cardiovasculaires, la néphropathie, et la rétinopathie. Les animaux diabétiques ont un besoin de boire et des urines accrus, et perdent du poids. Ils perdent du tonus et prennent un aspect vouté au cours du temps. Les animaux n’ont plus ou peu de gain de poids malgré une consommation d’eau et de nourriture accrue. Au bout d’un mois de diabète, le poids des rats malades représente 50 à 60 % du poids des rats contrôles du même âge, la différence semble moins importante chez la souris et serait plutôt autour de 80% du poids des souris contrôles non induites au bout d'un mois de diabète.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...).

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. Le recours à un modèle animal est nécessaire en raison de la physiologie particulière l'oeil composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen) en interaction les uns avec les autres. Le développement de la kératopathie diabétique ne peut être mimé par un modèle alternatif.Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur l'efficacité ou non d'un traitement. Une analyse de puissance avec un calcul de l’effectif sera réalisé ce qui permettra d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal. L'analyse des deux yeux sera effectuée chaque fois que possible afin de réduire le nombre d'animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum, de l’enrichissement adapté (abri et morceaux de bois à ronger). En raison de la polydipsie et de la polyurie des animaux diabétiques, la litière sera changée plus fréquemment (1 fois par jour), et un biberon supplémentaire sera ajouté. Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.

Choix des espèces

Ce modèle est bien décrit sur ces espèces dans la littérature et l’apparition des signes cliniques recherchés de la cornée diabétique est bien documentée chez la souris pigmentée (Young L, et al 2014) ou le rat albinos. Les animaux, rats et souris, seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie, âgés de 6 semaines minimum à l'induction du diabète conformément aux publications de référence qui servent de base à ce modèle. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation d'un minimum de 5 jours.

Toutes tuées pour que leurs organes soient prélevés et analysés, 100 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Infectées par Helicobacter pylori, elles subissent un gavage par jour pendant trois jours puis deux par jour pendant sept jours, sur animal vigile. Le porteur annonce une possible perte de poids liée au stress du gavage et à l'infection, et ne décrit aucun autre effet. Il indique que l'activité antibactérienne du composé a déjà été montrée en culture, et juge les expériences chez la souris "indispensables" pour confirmer sa biodisponibilité dans la muqueuse gastrique.

Objectifs

Le cancer gastrique est actuellement la 4e cause de mortalité par cancer dans le monde. L’infection chronique par Helicobacter pylori est considérée comme étant responsable d'une grande majorité des cancers de l'estomac. L’objectif est de montrer l’efficacité anti bactérienne contre Helicobacter pylori du composé développé par notre collaborateur.

Bénéfices attendus

L’objectif à terme est de développer un nouveau médicament pour le traitement de l’infection à H. pylori.

Procédures

Gavage : animaux vigiles, 1 fois par jour pendant 3 jours puis 2 fois par jour pendant 7 jours. Le gavage dure moins d'une 1 minute.

Impact sur les animaux

Possible perte de poids liée au stress du gavage 2 fois par jour et à l’infection à H. pylori.

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin que leurs organes soient prélevés et analysés.

Remplacement

L’effet antibactérien du composé sur Helicobacter pylori a été montré in vitro par nos collaborateurs. Des expérimentations chez la souris avec ce composé sont indispensables afin de confirmer sa biodisponibilité et son activité in vivo dans la muqueuse gastrique, éléments qui ne peuvent pas être modélisés in vitro.

Réduction

Le modèle d’infection à H. pylori est connu et maitrisé. Sur les échantillons prélevés nous prévoyons de réaliser des études statistiques ; pour cela, d’après les publications précédentes de l’équipe et d’après la littérature scientifique sur ces modèles murins d’infection par H. pylori qui présentent une certaine hétérogénéité de réponse entre animaux, des groupes de 10 animaux par condition expérimentale sont requis. Une application permettant de déterminer le nombre d’animaux optimal a été utilisé.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (nids de litière et maisonnettes en polycarbonate). Les souris seront suivies quotidiennement par le personnel de l’animalerie ainsi que par les expérimentateurs en suivant des critères bien définis. En cas de souffrance des mesures conservatoires seront mises en place pour soulager l'animal. Si l'état de l'animal ne s'améliore pas alors il sera mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle d’infection à H. pylori a été mis au point chez la souris et est parfaitement maitrisé. Les souris seront utilisées à un âge de 6 semaines car c’est l'âge optimal pour permettre une infection à H. pylori. Après ce stade l’infection ne se met pas en place.