Souris

3 880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon leur groupe, elles reçoivent une injection de cellules tumorales dans une veine ou entre les côtes, avec dans ce dernier cas une plaie cutanée qui se forme nécessairement, ou onze injections hebdomadaires d'un agent cancérigène, puis jusqu'à quatorze injections de traitement sur quarante jours et deux séances d'imagerie par semaine sous anesthésie. Le porteur indique que les tumeurs en développement peuvent comprimer les tissus voisins et provoquer des douleurs et un inconfort important. Il affirme que les réponses immunitaires ne peuvent être comprises que dans un organisme vivant, et rappelle que 50 à 80 % des patients ne répondent pas de façon satisfaisante à l'immunothérapie actuelle.

Objectifs

Les cancers du poumon représentent la principale cause de décès par cancer chez les hommes en France, et leur origine complexe est influencée par une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux. Cette interaction crée des variations dans la susceptibilité au cancer du poumon parmi les individus. Les traitements de première ligne contre ce type de cancer incluent la chirurgie, la radiothérapie et divers traitements médicamenteux tels que la chimiothérapie, les thérapies ciblées et l'immunothérapie, qui peuvent être utilisés seuls ou en combinaison. L'autophagie, un processus cellulaire essentiel pour l'élimination des composants endommagés et le recyclage des nutriments, joue un rôle clé dans la réponse au stress cellulaire. Des recherches récentes ont mis en évidence son influence sur l'immunité antitumorale, notamment dans le cadre de l'immunothérapie. Bien que le lien entre autophagie et immunothérapie ne soit pas encore totalement élucidé, des données croissantes suggèrent que l'autophagie pourrait moduler la réponse tumorale à ces traitements. Par conséquent, cibler l'autophagie et ses modulateurs au sein du microenvironnement tumoral est considéré comme une stratégie prometteuse pour améliorer les résultats de l'immunothérapie contre le cancer. Dans ce projet, nous visons à évaluer l'impact de la modulation de l'autophagie sur l'efficacité des traitements anticancéreux dans des modèles de cancer du poumon, en neutralisant une protéine clé impliquée dans ce processus. Nous cherchons également à comprendre comment cette neutralisation influence les réponses immunitaires et la formation de la mémoire immunitaire dans le contexte du cancer.

Bénéfices attendus

La recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer du poumon est d'une importance cruciale, tant en France qu'à l'échelle mondiale. Ce cancer, qui est l'un des plus courants en France, affecte un nombre croissant de personnes, incluant désormais de plus en plus de femmes. L'immunothérapie, explorée intensivement au cours des quinze dernières années, a montré des résultats prometteurs chez certains patients. Cependant, une grande proportion de patients, entre 50 et 80 pourcents ne répondent pas de manière satisfaisante à ces traitements. Il est donc essentiel de développer des options thérapeutiques supplémentaires, notamment des traitements administrés avant (néoadjuvants) ou après (adjuvants) la chirurgie, pour améliorer la prise en charge à long terme des patients. En résumé, l'élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques est impérative pour relever ce défi de santé publique et offrir un espoir tangible aux personnes touchées par cette maladie. Cette étude a pour objectif d'évaluer si la neutralisation d'une protéine impliquée dans le métabolisme cellulaire pourrait constituer une nouvelle approche thérapeutique contre le cancer du poumon. Il est également pertinent de noter que ce cancer touche environ 400 000 nouvelles personnes chaque année en Europe.

Procédures

Dans ce projet, les souris subiront diverses interventions en fonction de leur groupe expérimental : Pour les souris avec un fond génétique particulier, en plus des différentes interventions, elles recevront 5 injections consécutives d’un agent chimique pour induire la déplétion de la protéine. Chaque injection dure quelques secondes et sera administrée une fois par jour pendant 5 jours, 21 jours avant l’induction tumorale. Pour un groupe expérimental, les souris recevront d'abord une injection intraveineuse de cellules tumorales. Cette procédure prend quelques secondes à quelques minutes par souris, effectuée sous contention. Ensuite, elles recevront des injections intrapéritonéales pour les traitements, qui dureront quelques secondes chacune. Jusqu’à 14 injections seront administrées, à raison de 2 injections par semaine sur une période maximale de 40 jours. Certaines souris seront anesthésiées pour le suivi de la croissance tumorale par imagerie bioluminescente, chaque session durant environ 10 minutes et réalisée 2 fois par semaine pour suivre l’évolution des tumeurs. Pour un autre groupe, les souris recevront une injection intercostale de cellules tumorales, une procédure d'environ 15 minutes incluant l’analgésie, l'anesthésie, et le réveil. Ensuite, elles recevront des injections intrapéritonéales pour les traitements, qui dureront quelques secondes chacune, jusqu’à 14 injections réparties sur 40 jours. Un suivi par imagerie bioluminescente sera effectué, chaque session durant environ 10 minutes, 2 fois par semaine pour surveiller la progression tumorale. Pour un troisième groupe, les souris recevront des injections intrapéritonéales d’un un agent cancérigène, qui dureront quelques secondes chacune. Ces injections seront administrées une fois par semaine pendant 11 semaines pour induire des tumeurs. Par la suite, elles recevront des injections intrapéritonéales pour les traitements, jusqu’à 14 injections au total, réparties sur une période de 40 jours.

Impact sur les animaux

Certains animaux de ce projet recevront des injections de cellules tumorales par voie intraveineuse ou intercostale. Ces injections, qu'elles soient intraveineuses, intercostales ou sous-cutanées, peuvent provoquer une légère douleur temporaire au site d'injection. Dans le cas des injections intercostales, une plaie cutanée se forme nécessairement, ce qui peut entraîner une douleur et un risque accru d'infection. Les injections intraveineuses, quant à elles, peuvent également causer une irritation locale et un stress pour l'animal. L'administration d'un agent chimique pour induire un cancer peut provoquer des effets secondaires tels que perte de poids, diminution de l'appétit, et léthargie. Ces symptômes peuvent être plus prononcés juste après l'injection, bien qu'ils tendent à se dissiper en quelques minutes. Les tumeurs en développement peuvent exercer une pression sur les tissus environnants, provoquant des douleurs et un inconfort important. De plus, les tumeurs peuvent induire des perturbations physiologiques et métaboliques, telles que des inflammations, des désordres de la fonction organique, et une altération générale de l'état de santé des animaux. Les injections intrapéritonéales (au niveau de l'abdomen) peuvent induire un stress lié à la contention ainsi qu’une douleur immédiate et transitoire au point d'injection. L'anesthésie utilisée pour certaines procédures peut réduire la capacité de l'animal à réguler sa température corporelle et peut entraîner un risque cardio-respiratoire.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques afin de répondre à la question scientifique.

Remplacement

L'impératif d'utiliser des animaux vivants découle de l'incapacité actuelle à reproduire in vitro ou ex vivo la complexité des effets des traitements anti-cancéreux sur la tumeur, les tissus environnants, les facteurs solubles et le système immunitaire. Les réponses immunitaires ne peuvent être pleinement comprises que dans le contexte d'un organisme vivant. Les modèles animaux reproduisent mieux la complexité du microenvironnement tumoral, y compris les interactions entre les cellules cancéreuses, les cellules immunitaires et les vaisseaux sanguins.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 3880 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu sera enrichi à l’aide de coton de nidification). Une surveillance régulière permettra de détecter rapidement tout signe de mal-être, tels que les yeux mi-clos, ou des comportements anormaux, afin de permettre une intervention rapide pour traiter tout problème de bien-être. Des points limites précoces et adaptés à chaque type d'expérience seront établis pour garantir que la douleur et la souffrance des animaux soient minimisées autant que possible. Par exemple, la perte de poids, l'apparition de signes cliniques sévères (comme une altération de l'état général ou des difficultés respiratoires), ou une augmentation rapide de la taille des tumeurs au-delà d'un seuil défini entraîneront une intervention immédiate. La réaction au site d'injection sera régulièrement évaluée pour détecter tout signe d'inflammation ou d'infection, avec des interventions vétérinaires prêtes en cas de complication comme l’utilisation d’antiseptique. Les animaux présentant des signes de douleur recevront des analgésiques adaptés à leur état spécifique. En cas de problèmes empêchant les souris de se nourrir normalement, un gel alimentaire sera ajouté directement dans la cage. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de lampes chauffantes...). Les mâles qui montreront des signes d'agressivité seront placés en hébergement individuel pour prévenir les blessures et le stress causés par les combats. Des ajustements seront faits en temps réel pour améliorer les conditions de vie des animaux ou modifier les protocoles de traitement si nécessaire.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par des raisons d’ordres scientifiques : - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé, ce qui permet de bénéficier d'une vaste expertise en termes d’élevage, de techniques d’expérimentation animale, ainsi que du suivi microbiologique et vétérinaire. - Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Les différentes lignées utilisées dans cette procédure ne présenteront pas de phénotypes dommageables et seront immunocompétentes.

900 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, chacune passant trois heures immobilisée dans un tube de contention pour un test de tolérance au glucose et 72 heures isolée en cage de calorimétrie, série de tests répétée jusqu'à trois fois sur les 20 à 30 semaines du protocole. Elles reçoivent un gavage de sucrose, des injections d'insuline, cinq gouttes de sang prélevées à la queue par test, et un régime enrichi en graisses et en sucre qui les fait grossir et provoque des lésions cutanées d'hypertoilettage. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour analyser leurs organes. Le porteur renvoie à "plus long terme" le développement de médicaments contre le diabète et l'obésité, pour un projet qui compare des groupes de neuf animaux par gène étudié, à raison de cinq gènes par an pendant cinq ans.

Objectifs

Le but de ce projet est d'étudier le rôle de gènes potentiellement impliqués dans la régulation du métabolisme chez les mammifères. Chaque projet se focalisera sur un gène d'interêt disposant d'éléments de la littérature justifiant son analyse dans un modèle physiologique complet. Afin de déterminer ce rôle, nous disposons du modèle Souris qui permet des modifications génétiques capables d'annuler la présence de ce gène chez l'animal. En retirant le gène de l'organisme, nous pouvons ainsi étudier comment les réponses à différentes variables métaboliques sont impactées. Ainsi, nous souhaitons comparer des souris contrôles à des souris génétiquement modifiées pour un gène, en présence ou non d'un régime enrichi en graisses et/ou en sucre, selon les mécanismes d'actions supposés du gène ciblé. Le facteur sexe pourra aussi être étudié, selon le gène cible. La mise en place d'une obésité ou d'une affection du foie liée à ce régime enrichi sera suivie par différentes analyses au cours du temps, et les données générées permettront de déterminer l'impact de la modification génétique dans ce cadre. Pour chaque gène analysé, nous prévoyons de comparer des groupes de 9 animaux pour chaque condition, soit 36 animaux par gène étudié. Durant la durée de ce projet, nous anticipons 5 études par année, soit un total de 36 animaux * 5 projets * 5 ans, soit 900 souris au maximum. Chaque projet contiendra 4 groupes expérimentaux de 9 animaux : Deux schémas expérimentaux sont ainsi possibles : 1) étude de l'effet de la diète, en se focalisant sur un seul genre male ou femelle controle avec une diète classique / controle avec une diète enrichie / animal mutant avec diète classique / animal mutant avec une diète enrichie 2) étude de l'effet du genre : controle male avec une diète enrichie / controle femelle avec une diète enrichie / animal mutant male avec une diète enrichie / animal mutant femelle avec une diète enrichie. Dans certaines études, une analyse de la fonction cardiaque sera associée à l'analyse du métabolisme, pour comprendre les interactions entre ces deux aires qui sont souvent impliquées au niveau des comorbidités.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de progresser dans la connaissance que nous avons sur les gènes étudiés, en recherche préclinique. Les données générées nous permettront de mettre en évidence des pistes thérapeutiques potentielles qui seront utilisées pour le développement de nouveaux candidats médicaments dans le cadre des pathologies liées à la régulation de la glycémie (diabete) et de l'obésité ainsi qu'aux comorbidités cardiaques. A plus long terme, ces données pourront permettre le développement de médicament chez l'Homme.

Procédures

Durant ce protocole, des cohortes de 36 animaux suivront une série de protocoles qui viseront à déterminer l'effet d'un régime enrichi sur les fonctions métaboliques. Pour cela, nous effectuerons un test de tolérance au glucose, dans lequel l'animal reçoit un gavage de sucrose suivi de 5 prélevement d'une goutte de sang à la queue afin de suivre sa glycémie (chaque acte durant environ 30 secondes) ; tout comme peut le faire l'homme en cas de diabète. Un test de sensibilité à l'insuline sera aussi effectué, assez similaire au précédent mais avec une injection intrapéritonéale d'insuline entrainant une réduction de la glycémie (chaque acte durant environ 30 secondes). Ce test permet de vérifier si un diabète de type I ou type II est installé chez l'animal. Ces deux tests durent environ 3 heures durant lesquelles l'animal est placé dans un tube de contension afin de prélever des gouttes de sang à plusieurs temps (5 gouttes sur la durée du test). Un test de calorimétrie permet de vérifier la consommation en oxygène des animaux et nécessite d'isoler les souris durant 72h, ce qui peut être un stress d'isolement. Néanmoins, elles retrouvent ensuite leurs groupes sociaux. Enfin, des prélevements sanguins seront effectués pour suivre l'évolution des paramètres biochimiques. Ces prélevements se font en quelques minutes. Là encore, nous définissons des volumes réduits pour éviter un impact sur le bien-être des animaux. Et une durée de récupération d'au moins deux semaines est appliquée après un prélevement sanguin. L'ensemble des ces procédures expérimentales pourront être répétées au maximum trois fois durant la durée du protocole durant les 20 à 30 semaines de durée du protocole, en espacant chaque geste pour éviter un stress cumulatif et donc un effet négatif sur l'animal. Dans certaines études, une analyse de la fonction cardiaque sera associée à l'analyse du métabolisme, pour comprendre les interactions entre ces deux aires qui sont souvent impliquées au niveau des comorbidités. Cette évaluation cardiaque pourra être effectuée deux fois au maximum et implique une anesthésie gazeuse de 30 minutes environ. L'ensemble du protocole sera réalisé environ 5 fois par an sur des lignées différentes durant une période de 5 ans (soit un total maximal théorique de 900 animaux) Amendement: Pour tester la fuite vasculaire une l'injection en intra-veineuse d'un colorant, sous anestésie gazeuse terminale, sera réalisée. Amendement 2: 2 injections intrapéritonéales.

Impact sur les animaux

Durant ce projet, les animaux subiront des prélevements sanguins, des mesures de la glycémie et de la sensibilité à l'insuline. Dans ce cadre, ils seront immobilisés durant quelques heures et prelevés de gouttes de sang. Durant la mesure de calorimétrie, les animaux seront isolés durant 72h ce qui peut créer un stress temporaire d'isolement. Les animaux prendront du poids du fait du régime enrichi, ce régime peut apporter aussi des lésions cutanées qui sont liées à un hypertoilettage des animaux. Ces lésions sont traitées localement et se résolvent rapidement. Si la fonction cardiaque est évaluée, les animaux seront anesthésiés durant environ 30 minutes et de fines électrodes seront piquées en surface de la peau des pattes pour obtenir le signal électrique. Amendement 2: une anesthésie peut induire un inconfort lors du reveil des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole pour collecter des tissus qui seront analysés histologiquement afin de déterminer l'impact de ce régime et de la mutation sur les organes.

Remplacement

Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de la modification génétique d'un gène sur des fonctions métaboliques complexes. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologies de régulations (homéostasie glucidique et lipidique et fonction cardiaque). Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour modéliser les analyses effectuées dans ce projet. Le modèle Souris nous permet d'accéder à une première approche de ces phénomènes physiologiques complexes afin de comprendre comment ceux-ci se transposent chez l'Homme. Par ailleurs, il permet des modifications génétiques ce qui facilite la compréhension du rôle des différents gènes que nous prévoyons d'étudier.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été determiné au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 9 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données paramétriques (poids, glycémie, paramètres sanguins, consommation d'oxygène, paramètres cardiaques) qui seront analysées à l'aide d'analyses de variances à deux facteurs, répétées pour les mesures ayant lieu dans le temps (suivi du poids ou de la glycémie). Nous avons aussi conçu notre protocole afin d'utiliser une seul cohorte d'animaux qui suivra un ensemble de tests, afin de réduire autant que possible les animaux employés pour répondre à notre problématique scientifique.

Raffinement

Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Durant les prélevements sanguins, nous réaliserons des injections de sérum physiologique tiède afin de compenser la perte hydrique. Une surveillance quotidienne de l'état des animaux, une pesée hebdomadaire ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux seront mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. Par ailleurs, nous nous efforcerons de fournir les meilleurs conditions d'hébergement possible avec la présence d'un enrichissement. En cas de rixe entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et procéderons à des soins locaux le cas échéant. Durant l'ensemble des procédures, des points limites spécifiques ont été mis en place afin de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions éthiquement acceptables et d'une réponse appropriée à tout signe de souffrance ou de diminution du bien-être. Le cas échéant, une couverture pharmacologique pourra être employée, et adpatée en accord avec notre vétérinaire (analgésie, antiseptiques..)

Choix des espèces

La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement de modèles d'intérêt porteurs de modifications génétiques sur les gènes d'intérêt. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les animaux démarreront leur protocole en tant que jeune adulte, à partir de 6 semaines. A ce stade, ils ont déjà une régulation métabolique qui est mise en place.

Rasées sous anesthésie puis greffées sous la peau avec des cellules de cancer du pancréas, 180 souris subissent, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, treize à dix-sept injections de médicaments anticancéreux et d'anticorps, plus quatorze mesures de leur tumeur au pied à coulisse. Toutes sont tuées pour prélever tumeurs, rates et ganglions lymphatiques. L'objectif déclaré est de trouver la meilleure dose et la meilleure voie d'administration d'un composé, en vue d'un essai clinique chez des patients atteints d'un cancer du pancréas. Le RNT ne nomme ni ce composé, ni la protéine tumorale qu'il cible, ni l'immunothérapie à laquelle il est associé.

Objectifs

Le cancer du pancréas touche près de 500.000 personnes chaque année, et est la 4e cause de décès par cancer dans le monde. Récemment, une nouvelle catégorie de médicaments ciblant une protéine tumorale, a été mise au point. Nous souhaitons évaluer dans ce projet, les meilleures modalités d’administration (voie d’injection, dose et durée) d’un de ces composés, et son effet synergique avec une immunothérapie, dans un modèle de cancer du pancréas chez la souris.

Bénéfices attendus

Ces travaux pourraient permettre d’identifier la meilleure modalité d’administration d’un nouveau médicament anti-cancéreux et ainsi fournir un rationnel pour la mise en place d’un essai clinique chez les patients atteints de cancer du pancréas.

Procédures

- Rasage du flanc des souris sous anesthésie gazeuse (1x 2 minutes/souris) - Injection sous-cutanée dans le flanc, sous anesthésie gazeuse, de cellules tumorales (1x 2 minute/souris) – injections intrapéritonéales et sous-cutanées de médicaments anti-cancéreux et d’anticorps (13 à 17 x 5 secondes/souris) ; mesure des tumeurs au pied à coulisse (20 secondes souris x 14 mesures au maximum).

Impact sur les animaux

Les volumes tumoraux sont mesurés 2 fois par semaine, et le poids est évalué 3 fois pas semaine. Ceci nécessite une contention de quelques secondes, pouvant engendrer un stress léger. Les injections peuvent entraîner des douleurs courtes au site d'injection au niveau de l'abdomen pour l'administration des traitements, et sur le flanc pour l'injection des cellules tumorales. Possible douleur légère ou gène autour de la tumeur et autour des sites d’injection des médicaments.

Devenir

Afin d’effectuer des analyses sur les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques, les souris seront mises à mort et ces tissus seront prélevés pour analyse. Ceci permettra de documenter l’effet des médicaments non seulement dans la croissance tumorale mais aussi dans la composition et distribution du microenvironnement immunitaire.

Remplacement

Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro confirmant l’effet anti-tumoral du médicament d’intérêt. Néanmoins, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal pour évaluer l’effet des divers protocoles d’injection sur la pousse tumorale, ainsi que la synergie entre ces traitements et l’immunothérapie. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature.

Raffinement

Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. En cas d’altération du bien être ou de perte de poids limitée, de la nourriture liquide et de l’eau gélifiée pourront être utilisés. En cas de douleur détectable, un analgésique sera administré.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation chez la souris est justifié par l’utilisation d’un modèle de cancer du pancréas, le plus utilisé dans la littérature car reflétant la pathologie humaine de façon fidèle, notamment concernant le rôle des cellules immunitaires. Les méthodes de scoring et les points limites sont également très bien établis. Les souris seront âgées de 7 à 12 semaines, ce qui correspond à un état de maturité du système immunitaire. L’âge sera homogène dans chaque procédure.

370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules de glioblastome sous la peau, puis jusqu'à six injections de virus tueurs de tumeurs, certaines subissant avant chaque injection une irradiation par faisceau de protons, soit jusqu'à 82 minutes d'anesthésie cumulées sur quatre à quatorze semaines. Les tumeurs et les rates sont prélevées après la mise à mort pour analyser l'activation des cellules immunitaires. Le porteur indique que la greffe, le développement de la tumeur et l'imagerie n'induisent pas de douleur et conclut qu'une analgésie n'est donc pas "nécessaire", tout en prévoyant de mettre à mort les souris dont les tumeurs se nécrosent ou qui perdent plus de 20 % de leur poids.

Objectifs

L'objectif majeur de ce projet est d'étudier in vivo l'effet immunostimulant et anticancéreux contre le glioblastome, un cancer du cerveau actuellement incurable, de traitements associant dans une première phase, une radiothérapie (faisceau de protons) suivie d'une infection par un virus tueur de tumeurs (MVMp), puis par une deuxième phase, 2 jours plus tard, associant à nouveau une radiothérapie (faisceau de protons) suivie elle aussi d'une infection, mais cette fois, par un autre virus tueur de tumeurs à savoir une souche vaccinale du virus de la rougeole. Dans notre projet, l'irradiation ionisante est appliquée juste avant que les tumeurs soient infectées par un virus oncolytique (MVMp ou souche vaccinale du virus de la rougeole). Cette procédure est utilisée parce que nos résultats montrent que l'irradiation ionisante de cellules murines de glioblastome (GL261) avant leur infection par MVMp, permet d'augmenter la réplication lytique de de ce virus et qu'elle permet également, in vivo, d'augmenter l'action anticancéreuse de la souche vaccinale (Schwarz/Moraten) du virus de la rougeole, sans que l'on sache actuellement quels sont exactement les mécanismes impliqués dans ces phénomènes.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de découvrir et valider une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement du glioblastome. La souche vaccinale du virus de la rougeole et le parvovirus de rat H-1PV (un cousin très proche en séquence et en comportement antitumoral, de MVMp) ont déjà fait l'objet de plusieurs études cliniques qui ont démontré le potentiel prometteur de ces deux agents contre certains cancers tel que le glioblastome. Elles ont toutefois également révélé que l'action immunostimulante et anticancéreuse de ces agents infectieux n'était pas encore assez puissante pour qu'ils puissent représenter une alternative crédible et efficace pour lutter contre des cancers tels que le glioblastome ou l'adénocarcinome pancréatique, dont le pronostic reste actuellement, malgré de nombreux progrès réalisés ces dernières années dans différents types de traitements, très sombre.

Procédures

Tous les les animaux seront soumis à 1 injection sous-cutanée de cellules tumorales (100 µl) ce qui correspond à une anesthésie de 5 min sous isoflurane 2%. Certains subiront en plus 6 injections de 2 min chacune d'une solution de 10 à 100 µl de PBS ou de virus oncolityque (MVMp ou Souche Schwarz/Moraten du virus de la rougeole). Ceci correspond à une anesthésie de 5 min/injection donc à 6 x 5 = 30 min d'anesthésie. Ainsi, chaque animal subira entre 5 et 35 min d'anesthésies sur une période allant de 4 à 14 semaines, en fonction de la procédure et des groupes considérés. Certains animaux subiront préalablement à chacune de leurs 6 injections, une irradiation par faisceau de protons d'une durée maximale de 3 min (6 Gy). Etant donné que l'irradiation de leur tumeur sera immédiatement suivie par une injection, nous proposons d'attribuer 12 min d'anesthésie à ce type de protocole. Ceci correspond donc pour ces animaux a un total de 6 x 12 min d'anesthésie= 72 min. Etant donné qu'une anesthésie sera également nécessaire pour les mettre tous à mort (5 min) et que certains subiront une deuxième greffe (injection) de cellules tumorales, nous pouvons affirmer que les animaux de notre étude subiront entre 10 et 82 min d'anesthésie sur une période allant de 4 à 14 semaines d'étude.

Impact sur les animaux

Nous suivrons par des mesures et observations réalisées 2 fois/semaine, le poids des animaux et analyserons leur comportement (toilette, mobilité, etc...) et l'évolution de la taille des tumeurs. Une baisse au-delà de 20% du poids de l'animal après soustraction du poids des tumeurs (1g/cm3) ou l'apparition de signes d'affaiblissement, de perte de mobilité avant atteinte du point limite, de nécrose des tumeurs, nous conduirons à chaque fois à mettre à mort, sous anesthésie à l'isoflurane 2 %, ces animaux. Il est à noter que les doses de radiation appliquées sur les tumeurs ne devraient pas induire d'effets indésirables sur la durée de l'étude.

Devenir

mise à mort car prélèvement post-mortem des tumeurs et des rates pour des études in vitro sur l'activation de cellules immunitaires.

Remplacement

Notre approche scientifique et les objectifs que nous nous sommes fixés ne nous permettent pas hélas de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, le recrutement sur une periode de plusieurs semaines de cellules immunitaires au sein d'un glioblastome par des traitements d'immunothérapie, basés sur l'utilisation d'une radiothérapie et/ou d'infections par des virus oncolytiques (MVMp et/ou souche vaccinale du virus de la rougeole), n'est envisageable que chez un animal vivant. Notre étude cherchant à caractériser au niveau immunitaire, l'impact de ces traitement sur une tumeur sous-cutanée, il nous est impossible de travailler dans un autre modèle que celui de l'animal vivant.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux à étudier, le projet sera réalisé étape par étape et les données obtenues à l'étape précédente conditionneront toujours la mise en oeuvre de l'étape suivante sur les animaux. Une approche statistique a permis de déterminer le nombre d'animaux necessaire pour réaliser l'étude.

Raffinement

En dehors des périodes d’examen les animaux sont manipulés régulièrement afin de minimiser le stress induit par la manipulation et la présence du personnel du laboratoire. Les animaux sont placés à plusieurs par cage et leur environnement est enrichi (tunnel en PVC, frisure, ouate de cellulose, bâtons de bois) afin de respecter les interactions sociales et une activité motrice. La frisure de papier kraft est un enrichissement qui diminue le stress de l’animal et facilite la thermorégulation de l’animal ; elle permet également de créer des nids simulant ainsi l’activité naturelle. Le protocole expérimental prend en compte un éventuel impact sur la souffrance animale. Les animaux sont observés quotidiennement, pesés 2 fois par semaine. Les injections de cellules et les séances d'imagerie sont réalisées sous anesthésie. L'injection de cellules en sous cutané, le développement de la tumeur et l'imagerie TEP n'induisent pas de douleur. De ce fait, une analgésie n'est donc pas nécessaire.Les données issues de ces observations ( perte de poids, apparence générale, comportement alimentaire, apparition de zones nécrotiques sur les tumeurs) sont reportées dans une grille de score afin de déceler tout signe précoce de mal être et de mettre en place une surveillance. Si l'état général atteint un point limite dont les critères ont été établis préalablement, celui-ci sera immédiatement mis à mort. En fin de protocole, tous les animaux sontmis à mort pour permettre un prélèvement des tumeurs et des anlyses ex vivo. Les doses d'irradiation ionisante délivrées lors des séances d'irradiation n'induisent normalement pas de douleur ni de rougeur cutanées. Toutefois, en raison des anesthésies répétées, les animaux seront observés quotidiennement notamment pour controler le poids et l'apparition de rougeur au niveau du site d'irradiation. En cas d'apparition de rougeur, de la biafine sera appliquée sur la zone.

Choix des espèces

Le modèle souris est utilisé depuis de nombreuses années dans le domaine de la recherche préclinique en cancérologie. Il est à noter également que les cellules GL261, un modèle de glioblastome, sont syngéniques des souris C57BL/6 et sont souvent employées in vivo comme modèle de glioblastome. Pour toutes ces raisons il nous parait impossible de réaliser de telles expériences sur des modèles in vitro ou ex-vivo. La souris C57BL/6 est de ce fait le modèle le plus adapté à notre projet. Les animaux seront greffés à un âge de 10 semaines, âge optimal pour la prise tumorale d'après notre expérience. C'est aussi un stade auquel le système immunitaire et les mécanismes physiologiques sont potentiellement matures.

208 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un premier groupe subit une obstruction chirurgicale de l'uretère, un deuxième la même obstruction puis une reconnexion à la vessie deux jours plus tard, un troisième un pinçage de quinze minutes des vaisseaux qui alimentent le rein, avec douleur postopératoire et risque d'infection de la cicatrice. Les deux reins sont prélevés après la mise à mort pour suivre des fibroblastes rendus fluorescents, dans l'espoir de repérer les cellules qui déclenchent la maladie rénale chronique, les outils de diagnostic n'étant évoqués que pour le long terme. Le porteur conclut qu'il est "impossible" de reproduire cette pathologie sur des modèles qui ne soient pas des animaux, les modèles cellulaires ne rendant pas selon lui la complexité de la maladie.

Objectifs

La maladie rénale chronique est une maladie fréquente (10% de la population mondiale) et grave (elle est estimée devenir la 4ème cause de mortalité d’ici 2040). Les événements précoces dans le développement de la maladie rénale ne sont pas bien connus. Identifier des types de cellules qui participent à l’initiation des phénomènes de dégradation du rein est l’objectif de ce projet. En particulier, nous analyserons des animaux qui présentent des cellules fluorescentes, c'est à dire qui émettront une lumière vive lorsqu'observées avec un microscope particulier, permettant ainsi de les suivre durant le développement de la maladie rénale. Ces cellules sont appelées fibroblastes, et sont impliquées dans la maladie rénale chronique. Ce projet cherchera à évaluer leur rôle de manière très précoce

Bénéfices attendus

La meilleure compréhension de ces phénomènes précoces, et plus particulièrement l’identification d’un type de cellule impliquée dans le développement des lésions permettra, à terme, de développer des outils diagnostics et thérapeutiques de la maladie rénale chronique. En effet, à ce jour, les tests diagnostics identifient la maladie à un stade souvent avancé, et les thérapeutiques permettent d’éviter l’aggravation de la maladie mais ne permettent pas sa régression. Identifier puis traiter à un stade précoce permettrait de lutter contre le développement de cette pathologie

Procédures

Trois types de chirurgie sous anesthésie générale auront lieu. Un premier lot d’animaux subira une obstruction de l’uretère (conduit reliant le rein à la vessie), durée de l’acte 5 minutes. Un 2e lot subira aussi une chirurgie d’obstruction de l’uretère puis 2 jours plus tard, nous le reconnecterons à la vessie afin d’étudier les capacités de réparation du rein – durée de l’acte : 30min. Et enfin sur un 3e lot, on pincera pendant 15 mn les vaisseaux sanguins qui alimentent le rein pour ensuite observer les dommages causés après quelques jours ou semaines

Impact sur les animaux

Les chirurgies risquent d’induire des nuisances, en particulier une douleur post opératoire, une irritation ou une inflammation au niveau de la cicatrice, voire une infection du site opératoire (exceptionnel). Uniquement dans ces cas, une perte de poids et/ou une modification du comportement pourrait survenir.

Devenir

Tous les animaux du projets seront euthanasiés afin de prélever en post-mortem les 2 reins et ainsi étudier les tissus.

Remplacement

Les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité de la maladie rénale chronique. D’autre part, il est probable que le développement des lésions rénales soit la conséquence de multiples types de cellules présent dans le rein. Il est donc impossible de reproduire cette pathologie sur des modèles qui ne soient pas des animaux.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés est appliquée pour répondre aux différentes questions du projet scientifique. Une analyse statistique estime qu’un nombre total de 208 animaux est nécessaire. Ce nombre a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement qui respectent leur bien-être (contrôle de la température et du taux d'humidité de l’environnement, densité d’animaux, présence d’enrichissement (c'est à dire l'apport de structures permettant d'améliorer le bien-être animal, comme des petites maisons en plastique, du coton...) , change régulier des litières, eau et nourriture à volonté, surveillance quotidienne des animaux). Toutes les procédures sont réalisées de façon à limiter le stress et la souffrance des animaux. Les souris seront surveillées quotidiennement par nos soins et ceux du personnel qualifié pour détecter le moindre signe de souffrance de l’animal. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (grilles d’évaluation et points limites) sera strictement respecté, et effectué quotidiennement en concertation avec l'équipe de zootechnie. En cas d‘atteinte d’un point limite et selon le signe clinique observé, un antidouleur pourra être administré durant deux jours. Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera euthanasié

Choix des espèces

La souris est la seule espèce permettant à ce jour de suivre l’évolution des fibroblastes grâce à la présence de cellules fluorescentes, en particulier suite à une intervention permettant de reproduire la maladie observée chez l’homme. Les interventions seront réalisées chez des souris adultes, la maladie rénale chronique chez l'homme concernant principalement des adultes.

Dépourvues de système immunitaire pour ne pas rejeter des greffons faits de cellules humaines, 540 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit sous anesthésie l'ablation d'un disque de peau de 12 millimètres sur toute son épaisseur, au milieu du dos, puis la suture d'un substitut cutané dans la plaie. Les pansements sont changés deux fois par semaine sous anesthésie, et les souris greffées vivent seules en cage quatre à cinq semaines pour qu'elles ne s'arrachent pas mutuellement les greffons. Elles sont tuées par groupes de six à 3, 7, 14, 30, 60 et 90 jours après la greffe, et celles qui perdent trop de poids ou dont la plaie s'infecte le sont avant ces termes.

Objectifs

L’objectif de notre projet est d’évaluer la fonctionnalité de différents substituts cutanés nouvellement développés afin de sélectionner celui ou ceux qui permettront de favoriser la régénération du tissu cutané et la revascularisation au cours du temps après réalisation d’une greffe cutanée. Ce projet est la suite d’un projet précédemment autorisé au cours duquel nous avons évalué 15 premiers substituts cutanés. Les substituts cutanés, préparés à partir de cellules humaines, seront greffés sur des souris dépourvues de système immunitaire afin d’éviter le rejet des greffes, après induction d’une plaie cutanée sur toute l’épaisseur de la peau. Les nouveaux substituts cutanés seront utilisés "jeunes" = dès la fin de leur préparation, "âgés" = 5 jours maximum après la fin de leur préparation, ou "cryoconservés" = après congélation et décongélation selon un mode opératoire défini en collaboration avec des chirurgiens plasticiens spécialisés en chirurgie reconstructrice de la peau. Le but est d’évaluer les différentes conditions opératoires qui seront suivies pour la réalisation des greffes cutanées chez l’Homme. Des prélèvements seront effectués à différents temps précoces et prolongés après réalisation des greffes de substituts cutanés afin d’étudier les interactions se mettant progressivement en place entre les substituts cutanés et l’environnement de l’hôte, le développement d’un réseau vasculaire et la régénération du tissu cutané à partir du greffon lors des phases précoces et tardives de la cicatrisation. Les substituts cutanés nouvellement développés vont en effet permettre d’accélérer le processus de cicatrisation grâce à l’ensemble de ces interactions complexes. Un ensemble d’analyses seront effectués sur les prélèvements cutanés collectés et permettront de caractériser in vivo au cours du temps la fonctionnalité des substituts cutanés nouvellement développés, d’appréhender les interactions se mettant progressivement en place au cours du temps entre les substituts cutanés et l’hôte, et de suivre l’évolution des substituts cutanés au cours du temps.

Bénéfices attendus

Les substituts cutanés sont des biomatériaux capables de remplacer une partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée. Aujourd'hui, si les auto-transplantations (donneur et receveur sont la même personne) sont les greffes de première intention pour la couverture des plaies, elles se heurtent à l’écueil d’une disponibilité limité de peau, en particulier dans la prise en charge des grandes brûlures et les procédures restent invasives et douloureuses. Des greffes de tissu "étranger" peuvent pourvoir au remplacement temporaire de la peau, avant de laisser la place à une auto-transplantation. Subsiste évidemment les risques de rejet, douleurs et infection, et la formation de cicatrices. De nombreux substituts cutanés produits par biosynthèse sont aujourd’hui disponibles. Ils sont constitués de cellules humaines vivantes ensemencées sur une matrice et nourries de protéines et des facteurs de croissance nécessaires pour mieux se développer et se multiplier dans le tissu souhaité. Ils sont utilisés pour traiter les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, pour les greffes de tissus mous chez les patients présentant des brûlures à épaisseur partielle ou des plaies chirurgicales, les ulcères du pied diabétique…, et également les maladies génétiques de la peau. Il est donc important de tester de nouveaux substituts cutanés sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation des plaies cutanées ou le remplacement de tissu cutané.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation d’une greffe de substitut cutané. Sous anesthésie générale, un prélèvement de peau circulaire de 12 mm de diamètre sur toute l’épaisseur de la peau sera effectué au milieu du dos et en arrière des omoplates sur l’ensemble des souris. Un substitut cutané sera placé dans le lit de la plaie cutanée et suturé en plusieurs points indépendants. Un traitement analgésique des souris sera administré avant la chirurgie puis après la fin de celle-ci. La chirurgie sera réalisée en 20 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes de substitut cutané seront protégées par des pansements et compresse changés 2 fois par semaine, sous anesthésie générale pendant 10 minutes environ, permettant d’effectuer des observations et de scorer différents paramètres au niveau des greffes cutanés. Un suivi quotidien de l’ensemble des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations, week-ends et jours fériés inclus. Un maintien des souris greffées en cage individuelle sera nécessaire pendant 4 à 5 semaines maximum après réalisation des greffes cutanées pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles les pansements et la compresse et surtout le greffon cutané. Après régénération tissulaire et cicatrisation complètes, 4 à 5 semaines maximum après réalisation des greffes cutanées, les souris seront replacées à 2 par cage jusqu’à la fin des expérimentations.

Impact sur les animaux

L’induction d’une plaie cutanée pour la réalisation de la greffe cutanée va engendrer une douleur modérée transitoire pendant quelques heures. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées, nécessaire tout au long du processus cicatriciel et de régénération tissulaire, soit pendant 4 à 5 semaines maximum, pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le greffon cutané, et l’ensemble pansements, compresse et bandes de sparadrap, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes.

Devenir

Les 540 souris seront euthanasiées à différents temps après réalisation de la greffe cutanée, 3, 7, 14, 30, 60 et 90 jours après, avec 6 souris, 3 souris mâles et 3 souris femelles, par temps de prélèvement. Un prélèvement cutané sera réalisé au large de la région greffée pour réaliser un ensemble d’analyses permettant de caractériser sur des temps précoces et prolongés la fonctionnalité et l’évolution de substituts cutanés greffés, processus dépendants de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, mise en place de la vascularisation…).

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité et l’évolution de substituts cutanés greffés, processus dépendants de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, mise en place de la vascularisation …). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ainsi, 6 souris par temps de prélèvements, 3 souris mâles et 3 souris femelles, seront suffisants. Ce nombre a été déterminé sur la base des résultats des études précédentes obtenus sur ce modèle de greffe cutanée, suivant les mêmes conditions expérimentales et selon les recommandations en vigueur (5 animaux minimum par condition). La réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permettra également de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation de la greffe cutanée (traitement pour supprimer la douleur avant la chirurgie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (traitement pour supprimer la douleur après la chirurgie et observations régulières). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine à chaque renouvellement de pansement, et si une perte de poids trop importante par rapport au poids maximal est observée ou si des signes d’infection de la plaie greffée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les animaux seront placés dans des conditions permettant d’observer leur comportement pendant leur phase d’activité et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie). Des bâtonnets de coton seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie représentative des plaies à traiter chez l’Homme, et la souche de souris utilisée est dépourvue de système immunitaire, permettant d’éviter les risques de rejet suite à une greffe de peau d’un organisme étranger. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des souris âgées de 6-7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7-8 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).

Des souris receveuses sont irradiées à une patte arrière, puis reçoivent la moelle osseuse de souris génétiquement modifiées pour le gène TET2, dont la mutation est activée deux mois plus tard par cinq jours de gavage d'un médicament. 1320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les receveuses subissent deux doses d'irradiation à 17 heures d'intervalle, une injection de cellules sous anesthésie et des prises de sang régulières pendant deux mois de suivi, le porteur signalant douleurs temporaires, perte de poids et baisse d'activité possibles. Aucune mise à mort n'est décrite dans ce projet. Toutes les souris doivent être exportées en Allemagne, où des collaborateurs provoqueront chez elles un accident vasculaire cérébral, dans le cadre d'un projet européen.

Objectifs

Ce projet vise à explorer le lien possible entre l'accident vasculaire cérébral (AVC) et l'hématopoïèse dite clonale, une condition liée à l'âge où les cellules souches hématopoïétiques (à l’origine de toutes les cellules du sang) subissent des mutations et prolifèrent de manière déséquilibrée. Les personnes atteintes d'hématopoïèse clonale présentent un risque accru de développer des tumeurs, des AVC ou des crises cardiaques. Il reste cependant incertain que ces cellules sanguines mutées pénètrent dans le cerveau et y causent des dégâts après un accident vasculaire cérébral. Chaque année, environ 12 millions de nouveaux cas d'AVC sont recensés dans le monde, avec, au total, environ 103 millions de survivants qui doivent vivre avec les séquelles de cette affection. Dans une étude récente, 41 % des patients ayant subi un premier AVC présentaient des mutations dans leurs cellules souches hématopoïétiques, augmentant leur risque de subir un deuxième AVC ou d'autres événements vasculaires dans les trois ans suivants. Pour examiner cette hypothèse, nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées pour le gène appelé TET2 codant pour une enzyme importante pour la stabilité de l’hématopoïèse. Nous transplanterons la moelle osseuse de ces souris dans des souris receveuses localement irradiées sur le membre postérieur au préalable afin d’étudier la progression de l’hématopoïèse clonale à partir du site d’implantation du greffon comme pour modéliser le départ d’une hématopoïèse clonale chez l’Homme. Ces souris seront ensuite envoyées à nos collaborateurs en Allemagne pour modéliser l'AVC dont les conséquences seront graduées par gravité en fonction de la proportion de cellules clonales TET2. Les études sur les souris nous permettront de mieux comprendre les mécanismes des lésions cérébrales post-AVC, notamment l'impact des traitements sur la motricité fine, la démarche, l'équilibre, et la restauration des fonctions motrices, ainsi que sur la possibilité de traiter l'inflammation cardiaque. L'objectif global de ce projet est donc de déterminer si l'hématopoïèse clonale contribue à la gravité des AVC et de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents, ce qui pourrait ouvrir la voie à de nouveaux traitements pour améliorer la qualité de vie des patients.

Bénéfices attendus

Ce projet présente plusieurs bénéfices potentiels significatifs pour la compréhension et le traitement des accidents vasculaires cérébraux (AVC) et des conditions liées à l'hématopoïèse clonale. 1. Amélioration de la compréhension des AVC: En explorant les liens entre l'hématopoïèse clonale et les AVC, nous pourrons mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans l’aggravation des conséquences post-AVC et comment ceci est influencé par la présence de mutations sur un gène connu comme responsable de dérégulations de l’hématopoïèse (TET2). 2. Développement de nouveaux traitements: La recherche sur les souris génétiquement modifiées pour ce gène TET2 permettra d'évaluer l'impact des mutations sur les lésions cérébrales après un AVC. Ces études peuvent révéler si la taille du clone muté aggrave les conséquences de l'AVC, ce qui ouvrirait la voie à de nouveaux traitements ciblés, notamment des thérapies anti-inflammatoires adaptées aux patients présentant une proportion importante de cellules mutées pour le gène TET2.. 3. Amélioration de la prise en charge des patients: Pour les patients atteints d'hématopoïèse clonale, comprendre le rôle des cellules mutées dans les tissus cérébraux après un AVC peut améliorer les stratégies de traitement. Par exemple, en mesurant la taille des clones mutés, les médecins pourraient mieux orienter les traitements pour réduire l'inflammation et améliorer la récupération des fonctions motrices et cognitives après un AVC. 4. Contributions à la recherche sur le cancer: Étant donné que la mutation de TET2 est également courante dans les cancers de la moelle osseuse, ce projet pourrait avoir des implications pour la recherche oncologique. Les découvertes faites ici pourraient aider à développer des traitements qui ciblent non seulement les AVC mais aussi les cancers liés à ces mutations génétiques.

Procédures

Dans ce projet, nous réaliserons plusieurs interventions sur des souris pour comprendre les effets de certaines cellules sur les accidents vasculaires cérébraux (AVC). Les souris seront d'abord endormies (15min) avec une injection pour les préparer à une procédure. Elles recevront ensuite deux courtes doses d’irradiation (5min) , espacées de 17 heures, pour préparer leur moelle osseuse à recevoir la greffe de nouvelles cellules. Après chaque dose de rayons, les souris seront réveillées. Deux heures après la deuxième irradiation, les souris seront brièvement endormies pour que nous puissions injecter (30 secondes par injection) les nouvelles cellules mutées pour le gène TET2. Cette méthode permet de s'assurer que ces cellules atteignent bien leur destination et commencent à se développer correctement dans la moelle osseuse des souris. Deux mois après cette intervention, nous donnerons un médicament par gavage (1 minute) aux souris pendant cinq jours pour activer la mutation de ces nouvelles cellules TET2. Nous surveillerons ensuite les souris pendant deux mois supplémentaires pour vérifier que ces cellules se développent comme prévu. Pendant cette période, nous prélèverons régulièrement de petites quantités de sang pour suivre l'évolution des cellules et vérifier l'état de santé général des souris.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées pour comprendre les effets de certaines cellules mutées sur les AVC pourraient éprouver divers désagréments et effets secondaires. Les procédures que les souris subiront, comme l'irradiation et la greffe de moelle osseuse, peuvent provoquer des douleurs temporaires et un stress. L'irradiation peut entraîner une gêne temporaire dans la zone traitée. De plus, le traitement avec un médicament peut aussi causer des douleurs passagères, et le fait de donner ce médicament aux souris peut les stresser. Après l'irradiation et la greffe, il est courant que les souris perdent un peu de poids en réaction à ces procédures. Cette perte de poids est généralement temporaire, mais nous devons surveiller les souris de près pour nous assurer qu'elles restent en bonne santé. Les souris pourraient également être moins actives et bouger moins que d'habitude pendant un certain temps après ces interventions. Elles pourraient réduire leurs activités quotidiennes, explorer moins leur environnement et interagir moins avec les autres souris. Il existe aussi des risques de complications, comme des infections ou des réactions du système immunitaire, bien que ces problèmes soient rares si les procédures sont bien contrôlées. En résumé, les souris pourraient ressentir des douleurs, du stress, une perte de poids et une diminution de leur activité pendant un certain temps en raison des interventions nécessaires pour cette étude. Nous veillerons à surveiller attentivement leur bien-être tout au long du processus.

Devenir

Tous les animaux sont prévus pour être exportés en Allemagne à nos collaborateurs pour les expériences d’AVC dans le cadre du projet européen.

Remplacement

Ce projet a pour but de comprendre le lien entre l'accident vasculaire cérébral (AVC) et un phénomène complexe appelé hématopoïèse clonale. Il explore comment certaines cellules sanguines, qui ont subi des mutations, interagissent avec le cerveau lors d'un AVC. A ce jour, les méthodes sans animaux ne peuvent pas reproduire ces interactions complexes. Les cultures cellulaires et les organoïdes (mini-organes cultivés en laboratoire) ne parviennent pas à imiter toutes les interactions entre les différentes parties du corps. Elles ne peuvent donc pas nous donner une vue complète des effets de l'hématopoïèse clonale sur les AVC. Les simulations informatiques et les modèles mathématiques peuvent aider à comprendre certains aspects de cette recherche. Toutefois, ces outils dépendent de données préexistantes et ne peuvent pas prédire de manière fiable les interactions biologiques complexes qui se produisent dans un organisme vivant. Par conséquent, ils ne sont pas suffisants pour répondre à nos questions de recherche. Pour vraiment comprendre comment l'hématopoïèse clonale influence la progression et les conséquences des AVC, nous devons observer ces processus dans un organisme entier. Les souris TET2 présentent des mutations génétiques spécifiques et sont essentielles pour cette étude. Elles nous permettent de modéliser les mutations et de voir leurs effets sur l'ensemble du corps, y compris le cerveau. Ces modèles animaux nous offrent une vue intégrée des interactions entre les cellules sanguines mutées et les tissus cérébraux touchés par un AVC. Cette compréhension est cruciale pour développer des stratégies thérapeutiques efficaces. En résumé, bien que nous ayons envisagé des alternatives non animales, elles ne peuvent pas fournir les informations nécessaires pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Pour ce projet, nous avons pris plusieurs mesures pour réduire le nombre d'animaux nécessaires, tout en garantissant des résultats fiables et pertinents. D'abord, nous avons effectué des expériences préliminaires pour déterminer combien de souris sont nécessaires pour obtenir des résultats significatifs. Ces expériences nous ont aidés à établir des sous-groupes d'au moins 8 à 10 souris, ce qui est crucial pour assurer la validité des résultats. Pour chaque condition expérimentale, nous avons besoin d'un minimum de 60 souris. Cela inclut 30 souris greffées avec des cellules souches mutantes TET2 et 30 avec des cellules souches non mutantes, réparties en trois sous-groupes en fonction de la réponse biologique observée. Pour réduire encore le nombre d'animaux, nous avons optimisé nos protocoles expérimentaux. Cela signifie que nous avons standardisé les procédures pour maximiser les données obtenues sur chaque souris. Nous suivons chaque animal à plusieurs moments clés au cours de l'étude. Cette approche longitudinale permet d'obtenir plus d'informations de chaque souris, réduisant ainsi le nombre total d'animaux nécessaires. Nous avons aussi pris en compte la variabilité biologique inhérente à ce type d'étude, ce qui signifie que nous avons ajusté nos chiffres pour compenser les éventuelles variations biologiques. Ces mesures permettront de garantir des résultats fiables tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés dans cette recherche.

Raffinement

Pour minimiser les nuisances sur le bien-être des animaux dans les procédures expérimentales de ce projet, nous mettrons en place plusieurs mesure, basées sur les meilleures pratiques en matière de soin et d’éthique animale. Les animaux seront surveillés de manière régulière, surtout après les interventions critiques telles que l'irradiation et la transplantation de moelle osseuse. Des observations fréquentes seront réalisées pour détecter rapidement tout signe de douleur, de stress ou de comportement anormal ou des aspects tels que la perte de poids, l’inactivité, les signes de douleur et d’autres indicateurs de bien-être. Immédiatement après les interventions, les animaux bénéficieront de soins post-opératoires complets. Cela inclut la mise en place de conditions environnementales optimales (température, humidité, nourriture et eau) pour favoriser une récupération rapide et confortable. Toutes les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale pour minimiser la douleur et le stress. Les paramètres vitaux des animaux seront surveillés tout au long de l’anesthésie pour s’assurer qu’ils restent dans des plages sécuritaires. Les cages des souris seront enrichies pour fournir un environnement stimulant et réduire le stress. Cela inclut l’ajout de matériaux de nidification et de cachettes (tube carton) pour favoriser une activité physique et mentale. Un environnement enrichi contribue au bien-être général des animaux et à leur récupération post-intervention. Des points limites ont été définis pour limiter ou arrêter la douleur et une analgésie sera mise en place si nécessaire

Choix des espèces

Pour ce projet, nous avons choisi d'utiliser des souris adultes consanguines. Ces souris sont les mieux caractérisées et les plus couramment utilisées dans les études sur le système hématopoïétique car leur consanguinité permet d’éviter les rejets lorsqu’on les greffe entre-elles et de limiter les variabilités expérimentales. Elles ont la particularité de pouvoir exprimer deux protéines distinctes , ce qui permet de reconnaître le greffon de l’hôte greffé. Les souris TET2 expriment le CD45.1 et sont greffées dans des souris CD45.2, ce qui permet de les suivre dans l’organisme. Nous utilisons également des lignées spéciales de souris TET2 qui portent des mutations génétiques spécifiques muettes que l’on rend fonctionnelles après la transplantation, grâce à un traitement avec un médicament appelé tamoxifène. Cela nous permettra d’étudier comment ces mutations affectent les cellules sanguines de l’hôte et leur interaction avec le cerveau. Les souris que nous utiliserons pour les greffes et les expériences seront toutes des adultes, âgées de 8 à 12 semaines. Ce choix d'âge est crucial car les processus biologiques que nous étudions, tels que l'hématopoïèse (la formation des cellules sanguines), sont plus stables et prévisibles chez les souris adultes. De plus, étant donné que nos expériences peuvent durer 2 à 3 mois, il est important que les souris ne soient pas trop âgées, afin d'assurer que les résultats soient cohérents et fiables.

Pour reproduire le syndrome des ovaires polykystiques et y tester des composés pharmacologiques, des souris et des rats reçoivent, certains dès 3 à 4 semaines d'âge, des hormones sexuelles ou d'autres molécules qui dérèglent leur équilibre hormonal, chaque jour ou par un dispositif sous la peau, pendant 1 à 24 semaines. 1072 rongeurs, 536 souris et 536 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs ovaires. Les rongeurs reçoivent en plus le composé testé, un témoin négatif ou une molécule de référence, un frottis vaginal par jour pendant au moins 14 jours et, selon les protocoles, des prises de sang et d'urine jusqu'à une fois par semaine. Selon le porteur, l'excès d'androgènes et les follicules immatures entraîneraient une infertilité et "ne devraient pas provoquer d'autres effets indésirables", mais il ne nomme ni les hormones ni les molécules employées. Il justifie le choix des rongeurs par le souci d'utiliser les espèces "les moins sensibles du point de vue neurophysiologique".

Objectifs

Le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) est la maladie hormonale la plus fréquente chez les femmes en âge de procréer, touchant environ une femme sur dix dans le monde. Il se caractérise par un dérèglement hormonal, une production excessive d’androgènes (comme la testostérone), des règles irrégulières et la formation de follicules inachevés dans les ovaires. Le SOPK est l’une des principales causes d’infertilité. L’origine du SOPK n’est pas clairement identifiée, mais elle est probablement multifactorielle (génétique, épigénétique, environnementale). Un lien est souvent rapporté entre l’excès d’androgènes, la résistance à l’insuline et l’obésité, avec environ 35 à 50 % des patientes avec un SOPK qui sont obèses. Les symptômes varient selon les personnes : pilosité excessive, perte de cheveux, acné, règles irrégulières ou absentes. Ces symptômes évoluent avec l’âge, l’hypersécrétion des androgènes aggravant la résistance à l’insuline. Le SOPK augmente aussi le risque de syndrome métabolique (surpoids, dyslipidémie, hypertension, troubles de la glycémie), conduisant à l’insulinorésistance, au diabète de type 2 et aux maladies cardiovasculaires. Il accroît également le risque de cancer de l’endomètre. Le SOPK est une maladie chronique, et actuellement incurable. La prise en charge des patientes vise à améliorer les symptômes par des changements de mode de vie et ou des traitements médicamenteux. La recherche médicale est donc très active, cherchant à comprendre les dysfonctionnements et à développer de nouveaux traitements, notamment des traitements curatifs. Des modèles animaux de SOPK sont décrits dans la littérature, principalement chez les rongeurs. Ceux-ci sont développés via des modifications génétiques, des manipulations environnementales (exposition au stress ou lumière constante) ou l’induction de taux élevés d’hormones sexuelles, parfois combinée à l’induction du diabète (lignée de rongeurs diabétiques ou alimentation riche en graisses (type Western ou High-fat-diet, HFD). Ce projet vise donc à développer des modèles animaux pertinents, afin de mieux comprendre la physiopathologie du SOPK et de contribuer à la recherche de nouveaux traitements, curatifs ou symptomatiques.

Bénéfices attendus

Selon l’Organisation mondiale de la santé, le SOPK est un problème de santé publique important et l’un des troubles hormonaux les plus courants chez les femmes en âge de procréer. La maladie touche environ 8 à 13 % des femmes en âge de procréer. Les effets biologiques et psychologiques du SOPK, en particulier ceux liés à l’obésité, à l’image du corps et à l’infertilité, peuvent entraîner des problèmes de santé mentale et une stigmatisation sociale. D’après l’Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm, dossiers SOPK), un des enjeux de la recherche sur le SOPK est le développement de nouveaux traitements qui permettraient de résoudre toutes les complications à la fois, en s’attaquant à la cause du problème et non à chacun des symptômes séparément. Ce projet de recherche permettrait la mise en place d’un modèle robuste et valide de SOPK chez le rat et la souris. Ensuite, l’évaluation de nouveaux traitements du SOPK sur ces modèles animaux, donc une preuve de concept préclinique, avant les essais chez l’homme.

Procédures

Pour l’induction du SOPK, les animaux vont recevoir un traitement par des hormones sexuelles ou autres molécules entraînant un déséquilibre hormonal. Ce sera une administration par jour par voie orale ou parentérale, ou via un dispositif sous-cutané permettant une libération prolongée, pendant 1 à 24 semaines. En plus, les animaux vont aussi recevoir une administration (voie selon la molécule à étudier) du composé à analyser, d’un contrôle négatif (souvent le véhicule du composé à tester) et d’une molécule de référence. La fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (une ou plusieurs fois par jour pendant 1 à 24 semaines). Des frottis vaginaux seront réalisés chez les animaux, une fois avant le début des traitements, puis une fois par jour pendant au moins 14 jours consécutifs afin de déterminer la présence de SOPK. Enfin, si le protocole le requiert, des prélèvements de sang et d’urines pourront être envisagés jusqu’à une fois par semaine pendant la durée de l’étude. Chaque prélèvement, réalisé par des personnels tutorés, durera moins de 3 minutes

Impact sur les animaux

L’administration des composés, la réalisation des frottis vaginaux et les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress et/ou une sensation d’inconfort passager chez les animaux. L’excès d’hormones androgènes et la formation des petites follicules ovariens immatures entraîneraient une infertilité mais ne devraient pas provoquer d’autres effets indésirables chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure. En effet, un prélèvement des ovaires est indispensable pour mettre en évidence le SOPK et l’efficacité ou non d’un traitement.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro pertinent permettant d’évaluer l’efficacité d’un principe actif sur le SOPK. En effet, le syndrome est le résultat d’un ensemble de désordres hormonaux et tissulaires, faisant appel à l’axe hypothalamo-hypophysaire et atteignant en même temps le cerveau et les organes.

Réduction

La réalisation des études se fera de façon à limiter le plus possible le nombre d’animaux utilisés. Une étude pilote sera réalisée pour la validation du modèle. L’évaluation d’un nouveau traitement se fera seulement lorsqu’un modèle robuste et valide sera obtenu. Comme utilisé par les autres équipes de recherche dans la littérature, le nombre d’animaux par groupe sera entre 5 et 8 au début du projet. Ce nombre sera ensuite affiné après la récolte des premières données avec des tests statistiques. Des tests statistiques seront aussi réalisés pour comparer les paramètres mesurés dans les groupes d’animaux étudiés. Pour une petite population, le t-test non apparié sera utilisé pour les comparaisons 2 à 2 et une analyse de variance à 1 ou 2 facteurs pour les comparaisons multiples.

Raffinement

Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible. Les animaux sont hébergés en groupe dans les cages (2 rats et jusqu’à 5 souris) afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un suivi quotidien de tous les rats sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Des points limites adaptés ont été fixés pour la réalisation du projet. L’atteinte d’un point limite sera signalé par le zootechnicien à un responsable des soins et au responsable du projet. Le cas échéant, si les symptômes sont réversibles, l’animal sera sorti de l’expérience et des procédures de soins peuvent être mis en place avant une éventuelle ré-inclusion dans l’étude. Si les symptômes sont irréversibles, l’animal sera euthanasié. Toute décision (sortie de la procédure en cours, soins ou euthanasie) sera prise en concertation avec le responsable du projet, le vétérinaire référent, et/ou le responsable de la structure du bien-être animal (SBEA) et/ou le responsable de la plateforme animalerie.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les rongeurs, que ce soit le rat ou la souris, sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche dans les modèles de SOPK. En effet, les rongeurs ont aussi un axe hypothalamo-hypophysaire qui régule le taux hormonal, qui est essentiel dans l’étiologie du SOPK. Malgré l’absence de menstruation chez la femelle, le suivi du cycle œstral permet d’observer une perturbation de l’ovulation. De plus, le cycle oestral dure seulement 4 à 5 jours chez les rongeurs, permettant d’observer rapidement une perturbation ou l’efficacité d’un traitement. Les animaux seront utilisés à l’âge prépubère (3-4 semaines d’âge) ou à l’âge adulte. En effet, il a été décrit que l’excès d’hormones androgènes à l’âge prépubère, voire intra-utérin, reproduirait mieux les symptômes du SOPK qu’à l’âge adulte.