Souris
Impact d’un cocktail de polluants persistants sur le développement du syndrome cardiorenal
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système urogénital
Toute souris dont le score d'évaluation devient trop élevé est mise à mort immédiatement, et 15 % des opérées meurent dans les trois jours qui suivent la chirurgie. 840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, toutes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune subit un infarctus provoqué par ligature coronaire ou une ischémie rénale avec ablation de l'autre rein, un cathétérisme du ventricule gauche, jusqu'à trois mesures de filtration rénale de deux heures, un prélèvement de sang à la veine cave et jusqu'à sept gavages hebdomadaires de dioxine et de benzopyrène. Le bénéfice annoncé est une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels ces polluants aggravent l'insuffisance cardiaque et rénale, le porteur ajoutant que passé les 72 premières heures il est rare d'observer des signes de souffrance.
Objectifs
Les polluants organiques persistants (POPs) sont relargués dans l'atmosphère de façon naturelle (feu de forêt, éruption volcanique) ou industrielle (combustion incomplète des matières organiques). Une fois émis dans l'atmosphère, les POPs retombent et polluent les eaux et les sols et contaminent les végétaux et les animaux où ils s’accumulent du fait de leur persistance. Malgré les mesures visant à réduire leur émission, l'homme continue à être exposé chroniquement aux POPs par l’ingestion d’aliments contaminés. Les POPs sont connus pour endommager le bon fonctionnement de différents organes. Ils exercent leurs effets toxiques en se fixant sur un récepteur aux hydrocarbures aromatiques nommé AHR. Des études récentes démontrent que AHR joue un rôle important dans les atteintes cardiaques et rénales liées à l’exposition aux polluants. En particulier chez l’homme, l’activation de AHR est associée à un risque accru de développer une hypertension artérielle et une atteinte rénale et ainsi de surmortalité cardiovasculaire. Il a également été montré chez les rongeurs que l’activation de AHR par les polluants favorise le développement d’une hypertrophie cardiaque et induit une toxicité rénale. Le cœur et les reins sont deux organes fortement interconnectés et la dysfonction de l’un peut affecter la fonction de l’autre conduisant ainsi à une maladie appelée syndrome cardio-rénal. Le récepteur AHR est fortement exprimé dans ces deux organes qui répondent à l’exposition aux POPs en activant les gènes cibles de la voie AHR. Le rôle des POPs et de l’activation de la voie AHR dans le développement du syndrome cardio-rénal n’est pas connu. Les objectifs de ce travail sont : 1. D’étudier l’effet d’une exposition chronique d'un cocktail de deux POPs (la dioxine et le benzopyrène) sur le développement du syndrome cardio-rénal chez des souris présentant une atteinte cardiaque ou rénale primaire. 2. De déterminer si le potentiel effet du cocktail de POPs sur le syndrome cardio-rénal est médié par l’activation de la voie AHR.
Bénéfices attendus
Ce travail offrira une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels les polluants organiques persistants accélèrent la progression de l'insuffisance cardiaque et rénale primaire et l'apparition du syndrome cardio-rénal de type 1 ou 3 dans les populations vulnérables.
Procédures
Chaque animal subira les interventions suivantes : A. Procédures chirurgicales ou prélèvement invasif sur animal anesthésié au nombre de quatre : 1. Modèle d'insuffisance cardiaque post-ischémique (1 fois, durée : 20 min) ou modèle d'insuffisance rénale par ischémie rénale unilatérale et néphrectomie controlatérale (1 fois, durée : 30 min) 2. Analyse de l'hémodynamique cardiaque par cathétérisme consistant à introduire une sonde (cathéter) dans le ventricule gauche afin de mesurer les pressions et les volumes cardiaques (1 fois, durée : 20 min) 3. Mesure du débit de filtration glomérulaire (DFG) (3 fois max, durée : 2h) 4. Prélèvement de sang par la veine cave (1 fois, durée : 2 min). B. Procédures non ou peu invasives sur animal anesthésié ou vigile sont au nombre de trois : 1. Échographie cardiaque ou rénale sur animal anesthésié (3 fois max, durée : 20 minutes) 2. Gavage au polluant ou au solvant sur animal vigile (7 fois max à raison d’1 fois par semaine, durée : 20 secondes) 3. Récolte d'urine après miction spontanée (4 fois max, durée : 2 minutes)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont principalement du stress lié à la contention et aux manipulations sur animal vigile (prélèvement d’urine, gavage). Les effets indésirables sont principalement ceux liés à la chirurgie (modèle d’insuffisance cardiaque ou rénale post-ischémique) ; pouvant dans les trois premiers jours suivant l’opération conduire à une atteinte cardiaque ou rénale aigue avec une mortalité accrue pour les animaux les plus atteints (15% dans les deux modèles). Les effets indésirables seront la perte de poids (10%), une altération de leur apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale) ou un comportement anormal (mobilité réduite, agressivité). Dans notre expérience, passées les premières 72h, il est rare d’observer des signes de souffrance chez l’animal ayant subi une thoracotomie/ischémie cardiaque ou une ischémie rénale/néphrectomie, suggérant que la période critique douloureuse est limitée à ce temps court après la chirurgie.
Devenir
A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort. Leurs organes seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques et/ou moléculaires nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude.
Remplacement
Afin de tester les mécanismes moléculaires impliqués, des expériences de culture cellulaire en présence de polluants seront menées indépendamment. Pour répondre à cette question, le remplacement total des animaux par de la culture cellulaire n'est pas réaliste car les modèles in vitro ne rendent pas compte de l'immense complexité des interactions physiopathologiques qui existent entre deux organes à l’échelle d’un organisme entier. L'utilisation de modèles animaux pour étudier la toxicité cardio-rénale médiée par les polluants reste nécessaire pour atteindre les objectifs de notre projet de recherche. Dans ce contexte, la souris est le modèle de choix en raison des similitudes physiopathologiques avec les maladies cardio-rénales humaines. Par ailleurs, les souris génétiquement modifiées peuvent fournir des notions importantes sur le rôle de la voie de signalisation du récepteur aux hydrocarbures aromatiques appelé AHR dans la toxicité des polluants, avec une grande pertinence pour la santé humaine.
Réduction
Nous allons réduire le nombre d'animaux par l'utilisation des méthodes non invasives (échocardiographie, échographie rénale, mesure du débit de filtration glomérulaire, prélèvements d'urine) permettant de répéter les analyses sur le même animal au cours de la maladie, mais aussi grâce à l'utilisation de tests statistiques appropriés. Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que : - des groupes de n=15 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour les analyses histologiques et moléculaires compte tenu de la mortalité post-opératoire dans nos deux modèles chirurgicaux (infarctus du myocarde et ischémie rénale/néphrectomie) et de la variabilité biologique de la réponse aux polluants. - des groupes de n=20 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour les évaluations fonctionnelles compte tenu de la variabilité inter-individuelle et de la mortalité accrue post-opératoire.
Raffinement
Pour raffiner, les animaux importés de fournisseurs agréés pour les besoins expérimentaux sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. La souffrance des souris sera réduite en utilisant des sédatifs et analgésiques. Pour les échographies et les modèles chirurgicaux, les souris seront anesthésiées, placée sur plaque chauffante à 37°C pour éviter toute hypothermie et des injections d’antidouleurs seront faites en pré- et post-opératoire afin de limiter la douleur. Dans la semaine suivant la chirurgie, la surveillance des animaux sera renforcée avec un examen bi-quotidien par du personnel compétant afin de vérifier leur état général de santé. Tout au long de l’étude, nous suivrons la grille d’évaluation proposée tenant compte des changements du poids, de perturbation de l'apparence physique et du comportement. Tout animal auquel aura été attribué un score élevé à cette évaluation recevra des analgésiques. Tout animal auquel aura été attribué un score trop élevé sera immédiatement mis à mort. La qualité de l'élevage est améliorée en enrichissant les cages expérimentales avec des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification (papiers, maison en carton) ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson.
Choix des espèces
La souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des souris génétiquement modifiées afin d'identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables des effets toxiques des polluants. Dans ce projet, nous allons notamment utiliser des souris mutantes où le récepteur des polluants est spécifiquement supprimé dans les cellules endothéliales vasculaires. La souris offre également l'avantage d'être de petite taille et de limiter ainsi les quantités de polluants au cours de l'étude. Le modèle d’infarctus du myocarde induit par ligature coronaire permanente chez la souris conduit à une insuffisance cardiaque progressive dès les premiers jours après l’intervention chirurgicale. Il en est de même pour le modèle d'ischémie rénale/néphrectomie unilatérale conduisant à une insuffisance rénale aigue. Nous maitrisons les outils permettant les évaluations fonctionnelles et structurelles cardiaques et rénales in vivo ainsi que ex vivo dans ces modèles chez la souris. Nous utiliserons des animaux adultes mâles de 8 semaines pour notre étude. A ce stade, le cœur et le rein sont parfaitement formés et nous possédons déjà tous les paramètres fonctionnels et structurels de ces deux organes pour l'ensemble des génotypes à tester.
Evaluation de l’efficacité de nouveaux traitements dans un gliome pédiatrique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Des cellules de gliome sont injectées dans le tronc cérébral de souriceaux âgés de deux jours, puis la tumeur qui s'y développe est suivie sous anesthésie trois fois par semaine, vingt minutes à chaque fois. 1 000 souris fortement immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées pour que leurs tumeurs soient prélevées et analysées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet teste des associations de deux molécules contre un cancer pédiatrique du tronc cérébral aujourd'hui incurable. Le porteur affirme que les nuisances ont un effet limité parce que les souris sont manipulées sous anesthésie générale, et confie l'estimation de la souffrance au personnel de l'animalerie sans décrire de grille de score.
Objectifs
Ces travaux de recherche vise à étudier le gliome du tronc cérébral, un cancer pédiatrique toujours incurable. Aucun des traitements actuels ne prolonge la vie des enfants atteint de ce gliome. Dans ce contexte, il est nécessaire de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques mais aussi d’optimiser celles développées récemment afin que le traitement soit le plus efficace possible. Récemment, nos études sur les lignées cellulaires ont mis en évidence l’intérêt de plusieurs nouvelles combinaisons de deux composés chimiques et de nouvelles combinaisons sont en cours de développement. Certains aspects de nos projets vise aussi à optimiser l’efficacité de certaines combinaisons médicamenteuses. Des analyses moléculaires et de tissus seront réalisées sur les tumeurs après prélèvement afin d’apprécier l’action de chacune des deux produits et de la combinaison sur les cellules cancéreuses et sur certains gènes dans un contexte in vivo.
Bénéfices attendus
Démontrer que l’association de deux nouveaux médicaments bloque la formation de tumeur chez la souris. Etudier l’effet des deux composés, seuls ou en association, au niveau moléculaire et sur les tissus tumoraux.
Procédures
Injection sous anesthésie de cellules dans le tronc cérébral (une fois, 5 minutes ). Suivi du poids et du développement tumoral sous anesthésie (3 fois par semaine, 20 minutes)
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée avec la greffe de cellules tumorales dans le tronc cérébral et la formation de tumeur dans le cerveau. Dans certaines conditions du projet, des agents anticancéreux seront administrés aux animaux afin d’évaluer la sensibilité des cellules tumorales à cette nouvelle thérapie. Les nuisances attendues sont la manipulation des cages et des souris lors des expériences, un léger stress thermique dû à l'anesthésie qui est pris en charge par l'utilisation d’un tapis chauffant et une douleur due à l’injection de cellules et de solutions chimiques avec une aiguille. Comme les souris sont manipulées sous anesthésie générale, toutes ces nuisances ont un effet limité sur les animaux.
Devenir
Les 1000 souris de ce projet seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des tumeurs et leur analyse pas des approches cellulaires, moléculaires et des analyses de tissus.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris (souris ayant un système immunitaire à capacité limitée). Sources bibliographiques consultées (PubMed, CEVMA). Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiment stromales et tumorales en action in vivo chez la souris.
Réduction
Nous utiliserons des mâles comme des femelles. Nos résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés en tenant compte du nombre d’animaux par lot qui est de 10.
Raffinement
Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids en papier crépon. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Si pour une raison quelconque, un animal est considéré comme en souffrance, il sera euthanasié sans attendre.
Choix des espèces
1. La souche de souris choisie est largement utilisée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. Pour le modèle intracrânien de gliome, l’injection de cellules dans les souris sera réalisée au deuxième jour après la naissance. À cet âge, une injection intracérébrale est faisable sans procédures chirurgicales, ce qui réduit considérablement la souffrance animale. Il est aussi important que le cerveau soit à un stade de développement précoce pour être proche du microenvironnement présent chez les enfants atteints de gliomes du tronc cérébral.
Utilisation de vecteurs dérivés de phages pour modifier génétiquement des bactéries toxigéniques responsables d’infections intestinales sévères chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Le hamster, modèle historique de cette infection intestinale, a été écarté parce qu'il y meurt trop, et c'est la souris qui prend sa place. 3 553 souris vont être utilisées, dont 1 455 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec diarrhées, déshydratation et douleurs intestinales pouvant durer plusieurs jours. Elles reçoivent par gavage des bactéries productrices de toxines puis les candidats médicaments à tester, jusqu'à deux fois par jour pendant trois jours, et leurs fèces sont récoltées jusqu'à six fois par jour en les isolant quelques minutes dans une boîte. Toutes sont tuées à l'issue, y compris celles qui n'auront pas été infectées, le porteur les considérant comme potentiellement contaminées du fait de leur hébergement dans la même animalerie.
Objectifs
Certains agents pathogènes bactériens ont la capacité de coloniser l’intestin humain et de s’y reproduire très efficacement, entraînant des symptômes sévères (diarrhées violentes, perforation de la paroi intestinale…) pouvant engager le pronostic vital du patient. La sévérité de ces infections tient à la production par ces bactéries pathogènes de toxines qui ciblent et détruisent les cellules de la paroi intestinale et du côlon. Pathogènes opportunistes, ces bactéries intestinales entraînent rarement des infections chez les personnes en bonne santé car leur développement est inhibé par les nombreuses bactéries qui colonisent naturellement l’intestin et constituent le microbiote (encore appelé flore intestinale). En revanche, ces pathogènes prospèrent dans l’intestin de personnes affaiblies et/ou dont le microbiote a été perturbé par un traitement antibiotique, les rendant ainsi particulièrement sensibles à l’infection. Malgré la pression considérable que ces bactéries pathogènes exercent sur les systèmes de santé, avec des coûts globaux annuels estimés à plusieurs milliards de dollars, il n’existe à ce jour aucune approche pleinement satisfaisante pour les traiter. En effet, les antibiotiques restent le standard thérapeutique contre ces infections, or ils participent à la perturbation du microbiote intestinal favorisant le développement même de ces pathogènes et sont responsables de l’augmentation continue de l'antibiorésistance, deux facteurs clés favorisant le risque de récurrence des infections. Dans ce contexte, nous développons 2 approches thérapeutiques inédites permettant, après administration par voie orale, de cibler les bactéries pathogènes dans l’intestin et de les éliminer de manière spécifique sur la base de leur séquence génétique, ou bien de les modifier génétiquement afin d’abolir leur production de toxines, les rendant ainsi inoffensives. Ces deux approches ont l'avantage unique d’être extrêmement spécifiques : contrairement aux antibiotiques elles ne ciblent que les bactéries pathogènes et préservent ainsi le reste du microbiote, limitant ainsi le risque de récurrence des infections. L'objectif de ce projet est donc d’évaluer l’efficacité de ces deux approches thérapeutiques dans des modèles murins d’infection par ces pathogènes bactériens intestinaux afin de sélectionner la plus prometteuse en vue d’en faire un médicament et d’organiser des essais cliniques chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Il n'existe à ce jour aucune approche thérapeutique pleinement satisfaisante pour soigner les infections causées par les bactéries pathogènes intestinales productrices de toxines. En effet, si les antibiotiques demeurent le standard thérapeutique contre ces infections, ils perturbent grandement le microbiote intestinal, un point clé favorisant le développement de ces pathogènes intestinaux. De plus, ils sont responsables de l’augmentation continue du phénomène d’antibiorésistance. De ce fait, les antibiotiques peuvent paradoxalement être contre productifs et favoriser le risque de récurrence des infections chez les patients. Dans ce contexte, ce projet vise à tester l'efficacité de 2 modalités thérapeutiques inédites et permettant de combler les lacunes des antibiotiques. La première modalité consiste en un antimicrobien extrêmement spécifique capable de reconnaître et d’éliminer les bactéries pathogènes dans l’intestin sur la base de leur séquence génétique. La seconde fonctionne à la manière d’un produit de thérapie génique et permet de cibler les bactéries pathogènes dans l’intestin et de le modifier génétiquement afin d’inactiver les gènes responsables de la production de toxines, les rendant ainsi inoffensives. Ces deux approches ont en commun leur spécificité sans précédent : nous avons en effet pu démontrer par le passé sur une autre bactérie qu’elles ne ciblent que les bactéries d'intérêt et n’engendrent aucune perturbation du microbiote intestinal. Elles se démarquent donc très nettement des antibiotiques et réduisent le risque de récurrence des infections à ces pathogènes intestinaux. En utilisant des modèles murins de colonisation et d’infection intestinale, ce projet vise à démontrer la capacité de ces 2 approches à éliminer les bactéries pathogènes ou à les rendre inoffensives tout en préservant le reste du microbiote intestinal. Le principal bénéfice en découlant sera le développement d’une stratégie thérapeutique alternative plus performante, plus sûre et plus adaptée au traitement clinique des infections intestinales aux bactéries productrices de toxines que les antibiotiques.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont les suivantes : - Une administration orale par gavage de bactéries puis des candidats médicaments que nous testons (quelques secondes par animal); jusqu’à 2 administrations par jour pendant 3 jours maximum dans certaines procédures - Prélèvements de fèces: ils seront effectués au maximum une fois par jour (sauf procédure spécifique: 6 fois par jour pendant 2 jours), en récoltant les fèces excrétées naturellement par les animaux, en les plaçant dans une boite pendant quelques minutes. Il est également attendu que certains animaux infectés présentent une diarrhée et une perte de poids associées à la maladie que nous étudions.
Impact sur les animaux
Le gavage oral avec les bactéries ou avec le traitement à tester entraîne une gêne et un stress légers et de courte durée. Les prélèvements de fèces entraînent un stress physique léger et un isolement de courte durée (5 minutes maximum). La maladie étudiée entraîne des symptômes tels que de la diarrhée, et donc une déshydratation légère à modérée, ainsi que des douleurs intestinales légères à modérées pouvant durer plusieurs jours (jusqu’à guérison ou atteinte d’un point limite, tel que décrit dans la section dédiée).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, la quasi-totalité de ces animaux seront infectés par des bactéries pathogènes, empêchant toute sortie de l’animalerie pour des raisons de sécurité biologique. Les quelques animaux qui ne seront pas infectés seront tout de même hébergés dans l’enceinte de la même animalerie, et doivent donc aussi être considérés comme potentiellement contaminés.
Remplacement
Les bactéries cibles colonisent l’intestin, où elles produisent des toxines qui entraînent notamment des diarrhées. Un traitement efficace doit donc être capable d’atteindre l’intestin afin d’agir sur ces bactéries. Bien que des modèles in vitro permettent de simuler les conditions gastrique et intestinale et seront utilisés en première intention au laboratoire, seule l’utilisation d’animaux permet de récapituler à la fois les obstacles physico-chimiques qui seront rencontrés par notre traitement chez l’homme, mais aussi les conditions physiologiques dans lesquelles ces bactéries cibles seront retrouvées chez l’homme. De plus, bien que la réduction/abrogation de la production des toxines sera montrée préalablement in vitro au laboratoire, un modèle récapitulant les symptômes causées par l’infection avec ces bactéries est nécessaire pour évaluer l'efficacité de notre traitement dans la réduction/abrogation de ces symptômes chez l’homme.
Réduction
Le nombre de souris nécessaires à ce projet est évalué à 3553 sur 5 ans. Ce nombre a été déterminé après consultation de biostatisticiens et réalisation d’analyses statistiques préalables permettant de déterminer à partir de combien de sujets une mesure est exploitable scientifiquement, et ce dans le souci de n’utiliser que le nombre d’individus strictement nécessaires tout en récupérant le maximum d'informations par animal. Nous effectuerons un grand nombre de tests préliminaires in vitro au laboratoire avant de passer chez l’animal. Ainsi, la diminution et l’abrogation de la production de toxines par les bactéries confrontées à notre traitement seront mesurées in vitro; la stabilité de notre traitement en conditions physico-chimiques physiologiques (acidité de l’estomac, présence d’enzymes digestives) sera mesurée in vitro; la capacité de notre traitement à tuer les bactéries ciblées sera évaluée par culture microbienne au laboratoire. Ces tests préliminaires permettront de réduire au strict minimum les tests devant absolument être effectués sur animaux en les effectuant que sur les candidats médicaments les plus prometteurs. Nous allons vérifier la colonisation bactérienne (un des indicateurs principaux) dans l’intestin des animaux au cours de l’expérience à partir du matériel fécal; cette stratégie non invasive, que nous avons déjà mis en place précédemment, nous permettra de procéder à des études longitudinales sur un même individu, réduisant ainsi le nombre d’animaux à mettre à mort sans perdre des informations essentielles pour le développement et l'interprétation de nos expérimentations.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux seront celles classiquement admises, notamment en termes de socialisation (jamais moins de 3 animaux par cage) et d’enrichissement (coton pour nidification); la nourriture et l’eau seront fournies ad libitum (sauf exception la veille au soir d’une administration de traitement oral). Il n’est pas prévu d’isoler des animaux ou de restreindre leur environnement au cours du projet. L’infection par nos bactéries toxinogènes cibles entraînera sous quelques jours des diarrhées dont la sévérité peut évoluer rapidement. C’est pourquoi dans toutes les procédures impliquant des animaux infectés par des bactéries produisant des toxines, nous prévoyons une surveillance accrue des animaux (au minimum 1 fois par jour; voire 2 fois par jour dans les cas des animaux ayant perdu du poids ou peu mobiles), afin d’anticiper l’aggravation des symptômes et le cas échéant de procéder à la mise à mort des animaux pour éviter toute souffrance inutile. Des blocs d’hydrogel et des morceaux de nourriture pourront être fournis au fond de la cage pour les souris pouvant présenter des symptômes les empêchant d’accéder aussi librement que possible à l’eau et la nourriture présents dans le capot de la cage. Enfin, nous avons prévu d’utiliser pour la plupart de nos procédures une souche ne produisant pas la toxine majeure de cette bactérie cible; des telles bactéries possèdent encore une toxine mineure avec le même mécanisme d’action, mais dont la dose toxique est 1000 fois moindre que la première. La majorité de nos procédures utiliserons cette souche comme alternative, moyennant certains changements dans la nature de notre traitement, à l’exception des procédures évaluant l’effet du traitement sur les symptômes eux-mêmes, par définition, où l'efficacité devra être démontrée contre les souches sauvages impliquées dans la maladie chez l’homme.
Choix des espèces
De nombreux animaux ont été infectés expérimentalement par la bactérie pathogène que nous étudions tels que hamsters, souris, rats, lapin et cailles, mais aussi des cochons et des singes. Le modèle historiquement utilisé pour étudier la pathologie est le hamster, cependant ce modèle est extrêmement sensible et présente une forte mortalité. Dans ce projet, nous limitons au maximum les souffrances éprouvées par les animaux, en travaillant majoritairement avec des versions fortement atténuées de ces bactéries. Ainsi, la souris devient le modèle le plus simple pour lequel il existe des données de littérature confirmant une colonisation intestinale stable. Nous disposons également de nombreuses données antérieures générées dans notre laboratoire chez la souris sur des candidats médicaments similaires, ce qui bénéficiera au projet. Le modèle souris récapitule également certains des symptômes clés de ces infections bactériennes chez l'Homme; cela nous permettra d'évaluer l'impact de notre traitement sur l'évolution de la maladie. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes, typiquement âgés de 6 à 9 semaines en début d’expérimentation. L’âge des animaux en fin d’expérimentation ne dépassera pas 12 semaines, du fait de la durée maximum des expériences prévues dans les différentes procédures. Il faut noter que cet âge maximum n’est pas une limite scientifique, mais simplement un fait lié à la durée de nos expériences. Les individus plus jeunes ou beaucoup plus âgés pourraient être plus sensibles aux toxines produites par nos bactéries cibles, et ainsi développer des symptômes plus sévères, ce qui n’est pas nécessaire pour notre projet, et serait même contre-productif en termes d’obtention de colonisation intestinale stable avec ces bactéries.
Impact de la cytidine désaminase APOBEC3A sur la survenue de tumeurs
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des tumeurs se développent chez elles après induction d'un transgène, avec douleurs et lésions attendues, 60 souris subissant quatre prélèvements sanguins par ponction rétro-mandibulaire sur deux mois et 30 une administration intraveineuse. Le porteur annonce comme retombée d'ouvrir "une nouvelle voie d'exploration pour d'éventuelles thérapies", quand l'objectif immédiat est de montrer qu'une enzyme mutagène favorise l'apparition de tumeurs chez l'animal vivant. Il justifie le recours à la souris par le "besoin" d'observer la tumorigénicité dans le cadre d'un "organisme entier", malgré les modèles in vitro dont il dispose.
Objectifs
Une source importante de mutations observées dans les génomes de nombreux types de tumeurs est liée à certaines enzymes. L’objectif de ce projet est dans un premier temps de montrer que certaines enzymes (A3A) peuvent-être impliquées dans la survenue de cancers in vivo. Nous disposons de données obtenues en culture montrant que l’enzyme A3A peut muter des gènes impliqués dans la carcinogenèse. Ce projet nous permettra de montrer directement au sein de l’animal l’implication de A3A et d’autres molécules dans la survenue des cancers ou dans un début de pathologie tissulaire.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence l’activité mutagène de A3A in vivo. Nous espérons montrer également que d’autres molécules pourront contrecarrer l’effet mutagène de A3A chez l’animal. Le but du projet est d’améliorer la connaissance des mécanismes de tumorigénèse et l’implication de A3A dans ce processus. Ceci ouvrirait une nouvelle voie d’exploration pour d’éventuelles thérapies.
Procédures
Prélèvements sanguins de sang veineux par ponction dans la veine rétro-mandibulaire (sur 60 souris), quelques secondes par prélèvements ; et 4 prélèvements quinzomadaires/souris (pendant 2 mois) ; un antibiotique sera ajouté dans l’eau de boisson des souris. Administration intraveineuse,1 unique administration par souris (sur 30 souris) ; durée de l’acte : quelques secondes
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sur les animaux seront principalement la douleur et les lésions dues à la genèse des tumeurs. L’apparition des tumeurs suite à l’expression du transgène par l’administration de l’inducteur est liée à une douleur en principe de sévérité modérée, qui peut comporter une diminution d’activité seulement de quelques jours et une diminution de poids ne pas dépassant 20% si pas d’atteinte de points limites. Etant donné les caractéristiques de l’étude, nous évaluerons mieux la condition des animaux par la grille de Body Condition Score (BCS) (plus fiable et a adaptée pour ce type d’étude que le Body Weight (BW) due à l’ éventuelle apparition de tumeurs qui peut fausser ce dernier paramètre) A son tour, les prélèvements sanguins rétromandibulaires ou l’administration de substances via la veine de la queue peut induire une douleur et un inconfort léger de courte durée liés à l’introduction de l’aiguille.
Devenir
Les souris utilisées dans le cadre de ce projet seront mises à mort pour analyse tout au long de chaque procédure à des points définis ou en fonction de l’état des souris (signes cliniques de détresse/souffrance suite à survenue de tumeurs). En tout cas à la fin des procédures toutes les souris restantes seront mises à mort et les organes cibles prélevés pour analyse.
Remplacement
Malgré disposer de quelque modèle in vitro, le recours à la souris pour ce projet se justifie par le besoin d’avoir accès aux effets de tumorigénicité en présence des transgènes d’intérêt dans le cadre de l’organisme entier (affectation différents organes, circulation des exosomes par voie sanguine)
Réduction
Le nombre d’animaux que nous estimons nécessaire est basé sur notre expérience préalable et corroboré par l’avis des biostatisticiens pour être surs d’utiliser le nombre minimum d’animaux nécessaire, avec le maximum d’information par animal, afin d’attendre l’objectif fixé avec des résultats fiables. Quand cela sera possible, les animaux seront leur propres témoins (i.e. point a 21 jours). Pour la production d’exosomes à utiliser dans la deuxième procédure, nous utiliserons du sang de certains animaux de la première procédure. Nous utilisons males et femelles afin de réduire le nombre d’individus en considérant qu’il ne devrait pas y avoir un biais de sexe quant à la formation tumorale
Raffinement
Nous suivrons quotidiennement les animaux sous traitement avec l’antibiotique ainsi que leurs contrôles. Nous serons particulièrement attentifs à tous les signes de détresse susceptibles de survenir afin de réduire/éliminer la souffrance des animaux, les signes cliniques externes (prostration, poils hérissés, jaunissement, corps dur à la palpation, perte de poids). Les animaux seront mis à mort quand cela sera nécessaire en fonction de leur état et en suivant des grilles d’observation de souffrance et les points limites spécifiques et précoces définis (évaluation du Body Condition Score (BCS) problèmes posturaux prolongés, corps dur à la palpation abdominale pouvant être associé à une tumoration/hepatomégalie). En cas de souffrance et avant la mise à mort au plus tard au bout de 24h après confirmation des signes cliniques externes, nous aurons recours au besoin de la nourriture humidifiée / gel hydrique, la réhydratation sous-cutanée ou le chauffage des animaux si hypothermie associée.
Choix des espèces
La souris est un mammifère de petite taille à reproduction rapide qui montre 90% d’homologie avec le génome humain, d’où l’intérêt majeur en recherche fondamentale et création de modèles pour des maladies humaines. Les souris utilisées seront des souris adultes de 2-6 mois car l’étude d’apparition de tumeurs porte sur les adultes et est longue.
Etude transcriptomique de la réponse au jeûne alimentaire
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
60 souris vont être privées de nourriture pendant vingt-quatre heures, puis tuées pour qu'on prélève leurs îlots pancréatiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le jeûne fait baisser leur activité, leur température corporelle et leur poids. L'objet est de séquencer les noyaux de leurs cellules pancréatiques pour repérer les gènes dont l'expression change avec le jeûne, dix souris étant utilisées par point de séquençage. Le porteur écrit à deux reprises qu'un jeûne de vingt-quatre heures ne met "en aucun cas" en danger des souris en bonne santé, pour des procédures qu'il déclare lui-même de gravité modérée.
Objectifs
Le maintien de la balance énergétique dépend de l'équilibre entre les apports et les dépenses énergétiques. Il existe des systèmes de régulation de la prise alimentaire qui permettent un équilibre entre les apports énergétiques, les dépenses et le maintien du poids corporel. Une dérégulation de ce système peut conduire à l'obésité et aux maladies métaboliques qui lui sont associées, comme le diabète. Au laboratoire, nous étudions le développement de l'obésité et ses altérations métaboliques. Dans cette nouvelle étude, nous nous proposons d'analyser la réponse des tissus actifs en réponse au jeûne. Le jeûne est connu pour induire des changements significatifs dans l'expression génique des tissus tels que le cerveau, le pancréas, le foie, les muscles et le tissu adipeux, qui jouent un rôle crucial dans la régulation énergétique et métabolique. Notre objectif est de caractériser ces changements au niveau moléculaire pour mieux comprendre les mécanismes par lesquels le jeûne influence la balance énergétique et le métabolisme global. En utilisant des technologies de nouvelle génération, nous chercherons à identifier les gènes dont l'expression est modifiée par le jeûne et à élucider les voies de signalisation impliquées. Les résultats de cette recherche pourraient fournir des informations précieuses pour le développement de stratégies thérapeutiques visant à améliorer la santé métabolique et à prévenir les maladies associées à une dérégulation de l'équilibre énergétique telles que l'obésité et le diabète.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette recherche pourraient fournir des informations précieuses pour améliorer la santé métabolique et prévenir les maladies associées à une dérégulation de l'équilibre énergétique. Bénéfices attendus pour ce projet : nous pourrons identifier de nouvelles cibles potentielles pour des interventions thérapeutiques visant à traiter ou prévenir les maladies métaboliques telles que l'obésité et le diabète.
Procédures
60 animaux seront mis à jeûn durant 24H.
Impact sur les animaux
Un jeûne prolongé de 24H sera nécéssaire avant le prélèvement des tissus des souris. Ce jeûne va entrainer de nombreux effets, notamment metaboliques, sur le systeme digestif, immunitaire, etc, mais ne met en aucun cas en danger les animaux. Un jeûne de 24H pour une souris en bonne santé tel que dans notre cas peut entrainer une baisse de son activité, de sa température corporelle et une légère perte de poids.
Devenir
Après la période de jeûne de 24H qui ne met pas en danger les animaux, les animaux seront euthanasiés et une préparation d'îlots pancréatiques sera faite afin de recueillir les noyaux des cellules, et de les séquencer. Il en sera de même pour les animaux contrôle qui n'auront pas jeûné.
Remplacement
La régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes de régulation ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris. Les modèles in vitro ou d'organismes inférieurs ne permettent pas de reproduire l'intégralité de ces interactions physiologiques complexes. Ainsi, l'utilisation de la souris est essentielle pour obtenir des résultats pertinents et transposables aux mécanismes chez les mammifères, y compris les humains. Nous utiliserons des tissus de souris afin de réaliser des séquençages spécifiques. Cette approche permet d'obtenir des données détaillées sur l'expression génétique à l'échelle cellulaire.
Réduction
Nous utiliserons un total de 60 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Une préparation d'îlots pancréatiques provenant d'une souris permet de recueillir environ 30 000 noyaux. Étant donné que 300 000 noyaux sont nécessaires pour réaliser un point de séquençage, 10 souris seront nécessaires pour chaque point de séquençage. Nous prévoyons de réaliser 6 expériences indépendantes, nécessitant ainsi un total de 60 souris. Cette approche nous permet de maximiser les informations obtenues tout en minimisant le nombre total d'animaux utilisés, en conformité avec les principes de réduction. Nous déterminerons si la distribution des échantillons suit une loi normale. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés pour déterminer le nombre optimal d'animaux à utiliser et pour analyser les données obtenues.
Raffinement
Les cages seront étiquetées pour cette procédure et les animaux seront surveillés par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort, cependant un jeûne de 24H ne met en aucun cas en danger des souris en bonne santé. Les animaux conservent leurs congénères et leurs conditions d'hébergement avec accès à l'eau de boisson et un carré de chanvre est mis à leur disposition permettant la fabrication d'un nid utile pour préserver leur température corporelle, pendant ces 24H.
Choix des espèces
Pour étudier le métabolisme, la souris est le modèle animal de référence. Ce choix est justifié par plusieurs raisons : Similitudes physiologiques et génétiques avec l'humain : La souris partage de nombreuses similitudes physiologiques et génétiques avec l'humain, ce qui permet de transposer plus facilement les résultats obtenus chez la souris aux humains. Cela est particulièrement pertinent pour les études sur le métabolisme et les maladies métaboliques telles que l'obésité et le diabète. Historique de recherche étendu : Il existe une vaste base de données et une longue histoire d'utilisation des souris dans la recherche biomédicale, fournissant un contexte riche et des outils bien développés pour l'analyse des résultats. Les souris sont donc bien caractérisées en termes de biologie et de réponses métaboliques, facilitant les comparaisons et l'interprétation des données. Les souris seront utilisées à l'âge de 10 semaines pour plusieurs raisons importantes: À l'âge de 10 semaines, les souris ont atteint un stade de développement où leur physiologie, y compris leur métabolisme, est généralement stable. Cela permet de minimiser les variations dues à la croissance et au développement, assurant ainsi une plus grande cohérence des résultats expérimentaux. L'utilisation de souris âgées de 10 semaines offre une combinaison optimale de maturité physiologique, de stabilité métabolique, de standardisation des conditions expérimentales et de comparabilité avec la littérature existante, ce qui en fait un choix approprié pour notre étude sur les mécanismes métaboliques en réponse au jeûne.
Evaluation de l’efficacité thérapeutique contre le cancer métastatique chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Rats : 720
Greffés de cellules tumorales sous la peau ou directement dans l'organe visé, 1 800 souris et 720 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 840 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie des animaux est immunodéficiente pour accepter des cellules humaines, et chacun subit des prélèvements sanguins deux fois par semaine sous anesthésie générale pendant toute la durée du protocole. Le projet cherche d'abord la dose maximale tolérée, puis l'efficacité de nouvelles molécules anticancéreuses, à raison de deux campagnes par an pendant cinq ans. Les atteintes attendues tiennent en cinq lignes, perte de poids, croissance tumorale et perturbations comportementales, pour un protocole qui range 840 individus en souffrance sévère.
Objectifs
Le cancer est l'une des principales causes de décès dans le monde et représente un énorme défi pour la santé publique. Cette maladie grave impose un lourd fardeau aux patients et à leurs familles à cause des traitements coûteux et des souffrances qu'elle engendre. Les traitements contre le cancer actuels, comme les chimiothérapies, peuvent avoir de graves effets secondaires. Il est donc crucial de développer de nouveaux traitements qui soient plus efficaces et moins nocifs. Pour cela, il est nécessaire de tester de nouvelles molécules sur des modèles animaux. Notre projet a pour but d’évaluer l’efficacité de ces nouvelles molécules contre le cancer. Nous avons déjà testé ces molécules en laboratoire sur des cellules, mais ces tests ne reproduisent pas entièrement la complexité du corps humain. Nous devons donc confirmer ces résultats sur des animaux. Voici comment nous procédons : Évaluation de la Dose Maximale Tolérée (DMT) : Nous déterminons la plus grande dose de chaque molécule qui peut être administrée sans provoquer de toxicité sévère chez les animaux. Étude Pharmacologique : Nous analysons comment la molécule est absorbée, distribuée, métabolisée et éliminée par l’organisme à la dose maximale tolérée. Essai d’Efficacité : Nous testons la molécule sur des modèles animaux de cancer pour vérifier son efficacité à différentes doses, inférieures à la DMT, en utilisant plusieurs types de tumeurs. Pour ces tests, nous utilisons soit des cellules tumorales provenant de l’espèce animale étudiée, soit des cellules humaines. Les animaux doivent être immunodéficients pour accepter les cellules humaines. Les tumeurs peuvent être implantées sous la peau ou directement dans l'organe cible pour mieux imiter la réalité de la maladie. Les procédures incluent des injections sous-cutanées ou des interventions chirurgicales mineures. Nous avons établi des critères stricts pour arrêter les expériences si les animaux montrent des signes de douleur ou d’inconfort, comme un volume tumoral trop important ou une perte de poids excessive. Ce projet se déroulera deux fois par an pendant cinq ans et nous permettra d’évaluer si ces nouvelles thérapies peuvent offrir une meilleure alternative aux traitements actuels.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples et significatifs pour la lutte contre le cancer. Les nouvelles molécules anti-tumorales que nous évaluons ont déjà montré un potentiel prometteur dans des tests cellulaires. Toutefois, pour déterminer leur véritable efficacité et sécurité, il est crucial de les tester sur des modèles animaux, qui simulent mieux la complexité du cancer humain. 1. Amélioration des Traitements : Ce projet vise à identifier des molécules capables de traiter efficacement les tumeurs tout en minimisant les effets secondaires. En testant ces molécules sur des modèles animaux, nous pouvons déterminer les doses optimales qui tuent les cellules cancéreuses sans nuire gravement aux tissus sains. 2. Réduction des Effets Secondaires : Les traitements actuels contre le cancer sont souvent accompagnés d’effets secondaires sévères. En évaluant la toxicité et l’efficacité des nouvelles molécules, nous cherchons à développer des traitements moins nocifs, offrant ainsi une meilleure qualité de vie aux patients. 3. Avancées Scientifiques : Ce projet contribue à une meilleure compréhension des interactions entre les molécules anti-cancéreuses et les tissus tumoraux. Cela nous permet de concevoir des thérapies plus ciblées et adaptées aux besoins spécifiques des patients. 4. Progression Vers des Essais Cliniques : Les résultats de ces études précliniques guideront les futures recherches cliniques, ouvrant la voie à des traitements innovants et potentiellement plus efficaces contre divers types de cancers.
Procédures
Pour induire le cancer chez l’animal, des cellules tumorales seront injectées sous anesthésie générale. Après cette intervention, les animaux seront surveillés et suivis tout au long de l’étude. Les traitements seront administrés selon un calendrier établi, et des prises de poids seront effectuées quotidiennement. La taille des tumeurs sera vérifiée régulièrement, deux fois par semaine. Des prélèvements sanguins d'une durée de 30 secondes, sous anesthésie générale, seront réalisés deux fois par semaine durant tout le protocole, chaque intervention anesthésique durant environ 3 minutes. À la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés, et des organes tels que les reins, le foie, les poumons, la rate et le cerveau seront prélevés pour une analyse approfondie.
Impact sur les animaux
Une perte de poids peut être observée sur certains animaux. Une apparition de nouvelle tumeur peut être observée ou une croissance tumorale dans les groupes témoins. Une non-efficacité du traitement sur les animaux. Des perturbations comportementales peuvent apparaître. Une surveillance quotidienne sera mise en place et la mesure de la douleur sera effectuée.
Devenir
Les rongeurs seront euthanasiés à la fin de l’étude. La réutilisation ou l'adoption des animaux n’est pas envisageable en raison du risque d’interactions entre les molécules, particulièrement pour ceux ayant subi une procédure sévère.
Remplacement
Les protocoles présentés dans ce projet intègrent des réponses souvent complexes obtenues à partir d'expériences in vivo, menées dans diverses conditions physiologiques. Bien que l'évaluation des réponses de différentes lignées cellulaires puisse parfois être réalisée in vitro, ces modèles restent trop simples et limités pour capturer la complexité des processus biologiques, tels que l'angiogenèse ou l'interaction avec le système immunitaire, qui sont présents dans les modèles in vivo. Par conséquent, le passage de l'in vitro à l'in vivo est indispensable pour obtenir des données supplémentaires et essentielles sur les propriétés des médicaments testés dans des tissus vivants. Les espèces animales utilisées pour les tests, ainsi que le nombre d'échantillons à tester avant un essai clinique sur l'homme, sont strictement déterminés par les normes réglementaires. Ces directives garantissent que les résultats obtenus sont aussi précis et pertinents que possible pour les étapes ultérieures du développement thérapeutique.
Réduction
En accord avec la règle des 3R, des efforts seront mis en œuvre pour déterminer un nombre optimal d'animaux à utiliser pour chaque procédure, en veillant à minimiser leur utilisation sans compromettre la qualité des données obtenues. Ce nombre pourra être ajusté en fonction des résultats obtenus au cours de l’étude, afin de réduire au maximum le recours aux animaux tout en garantissant la pertinence scientifique des données recueillies.
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel d'animalerie et par notre équipe. Ils seront anesthésiés sous anesthésie générale pour chaque procédure et prélèvement. Un système de scoring sera instauré pour attribuer une note journalière aux animaux, permettant d'évaluer leur état de santé (voir annexe). En fonction des résultats, des analgésiques pourront être administrés, ou nous procéderons à l'euthanasie si les points limites sont atteints. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec un accès à la nourriture et à l'eau à volonté. Chaque cage sera équipée d'un enrichissement spécifique à l'espèce, et du diet gel pourra être ajouté si certains animaux éprouvent des difficultés à se nourrir ou à se mouvoir. Les paramètres environnementaux seront suivis quotidiennement pour garantir un hébergement optimal et assurer le bien-être des animaux.
Choix des espèces
L’utilisation des rats et des souris dans ce projet est justifiée par leur pertinence comme modèles en recherche préclinique, en raison de leur représentativité pour certaines pathologies humaines. Le choix entre souris et rats repose sur plusieurs critères essentiels : disponibilité de lignées cellulaires tumorales / capacité de chaque espèce à subir les interventions chirurgicales nécessaires / prélèvements sanguins en volumes adéquats pour analyser les molécules administrées. Les animaux utilisés auront un âge de 5 à 6 semaines, correspondant à un stade adulte où la maturité sexuelle est atteinte. Cela permet de garantir la stabilité des résultats sans risque de perturbations physiologiques dues aux variations hormonales de la puberté.
Étude de la pharmacocinétique de nouveaux composés antidiabétiques
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
7 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une administration du composé et trois prélèvements sanguins. Les prélèvements se font par ponction de la veine caudale et par ponction sous la mandibule, et les composés sont administrés par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse ou par gavage, avec les risques que le porteur énumère lui-même : perforation d'organes internes, œdèmes, hématomes, perforation de l'œsophage, passage du liquide dans les poumons. L'objet reste en amont de tout traitement, il s'agit de mesurer comment cinq variantes d'une protéine antidiabétique se répartissent dans le corps selon la dose et la voie d'administration. Le porteur affirme par ailleurs que trois animaux par condition suffisent, sans que le passage de ce chiffre à 7 560 souris soit détaillé.
Objectifs
Notre recherche porte sur le diabète de type 1 (DT1), une maladie caractérisée par la destruction des cellules du pancréas qui produisent de l'insuline. Cela entraîne des hyperglycémies chroniques pouvant provoquer de graves complications vasculaires. Nous avons identifié une protéine capable de régénérer ces cellules et développé cinq variantes de cette protéine, que nous avons testées sur des souris diabétiques. Nos résultats préliminaires montrent que ces protéines peuvent stimuler la prolifération des cellules productrices d'insuline, ce qui pourrait en faire des traitements prometteurs pour le DT1. Pour développer un médicament antidiabétique, nous souhaitons analyser le comportement de ces nouvelles protéines dans le corps (pharmacocinétique) afin de déterminer la meilleure dose et la meilleure méthode d'administration. Chaque variante de la protéine étant unique, nous devons tester différentes combinaisons de méthodes et de doses pour comprendre leur fonctionnement. Nous testerons donc cinq concentrations différentes avec quatre méthodes d'administration (intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse et orale) sur trois modèles de souris : des souris saines pour garantir des résultats représentatifs des réponses physiologiques normales ; des souris diabétiques pour évaluer l'efficacité des composés dans le contexte du DT1 ; et des souris génétiquement modifiées pour mieux simuler les humains. Notre approche sera séquentielle et hiérarchisée : si l'une des protéines candidates montre de bons résultats avec une méthode et une dose spécifiques, nous pourrons écarter les autres options, réduisant ainsi le nombre de souris nécessaires. Au total, nous prévoyons d'utiliser 7 560 souris pour ce projet, tout en respectant strictement les principes des 3R : Remplacement (l'étude du diabète nécessite l'utilisation d'animaux, car cette maladie ne peut pas être entièrement reproduite en laboratoire), Réduction (nous utiliserons le minimum d'animaux nécessaires et ajusterons les expériences selon les résultats), et Raffinement (une grille de score évaluera la souffrance et le stress des animaux, avec des seuils adaptés).
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude seront essentiels pour déterminer la dose et la voie d’administration qui assurent la meilleure exposition du composé antidiabétique dans les tissus et le sang. Ces données guideront les conditions expérimentales des futures études sur l'efficacité à long terme et la pharmacodynamique du composé candidat. En combinant ces études complémentaires, nous maximiserons les chances de succès dans le développement thérapeutique pour le diabète de type 1 (DT1).
Procédures
Trois prélèvements sanguins seront effectués sur chaque animal, selon les modalités suivantes : deux prélèvements seront réalisés par ponction de la veine caudale (l'un au début de la procédure et l'autre à la fin; durée de l'intervention : 30 secondes) ; et un prélèvement sera effectué par ponction submandibulaire (soit à 0 min, avant administration du composé, soit à 30 min, 60 min, 120 min, 24 h, ou 48 h après l’administration ; durée de l'intervention : 1 minute). Une injection ou une administration du composé sera effectuée sur chaque animal (durée pour les injections intrapéritonéales, sous-cutanées, intraveineuses et orales : entre 30 secondes et 1 minute).
Impact sur les animaux
Une partie des souris utilisées dans cette étude constitue un modèle classique pour l'étude du diabète de type 1 (DT1), présentant généralement une hyperglycémie modérée. Le prélèvement submandibulaire, réalisé en prélevant du sang sous la mandibule avec une aiguille ou une lancette, peut provoquer du stress et un inconfort local. Il y a également un risque de formation d'œdème autour du site de ponction et d'infection si les conditions d'asepsie ne sont pas rigoureusement respectées. La ponction de la veine caudale, qui implique l'extraction de sang de la veine située dans la queue, peut entraîner une douleur ou un inconfort, avec un risque d'infection si le site n'est pas correctement aseptisé. L'administration par voie orale (ou gavage) peut causer du stress et de l'inconfort, avec des risques de perforation ou de blessure de l'œsophage, ainsi que d'aspiration du liquide dans les poumons, entraînant des difficultés respiratoires si la sonde n'est pas correctement insérée. Les injections intrapéritonéales (IP), sous-cutanées (SC) et intraveineuses (IV) peuvent entraîner des risques d'inconfort et de douleur au site d'injection. Pour les injections IP, il existe également un risque de perforation des organes internes. Concernant les injections SC, les risques incluent la formation d'œdèmes ou d'hématomes si l'injection est trop rapide. Pour les injections IV, les risques comprennent des saignements et des dommages veineux. Dans tous les cas, des infections peuvent survenir au site d'injection si les conditions d'asepsie ne sont pas strictement respectées.
Devenir
À la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre des analyses post-mortem.
Remplacement
Dans notre étude, les composés développés présentent des caractéristiques pharmacocinétiques uniques qui ne peuvent être correctement évaluées que dans des systèmes biologiques complexes, comme ceux des souris. L'étude in vivo est indispensable pour déterminer avec précision comment ces molécules sont absorbées, distribuées, métabolisées et éliminées dans l'organisme, car ces processus ne peuvent pas être simulés de manière fiable par des méthodes in vitro ou par modélisation informatique.
Réduction
Nous utiliserons un nombre minimal d'animaux pour nos expériences. Des tests statistiques sur des échantillons préliminaires ont montré que trois animaux par condition suffisent pour obtenir des résultats exploitables sans nécessiter de répétition supplémentaire. Certaines souris peuvent ne pas développer d’hyperglycémie, mais elles ne seront pas écartées, car elles présentent une infiltration lymphocytaire significative, un indicateur préclinique important du diabète de type 1 (DT1). Ainsi, notre étude inclura les souris diabétiques et prédiabétiques pour obtenir des données complètes et fiables sur la pharmacocinétique de nos composés. Enfin, pour réduire le nombre d’animaux utilisés, nous adopterons une approche séquentielle et hiérarchisée. Si un composé montre un profil d’exposition optimal avec une voie d’administration spécifique et une concentration donnée, les autres conditions expérimentales pourront être écartées. Nous ajusterons les expériences en fonction des résultats obtenus, conformément aux principes de réduction des 3R.
Raffinement
La glycémie sera mesurée par prélèvement d'une goutte de sang de la veine caudale. Avant l'incision, une crème analgésique contenant de la lidocaïne sera appliquée sur le bout de la queue pour une anesthésie locale. La ponction sera effectuée rapidement et avec précision pour minimiser le stress, et une légère pression sera appliquée pour arrêter le saignement et prévenir les hématomes. Le prélèvement submandibulaire sera réalisé par un opérateur expérimenté pour garantir rapidité et précision, réduisant ainsi l'inconfort. Des lancettes ou aiguilles stériles seront utilisées pour minimiser le risque d'infection ou d'œdème. Après le prélèvement, une légère pression sera appliquée pour arrêter le saignement. Pour les injections intrapéritonéales (IP), sous-cutanées (SC) et intraveineuses (IV), une désinfection locale sera effectuée avant et après chaque injection pour réduire le risque d'infection. Des aiguilles de petit calibre seront utilisées pour diminuer la douleur et les traumatismes tissulaires. Avant une injection IV, la queue de la souris sera réchauffée dans de l’eau tiède pour dilater les vaisseaux sanguins, facilitant l'injection et réduisant les tentatives. Les volumes administrés seront limités afin d'éviter tout inconfort. Pour l'administration orale (ou gavage), des sondes d’alimentation appropriées seront utilisées pour minimiser le risque de perforation de l’œsophage ou de blessures internes. Les animaux seront surveillés pour tout signe de détresse ou difficulté respiratoire. Tous les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi et en groupes sociaux, dans des portoirs ventilés. Ils auront accès à de l'eau stérilisée et des aliments irradiés pour minimiser les risques de contamination. Durant toute la procédure, les animaux seront surveillés à l’aide d'une grille de score pour évaluer et objectiver les éventuelles souffrances, avec des points limites précoces et des mesures correctives adaptées.
Choix des espèces
Une partie des souris utilisées dans cette étude constitue un modèle classique pour l’étude du diabète de type 1 (DT1), car elles développent spontanément la maladie par des mécanismes similaires à ceux observés chez l'humain. Leur phénotype et les étapes de progression du DT1 sont bien documentés, ce qui permet de mener des études précises et reproductibles. Dans notre recherche, ces souris sont essentielles pour évaluer l’efficacité de nos composés dans le contexte du DT1. Une autre partie des souris de cette étude est dite "humanisée" ; elles ont été modifiées génétiquement pour exprimer un gène humain, ce qui permet de mieux prédire les réponses humaines aux composés étudiés. Des souris non modifiées seront également utilisées afin d’obtenir des données fiables sur le comportement des composés dans un contexte physiologique normal. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 20 semaines pour examiner comment les différents composés se comportent dans le corps. Cet âge correspond à la période adulte, où leur métabolisme est stabilisé, garantissant ainsi des réactions plus prévisibles aux traitements. À ce stade, les souris ont un métabolisme bien développé, ce qui nous permettra d’obtenir des résultats plus fiables et applicables, tout en réduisant les variations liées à la croissance ou au sevrage.
Transmission du virus de l’encéphalite à tiques par le lait (voie alimentaire)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Des souriceaux sont allaités par des mères infectées par le virus de l'encéphalite à tiques, d'autres reçoivent le virus par gavage ou à la pipette dans la bouche. 2 398 souris vont être utilisées, dont 720 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec perte de poids, apathie et paralysie possibles, les mères allaitantes étant ponctionnées de leur lait sous anesthésie sans réveil. Le porteur annonce des points limites précoces, puis admet que chez les souriceaux ces points limites, moins visibles ou d'apparition brutale, ne préviendront ni les signes majeurs de souffrance ni la mortalité. Toutes sont tuées à l'issue de chaque procédure, le porteur indiquant qu'ayant été infectées en confinement de niveau 3 elles ne peuvent ni sortir de l'animalerie ni être réutilisées.
Objectifs
Les 4 objectifs de cette étude visent à mieux comprendre les mécanismes de cette voie de transmission (consommation de produits au lait cru ou allaitement), et à déterminer quels facteurs physiologiques et génétiques peuvent influer sur l’efficacité de transmission. Ces objectifs sont les suivants : (1) Etudier la dissémination du virus dans les glandes mammaires de souris non lactantes, quantifier la production virale dans cet organe et déterminer le tropisme cellulaire associé. Cette première étape, sur souris non lactantes (donc en l’absence de souriceaux) sera nécessaire à la mise au point du protocole optimal des procédures suivantes (choix des lignées de souris, des temps d’infection, des doses virales infectieuses), afin de réduire de manière raisonnée, au final, le nombre d’animaux utilisés. (2) Etudier la dissémination du virus dans les glandes mammaires de souris lactantes et quantifier la charge virale infectieuse dans le lait maternel, ainsi que son infectiosité et sa persistance dans l’estomac des souriceaux allaités par ces souris. (3) Mesurer l’efficacité de transmission par allaitement dans le modèle souris. (4) Evaluer l’impact du lait de chèvre, de vache ou humain (ou de certains de leurs composants) sur l’infectiosité et la transmission du virus par voie orale (alimentaire ou par allaitement).
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux caractériser les voies de transmission qui sont encore largement sous-étudiées mais qui pourraient avoir un impact majeur sur la santé humaine et vétérinaire dans le contexte des maladies virales émergentes actuelles et futures
Procédures
Une partie des souris seront infectées par une injection sous-cutanée une fois pour une durée de quelques secondes. Certaines souris seront infectées par administration orale dans la bouche à l’aide d’une pipette ou par gavage avec une sonde souple une fois pour une durée de quelques secondes. Des prises de sang seront réalisées, au maximum 3 prélèvements sur 8 jours consécutifs. Chaque prise de sang durera environ 30 secondes. Certaines souris feront l’objet d’une injection intrapéritonéale une fois pour une durée de quelques secondes puis de prélèvement de lait maternel, sous anesthésie générale sans réveil, une fois pour une durée de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les injections (par voie sous-cutanée ou par gavage à l’aide d’une sonde souple) et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention et une introduction d’une aiguille (ou d’une sonde souple pour le gavage) selon les bonnes pratiques vétérinaires. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée. Par conséquent, l’impact principal de nos procédures proviendra de l’infection virale elle-même (même virus dans toutes les procédures). Dans certains cas (selon la souche virale, la lignée de souris, la dose infectieuse, la voie d’injection), l'infection aura un impact très modéré sur l'état de santé des souris, avec une perte de poids inférieure à 5% et transitoire (quelques jours). Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante, une apathie et des troubles neurologiques tels qu’une paralysie. Des points limites adaptés seront utilisés pour pouvoir mesurer précocement la pathogénicité liée à l’infection tout en limitant au maximum la souffrance des animaux et sans attendre la mort de l’animal. Dans le cas particulier de l’infection de souriceaux (et non de souris adultes), , il est possible, d’après notre expérience préalable avec d’autres virus de la même famille) que l’utilisation de points limites (moins visibles ou apparaissant plus brutalement) ne permettent pas de prévenir l’apparition de signes majeurs de souffrance ou de la mortalité chez tous les souriceaux, d’où une gravité potentiellement plus sévère des expériences chez quelques souriceaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ces animaux auront été infectés et manipulés en zone de sécurité biologique de niveau 3.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans une vaste collaboration de recherche visant à mieux comprendre et mesurer les risques en santé humaine et vétérinaire liés à la transmission du s de la méningoencéphalite à tiques par le lait. Des expériences in vitro, utilisant des organoïdes et cultures de cellules primaires, seront réalisées en parallèle de ce projet pour caractériser le tropisme cellulaire de l’infection et les mécanismes de franchissement de barrières de l’hôte (animal ou homme) au niveau mammaire (franchissement qui conduit à l’excrétion de virus dans le lait) et au niveau digestif (franchissement qui conduit à l’infection d’un nouvel hôte). Cependant, aucune expérience in vitro ne peut permettre de répondre aux 4 objectifs de ce projet (étude de la dissémination du virus dans les glandes mammaires des individus infectés, de la charge virale, l’infectiosité et la persistance du virus dans le lait et l’estomac, l’efficacité de transmission par allaitement et l’impact du lait sur la transmission par voie orale) nécessitant l’utilisation d’un modèle animal.
Réduction
L'évaluation de la dissémination virale dans une lignée de souris ne devrait pas nécessiter plus de 5 souris d'après notre expérience avec des virus de la même famille. Ces éléments nous ont permis de calculer les effectifs pour chaque procédure en conciliant réduction du nombre d'animaux et puissance statistique pour conclure. Certaines expériences feront l'objet de réplication mais uniquement lorsque ce sera nécessaire pour atteindre les résultats significatifs et conforter la validité des conclusions. Ceci est mentionné et justifié dans chaque procédure. Le calcul du nombre d'animaux nécessaire dans chaque procédure dépendra de la nature des variables et de la question posée. La conception de chaque expérience repose sur une analyse statistique préalable pour optimiser la nature et l'effectif de chaque groupe, et éviter les biais expérimentaux. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques appropriés. Aussi souvent que nécessaire, il sera fait appel à des experts en biostatistique. Nous déterminerons tout d’abord le temps d’infection, la dose infectieuse, les deux lignées de souris et les deux souches virales les plus pertinentes pour notre étude, qui seront ensuite utilisés pour la suite du projet. De plus, si aucune différence significative entre lignées de souris et/ou souches virales n’est mesurée, une seule souche virale et/ou une seule lignée de souris seront utilisées pour certaines procédures.
Raffinement
Deux formes de raffinement seront utilisées dans toutes les cages contenant des souris lactantes et leurs portées : des igloos ainsi que du coton afin notamment que les mères puissent construire des nids pour leurs portées de souriceaux. Les mères ne seront jamais isolées dans les cages, avec présence d’une autre souris femelle adulte dans la cage (mère ou pas), ce qui selon notre expérience réduit considérablement leur stress et le risque que la(les) mère(s) mange(nt) ses(leurs) souriceaux. Tous les gestes techniques effectués sur les mères allaitantes et leurs portées ont été discutés avec la structure du bien-être animal et adaptés spécifiquement afin de garantir un maximum de bien-être pour tous les animaux durant toutes les expériences. Les expérimentateurs changeront également de gants entre les manipulations de chaque portée pour ne pas perturber la reconnaissance (par l’odorat) des souriceaux par leur mère. Concernant les expériences sur des souris uniquement adultes, toutes les règles normales d’élevage et d’enrichissement seront respectées, en évitant totalement la présence d’animaux isolés. Seuls des gestes techniques approuvés seront utilisés. Dans certains cas, l'infection se traduira par un impact très modéré sur l'état de santé des souris. Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante dont l’ampleur sera à déterminer, une apathie et des troubles neurologiques tels qu’une paralysie. Les animaux infectés seront surveillés quotidiennement pendant la période symptomatologique (précisée dans chaque procédure) avec plusieurs points limites : i) score clinique sur la base de 5 critères, ii) suivi de poids. Un gel nutritif sera placé dans les cages des animaux présentant un affaiblissement ou une parésie/paralysie pouvant laisser craindre qu'ils peinent à atteindre la mangeoire. Des points limites (précisés dans chaque procédure) spécifiques et précoces seront utilisés afin de minimiser la souffrance.
Choix des espèces
Les rongeurs constituent le réservoir naturel du virus étudié, le modèle souris est donc un modèle d’infection pertinent. D’un point de vue pratique et éthique, il est nécessaire de commencer cette étude sur modèle petit animal (la souris est un bon choix car les rongeurs sont le réservoir naturel du virus), avant de valider (dans un autre projet à venir, qui sera réalisé par des collaborateurs) les résultats les plus probants sur un gros animal (chèvre, vache…) plus pertinent concernant le risque de transmission à l’homme par l’intermédiaire de produits laitiers. La dangerosité du virus impose d'héberger les animaux en isolateurs, ce qui est facilement réalisable aves l’espèce souris et beaucoup plus difficile dans d'autres espèces. Les animaux utilisés dans les procédures seront : - Des souris adultes et des souriceaux. - Le choix des âges utilisés est lié à la nature du projet, qui est d’étudier la présence de virus infectieux dans les glandes mammaires et le lait, et la transmission soit par allaitement (donc aux souriceaux), soit la transmission par voie orale quel que soit l’âge (alimentaire : donc à la fois à des souriceaux et des souris adultes, afin de déterminer une éventuelle différence de sensibilité à l’infection)
Rôle de Jam A dans la production des plaquettes sanguines
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Trois heures d'anesthésie et une chirurgie du crâne sans réveil pour 100 d'entre elles : 466 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 318 subissent des cycles répétés d'anesthésie gazeuse, des injections et des contrôles de numération à la queue avant un prélèvement terminal de sang à l'aorte, et 18 un temps de saignement mesuré à la queue pendant quinze à trente minutes. L'objet est de comprendre comment se forme le réseau de membranes internes qui donne naissance aux plaquettes sanguines, le porteur indiquant que ce réseau reste sous-développé en culture cellulaire, ce qui l'amène au modèle animal. Sur les 466 souris, 448 sont tuées parce que les expériences sont terminales et 18 sont réutilisées pour un prélèvement d'organes.
Objectifs
Les plaquettes sanguines sont produites par les mégacaryocytes (MKs) dans la moelle osseuse et sont vitales pour l'arrêt des saignements. Les MKs possèdent la caractéristique unique de contenir un réseau complexe de membranes internes (DMS). Ce réseau joue un rôle essentiel dans la production journalière de plaquette puisqu’il forme les futures plaquettes. Ainsi, la production par chaque MK d’environ 2000 plaquettes nécessite une production abondante et régulée de ce réseau membranaire. Un développement anormal est associé à une diminution du nombre de plaquettes circulantes dans certaines maladies héréditaires hémorragiques. A ce jour, les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement des membranes internes sont encore largement méconnus. De façon remarquable, nous avons récemment observé la présence de jonctions serrées au niveau de ces membranes internes. Nous avons précédemment montré la présence d'une protéine particulière à ce niveau. Notre hypothèse est que cette protéine est un acteur clé du développement normal de ces membranes, en relation avec les protéines présentes autour des MKs dans la moelle elle jouerait un rôle clé dans la libération des plaquettes vers la circulation sanguine. Nous savons que ce réseau de membranes est sous-développé dans les MK en culture. C'est la raison pour laquelle le modèle animal est choisi dans le but de reproduire, le plus fidèlement possible, l'environnement de la moelle osseuse. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées n’exprimant plus cette protéine d'intérêt spécifiquement dans la lignée MK, qui sont disponibles au laboratoire, et ne présentent pas de phénotype dommageable.
Bénéfices attendus
Les retombées de ce projet sont cognitives et cliniques. Sur le plan fondamental, il vise à comprendre la biogénèse du réseau de membranes internes du MK (DMS), une étape clé et indispensable de la formation des futures plaquettes sanguines. Sur le plan clinique, une meilleure compréhension de la formation des plaquettes permettra de mieux comprendre la régulation du nombre de plaquettes produites par MK, et à plus long terme, de contribuer à faire avancer les traitements chez les patients thrombopéniques.
Procédures
Les animaux seront soumis à 4 différents types d'interventions : 1- Anesthésie générale par voie injectable et prélèvement terminal à l'aorte : 30 souris. 2- Anesthésie gazeuse de 5 minutes au masque pour injection des traitements pharmaceutiques et suivi de la numération à la queue, puis anesthésie générale par voie injectable pour le prélèvement terminal de sang à l'aorte : 318 souris. 3- Anesthésie générale longue de 3h au maximum, par voie injectable, et chirurgie du crane pour 100 souris, la chirurgie est sans réveil. 4-Anesthésie gazeuse de 15 à 30 minutes pour la réalisation d'un temps de saignement à la queue : 18 souris. Total : 466 souris
Impact sur les animaux
Les injections et prélèvements de sang répétés présentent un risque modéré de douleurs à la queue et de saignements légers : nuisances légère. Les protocoles liés aux traitements pharmaceutiques ont déjà bien été établis au laboratoire et les souris ne présentent pas de signes manifestes de gêne, de détresse ou de perte de poids : nuisance légère . En raison de la répétition des cycles d'anesthésie gazeuse et de réveil, nous anticipons un stress supplémentaire des animaux : nuisance modérée. En ce qui concerne les expériences par microscopie intravitale, nous anticipons un risque d'hypothermie, un dessèchement oculaire et un risque de douleur liée à la durée de l'anesthésie de longue durée : nuisance modérée.
Devenir
Lors de ce projet, sur les 466 animaux : 448 seront mis à mort puisque les expériences auquelles ils sont soumis sont terminales, et 18 animaux seront réutilisés (prélèvement d'organes).
Remplacement
Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique in vivo dans sa totalité, à l’état homéostatique, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la compléxité du vivant et en particulier la circulation sanguine. Nous avons par ailleurs remarqué que la morphologie, en particulier notre sujet d'étude, le DMS, diffèrent fortement dans des MKs en culture par rapport à ceux observés in vivo
Réduction
A la fin des expériences les animaux seront mis à mort et les moelles osseuses récupérées, fixées et stockées pour des observations ultrastructurales ultérieures, limitant ainsi le nombre de souris. Le nombre de souris est réduit au minimum mais déterminé afin d’obtenir des résultats statistiques solides dans les différents génotypes et traitements. Enfin, le maximum de prélèvements seront réalisés sur une même souris (sang, fémurs, tibia).
Raffinement
Les expériences seront raffinées afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés aux procédures expérimentales. : - Pendant l’hébergement, les animaux sont élevés en groupe dans un environnement calme, enrichi et non stressant et privilégié avec un minimum de manipulation. Les expériences intravitales et les prélèvements à l'aorte ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées. - Les prélèvements de sang à la queue seront réalisés sous anesthésie gazeuse, nous appliquerons un tampon hémostatique pour arrêter le saignement avant de replacer l'animal dans sa cage. A la fin de l’expérimentation, les animaux sont mis à mort avant leur réveil. Une fiche de suivi avec les points limites définis sera mise en place afin de pouvoir contrôler l’état des animaux tout au long du protocole expérimental. Une attention particulière est apportée à l’animal et une décision est prise : augmentation de l’enrichissement, soins, euthanasie. Concrètement, lors de la surveillance quotidienne des animaux, nous observerons attentivement l’aspect des souris pour s’assurer de l’absence de signes extérieurs d’infection tels que des lésions cutanées ou des écoulements nasaux ou oculaires. Une attention particulière sera apportée au niveau des sites d’injection des substances pour s’assurer qu’il n’y a pas d’infections.
Choix des espèces
La souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine en particulier pour la production de plaquettes. La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptés à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. Les souris seront utilisées sans distinction à un stade de développement adulte de 8 à 35 semaines.
Entrainement et optimisation des techniques utilisées en expérimentation animale.
- Formation professionnelle
Rats : 320
Entretenir la dextérité du personnel d'une unité qui vend des modèles animaux à ses clients : 1 320 souris et 320 rats vont être utilisés pour cela, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, ou menées sous anesthésie sans réveil pour la chirurgie. Chaque souris reçoit jusqu'à quatre administrations de sérum physiologique ou deux prélèvements de sang, le plus souvent sur animal vigile, et celles qui servent à l'entraînement chirurgical subissent une induction de cancer orthotopique de quinze minutes avant d'être tuées sans réveil. Une partie vient des surplus d'élevage déjà destinés à être tués, une autre d'une lignée immunodéficiente que le porteur décrit comme à phénotype dommageable. Il écrit que l'apprentissage de ces gestes bien exécutés contribue au bien-être animal et réduit la douleur lors des études commandées par ses clients.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le contexte d’une unité d’appui à la recherche en expérimentation animale qui propose un certain nombre de modèles animaux (dont modèle de cancer par induction orthotopique) à ses clients. Les actes mis en œuvre chez l’animal nécessitent que le personnel soit toujours opérationnel. Ce projet vise donc à utiliser des animaux pour l’apprentissage, le maintien ou l’amélioration des compétences de notre établissement utilisateur.
Bénéfices attendus
L’apprentissage de ces gestes bien exécutés a pour objet de contribuer au bien-être animal et de permettre de réduire la douleur lors de leur exécution dans les études de nos clients faisant appel à notre établissement et ainsi obtenir des résultats fiables et reproductibles.
Procédures
Les souris servant à l'entrainement des administrations et prélèvements auront au maximum 4 administrations de sérum physiologiques ou 2 prélèvements de sang (durée 1 minute maximum) avec un délai d'1 semaine entre chaque acte sur une durée d'1 mois maximum. Ces administrations et prélèvements se feront sur souris vigiles exceptées le dépot pulmonaire, la nébulisation endotrachéale et le prélèvement au sinus rétro orbitaire qui se feront sur souris anesthésiées. Les rats servant à l'entrainement des administrations auront au maximum 4 administrations de sérum physiologiques (durée 1 minute maximum) avec un délai d'une semaine sur une durée d'1 mois maximum. Ces administrations se feront sur rats vigiles exceptées la nébulisation endotrachéale et l'injection intrapénien qui se feront sur rats anesthésiés. Les souris servant à l'entrainement de la chirurgie pour l'induction des modèles de cancer orthotopiques auront 1 seul acte de chirurgie (durée 15 minutes maximum) sous anesthésie et antalgiques et sans réveil, elles seront mises à mort à la fin de l'acte.
Impact sur les animaux
Les dommages attendus sont limités à un petit hématome après une injection IP, SC, IM ou un prélèvement lorsque ce dernier est « raté ». Lorsqu’une intraveineuse est manquée, un léger gonflement apparait autours du point d’injection due à l’injection de liquide qui disparait dans les 5 minutes. Les animaux utilisés pour la chirurgie seront mis à mort à la fin de la séance sans réveil de ces derniers aussi si une hémorragie se produit ou si ue détresse respiratoire importante apparait, l'animal sera mis à mort sans attente.
Devenir
Les animaux ayant servi pour des entrainements ne peuvent être réutilisés pour des études clients.
Remplacement
L’entrainement et l’optimisation des techniques utilisées en expérimentation animale nécessite l’utilisation d’animaux. Dans le cadre du respect de la règle des 3R, le remplacement de l’animal n’est pas possible lors de ces séances.
Réduction
Pour ce projet nous utiliserons des animaux de nos élevages en surplus devant être mise à mort (d’où le nombre important de lignées pouvant être utilisé). Nous utiliserons également des souris de notre élevage BalB/c Nude qui sont immunodéficientes et qui sont très utilisées dans le service d'imagerie in vivo pour la création de souris modèle orthotopique de cancer humain obtenu par chirurgie principalement. Ces dernières sont à phénotype dommageable et seront hébergées en portoir ventilé. Pour limiter le nombre d’animaux (Réduire) mis en œuvre, nous utiliserons au maximum 6 souris et 4 rats pour les différents modes d’administration et prélèvement par opérateur et 6 souris par opérateur pour des entrainements d’actes chirurgicaux. Nous comptons former annuellement 8 opérateurs et effectuer 4 séances d’entrainement administrations/prélèvements par opérateur sur la souris et 8 opérateurs et 2 séances d’entrainement administrations /prélèvements par opérateur sur le rat au maximum. Pour la chirurgie, pour le maintiens des compétences, 2 opérateurs feront 6 séances d'entrainements d'actes chirurgicaux par an sur la souris.
Raffinement
L’apprentissage de ces gestes bien exécutés a pour objet de contribuer au bien-être animal et de permettre de réduire la douleur lors de leur exécution et ainsi obtenir des résultats fiables et reproductibles pour les études de nos clients faisant appel à notre établissement. Les souris immunodéficientes seront hébergées en portoir ventilé, ce qui empêchera l’expression du phénotype dommageable des souris immunodéficientes. Ces souris de part leur aspect et leur taille sont nécessaires dans l'entrainement des protocoles de chirurgies et des protocoles d'administration et de prélèvement afin d'être dans les mêmes conditions que dans les études clients. Les souris seront hébergées par 2 à 6 maximum et les rats par 2. Les cages seront enrichies avec du matériel pour la fabrication d’un nid, de quoi ronger et jouer avec leurs congénères. Ils auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum. Durant les actes de chirurgie qui se dérouleront sous anesthésie gazeuse, la douleur sera prise en charge par l’administration d’antalgiques et une anesthésie locale avant le début de l’intervention. A la fin de la chirurgie, sans réveil, les animaux seront mis à mort. Les animaux qui auront eu un prélèvement sanguin ou qui auront reçu une administration seront observés durant 24h et des grilles de scoring avec des points limites prédictifs (détérioration de l'aspect général ou de la locomotion) nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin de limiter toute souffrance.
Choix des espèces
La souris et le rat sont des espèces animales classiquement utilisées en recherche (en France en 2022, 66% de souris et 8% de rat). Ces 2 espèces sont élevées et utilisées dans les différents secteurs de l'établissement utilisateur. Les souris seront utilisées de 5 à 20 semaines et les rats seront âgés de 6 à 10 semaines de manière à reproduire les mêmes conditions que dans nos études clients.
Evaluation de l’efficacité antitumorale d’agents modulant la régénération osseuse dans l’ostéosarcome chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Greffées de cellules d'ostéosarcome sous la peau ou dans la patte, mesurées au pied à coulisse jusqu'à sept fois par semaine pendant trente-cinq jours et scannées quatre fois, 236 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Toutes sont tuées pour récupérer tumeurs et poumons, analyses que le porteur qualifie d'"indispensables" pour apprécier l'effet des composés. La tumeur peut provoquer une boiterie et une ulcération de la patte, et les métastases une gêne respiratoire, ce que le porteur prévoit de compenser en humidifiant la nourriture au fond de la cage. Il écrit que toutes les précautions seront prises pour stresser au minimum l'animal, dans un protocole qui prévoit jusqu'à sept manipulations par semaine sur des souris portant une tumeur osseuse à la patte.
Objectifs
Dans les cancers pédiatriques, l’ostéosarcome (OS) est un cancer rare qui touche 3.4 cas par million d’habitants/an. Ces tumeurs d’origine osseuse se développent dans diverses localisations comme au niveau des os longs (tibia, fémur), épaule ou encore au niveau de la mâchoire. La survie à 5 ans des patients est d’environ 75% alors qu’elle est inférieure à 27% chez les patients dont la maladie s’est propagée à d’autres parties du corps (métastases). Malgré les avancées de la médecine personnalisée, il n’y a eu que de faibles progrès dans le traitement de cette maladie. De nouvelles molécules ciblant le remodelage osseux ont été identifiées. Il faut donc démontrer que ces molécules possèdent des caractéristiques de candidats médicaments antitumoraux et anti-métastatiques. Ceci permettrait d’améliorer la prise en charge médicale de l’ostéosarcome chez l’enfant, les adolescents et jeunes adultes. L’objectif de ce projet est de confirmer chez la souris l’efficacité antitumorale de ces molécules c’est-à-dire que le traitement induit une diminution du volume de ces tumeurs primaires et de l’étendue des métastases.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules candidats médicaments dans le traitement d’un type de cancers pédiatriques (ostéosarcome) en vue d’un transfert technologique vers la clinique.
Procédures
Analgésique pré implantation : 1x lors de la greffe en sous cutané (Durée geste : 1min). Anesthésie : 1x au moment de la greffe au niveau de la patte (Durée geste : 5 min maxi). Évaluation de l’efficacité des composés : l'imagerie scanner (Durée geste : 8 min maxi par point d’acquisition 1x/semaine, 4x maximum. Traitement : 2 jours/7jours (un traitement 2min/souris) pendant 5 semaines maximum et mesure au pied à coulisse des tumeurs (maximum 7x/semaine, 2min/souris) pendant 35 jours maximum.
Impact sur les animaux
La réalisation de multiples contentions et manipulations (traitement, mesures, pesée) peut engendrer un stress chez l’animal. L’injection des cellules et des traitements peut provoquer une infection des points d’injection. Lors du développement tumoral (lyse osseuse) la tumeur peut entrainer une boiterie de l’animal mais aussi une ulcération de la patte. En cas d'apparition de métastases, une gêne respiratoire peut survenir (fréquence respiratoire irrégulière ou accélérée).
Devenir
La mise à mort de tous les animaux est nécessaire pour la récupération et l’analyse de tumeurs et poumons. Ces analyses sont indispensables pour apprécier l’effet antitumoral des composés
Remplacement
Pour le remplacement, les traitements à évaluer ont déjà démontré des résultats prometteurs sur des cellules en culture. Les modèles tumoraux chez la souris nous permettent de valider l’effet thérapeutique de nos traitements à l’échelle d’un organisme, ainsi que d’évaluer leur potentiel effet toxique avant d’envisager un essai clinique.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des études précédentes ont permis de sélectionner les composés d'intérêts. De plus, pour chaque modèle tumoral, la progression de la tumeur sera suivie par imagerie Scanner. Cette approche non invasive et quantitative nous permet de suivre la progression de la maladie. D’après les données de la littérature, on estime que le taux de prise de greffe sera de 90%. Cette donnée a été prise en compte afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux permettant de s’assurer de la reproductibilité et de réaliser une analyse statistique des résultats. De plus, les procédures prévues dans ce projet sont séquentielles, ce qui permettra de réduire au maximum le nombre de souris impliquées dans le projet. Les animaux n’ayant pas développé de tumeurs seront traités comme le reste des animaux, les organes seront également prélevés pour servir de tissus contrôles sains.
Raffinement
Au cours de ce projet, les précautions seront prises pour stresser au minimum l’animal. Dès leur arrivée, les souris seront hébergées par groupes de 5 souris par cage. Une période d’acclimatation de 7 jours sera respectée. L'administration d'analgésique/anesthésique, un suivi adapté des animaux et la définition précise des points limites précoces et prédictifs d'un mal être, permettent de limiter au maximum la souffrance animale. Post greffe au niveau de la patte, de la nourriture humidifiée sera ajoutée au fond de la cage au cas où les animaux présenteraient des difficultés à se déplacer. De plus, post-mortem différents organes seront prélevés pour des analyses complémentaires.
Choix des espèces
L'utilisation de souris dans les modèles d’ostéosarcomes, est justifiée par l'absence de modèles équivalents chez les petits rongeurs tels que les rats. Passer directement aux chiens impliquerait l'étude de cancers spontanés, ce qui relève davantage des essais cliniques. Les souris, en revanche, permettent de créer des modèles d’ostéosarcomes contrôlés et reproductibles, offrant ainsi un cadre expérimental plus rigoureux pour tester l'efficacité des traitements avant de passer à des essais cliniques. Les souris sont greffées à l’âge de 5 semaines, âge approprié pour reproduire le caractère peri-adolescent de l’ostéosarcome chez l’homme.
Rôle du Métabolisme dans le Couplage Neuro-vasculaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Modifiées pour que leurs neurones s'activent sous l'effet de la lumière, des souris transgéniques sont utilisées pour étudier le couplage entre activité des neurones et débit sanguin cérébral. 315 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. 120 subissent une chirurgie d'une heure sous anesthésie profonde, dont la pose d'implants chroniques, et 300 passent une à deux heures trente en imagerie, chaque animal étant utilisé plusieurs fois pour multiplier les mesures. Le porteur annonce à long terme des cibles diagnostiques et thérapeutiques, et la promotion d'un mode de vie adapté comme l'exercice physique, quand les chirurgies et les anesthésies répétées, elles, sont au protocole.
Objectifs
Lors d’une activation cérébrale, l’activité des neurones , le débit sanguin et le métabolisme local sont étroitement couplés. On parle de couplage neuro-vasculaire et de couplage neuro-métabolique. Ces couplages sont essentiels au fonctionnement du cerveau. Ils assurent une concentration adéquate de glucose dans le cerveau et conduisent à une montée transitoire du lactate. Cependant, en excès, le lactate peut devenir délétère. Il est d’ailleurs impliqué dans certains troubles neurologiques. Dans cette étude, nous testons l’hypothèse selon laquelle le lactate, produit par les neurones lors de l’activité neuronale, pourrait initialement favoriser la vasodilatation nécessaire à l’activite, mais en concentration excessive, pourrait induire une hyperactivité pathologique des neurones. Avec nos expériences, nous mettrons en évidence le mécanisme qui régule le flux sanguin après une forte activité neuronale pour éviter un excès de lactate et empecher l'hyperactivité des neurones. Le projet vise donc à déterminer comment le lactate sanguin et/ou le lactate produit localement modulent l'activité neuronale et le couplage neuro-vasculaire, grâce à des approches in vivo combinant l'imagerie par IRM avec des manipulations optogénétiques et pharmacologiques. Ce projet permettra de mieux comprendre la coordination entre activité neuronale, débit sanguin, et métabolisme chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les couplages entre activité neuronale, débit sanguin, et métabolisme. De plus, ces couplages étant la base physiologique de l’IRM fonctionnelle, ce projet contribuera aussi à une meilleure interprétation des signaux d'imagerie cérébrale. A long terme, ce projet pourrait également permettre d'identifier des cibles diagnostiques et thérapeutiques et contribuer à promouvoir l'adoption d'un mode de vie adapté (exercice physique entrainant une augmentation du lactate sanguin) à certains troubles neurologiques dans lesquels les altérations neuronales, vasculaires et métaboliques se superposent (maladies neurodégénératives, épilepsie).
Procédures
-Chirurgie sous anesthésie profonde : 120 animaux, durée 1h - Imagerie sous anesthésie profonde: 300 animaux, durée 1-2h30. - Une mise à mort par une méthode réglementaire est nécessaire à la fin pour les prélèvements et analyses.
Impact sur les animaux
Nous nous attendons à ce que certaines chirurgies, comme les implants chroniques, puissent causer de la douleur, du stress ou une perte de poids temporaire. Des effets indésirables (stress ou douleur) peuvent durer pour un temps variable d’un à trois jours après l’opération. Un risque de stress cardio-respiratoire est aussi présent lors de l’anesthésie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures pour prélèvement d’organe.
Remplacement
Le recours à l’animal est nécessaire car aucun milieu de culture ou système synthétique ne permet aujourd’hui de reproduire la complexité des cellules du cerveau, en particulier les interactions métaboliques entre neurones et astrocytes. En outre, l'influence de la physiologie des autres organes sur le cerveau des mammifères n'est pas suffisamment comprise pour être imitée in vitro, ce qui peut entraîner une mauvaise interprétation des résultats.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux a été défini de façon à produire les données expérimentales robustes pour pouvoir répondre à la question scientifique du projet. Dans chaque procédure, les animaux sont utilisés plusieurs fois, soit pour établir la répétabilité d’une technique d’imagerie, soit pour obtenir un maximum de variables d’intérêts acquises sur le même animal. Les techniques de neuro-imagerie développées dans ce projet permettent un suivi longitudinal des animaux. Ceci permet d’augmenter la puissance statistique et de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre l’objectif scientifique.
Raffinement
-Examens IRM: douleur minimisée par application locale d’analgésique et application d’une pommade oculaire contre le dessèchement des yeux. - Pour prendre en charge la douleur liée aux chirurgies , injections d’analgésique avant et après les chirurgies - Points limites établis pour réduire la souffrance et le stress des animaux - Animaux hébergés en groupe, dans environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h. Eau et nourriture fournies ad libitum. Animaux examinés quotidiennement par donneurs de soin, sous supervision permanente du vétérinaire du centre, également en charge du bien-être animal. Environnement enrichi par un système de nidification périssable renouvelé lors du change hebdomadaire. - La perfusion ne débute qu’une fois l’arrêt respiratoire constaté et l’absence de réflexe après le pincement de la patte confirmée.
Choix des espèces
Les modèles rongeurs sont pertinents car ils peuvent être observés in vivo par des scanners IRM à haute performance et ce, malgré la petite taille des cerveaux murins. Les modèles transgéniques dont les cellules peuvent être activées directement sous l’effet de la lumière et nécessaires à notre étude ne sont disponibles que chez la souris. Les animaux seront donc des souris adultes âgées de 3 à 8 mois environ (le projet ne porte pas particulièrement sur le développement cérébral, or le métabolisme cérébral est sans doute différent pendant le développement).