Souris

Deux heures trente de neurochirurgie sous anesthésie, puis vingt jours de restriction alimentaire ramenant le poids à 85 % de sa valeur initiale : 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Cent d'entre elles subissent deux opérations, une lésion cérébrale puis l'implantation de sondes, espacées de dix jours, avant d'être hébergées seules pour éviter que les implants ne s'arrachent. L'objectif tient à comprendre comment deux zones du cerveau dialoguent quand une souris décide d'agir après avoir exploré son environnement avec ses moustaches. Le porteur justifie le choix de la souris par une organisation du système nerveux "assez similaire" à celle de l'humain et par une taille de cerveau homogène qui garantit la reproductibilité des sites d'injection.

Objectifs

La prise de décision perceptuelle est le processus par lequel les informations sensorielles entrantes sont intégrées par le cerveau afin de guider le comportement de l’individu en produisant une réponse motrice appropriée. Chez les rongeurs, il apparaît de plus en plus clairement que cette intégration sensori-motrice fait intervenir deux zones cérébrales clés. La première zone est la partie du cerveau qui reçoit les informations sensorielles provenant des moustaches. La deuxième zone est la partie qui va planifier et organiser les mouvements. Elle est impliquée dans la sélection et l’exécution des commandes motrices. La première zone quant à elle constitue un système sensoriel important pour les rongeurs permettant de collecter les informations sensorielles de l’environnement. Les rongeurs ont en effet développé un système sensoriel complexe et utilisent de préférence leurs moustaches pour explorer leur environnement tactile immédiat. Pourtant, on ne sait toujours pas à ce jour comment ces deux zones cérébrales interagissent pour assurer une prise de décision adaptée en réponse à la perception de l’environnement. Par ailleurs, la plupart de nos connaissances proviennent d'études utilisant des tâches comportementales peu naturelles (avec immobilisation de la tête de l’animal par exemple). De plus le rôle de ces zones cibles et de leur interaction dans des conditions qui reproduisent ce qui se passe dans la nature de façon éthologiques reste à ce jour inconnu.

Bénéfices attendus

Ce projet est avant tout un projet de science fondamentale. Il vise à comprendre au niveau cellulaire les principes de l’intégration des informations sensorielle et motrice qui permettent l’adaptation de la prise de décision en réponse à la perception de l’environnement. Tout cela dans un contexte environnemental le plus éthologique possible. Au-delà de cet aspect fondamental, le projet vise à explorer des problématiques que l’on retrouve en clinique. En effet, l'accent mis sur la prise de décision au cours d’une tâche ayant une vraie valeur éthologique dans un environnement naturel est central dans les neurosciences cognitives modernes, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre la tâche comportementale proposée est une caractéristique frappante de plusieurs troubles moteurs et perceptifs. Le projet est donc particulièrement bien placé pour dessiner les bases d'études plus appliquées, en reliant notamment les techniques de neurosciences les plus récentes aux processus cognitifs essentiels. Enfin, le projet est à la pointe de nombreuses techniques expérimentales, allant de modèles comportementaux innovants à la neuroanatomie avancée et l’étude des signaux électriques générés par l'activité des neurones pendant la prise de décision. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs différents.

Procédures

Les animaux seront d’abord acclimatés à leur hébergement dans le premier établissement utilisateurs pendant 2 jours. Puis les animaux seront soumis à une neurochirurgie lésionnelle et/ou implantatoire de sondes. Ces chirurgies se feront sous anesthésie et dureront chacune entre 2h et 2h30. 75 animaux auront une chirurgie lésionnelle, 150 animaux auront une chirurgie implantatoire, et 100 animaux auront ces deux chirurgies (lésionnelle et implantatoire). 75 animaux auront une injection de solution saline pour servir de contrôle. Un intervalle de 10 jours sera respecté entre chaque chirurgie lorsqu'il est nécessaire de faire une chirurgie lésionnelle puis de faire une chirurgie implantatoire. Après 10 jours de récupération et de surveillance post-opératoire, les animaux seront déplacés dans le deuxième établissement utilisateurs puis acclimatés à leur nouvelle animalerie pendant 10 jours. Ensuite, les animaux seront soumis à un contrôle alimentaire qui durera une vingtaine de jours. Pendant ces 20 jours les animaux auront l’étape de comportement avec 3 phases : l’habituation (5 jours), l’apprentissage (5 jours) et le contrôle (5 jours). Pour la phase d’habituation les animaux auront des essais durant 30 minutes. Pendant la phase d’habituation et de contrôle, les animaux auront 60 essais par jour ce qui représentera environ 2 heures par jour. Les animaux seront hébergés de façon individuel après la chirurgie pour éviter tout arrachement des sondes.

Impact sur les animaux

Le projet peut induire des effets indésirables sur les animaux, listés ci-dessus. : ● Le risque de douleur durant la chirurgie. ● Le risque de douleur aiguë lié à la récupération post-opératoire. ● Le risque d’infection des implants. ● Le risque de stress lié à l’hébergement individuel après la chirurgie. ● Le contrôle des apports caloriques en régulant la quantité de nourriture disponible, nécessaire à l’exécution de la tâche comportementale, sera limitée pour atteindre une réduction maximale à 85% de leur poids initial.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issu des procédures. La mise à mort des animaux sera nécessaire pour réaliser des contrôles d’immunohistochimie sur les cerveaux.

Remplacement

Par définition, les mécanismes neuronaux de la prise de décision perceptuelle ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Cela est d’autant plus vrai dans le cadre d’expérimentation avec une forte valeur éthologique ajoutée. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici.

Réduction

Les techniques expérimentales utilisées ici permettent de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groupes expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques.

Raffinement

Une grille de notation sur le comportement de construction du nid chez la souris sera réalisée comme un indicateur du bien-être. En effet, lors de stress, de douleur ou de mal être chez la souris la construction des nids est affectée. Cette évaluation quotidienne permettra d’alerter ou d’identifier un mal-être ou une douleur éventuelle lorsque la qualité du nid est altérée. Elle permettra également de témoigner d’un bien-être lorsque le nid est de bonne qualité. Pour respecter le rythme de vie des animaux et les manipuler lorsqu’ils sont réveillés, les animaux seront hébergés avec un cycle de lumière jour/nuit inversé correspondant à leur phase d’éveil/sommeil. En effet, les souris sont des animaux nocturnes. Grâce à un système de programmation de l’éclairage, le jour ils seront donc dans l’obscurité avec lumière rouge (non visible pour eux) et la nuit ils seront hébergés avec de la lumière. Les tests comportementaux seront ainsi réalisés lors de l’éveil des souris et elles ne seront pas dérangées lors de leurs phases de sommeil. Les résultats avec ce cycle de lumière inversé seront plus pertinents sur le plan éthologique et fourniront des données plus fiables et robustes. Les tests comportementaux ont également été raffinés pour étudier des comportements de prise de décision éthologique (qui existent dans la nature) dans des conditions quasi-naturelles au sein même du laboratoire. Le projet comprend des chirurgies qui se feront sous anesthésie générale avec une couverture médicamenteuse qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les procédures de chirurgie ont été raffinées grâce à la cartographie du cerveau permettant des injections précises ciblant seulement les structures d’intérêt, permettant ainsi de réduire considérablement les effets secondaires liés à des injections peu spécifiques. Les animaux, bien que hébergés de façon individuelle, auront un contact olfactif et visuel avec leurs congénères. Ils auront un enrichissement important (nid, maison, tunnel, bâtonnets à ronger) et seront manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 8 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge jeune adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène, garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.

Un client pharmaceutique fait tester son candidat médicament anti-obésité à un stade précoce de développement. 48 souris mâles rendues obèses par un régime dont 60 % des calories viennent des graisses vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit 95 administrations sous-cutanées et 19 injections intrapéritonéales, subit 45 pesées, cinq prélèvements sanguins précédés d'un jeûne de quatre heures et deux séjours de 72 heures en mesure de dépenses énergétiques, le tout en cage individuelle. L'étude est limitée aux mâles pour ne pas doubler les effectifs, une seconde étude sur des femelles n'étant envisagée que si une efficacité est observée chez les mâles.

Objectifs

Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un candidat médicament de notre client et vise à tester son efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse, en administration seule ou combinée avec un autre composé anti-obésité déjà autorisé sur le marché. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament seul sur l'appétit, les dépenses énergétiques et, en conséquence, sur le poids corporel du modèle d'obésité. Dans le cadre des administrations combinées avec le sémaglutide, l'objectif est d'observer un additivité des effets et, ainsi, une amélioration des effets de la combinaison comparativement au sémaglutide seul.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (45 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de véhicule ou du candidat médicament par voie intrapéritonéale (19 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 3) Administrations de véhicule ou de composé de référence par voie sous-cutanée (95 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 4) Analyse non invasive de composition corporelle (5 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 5) Prélèvements sanguins (5 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 6) Mesures de dépenses énergétiques (2 sessions de mesures de 72h); 7) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements intrapéritonéaux et sous-cutanés, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs aiguës et de stress. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe témoins non obèse a été réduit à 8 animaux, contre 10 pour les groupes expérimentaux constitués de souris obèses, compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genre.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par voie intrapéritonéale et sous-cutané seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 20 semaines (35 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une période de 14 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur.

Pesées puis numérotées par poinçonnement de l'oreille sur animal vigile, 600 souris reçoivent une injection dans la veine de la queue, suivie de prélèvements sanguins à dix minutes, six heures, un jour, trois jours et sept jours, puis deux fois par semaine pendant quatre semaines. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Une partie subit en fin d'étude un prélèvement de grand volume par piqûre dans le cœur, sous anesthésie sans réveil, qui peut provoquer un arrêt cardiaque, suivi d'une dislocation cervicale. L'objet est de mesurer le passage dans le sang de candidats médicaments anticancéreux, en vue de fixer les doses des premiers essais chez l'être humain. Les souris qui n'entrent pas en protocole, et celles qui n'ont pas atteint les points limites, sont "reformées" pour l'entraînement du personnel aux gestes techniques.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer les données de pharmacocinétiques, c’est à dire le devenir du médicament dans le sang, au cours du temps. Ces données pharmacocinétiques sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront d’évaluer au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité antitumorale et de tolérance qui seront également effectuées sur des modèles souris. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de pharmacocinétique (projet actuel), d’efficacité et de tolérance seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, de définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Une méthode de micro-échantillonage (prélèvement d’un échantillon de volume faible par le biais d’un dispositif adapté) sera utilisée afin d’améliorer la significativité de ces études, tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires en prélevant beaucoup moins de volume sanguin et à des fréquences adéquates.

Bénéfices attendus

La pharmacocinétique de composés thérapeutiques est un élément essentiel pour analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et de tolérance et permettront, à terme de déterminer les doses et fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.

Procédures

1/ Après une semaine de stabulation, les souris seront pesées (maximum 1 min) et numérotées vigiles par poinçonnement auriculaire (maximum 3 min). 2/ Une contention suivie d'une injection/prélèvement sur animal vigile sont prévues sur chaque animal (1 à 3min) : - lors de l’injection par intraveineuse dans le veine caudale des candidats médicaments (t-0). - Lors de chacun des prélèvements dans la veine caudale et échantillonnage par microcapillaire. 3/ En fonction des expériences, un prélèvement sanguin terminal de grand volume (3 min), pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil (maximum 3 min), suivi d'une mise à mort par dislocation cervicale (maximum 1 minute).

Impact sur les animaux

1/ La contention et les injections/prélèvements induisent un stress de l’animal durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte - de 1 à 5 minutes). 2/ les injections/prélèvements induisent un stress et une douleur de type modérée durant plusieurs secondes (pendant l’acte - de 1 à 5 minutes). Note : Les composés de cette classe thérapeutique, injectés à cette dose sont parfaitement tolérés dans la littérature et n'induisent pas d’évènements indésirables à la dose utilisée. Ces derniers seront néanmoins surveillés lors de chaque manipulation. 3/ En fonction des expériences, un prélèvement sanguin final de grand volume, pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil, suivi d'une mise à mort par dislocation cervicale.

Devenir

Les animaux ayant atteint un point limite par rapport à la grille de score, seront euthanasiés. En fonction des besoins de l'expériences et de l'avis vétérinaire, les animaux inclus en expérience n'ayant pas atteint les points limites seront soit euthanasiés en fin de procédure pour un prélèvement terminal sans réveil suivi d'une nécropsie, soit reformées pour entrainement aux geste techniques sur avis vétérinaire. Les souris non entrées en protocole seront reformées pour entrainement aux geste techniques.

Remplacement

S’agissant d’analyses pharmacocinétiques, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs et robustes. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet se comportant de façon identique dans la souris comme chez l’humain (cible exprimée de la même façon et sans mutation entre les deux espèces), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.

Réduction

Le procédé de micro-échantillonnage lors des prélèvements sanguins permet d’obtenir l’ensemble des valeurs pour un même animal en ne lui prenant que de très faibles quantités de sang. Le nombre d’animaux utilisés est ainsi considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus sont également mieux maitrisées. Ainsi, seuls 4 à 5 animaux par groupe seront nécessaires pour ces expériences. Une majoration de 20% sur ce nombre d’animaux est appliquée en cas de problèmes à l’injection ou en cas de manque d’homogénéité entre les différents animaux au moment de l’entrée en expérimentation (pouvant mettre en péril les résultats de cette expérience).

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté ainsi qu'un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Afin de de mettre en évidence tout signe de souffrance ou d’évènements indésirables pouvant provenir du traitement, les animaux seront suivis quotidiennement et avant chacun des prélèvements (10 min, 6h, 1 jour, 3 jours, 7 jours) puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux seront également pesés avant le traitement, puis 1 jour, 3 jours, 7 jours post-traitement, puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux seront euthanasiés à la fin du dernier prélèvement (à 28 jours post-traitement). Une grille de score suffisamment prédictive et adaptée à l’étude, permettra d'éviter la souffrance des animaux avec une surveillance physiologique et comportementale. Un système de surveillance sera mis en place avec l’Etablissement Utilisateur (EU) pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue les autres jours, y compris le WE. Un prélèvement sanguin final de grand volume (par piqure dans le coeur) pourra être effectué sous anesthésie/antalgie générale sans réveil suivi d’une mise à mort par dislocation cervicales. Les prélèvements d’organes seront réalisés après la mort de l'animal.

Choix des espèces

Les études pharmacocinétiques nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études (permettant de transposer ces données chez l’Homme). En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de tolérances seront également générées sur cette espèce animale afin de déterminer au mieux les doses cliniques à injecter de ces candidats médicaments. Des souris de souche CD-1 seront utilisées car plus massive et bien adaptée à ces expériences nécessitant des prélèvements répétés. Ces animaux seront inclus en expérience à des âges de 8-9 semaines. A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une pharmacocinétique pertinente par rapport au type de thérapies utilisées dans ce projet.

Vingt-quatre gavages et trente-deux prélèvements sanguins en six mois, ou trente-deux injections intrapéritonéales et douze poses de cathéter : c'est ce que peut subir un même animal dans ce projet. 950 souris et 250 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour que le personnel s'entraîne aux gestes techniques et entretienne ses compétences. Le porteur présente cette utilisation comme un raffinement, au motif qu'un geste maîtrisé réduira le stress des animaux impliqués dans les autres projets, et signale par ailleurs qu'un gavage mal exécuté peut irriter les voies aérodigestives. Les animaux sont tués parce que le personnel ne peut pas être formé sur des animaux trop vieux, leurs organes étant ensuite "valorisés" dans des études ex vivo.

Objectifs

Dans une démarche de raffinement des expérimentations, nous souhaitons consacrer des animaux à la formation du personnel aux divers gestes techniques que nous pratiquons en routine. La thématique du laboratoire est notamment axée vers la recherche thérapeutique et diagnostique dans la lutte contre le cancer. Une fois les essais préliminaires in vitro validés, nos recherches nous mènent le plus souvent à des essais in vivo, les études sur cellules ne pouvant pas se substituer aux études sur un organisme entier afin d'évaluer les effets potentiellement indésirables d’une molécule diagnostique ou thérapeutique. Dans un objectif de raffinement des diverses méthodes mais également de réduction du nombre d’animaux utilisé pour une étude donnée, nous souhaitons travailler de manière continue sur un petit nombre d’animaux à la formation du personnel sur les divers modes d’administration (intraveineux, intra péritonéal, sous cutanée, intra articulaire, gavage) et de prélèvements sanguins. Nous avons régulièrement de nouveaux personnels (étudiants, temporaires ou statutaires) et nous devons également assurer le maintien des compétences techniques de chacun. Nous devons ainsi mettre en place des programmes de formation et maintien des compétences pour l’ensemble des acteurs des différents projets aux nouvelles approches dans le but d’être plus affin dans nos études.

Bénéfices attendus

Ces formations permettront au personnel d’être formé et de maintenir leurs compétences techniques sur les gestes qu’ils devront appliquer vis-à-vis de leurs différents projets. Ainsi, avec un geste maitrisé et plus précis, les expérimentateurs pourront diminuer le stress des animaux inclus dans les différents projets et raffiner la technique pour des résultats plus reproductibles.

Procédures

En fonction des gestes techniques, un animal pourra subir sur 6 mois soit : (i)24 gavages au maximum à raison de 2 gavages maximum par semaine d’une durée de 1 à 2 minutes et 32 prélèvements de sang dans la veine caudale à raison de 2 fois par semaine maximum avec alternance de la veine caudale et contention d’une durée de quelques secondes à 1 minute. Soit (ii)12 poses de cathéter en intraveineuse maximum 1 fois par semaine en alternance veine caudale sur animaux anesthésiés pour une durée inférieur à 1 minute et 32 injections intrapéritonéales maximum 2 fois par semaine avec alternance droite gauche sur animaux vigiles en contention pince dos d’une durée inférieur à 1 minute. Soit (iii)4 Injections intra articulaire par patte, maximum 1 fois par semaine, sous anesthésie gazeuse d’une durée inférieur à 2 minutes et 30 injections sous cutanées sur animal vigile d’une durée inférieure à 20 secondes. Soit (iv)6 Injections dans la masse graisseuse entourant la glande mammaire (1 par glande mammaire) sur animal anesthésié, maximum 1 injection par semaine, pour une durée de 1 à 2 minutes et 30 injections intraveineuses, maximum 2 fois par semaine en alternant les 2 veine caudale pour une intervention inférieur à 1 minute. Soit (v)2 prélèvements submandibullaires au maximum 2 par semaine avec alternance droite gauche sur animaux anesthésié pour une durée de 1 à 2 minutes et 50 injections sous cutanées sous anesthésie maximum 2 fois par semaine pour une durée inférieur à 1 minute. Soit (vi) 30 injections intraveineuses 2 fois par semaine maximum, avec alternance veine caudale droite et gauche et sur animaux vigiles dans appareil de contention, durée de l’intervention inférieur à 1 minutes et 50 injections sous cutanées sur animal anesthésié maximum 2 fois par semaine pour une durée inférieur à 1 minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont le stress modéré lors des diverses injections (intrapéritonéales, intraveineuses, sous cutanées), prélèvements (veine caudale) ou gavage réalisés en vigile sous contention. Toutefois il est à noter qu’une procédure de gavage mal exécutée peut entrainer une irritation des voies aérodigestives supérieures. Pour l’administration intra-articulaire, lorsque celle-ci est réalisée avec du sérum physiologique aucune douleur, ni effet indésirable n’est attendu. Concernant l’injection ou le prélèvement via un cathéter placé dans la veine caudale, la réalisation du geste sous anesthésie permet de prévenir le stress de l’animal lié à une contention plus longue le temps de la pose du cathéter. Dans tous les cas, un suivi régulier des animaux permettra de réagir rapidement en cas d’apparition d’une souffrance pour l’animal. L’arbre décisionnel viendra orienter les actions à mener jusqu’à l’atteinte de points limites.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chacune des procédures car nous ne pouvons former le personnel sur des animaux trop vieux. Dans le cadre de raffinement et de réduction, ces animaux seront valorisés post mortem par l’utilisation de leurs organes dans des expérimentations de mise au point d’études ex vivo ou en tant que contrôle pour certaines études.

Remplacement

Suite aux études in vitro, le développement et la validation préclinique de nouvelles molécules diagnostiques et/ou thérapeutiques requièrent la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant. Ainsi, il est nécessaire de former le personnel aux différentes voies d’administration et de prélèvements pour ces études. Pour les injections et prélèvements dans la veine de la queue, nous avons mis en place un système artificiel qui permet dans un premier temps de maitriser le positionnement du geste sans utilisation d’un animal.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum tout en permettant un entrainement régulier et pertinent des expérimentateurs. Nous prévoyons au plus performant de notre activité 950 souris et 250 rats. Il s’agit ici d’un nombre maximal sur 5 ans.

Raffinement

Les formations du personnel constituent un raffinement à part entière car elles permettront une formation et un maintien de compétence du personnel avec une meilleure qualité des gestes techniques pratiqués tant pour le bien-être animal que pour la pertinence et la reproductibilité des résultats. Pour l’ensemble des gestes décrit dans les procédures, nous avons réalisé une vidéo tutoriel. Chaque geste est rattaché à un formateur qui dispense la formation théorique accompagnée de la vidéo sus mentionnée. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être améliorés par l'administration d'antalgiques avant l'atteinte des points limites définis. Pour le bien-être des animaux inclus dans ce projet, nous mettons à disposition un enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane dans chacune des cages.

Choix des espèces

Les rongeurs sont classiquement utilisés en expérimentation animale dans le domaine de la recherche contre le cancer. Différentes souches de souris et rat pourront être utilisées en fonction des besoins au regard de leur différence de carnation. Souris adultes âgées d’au minimum 6 semaines et rats de 200 à 450g. L’âge des animaux a été déterminé en fonction de l’âge moyen des animaux utilisés dans les diverses études en oncologie.

Anesthésiées, greffées avec des cellules cancéreuses humaines sous la peau ou directement dans le poumon, le pancréas, le foie ou le cerveau, 2 000 souris aux défenses immunitaires réduites voient leur tumeur croître pendant huit semaines au maximum. S'ajoutent une séance d'imagerie sous anesthésie par semaine, une injection de nanoparticules, puis une séance de radiothérapie de vingt minutes. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et le porteur note que le modèle de souris immunodéprimée "est une nuisance en soi", tout en écrivant que la radiothérapie ne devrait pas provoquer d'effets indésirables. Elles sont tuées à la fin pour que la tumeur et les organes soient prélevés et analysés.

Objectifs

Selon les données récentes de l'Organisation mondiale de la santé (OMS), environ 19,3 millions de nouveaux cas de cancer ont été diagnostiqués en 2020, et les projections estiment que ce nombre atteindra près de 30 millions d'ici 2040. La radiothérapie est un traitement clé dans la prise en charge du cancer, utilisée chez environ 50 à 60 % des patients à un moment de leur parcours thérapeutique. Elle consiste à utiliser des rayons pour détruire les cellules cancéreuses tout en préservant au maximum les tissus sains. La radiothérapie est particulièrement efficace dans le traitement des cancers du sein, de la prostate, du poumon et des cancers de la tête et du cou. Elle reste donc un pilier essentiel des stratégies thérapeutiques, notamment pour les cancers localisés ou en complément d'autres traitements comme la chirurgie et la chimiothérapie. Un développement prometteur pour renforcer l'efficacité de la radiothérapie est l'utilisation de de deux types de particules de très petite taille appelées nanoparticules : 1) des nanoparticules en métal qui permettrait d'augmenter localement la dose de radiation absorbée par les cellules cancéreuses et d’amplifier les dommages infligés aux cellules tumorales lors de l'exposition aux rayonnement, ou 2) des nanoparticules remplies avec une drogue anticancéreuse qui peuvent s'ouvrir avec la radiothérapie permettant de libérer la drogue anticancéreuse localement dans la tumeur. L'intégration des nanoparticules dans les traitements de radiothérapie pourrait ainsi représenter une avancée majeure dans l'optimisation des thérapies contre le cancer, permettant d’améliorer la précision des traitements, et de réduire les effets secondaires. L’objectif de ce projet est de tester l’utilisation de nanoparticules, soit métalliques soit chargées en drogue anticancéreuse, améliorant la radiothérapie dans différents types de cancer. Ce projet se déroulera sur deux sites. Sur le premier (EU1), auront lieu : l’implantation des cellules cancéreuses et le suivi de croissance tumorale. Sur le deuxième (EU2), auront lieu les radiothérapies.

Bénéfices attendus

L'objectif du projet est de développer de nouvelles particules pour pouvoir proposer un schéma de traitement optimal avec une bonne efficacité thérapeutique pour un transfert vers un essai clinique chez l’homme.

Procédures

Interventions sur les animaux : anesthésie générale (EU1, entre 5 et 25 minutes), implantation sous cutanée et croissance de tumeur sous-cutanée (EU1, durée environ 10 minutes, 1 fois, suivi sur 8 semaine maximum), chirurgie d'implantation de cellules cancéreuses (EU1, durée environ 20 minutes, 1 fois), croissance de tumeur dans leurs sites d'origine (poumons, pancréas, foie, cerveau , 8 semaines maximum), anesthésie pour imagerie médicale (EU1, durée environ 15 minutes, 1 fois/semaine, 8 semaines maximum), injection de produit de contraste et/ou de particules (EU2, 1 fois), radiothérapie (EU2, durée environ 20 mimnutes,1 fois). Le modèle de souris avec des défenses immunitaires réduites est une nuisance en soi.

Impact sur les animaux

L’inoculation de tumeur peut induire des douleurs que ce soit en sous-cutanée ou en sur le site de la tumeur originelle. La radiothérapie ne devrait pas engendrer d’effets indésirables. Les procédures d'imagerie sont indolores. Si les traitements ne sont pas suffisamment efficaces, la tumeur continuera de grandir et pourra causer des douleurs, l‘étude sera alors interrompue.

Devenir

Les animaux issus des procédures seront mis à mort afin de prélever la tumeur et des organes pour des analyses anatomopathologiques.

Remplacement

Nous aurons, par une série de tests sur cellules en culture in vitro, sélectionné les particules d’intérêt. Grace à des tests complémentaires sur des tumeurs en culture 3D, nous nous focaliserons sur environ 20 particules différentes, constituant les candidates les plus prometteuses. Les paramètres d'efficacité thérapeutique sont obtenus uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.

Réduction

Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de particules à tester ainsi que le nombre de lignées de cellules. Cela nous permettra d’éviter de tester toutes les particules candidates sur animal. Concernant les tests sur animaux, nous nous efforcerons de faire en sorte que l’effectif utilisé soit minimal. Cela permettra ainsi de réduire le nombre d’animaux employé autant que possible tout en obtenant des informations scientifiques avec une validité statistique suffisante. Les particules qui seront validées après cette première étape seront injectées chez des souris porteuses de tumeurs afin de tester leur efficacité thérapeutique. Dans chaque procédure le nombre d’animaux pourra être réduit jusqu’à 50% si l’effet attendu est suffisamment important pour obtenir des résultats statistiquement fiables avec la première moitié d’animaux ou si les données se révèlent non pertinentes (arrêt alors des expérimentations). Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin de ne pas compromettre la validité des expériences. Ce nombre a été estimé à l'aide d'une approche statistique.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet ont des caractéristiques nuisibles pour leur santé, des mesures compensatoires de raffinement ont donc été prises pour leur hébergement : mesures d’hygiène supplémentaires, les cages sont stériles et jetables, la litière, les croquettes et l'enrichissent sont également stérilisés. L’étude se déroulera sur une période qui, dans la vie des animaux avec des défenses immunitaires réduites, se situe bien en amont des complications liées à l’âge chez ces animaux. Les chirurgies se feront sous anesthésie générale et la douleur sera gérée par une analgésie adaptée. Le transport entre les EU s’effectuera dans des boites de transport avec enrichissement, boisson et nourriture. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux garantiront leur bienêtre, et nous permettront d’intervenir immédiatement de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Toute forme de nuisance ou effets indésirables des procédures expérimentales seront attentivement surveillées lors de l'observation des animaux. Ces effets indésirables sont listés parmi les points limites de chaque procédure. L’utilisation de souris avec des défenses immunitaires réduites permet l'étude de lignées cancéreuses humaines sans phénomène de rejet. La croissance des tumeurs sera suivie régulièrement au pied à coulisse et par imagerie médicale.

Choix des espèces

Les souris immunodéprimées de 5 semaines permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. À ce stade de développement, on obtient des souris adultes avec des tumeurs bien installées, juste avant que leur système immunitaire, en particulier les cellules qui combattent les infections et les tumeurs, n'atteigne son niveau maximal de production à 8 semaines. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ces modèles de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues.

Des injections quotidiennes pendant cinq semaines, une tumeur greffée et jusqu'à deux séances d'imagerie par semaine : 4 170 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Le porteur décrit des tumeurs pouvant comprimer les tissus voisins, se nécroser ou s'ulcérer. La question posée est de savoir si neutraliser un régulateur de l'autophagie renforce l'effet des immunothérapies anticancéreuses. Le choix de la souris tient à l'habitude et à la commodité, le porteur indiquant que les laboratoires en utilisent principalement, que c'est l'animal de laboratoire le plus couramment employé et que l'équipe en a la pratique.

Objectifs

L’autophagie est un processus naturel qui permet aux cellules de se débarrasser de leurs parties abîmées, comme les organites ou les protéines endommagées. En recyclant ces éléments, les cellules peuvent mieux s’adapter aux situations de stress. Ce mécanisme est important car il aide les cellules à se réparer et à se protéger. Des recherches récentes ont montré que l’autophagie joue un rôle crucial dans le soutien du système immunitaire pour combattre les tumeurs. Bien que nous ne comprenions pas encore complètement comment cela fonctionne, il semble que l’autophagie puisse influencer l’efficacité des traitements de l’immunothérapie contre le cancer. Par conséquent, explorer comment cibler ce processus dans le contexte des tumeurs pourrait améliorer l’efficacité de ces traitements. Certains régulateurs de l’autophagie, présents à l’intérieur des cellules, participent à des fonctions comme le métabolisme des graisses. Mais ils peuvent aussi agir à l’extérieur des cellules, étant libérés par divers organes tels que le foie, les graisses, le cœur, les reins et les muscles. Des études ont montré que bloquer ces régulateurs extracellulaires active l’autophagie dans plusieurs modèles de souris, notamment dans le foie et le cœur. Ce projet a pour but d’évaluer si la neutralisation de certains régulateurs de l’autophagie, qui circulent à l’extérieur des cellules, peut améliorer l’efficacité des traitements anticancéreux. Nous cherchons également à comprendre comment cette neutralisation influence les réponses immunitaires, notamment la capacité du système immunitaire à se souvenir et à réagir de manière plus efficace face aux cellules cancéreuses. Enfin, nous souhaitons explorer le rôle de ces régulateurs dans le syndrome de Li-Fraumeni (SLF), une maladie héréditaire rare qui augmente le risque de développer plusieurs types de cancers dès le plus jeune âge.

Bénéfices attendus

La recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer revêt une importance cruciale tant en France qu'à l'échelle mondiale. Tout d'abord, le cancer demeure l'une des principales causes de morbidité et de mortalité, constituant un défi majeur pour les systèmes de santé. Les données épidémiologiques montrent une augmentation de l'incidence de ces cancers, avec des variations significatives selon les régions et les populations, influencées par des facteurs génétiques, environnementaux et de mode de vie. L'immunothérapie, une approche anticancéreuse largement discutée au cours des quinze dernières années, produit des résultats remarquables chez les patients réceptifs. Cependant, entre 50 et 80 pour cent des individus ne manifestent pas de réponse positive à ces traitements. En somme, trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques est impératif pour répondre efficacement à ce défi de santé mondial et offrir de l'espoir à ceux qui luttent contre cette maladie dévastatrice. Cette étude permettra de déterminer si la neutralisation de la protéine impliquée dans l’autophagie pourrait être proposée comme une nouvelle stratégie thérapeutique anticancéreuse.

Procédures

Les souris seront partiellement rasées au niveau du dos (quelques secondes). Les souris de ce projet recevront une injection de cellules afin de provoquer le développement d'une tumeur. Une partie des souris recevra une seconde injection pour tester le système immunitaire. Les injections seront réalisées pendant que les souris seront endormies avec un anesthésiant léger, afin de minimiser leur stress et leur inconfort. Les traitements anticancéreux seront ensuite administrés quotidiennement pendant une période maximale de 5 semaines, par des injections qui seront faites rapidement et sans provoquer de douleur ou de symptômes majeurs. La taille des tumeurs sera mesurée régulièrement, au moins deux fois par semaine, avec un instrument précis, sans perturber les souris plus d'une minute à chaque mesure. Pour suivre l'évolution des tumeurs, certaines d’entre elles seront surveillées par une méthode d’imagerie spéciale, deux fois par semaine. Ce suivi par imagerie ne durera pas plus de 10 minutes par animal. Dans certains cas, les souris recevront seulement deux injections de traitements, qui seront effectuées rapidement et ne provoqueront pas de symptômes gênants. Enfin, certaines injections seront réalisées dans une veine de la queue de l'animal, toujours sous anesthésie légère, pour garantir leur confort.

Impact sur les animaux

Certains animaux de ce projet recevront une injection de cellules tumorales, ce qui peut provoquer une légère douleur de courte durée au site d'injection. Aucun autre effet indésirable n’est attendu, à part ceux liés à la croissance de la tumeur elle-même. Les tumeurs en développement peuvent comprimer les tissus environnants, entraînant un certain inconfort. Selon le type de cellules injectées, les tumeurs peuvent également présenter des complications telles que des nécroses ou des ulcérations. Toutes les souris recevront des injections régulières au niveau de l'abdomen, ce qui peut entraîner un stress dû à la manipulation et une douleur passagère au point d'injection. Certaines souris subiront également des injections dans une veine de la queue. L'utilisation d'anesthésiant peut parfois réduire la capacité des animaux à réguler leur température corporelle et peut entraîner un risque pour leur fonction cardio-respiratoire.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour des analyses biochimiques, histologiques et métaboliques, car cela est nécessaire pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

L'impératif d'utiliser des animaux vivants découle de l'incapacité actuelle à reproduire in vitro ou ex vivo la complexité des effets des traitements anti-cancéreux sur la tumeur, les tissus environnants, les facteurs solubles et le système immunitaire. Les réponses immunitaires ne peuvent être pleinement comprises que dans le contexte d'un organisme vivant. Les modèles animaux reproduisent mieux la complexité du microenvironnement tumoral, y compris les interactions entre les cellules cancéreuses, les cellules immunitaires et les vaisseaux sanguins.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 4170 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Une surveillance régulière permettra de détecter rapidement tout signe de mal-être, tels que les yeux mi-clos, ou des comportements anormaux, ce qui permettra une intervention rapide pour adresser tout problème de bien-être. Des points limites précoces et adaptés à chaque type d'expérience seront établis pour garantir que la douleur et la souffrance des animaux soient minimisées autant que possible. La réaction au site d'injection sera régulièrement évaluée pour détecter tout signe d'inflammation ou d'infection, avec des interventions vétérinaires prêtes en cas de complication comme l’utilisation d’antiseptique (Chlorhexidine). De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie des animaux, utilisation de lampes chauffantes...). Les mâles qui montreront des signes d'agressivité seront isolés pour prévenir les blessures et le stress causés par les combats. Des ajustements seront faits en temps réel pour améliorer les conditions de vie des animaux ou modifier les protocoles de traitement.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - Les laboratoires utilisent principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. -La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé. -La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

Une plaie carrée de vingt millimètres de côté, sur toute l'épaisseur de la peau du dos, est pratiquée sous anesthésie sur chacune des 1 080 souris immunodéficientes du projet, puis recouverte d'un substitut cutané et de leur propre peau dévitalisée suturée. Toutes sont tuées 15, 30 ou 90 jours après la greffe pour prélever la zone greffée, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les greffons testés sont des produits de thérapie cellulaire préparés à partir de cellules souches humaines, destinés au traitement de maladies génétiques de la peau. Le porteur compte six souris par temps de prélèvement et trente substituts évalués au maximum, sans expliquer comment il parvient à 1 080 animaux. Il présente l'usage de la peau dévitalisée comme un progrès pour le bien-être des animaux non-humains, tout en isolant chaque souris en cage individuelle pendant trois à quatre semaines.

Objectifs

L’objectif de notre projet est d’évaluer la fonctionnalité et la stabilité de substituts cutanés de thérapie cellulaire préparés et utilisés suivant différentes modalités. Ce projet est la suite d’un projet précédemment autorisé au cours duquel nous avons évalué les premiers substituts cutanés de thérapie cellulaire préparés à partir de cellules souches humaines. Ces substituts cutanés sont destinés au traitement de maladies génétiques. Les substituts cutanés seront préparés suivant les normes concernant les exigences techniques relatives aux produits pharmaceutiques à usage humain. Un maximum de 30 substituts cutanés, sélectionnées sur la base d’essais préalables in vitro de stabilité et de fonctionnalité, seront transportés et utilisés dès réception ou conservés jusqu’à 5 jours dans l’attente de réalisation de greffes, afin de mimer au plus près les conditions cliniques qui seront utilisées chez l’Homme. Les greffes seront effectuées sur des souris avec un système immunitaire déficient afin d’éviter leur rejet, après induction d’une plaie cutanée sur toute l’épaisseur de la peau. Des prélèvements seront effectués à différents temps après réalisation des greffes afin d’étudier la fonctionnalité des greffons et les interactions se mettant progressivement en place entre greffon et hôte. Des analyses seront effectuées sur les prélèvements cutanés collectés et permettront de caractériser in vivo au cours du temps la fonctionnalité des greffons et d’appréhender les interactions se mettant en place entre le greffon et l’hôte. Les résultats obtenus permettront de définir les conditions optimales pour garantir les meilleures conditions de préparation, de transport et de stockage des substituts cutanés et de réalisation des greffes cutanées.

Bénéfices attendus

Les substituts cutanés sont des biomatériaux capables de remplacer une partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée. Aujourd'hui, si les greffes se heurtent à l’écueil d’une disponibilité limité de peau, en particulier dans la prise en charge des grandes brûlures et les procédures restent invasives et douloureuses. Certaines greffes peuvent pourvoir au remplacement temporaire de la peau, avant de laisser la place à une autre greffe. Subsiste évidemment les risques de rejet, douleurs et infection, et la formation de cicatrices. De nombreux substituts cutanés sont aujourd’hui disponibles, constitués de cellules humaines vivantes ensemencées sur une matrice et nourries de composés nécessaires pour mieux se développer et se multiplier dans le tissu souhaité, et des substituts cutanés à partir de cellules humaines sont produits par ingénierie tissulaire. La technologie utilisée pour produire les substituts cutanés que nous allons évaluer va permettre le traitement de maladies génétiques de la peau. Il est donc important et nécessaire d’évaluer la fonctionnalité et la stabilité de ces substituts cutanés sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation des plaies cutanées. Les différentes conditions expérimentales qui seront utilisées permettront de définir les conditions optimales pour garantir les meilleures conditions de préparation, de transport et de stockage des substituts cutanés et de réalisation des greffes cutanées.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation d’une greffe de substitut cutané. Sous anesthésie générale, un prélèvement de peau carré de 20 mm de côté sur toute l’épaisseur de la peau sera effectué au milieu du dos et en arrière des omoplates sur l’ensemble des souris. Un substitut cutané sera placé dans le lit de la plaie cutanée et le carré de peau prélevé, dévitalisé, sera suturé en plusieurs points indépendants. Un traitement analgésique des souris sera administré avant la chirurgie puis après la fin de celle-ci. La chirurgie sera réalisée en 25 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes de substitut cutané seront protégées par un pansement et la peau dévitalisée suturée permettant d’effectuer des observations et de scorer différents paramètres au niveau des greffes cutanés. Un suivi quotidien de l’ensemble des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations, week-ends et jours fériés inclus. Un maintien des souris greffées en cage individuelle sera nécessaire pendant 3 à 4 semaines maximum après réalisation des greffes cutanées pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles la peau dévitalisée servant de pansement de couverture, le pansement et surtout le greffon cutané. Après cicatrisation complète, 3 à 4 semaines maximum après réalisation des greffes cutanées, les souris seront replacées à 2 par cage jusqu’à la fin des expérimentations.

Impact sur les animaux

L’induction d’une plaie cutanée pour la réalisation de la greffe cutanée va engendrer une douleur modérée transitoire pendant quelques heures. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées, nécessaire tout au long du processus cicatriciel et de régénération tissulaire, soit pendant 3 à 4 semaines maximum, pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles la peau dévitalisée servant de pansement de couverture, le pansement et surtout le greffon cutané, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes.

Devenir

Les 1080 souris seront euthanasiées à différents temps après réalisation de la greffe cutanée, 15, 30 et 90 jours après, avec 6 souris, 3 souris mâles et 3 souris femelles, par temps de prélèvement. Un prélèvement cutané sera réalisé au large de la région greffée pour réaliser un ensemble d’analyses permettant de caractériser sur des temps précoces et prolongés la fonctionnalité et l’évolution de substituts cutanés greffés, processus dépendants de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, mise en place de la vascularisation…).

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité et l’évolution de substituts cutanés greffés, processus dépendants de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, mise en place de la vascularisation …). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous ne grefferons que des Unités Thérapeutiques Cliniques sélectionnées sur la base de résultats d’analyses préalables. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études précédentes effectuées suivant les mêmes conditions expérimentales et selon les recommandations en vigueur (5 animaux minimum par condition). Ainsi, 6 souris par temps de prélèvements, 3 souris mâles et 3 souris femelles, seront suffisants. La réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permettra également de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation de la greffe cutanée (traitement pour supprimer la douleur avant la chirurgie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (traitement pour supprimer la douleur après la chirurgie et observations régulières). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine, et si une perte de poids trop importante par rapport au poids maximal est observée ou si des signes d’infection de la plaie greffée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les animaux seront placés dans des conditions permettant d’observer leur comportement pendant leur phase d’activité et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie). Des bâtonnets de coton seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière. L’utilisation de la peau excisée dévitalisée, suturée au-dessus de la greffe de substitut cutané, comme pansement de couverture, évitera l’utilisation d’un système de maintien avec des bandes de sparadrap, favorisant le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie représentative des plaies à traiter chez l’Homme, et la souche de souris utilisée est dépourvue de système immunitaire, permettant d’éviter les risques de rejet suite à une greffe de peau d’un organisme étranger. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des souris âgées de 6-7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7-8 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).

6 176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, jusqu'à deux injections dans le sinus rétro-orbitaire, quatre injections intrapéritonéales, trois gavages hormonaux, deux prélèvements sanguins et une irradiation de six minutes et cinquante-quatre secondes. Le porteur décrit des tumeurs pouvant entraîner des difficultés respiratoires, des ulcérations, des nécroses, des automutilations et l'isolement des animaux, celles dont le système immunitaire est absent y étant plus exposées. Les retombées annoncées, mieux choisir les traitements et repérer les patients qui répondent aux immunothérapies, sont renvoyées au long terme, tandis que le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'évolution d'un "organisme entier" au cours du développement des cancers.

Objectifs

Les points de contrôle immunitaires sont des protéines qui interagissent avec les cellules du système immunitaire, appelées lymphocytes T, pour réguler leur activité une fois qu'une infection est éliminée. Cependant, dans le cas d’un cancer, les cellules tumorales utilisent ces protéines pour bloquer l’action des lymphocytes T, ce qui leur permet d’échapper au système immunitaire. Pour contrer cela, des médicaments appelés « inhibiteurs de points de contrôle immunitaires » ont été développés. Ils réactivent les lymphocytes T pour qu'ils attaquent les cellules cancéreuses. Ces traitements ont révolutionné le traitement de certains cancers, comme le mélanome avancé. Cependant, beaucoup de patients ne répondent pas à ces traitements ou rechutent dans les cinq ans. Il est donc crucial de mieux comprendre comment les voies cellulaires et moléculaires sont mises en place lors de traitements et de trouver des moyens de prédire qui va y répondre. La protéine Eomes, présente dans les lymphocytes T, joue un rôle important dans la lutte contre les tumeurs, mais on ne sait pas encore clairement comment elle influence la réponse à ces traitements. Les premières recherches montrent que plus il y a d'Eomes, meilleure est la réponse contre le cancer. Ce projet vise à comprendre comment Eomes agit sur l'efficacité des traitements contre le cancer, en utilisant des modèles de cancer chez la souris. Cela permettra de savoir si les lymphocytes T possédant Eomes sont les cibles principales des inhibiteurs des points de contrôle immunitaires.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en place lors du traitement par les inhibiteurs des points de contrôle immunitaires permettra d’améliorer la compréhension des réponses immunitaires impliquées dans la réponse antitumorale et ainsi de comprendre pourquoi certains patients sont réfractaires aux thérapies actuellement utilisées. À terme, cette étude aura donc pour but de mieux sélectionner les traitements, d’augmenter l’efficacité des traitements déjà existants, et potentiellement d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Tous les gestes invasifs seront réalisés sous inhalation d'isoflurane (2% + mélange air/oxygène). Une attention particulière sera portée au suivi par des personnes formées et compétentes. Les injections en sous cutanée ont une durée de 1 minute par souris et sont réalisées une seule fois. Les injections en intraveineuse au niveau de la veine caudale durent 5 minutes et sont réalisées une seule fois. Les injections en intraveineuse au niveau du sinus retro-orbital durent 1 minute et sont réalisées 2 fois avec un jour d’intervalle entre les deux injections. Les prélèvements de sang en sous-mandibulaire durent 1 minute par souris et sont réalisées 2 fois avec 3 semaines d’intervalle entre les deux prélèvements. Les injections intrapéritonéales ont une durée de 1 minute par souris et sont réalisées 4 fois avec 2 jours d’intervalle entre chaque injection. L’administration par gavage d’un traitement hormonal a une durée de 2 minutes par souris et sera réalisée 3 fois par souris. L’irradiation a une durée de 6 minutes et 54 secondes et est réalisé une seule fois.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux murins induits dans ce projet vont engendrer le développement de tumeurs pouvant entraîner des difficultés de déplacements. Un défaut d’alimentation et/ou de boisson et une perte de poids de l’animal peuvent apparaître. De plus, les tumeurs pourraient éventuellement induire des troubles fonctionnels chez l'animal comme des difficultés respiratoires ou une augmentation du rythme respiratoire ainsi qu’une altération de la température corporelle. Des troubles comportementaux pourraient survenir tels que des auto-mutilations,des défauts de toilettage et de nidification ainsi que l’isolement. L’état général des souris pourrait être altéré. Les tumeurs peuvent également présenter des ulcérations ou des infections. Lors de la régression tumorale favorisée par l’action des combinaisons d’immunothérapies, des nécroses peuvent être visibles sans saignements ni rougeurs. L’absence de système immunitaire chez certaines souris du projet les rendent plus sensibles au développement et à la progression tumorale ainsi qu’aux ulcérations, infections et invaginations de la tumeur.

Devenir

Les animaux qui ont développé des tumeurs seront mis à mort afin de réaliser des analyses sur les cellules purifiées à partir des organes prélevés (moelle osseuse ou tumeurs, ganglions drainants la tumeur et rate). Ceci nous permettra d’évaluer l’efficacité des immunothérapies sur la réponse immunitaire anti-tumorale.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Le principe de remplacement n'est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne sont pas capables de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de cancers. Ces études in vitro ne reproduisent pas l'ensemble des voies impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l'obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro capable de prendre en compte toute la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de cancers.

Réduction

L’ensemble des expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux grâce à des études préliminaires qui nous ont permis de maîtriser ces modèles murins. Les résultats actuels ont permis de valider que des lots de 10 souris par génotype selon les paramètres à évaluer permettent d'acquérir des données fiables. La stratégie d’expérimentation sera une étude longitudinale. Cette approche expérimentale permet d’appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées et permet d’avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle. Un test statistique sera utilisé pour les expériences du projet. Dans ce projet, nous utilisons un modèle de mélanome murin dans lequel les cellules cancéreuses émettent de la lumière. Par imagerie, nous sommes capables de visualiser la progression tumorale et les métastases au cours du temps et ce de manière non invasive en ré-utilisant les mêmes animaux. Par ailleurs, dans ce projet, nous injecterons simultanément des cellules immunitaires (Lymphocytes T) compétentes et déficientes pour une protéine d’intérêt dans une seule et même souris dont le système immunitaire est non fonctionnel, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisé.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale que nous prenons en considération grâce au suivi quotidien des animaux dès l’initiation des modèles de cancers. Ainsi, l’expérimentateur impliqué dans le projet observera le comportement et mesurera le poids des animaux tous les deux jours à compter de l'initiation des modèles de cancers jusqu'à la fin de l'expérimentation. Toutes modifications de la prise de nourriture/boisson, de la posture, des déplacements, de la sociabilité et de la nidification seront observées. En cas de déshydratation et de perte de poids inférieur au seuil défini dans les points limites, de la nourriture et de l’eau sous forme de gel seront ajoutés. Les comportements d’agressivité seront également surveillés et du coton sera ajouté. Suite à l’induction des modèles tumoraux, des nécroses inflammatoires avec apparition d'une invagination au centre de la tumeur, de petits saignements et de rougeurs sur le pourtour de la tumeur peuvent se développer et seront nettoyées avec de la Vétédine. Pour diminuer la souffrance et la douleur liée aux procédures expérimentales et au développement de cancers, un traitement analgésique en locale (lidocaïne) sera administré aux souris au niveau de ces nécroses inflammatoires. Par ailleurs, des grilles d’expressions faciales des souris mises à disposition dans l’animalerie sont consultées pour détecter la douleur, la détresse ou la souffrance des animaux. De manière concomitante, des points limites ont été définis en concertation avec les zootechniciens pour détecter une dégradation trop importante de la santé et du bien-être des animaux et arrêter l’expérimentation. Pour éviter la mort à cause d’une éventuelle infection des souris dont le système immunitaire est non fonctionnel, ces souris seront hébergées en portoir ventilé, manipulées sous hotte avec port de gants, masque, combinaison, surchaussures et charlotte. Certains actes seront réalisés sous anesthésie générale et/ou sous anesthésie locale suivies d’un réveil des animaux sur tapis chauffant. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en groupes sociaux harmonieux dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux.

Choix des espèces

Les modèles de l’espèce animale Mus musculus sont à la base de la compréhension des mécanismes de reconnaissance par le système immunitaire et ont permis ces dernières années d’importantes avancées thérapeutiques dans ce domaine. En effet, ces modèles sont très utilisés dans le criblage de nouvelles molécules, car, du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et chez la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules tumorales aux traitements. Par exemple, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour les molécules d’intérêt Eomes (délétion dans les lymphocytes T). Aucune autre espèce animale avec ces caractéristiques génotypiques pour ces protéines n’est disponible. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc...) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. L’ensemble des expériences du projet sera réalisé sur des jeunes adultes soit des animaux âgés d’environ 6 à 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise tumorale.