Souris
Etude de l’efficacité d’une nouvelle famille de molécules de synthèse pour traiter l’infection à Mycobacterium tuberculosis chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Quarante minutes immobilisées dans une chambre de contention, le nez pointé vers un flux d'air chargé de bacilles tuberculeux : 560 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Les autres sont infectées par instillation nasale sous anesthésie, puis toutes reçoivent par gavage une molécule à tester, une fois par jour, cinq jours par semaine. Le porteur indique que les bactéries se multiplient dans les poumons en provoquant inflammation et lésions, avec altération de l'état général et difficultés respiratoires, et que l'accumulation de ces actes entraîne des nuisances sévères. Il énumère macaques, ovins, bovins, porcs, cobayes, lapins, rats et poissons zèbres parmi les modèles existants de la tuberculose, retient la souris et la qualifie de modèle "incontournable".
Objectifs
Malgré l’existence d'un vaccin et de médicaments, la tuberculose fait encore 1,4 millions de décès chaque année et reste l’une des maladies les plus meurtrières dues à un agent infectieux unique, Mycobacterium tuberculosis. Le traitement est long (6 mois) et combine plusieurs médicaments antituberculeux de première intention découverts dans les années 1950 et 1960. De plus, l’émergence et l’expansion de formes de tuberculose multi, extrêmement ou même totalement résistantes aux antibiotiques soulignent le besoin urgent de développer de nouvelles molécules thérapeutiques possédant de nouveaux mécanismes d'action, en complément de l'antibiothérapie actuellement préconisée par l'Organisation Mondiale de la Santé. La structure chimique unique de ces composés suggère un mode d'action distinct de celui des médicaments antituberculeux classiques ce qui pourrait permettre de contourner le problème d’apparition de résistance et/ou réduire la durée du traitement. Des données préliminaires sur une nouvelle famille de composés, ont montré que ces molécules sont capables d’inhiber la croissance du bacille tuberculeux (Mycobacterium tuberculosis) dans des cultures in vitro mais aussi qu’elles permettent de réduire la charge bactérienne dans certains types de cellules immunitaires. De façon remarquable, ces composés à tester n’ont pas d’effet cytotoxique sur différentes lignées de cellules humaines aux concentrations qui sont actives sur la bactérie. Le projet a pour objectif : 1/ tester l’efficacité contre la tuberculose in vivo chez la souris de ces composés à tester à différentes doses, et 2/ évaluer l'éventuelle synergie de ce traitement avec l'antibiothérapie standard utilisée pour traiter la tuberculose chez l'humain. Ce projet permettra de valider que cette famille de composés possède une activité antituberculeuse dans un modèle de souris infectées et ouvrira la voie à des études complémentaires visant à améliorer cette activité en vue du développement de nouveaux médicaments antituberculeux.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de valider ces composés à tester comme nouveaux candidats prometteurs pour le développement de nouveaux médicaments antituberculeux qui, de par leur structure innovante, pourraient prévenir le développement de souches résistantes et réduire la durée actuelle du traitement.
Procédures
Les animaux seront infectés 1) soit par voie aérosol, les animaux vigiles sont maintenus immobiles dans des chambres de contention avec le nez pointant vers le flux d’air (durée d’environ 40 minutes) 2) soit par voie nasale, les souris seront anesthésiées/analgésiées une fois pendant 1h pour être infectées (durée d’environ 1 minute). Puis les animaux vigiles recevront par voie orale 1 fois par jour, 5 jours par semaine, la molecule ou le traitement (durée inférieure à 2 minutes).
Impact sur les animaux
Un stress modéré pourra être engendré par la préhension et la contention afin de procéder au gavage. Un stress léger sera engendré lors des pesées pour certains animaux. L’infection des souris peut se faire soit par voie intranasale soit par nébulisation: - Pour l’instillation intranasale, des nuisances modérées sont présentes au moment de l’anesthésie (préhension, contention piqûre) et lors de l’infection des animaux. -Pour l’infection par nébulisation, les animaux sont maintenus immobiles dans des chambres avec le nez pointant vers le flux d’air. Cette opération induit un stress modéré. Suite à l’infection des souris par le bacille tuberculeux, les bactéries se multiplient dans les poumons de l’animal générant une inflammation et des lésions tissulaires. Des nuisances modérées peuvent alors être observées: altération de l’état général et difficultés respiratoires L’accumulation de ces actes sur l’animal entraine des nuisances sévères
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort. Il n’y a pas de possibilité de replacement, vu le contexte hautement pathogène.
Remplacement
Différents modèles cellulaires sont utilisés par les équipes travaillant sur la tuberculose. Malheureusement il n’existe aucun modèle cellulaire pertinent pour comparer l’efficacité thérapeutique potentielle de molécules. Le modèle animal est donc incontournable à l’heure actuelle. Dans ce contexte, le modèle animal le plus couramment utilisé en première intention est le modèle souris. Ce modèle reproduit notamment au niveau immunologique bon nombre des observations faites chez l’humain.
Réduction
Les expériences antérieures ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. La taille des lots d’animaux a été fixée à n=5 animaux par groupe, l'expérience devant être réalisée 3 fois pour s'assurer de sa reproductibilité Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet est de 560 souris. Le nombre de bactéries nécessaires à l'infection a déjà été déterminé dans notre laboratoire permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Dans ce projet, il existe différentes étapes susceptibles de générer de la douleur, de la souffrance ou de l’angoisse chez les animaux. Pour chaque étape, des mesures adéquates ont été mises en place pour suivre et réduire au maximum ces nuisances. Les infections pouvant être douloureuses seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Les souris infectées par Mycobacterium tuberculosis seront monitorées quotidiennement. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront pris en compte à chaque observation et des points limites seront mis en place. Les animaux présentant des signes de souffrance seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
S'agissant de la tuberculose, il existe, au-delà de l'utilisation de prélèvements humains, des modèles animaux communs divers : macaques, ovins, bovins, porc, cobaye, lapin, rat, souris, poisson zèbre pour citer les principaux ainsi que des modèles cellulaires. Le modèle le plus accessible est l'infection d'un type de cellules immunitaires par les bactéries. L’efficacité de ces molécules a été montré in vitro dans un modèle de cellules immunitaires infectés par Mycobacterium tuberculosis et elle doit être confirmer in vivo. En effet, s'agissant de réponses intégrées, celles-ci ne sont pas prévisibles sur ce type de cellules immunitaires. Le modèle murin devient alors incontournable. Parmi les différents modèles animaux de la tuberculose, nous avons choisi la souris qui est largement utilisée pour le développement de médicaments et de vaccins antituberculeux. Le stade de développement choisi est le stade adulte car toutes les fonctions de l’organisme sont matures (notamment système immunitaire et digestif pour la métabolisation des molécules). Pour cette raison, nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes et, si possible, par soucis d’homogénéité, âgées entre 6 et 8 semaines.
Maladies inflammatoires de l’intestin (MICI) : Étude de biodistribution de molécules chimiques dans les souris développant une colite
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Toutes tuées à la fin de l'imagerie, 840 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, le porteur écrivant que l'état de souffrance provoqué par la maladie serait de toute façon trop grave pour les garder. Une colite est déclenchée chez elles par injection intra-rectale de molécules chimiques sous anesthésie gazeuse, ou par administration dans l'eau de boisson pendant huit jours. Suivent deux prélèvements de sang, une injection intraveineuse de molécules fluorescentes et des séances d'imagerie de cinq minutes, l'appareil traitant trois à cinq animaux à la fois. Le porteur qualifie la douleur provoquée par l'induction de la colite de sévère et de durée moyenne, et affirme qu'il faut étudier un "organisme entier", qu'il n'existe "pas d'alternative" et que la souris est la meilleure stratégie.
Objectifs
Les maladies inflammatoires de l'intestin constituent un grave problème de santé publique. La maladie de Crohn et la colite ulcérative sont les deux maladies les plus fréquentes de ce groupe de pathologies inflammatoires de l'intestin. Toutes deux sont caractérisées par une inflammation chronique du tube digestif. Les patients atteints de maladies inflammatoires de l'intestin souffrent de douleurs abdominales, de diarrhées fréquentes et parfois sanglantes et de lésions de la région anale. Ces symptômes s'accompagnent de grande fatigue, d'anorexie et de fièvre, ainsi que de manifestations extra-intestinales. Bien que la pathogenèse des maladies inflammatoires de l'intestin reste inconnue, elle est décrite comme une maladie d’origine multiple impliquant des composantes génétiques et environnementales. Il n'existe pas de traitement curatif. Les médicaments actuels tentent de corriger les symptômes mais n’agissent pas sur les causes. Il y a quelques années, une molécule a été découverte qui est actuellement testée en essai de phase III chez des patients atteints de lupus érythémateux systémique. Des études chez la souris ont validé l'effet bénéfique et l'innocuité de cette molécule dans des modèles murins de maladies auto-immunes inflammatoires chroniques et, récemment, de colites. Aujourd'hui, nous essayons de valider davantage l'efficacité thérapeutique de cette petite molécule et d’autres molécules candidates. Cette validation repose sur l'étude de leur distribution dans le corps (imagerie in vivo non-invasive) ou sur des organes individuels (imagerie ex vivo) après administration de ces nouveaux traitements chez des souris dans lesquelles nous avons induit une colite.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet auront un impact à la fois sur la communauté scientifique et sur les patients atteints de MICI. La découverte de nouveaux médicaments pour traiter une maladie incurable comme les MICI améliorerait considérablement la qualité et l'espérance de vie des patients en réduisant les effets secondaires causés par les médicaments non ciblés.
Procédures
Les souris recevront : Une injection intra-rectale sous anesthésie gazeuse (premier modèle) ou une administration dans l'eau de boisson (deuxième modèle). Deux prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse. Une injection intraveineuse de molécules fluorescentes dans une solution saline ou de solution saline seule (contrôle) sous anesthésie gazeuse. Durée : -Induction de la colite : 2/3 jours (premier modèle) 8 jours (deuxième modèle) -Prélèvement sanguin : 3--4 minutes/souris -Une injection intra-rectale : 10 minutes/souris -Une injection intraveineuse : 4 minutes/souris -Imagerie in vivo : 5 minutes/ scan. L'instrument d'imagerie contient 3/5 masques d'anesthésie gazeuse (selon le modèle d’appareil), ce qui permet l'analyse (le scan) simultanée (en même temps) de 3/5 animaux.
Impact sur les animaux
1)Induction de la colite après administration de molécules chimiques --> détresse, stress physique et thermique --> douleur sévère --> durée moyenne; 2)Piqure d'une aiguille ou un capillaire --> douleur légère --> de courte durée; 3)Injection intra rectale --> douleur légère --> de courte durée
Devenir
Tous les animaux sont sacrifiés à la fin de l’imagerie, à mesure que l'objectif du projet est atteint. De plus, l'état de souffrance induit par la maladie serait trop grave.
Remplacement
L'utilisation de modèles animaux dans ce projet est essentielle car l'apparition et la progression des MICI impliquent plusieurs organes (système immunitaire, microbiote intestinal et autres) qui ne peuvent être simplifiés avec des systèmes cellulaires. Pour comprendre comment les éventuels futurs médicaments agissent et s'accumulent, il est nécessaire d'étudier un organisme entier ; une approche qui n'est pas réalisable en utilisant uniquement des systèmes cellulaires. Il n'y a pas d'alternative à un modèle non-animal qui puisse répondre à nos questions. Le modèle de la souris est la meilleure stratégie pour générer des données qui peuvent avoir un impact sur l'homme.
Réduction
Le nombre d'animaux envisagé dans le projet tient compte de la nécessité de minimiser leur utilisation tout en obtenant des résultats statistiquement significatifs pour atteindre les objectifs de la recherche. Notre étude fait appel à l'imagerie par fluorescence, technique non-invasive et non irradiante, permettant de suivre la distribution des molécules fluorescentes en continu dans le temps dans le corps de chaque animal vivant, évitant ainsi leur sacrifice à chaque temps de mesure. Ici, les souris sont sacrifiées à la fin de l’expérience seulement.
Raffinement
Pour garantir le bien-être de l'animal, nous avons défini des seuils de tolérance basés sur l’aspect générale de l’animal, le poids corporel, la température corporelle et la consistance des fèces. Le prélèvement de sang, l'injection intraveineuse et l'imagerie sont effectués sous anesthésie gazeuse. Au cours de la première semaine d'hébergement, après une quarantaine (1 semaine), toutes les souris seront soumises à une transition alimentaire afin de limiter l’auto-fluorescence induite par le régime standard ; elles seront gardées toute l’étude sous le nouveau régime alimentaire.
Choix des espèces
Les souris adultes (> 6 semaines d’âge) ont un génome très proche de celui de l'homme, et leur système physiologique récapitule assez bien les observations faites chez l'homme. A cet âge, leurs organes et appareils (respiratoire, circulatoire, digestif, urinaire et génital) ont atteint leur maturité.
Caractérisation d’un modèle murin de xénogreffe de cellules de cancer du sein et évaluation des effets de l’irradiation sur la progression tumorale et la réponse immunitaire associée
- Recherche fondamentale
- Oncologie
L'apparition d'une nécrose ou d'une ulcération de la tumeur irradiée déclenche la mise à mort de l'animal, comme un volume tumoral jugé critique. 112 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Chacune reçoit des cellules tumorales dans ses deux coussins adipeux mammaires, puis des prélèvements de sang hebdomadaires sous sédation pendant quatre mois au plus et des irradiations sous anesthésie. Des métastases pulmonaires peuvent apparaître sans être détectables avant l'autopsie, et le projet ne teste encore aucun traitement : il sert à caler le modèle et à trouver la dose d'irradiation utile à un projet ultérieur sur les nanoparticules.
Objectifs
Un des axes d’amélioration thérapeutique dans le traitement du cancer par radiothérapie consiste en une augmentation de la dose d’irradiation ciblant les cellules tumorales, tout en limitant au maximum l’irradiation des cellules saines localisées autour de la masse tumorale. . Après avoir réalisé des études in vitro sur le potentiel thérapeutique d’une approche combinant irradiation et présence de nanoparticules dans les cellules cancéreuses , il est désormais nécessaire d’évaluer l’effet in vivo, où le système immunitaire des animaux pourrait augmenter encore l’effet souhaité. Ainsi, dans le cadre de ce projet, nous cherchons à développer et caractériser un nouveau modèle murin de cancer du sein, pour l’utiliser afin d’évaluer l’action de nouvelles nanoparticules sur la sensibilité aux irradiations des cellules cancéreuses. Nous utiliserons également ce modèle pour étudier l’impact de la réponse immunitaire sur l’effet à distance suite à un traitement. Le développement de ce nouveau modèle nécessite la réalisation de greffes de cellules tumorales mammaires dérivées d’un type de souris génétiquement modifiée dans des souris receveuses/hôtes, pour mimer ainsi les différentes étapes de la progression tumorale du cancer du sein. Le premier objectif est d’évaluer les paramètres cliniques de la progression tumorale, après greffe de ces cellules de tumeurs mammaires. Le second objectif correspond à la détermination des doses optimales d’irradiations et de leurs fractionnements pour observer une régression tumorale dans ce modèle murin. Enfin, le dernier objectif est d’évaluer la réponse immunitaire sanguine et tumorale des animaux suivant l’irradiation.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre - d’évaluer la faisabilité d’un modèle de greffe de cellules tumorales du sein, qui puisse être reproductible et utilisable pour tester des traitements anti-cancéreux. - de déterminer les conditions optimales d’irradiation de ce modèle. Pour un projet ultérieur, testant l’efficacité d’un double traitement avec nanoparticules et irradiations, il est nécessaire de déterminer une fenêtre d’irradiation réunissant deux conditions : un effet de l’irradiation seule doit être observé d’une part, mais sans éliminer l’ensemble des cellules tumorales présentes d’autre part, afin d’évaluer objectivement l’effet d’un double traitement.
Procédures
Les animaux seront soumis à trois types d’intervention, à savoir des prélèvements sanguins, une injection de cellules tumorales, et une irradiation. Chacune de ces interventions ne dure pas plus de quelques minutes (anesthésie comprise) - Les prélèvements sanguins sous sédation seront réalisés à partir du jour de l’injection de cellules tumorales, au maximum une fois par semaine, et pour un volume maximal de 60µl de sang. Les prélèvements seront effectués au maximum pendant quatre mois, correspondant au temps d’inclusion des animaux dans les procédures. - L’injection de cellules tumorales sera réalisée en une fois, dans deux coussins adipeux mammaires par souris. - Les irradiations seront effectuées sous anesthésie dans un irradiateur pour petit animal. Les animaux feront l’objet d’un suivi clinique, et l’apparition de nécrose ou ulcération tumorale sera répertoriée, afin de détecter l’apparition d’un point limite
Impact sur les animaux
Les effets indésirables induits par les traitements peuvent être d’une part dus à l’injection de cellules, avec une possible réaction inflammatoire au point d’injection. Avec un suivi adapté et une analgésie si nécessaire, ces effets peuvent être limités à quelques heures. Si l’inflammation persiste, l’animal sera exclu de l’étude, cette réaction pouvant entrainer un biais dans l’analyse de la réaction immunitaire. Les cellules tumorales injectées sont censées former une masse tumorale en croissance. Cette croissance sera progressive et pourra atteindre un volume critique, qui sera considéré comme un point limite. Dès l’atteinte de ce point limite, l’animal sera euthanasié. De même, une croissance tumorale qui serait défavorable au comportement normal de l’animal sera considérée comme point limite. Des métastases (pulmonaires essentiellement) sont susceptibles d’apparaître chez certains animaux. Elles ne seront pas détectables avant l’autopsie. La croissance des tumeurs et métastases peut également mener à une perte de poids globale et des signes cliniques de mauvais état général. Dans ce cas, l’utilisation d’une grille de score (outil d’évaluation quantitatif de points limites) permettra d’évaluer la nécessité de procéder à une euthanasie. Enfin, l’irradiation peut favoriser, notamment avec de fortes doses, l’apparition d’une nécrose ou ulcération de la tumeur irradiée. Cet effet sera reporté dans le tableau de scoring et utilisé comme point limite menant à l’euthanasie.
Devenir
Les animaux du projet seront tous euthanasiés, selon deux critères : - soit l’animal a atteint un point limite fixé dans ce document et sera euthanasié. - Soit l’animal n’a pas atteint de point limite dans le cadre de l’étude, mais est porteur de tumeurs, donc sera euthanasié en fin d’étude (soit au plus tard quatre mois après inclusion) car ne pourra pas être réutilisé.
Remplacement
Le projet présenté s’inscrit dans le cadre d’un programme plus large, visant à évaluer l’efficacité antitumorale d’un double traitement associant des nanoparticules à des irradiations. De nombreuses études sur l’augmentation des effets des irradiations par les nanoparticules métalliques ont été réalisées in vitro, et parfois sur des modèles 3D. Les résultats obtenus, très contrastés, sont la plupart du temps éloignés des résultats obtenus in vivo chez la souris, voire en essais cliniques. En effet, il est désormais admis que cet effet potentialisant est au moins en partie dû à la survenue d’une réponse inflammatoire et l’intervention de cellules immunitaires. De plus, le projet cherche également à mettre en évidence l’effet à distance d’un tel traitement, c’est-à-dire la régression d’une tumeur à distance du lieu d’irradiation. Ainsi un modèle in vitro, même de type organoïdes, ne permettrait ni de réellement évaluer l’efficacité de radiosensibilisation des nanoparticules, ni d’estimer le potentiel abscopal de ce type de traitement. Par conséquent, il est nécessaire de mettre en place un modèle pertinent de tumeurs du sein, objet de cette demande .
Réduction
Ce projet va permettre de déterminer les fenêtres de caractérisation et d’irradiations (doses et fractionnement) optimales dans ce modèle pour observer un effet sur la régression tumorale. Ce projet nous permettra de réduire le nombre d’animaux au minimum pour déterminer la dose d’irradiation optimale. Le modèle développé pour ce projet permet également de générer des tumeurs homogènes chez les souris receveuses/hôtes, assurant ainsi une meilleure reproductibilité dans la réponse thérapeutique.
Raffinement
Dès l’injection des cellules tumorales dans les souris, les animaux seront surveillés les lundis, mercredis et vendredis, chaque semaine. Chaque animal fera l’objet d’une observation dans la cage tout d’abord, puis sera anesthésié à l’isoflurane pour être caractérisé plus précisément. Les observations seront répertoriées dans des feuilles de suivi (de scoring) afin de pouvoir assurer un suivi et détecter une évolution défavorable des signes. L’observation du comportement des animaux d’une part, et la mesure du poids et de la taille des tumeurs d’autre part, nous permettra d’évaluer la nécessité d’apporter une solution analgésique ou de procéder à l’euthanasie des animaux si leur condition l’indique (amaigrissement important, prostration, etc...). Des aspects supplémentaires seront répertoriés (réaction à l’anesthésie et aux prélèvements sanguins, aspect clinique de la tumeur), afin de déterminer l’apparition d’autres points limites menant à l’euthanasie. Les animaux seront maintenus en groupe selon les conditions habituelles d’hébergement dans l’établissement utilisateur.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix en cancérologie. Les cellules tumorales utilisées proviennent du modèle murin génétiquement modifié qui développe des tumeurs mammaires spontanées comparables aux tumeurs humaines, en matière de carcinogénèse, et de types histologiques et moléculaires. Les cellules seront greffées dans des souris receveuses/hôtes, qui ont donc le même fond génétique que les cellules greffées, afin d’éviter tout rejet de greffe ou réaction inflammatoire indésirable. Enfin, les souris receveuses sont immunocompétentes (capables de produire une réponse immunitaire face à un corps étranger), critère indispensable dans notre étude qui cherche à déterminer les modifications de la réponse immunitaire. Le développement de cancers étant évalué à l’âge adulte, nous utiliserons des souris femelles âgées de 6 à 8 semaines. Le développement de cancers étant évalué à l’âge adulte, nous utiliserons des femelles âgées de 6 à 8 semaines.
Effets d’un candidat médicament anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Quarante-sept administrations par animal, douze dans l'abdomen et trente-cinq sous la peau, plus vingt et une pesées et quatre prélèvements de sang : 48 souris mâles rendues obèses par une alimentation à 60 % de graisses vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que les injections et les prélèvements sont source de douleurs aiguës, que le jeûne de quatre heures précédant chaque prise de sang induit une sensation de faim, et que l'obésité elle-même gêne les mouvements. Les femelles sont écartées pour ne pas doubler les effectifs, une seconde étude étant prévue chez elles seulement si le composé se montre efficace chez les mâles. Le candidat médicament appartient à un client de l'établissement, et le porteur présente cette étape in vivo comme une étape réglementaire incontournable avant le passage à l'humain.
Objectifs
Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un candidat médicament de notre client et vise à tester son efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse, en administration seule ou combinée avec un autre composé anti-obésité déjà autorisé sur le marché. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament sur l'appétit, les dépenses énergétiques et, en conséquence, sur le poids corporel du modèle d'obésité.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (21 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de placébo ou du candidat médicament par voie intrapéritonéale (12 administration; durée de la mesure : 1 minute); 3) Administrations de placébo ou d'un composé de référence par voie sous-cutanée (35 administrations; durée de la mesure : 1 minute); 4) Analyse non invasive de composition corporelle (5 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 5) Prélèvements sanguins (4 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements intrapéritonéaux et sous-cutanés, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs aiguës et de stress. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).
Réduction
Le nombre de 12 animaux par groupe a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Par ailleurs, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genre.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par voie intrapéritonéale et sous-cutané seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages collectives (2-3 animaux/cage) afin de maintenir leur caractère social. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée (2 visites par jour) et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée (Buprénorphine).
Choix des espèces
Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques.Les animaux seront utilisés au stade adulte de 20 semaines (27 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une pèriode de 14 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur.
Efficacité in vivo de nouveaux agents thérapeutiques dans les tumeurs cérébrales
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. 234 d'entre elles reçoivent une greffe de cellules de glioblastome directement dans le cerveau, opération de trente minutes, 60 une greffe sous la peau, et toutes jusqu'à huit injections derrière le globe oculaire. Le porteur indique que la progression de la tumeur provoque des troubles moteurs, une perte d'appétit puis une perte de poids, et attend de ces expériences la validation de composés anticancéreux ciblant le cerveau, dans une maladie dont la survie médiane est d'un an. Sur le remplacement, il écrit en une phrase qu'il n'existe pas de système suffisamment fiable pour mimer cette complexité biologique.
Objectifs
L'objectif du projet est d'évaluer l'efficacité de nouveaux agents anticancéreux dans des modèles animaux atteints de tumeurs cérébrales. Ces nouveaux médicaments ont la propriété de cibler efficacement le cerveau puis la tumeur, ce qui devrait permettre une amélioration de leur efficacité, tout en limitant les effets secondaires du traitement (troubles du système digestif, nausées, fatigue).
Bénéfices attendus
Le glioblastome est une tumeur cérébrale dont le pronostic est sombre. Il n’existe aucun traitement curatif et la survie médiane des patients est de un an avec un traitement combinant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie. La validation in vivo de l'efficacité des composés anticancéreux et de leur ciblage vis à vis du cerveau et donc de la tumeur permettrait la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le glioblastome.
Procédures
Des animaux recevront une administration intra-veineuse retro-orbitaire de composés (336 animaux, intervention de 5 minutes environ, 8 interventions maximum). Les injections retro-orbitaires se réalisent à l'arrière du globe oculaire. Des animaux recevront une greffe sous-cutanée de cellules tumorales de glioblastome 60 animaux, une seule intervention de 1 minute environ). Des animaux recevront une greffe intracérébrale de cellules tumorales de glioblastome (234 animaux, une seule intervention de 30 minutes environ). Les greffes intracérébrales sont des procédures chirurgicales. Elles consistent à introduire des cellules tumorales dans le cerveau afin d'induire une tumeur.
Impact sur les animaux
La manipulation, contention des animaux, les injections d'anesthésiques ou de cellules sont générateurs de stress pour les animaux. Par ailleurs, les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. La progression tumorale induite par la maladie (glioblastome) est susceptible d'induire des troubles moteurs et provoque à terme une perte d'appétit, donc une malnutrition et finalement une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés dans le cadre des études de survie, pour les analyses histologiques (prélèvement de cerveaux) et à la fin de l'étude de dose maximum tolérée (une semaine après la dernière administration).
Remplacement
L'analyse de l'efficacité des composés pour leur ciblage du cerveau et pour leurs effets sur le developpement tumoral nécessite une approche expérimentale in vivo. En effet, il n’existe pas à ce jour de système suffisamment fiable pour mimer cette complexité biologique.
Réduction
Le nombre d'animaux prévu dans chaque groupe est basé sur un calcul d'effectif permettant de prédire que nous avons 80% de chance d’obtenir un résultat statistiquement significatif.
Raffinement
La détection de toute souffrance de l’animal sera assurée et le niveau de souffrance évalué en fonction de deux grilles de scores. En fonction des scores obtenus, il sera envisagé une analgésie ou l'euthanasie de l'animal. Pour le bien-être de l'animal, les souris seront logées selon les normes requises avec un enrichissement (copeaux de bois, dômes) et en groupes de 5 individus par cage afin d’éviter le stress de l’isolement. Les cages pourvues de couvercles filtrants seront disposées dans une armoire ventilée.
Choix des espèces
Les données bibliographiques démontrent que le modèle murin est le plus adapté pour aborder les questions relatives aux tumeurs cérébrales. Les tumeurs de glioblastome générées dans ces différents modèles animaux sont particulièrement similaires aux tumeurs humaines. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 6 semaines et utilisées à l’âge de 7 semaines, en accord avec les protocoles décrits pour ces modèles physiopathologiques classiques.
Evaluation d’un ciblage de PCSK9 dans le cadre d’un traitement des conséquences cardiovasculaires du syndrome d’apnées obstructives du sommeil chez des souris 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Cent huit souris seront réutilisées dans d'autres procédures et les animaux d'élevage maintenus en vie pour la reproduction, les autres étant tués pour prélever leurs organes. 446 souris vont être utilisées au total, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles passent quatorze ou cinquante-six jours dans un dispositif qui les prive d'oxygène par intermittence pour reproduire les apnées du sommeil, avec des injections, deux à quatre prélèvements de sang, des mesures de pression artérielle à la queue trois fois par jour pendant trois jours, une échographie cardiaque sous anesthésie et un transport routier entre deux établissements. Le porteur écarte la drosophile, le poisson zèbre et le nématode comme animaux de "classes phylogénétiques inférieures" non pertinents, et affirme que les modèles cellulaires ne représentent pas la complexité d'un "organisme entier".
Objectifs
Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) est une pathologie touchant 5-20% de la population générale, caractérisée par des apnées répétitives pendant le sommeil conduisant à un manque d’oxygène dans le sang, qu’on appelle hypoxie intermittente (HI). Les complications cardiovasculaires qui en découlent posent un réel problème de santé publique, avec en particulier une incidence accrue d’athérosclérose chez les patients SAOS conduisant à une augmentation de la mortalité par infarctus du myocarde et accident vasculaire cérébral. Le traitement de référence du SAOS, la pression positive continue (PPC), permet d’améliorer les symptômes et la qualité de vie des patients, mais son effet sur le risque cardiovasculaire reste controversé. Ainsi, un axe futur de la prise en charge des patients apnéiques est d’associer la PPC à un traitement permettant de réduire le risque cardiovasculaire, mais il est nécessaire de bien connaitre les mécanismes associés au SAOS pour cibler les thérapeutiques les plus pertinentes. Parmi les mécanismes impliqués dans les premières phases de la formation des plaques d’athérome on peut citer une inflammation et des problèmes de paroi des vaisseaux, entraînant une augmentation de la migration des globules blancs et conduisant à un remodelage des vaisseaux avec un épaississement de la paroi et l’apparition de lésions d’athérosclérose. Ces phénomènes vont ainsi être activés chez les patients SAOS. Une protéase d’intérêt à commencer à se détacher ces dernières années dans la recherche sur l’athérosclérose. Notre hypothèse est donc que cette protéase serait un acteur majeur des troubles aux niveaux des parois des vaisseaux induits par l'HI. Afin de confirmer cette hypothèse nous voulons évaluer l’impact d’un blocage de cette protéase sur le remodelage vasculaire provoqués par une hypoxie intermittente, dans nos modèles expérimentaux de souris. Nous espérons ainsi déterminer si cette protéase pourrait servir de cible thérapeutique pour les conséquences cardiovasculaires du SAOS. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs différents.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si notre protéase d’intérêt pourrait être une cible thérapeutique possible pour lutter contre les conséquences cardiovasculaires du SAOS. Celles-ci n’ayant pas de traitement suffisamment efficace actuellement, et les anticorps contre celle-ci étant déjà approuvés chez l’homme pour d’autres indications, les résultats de cette étude pourraient conduire à proposer un nouveau traitement à moyen terme pour ces malades.
Procédures
Les animaux seront placés en hypoxie ou en normoxie pendant 14 ou 56 jours selon leur groupe. Le traitement étudié sera injecté aux animaux le premier jour pour les animaux exposés 14 jours et les jours 28 et 42 pour ceux exposés 8 semaines (10 minutes pour prendre en main l’animal et l’injecter). Deux prélèvements sanguins auront lieu pour les animaux exposés 2 semaines, et quatre prélèvements pour les animaux exposés 8 semaines (10 minutes pour réaliser la contention de l’animal et prélever le sang). Tous les animaux seront soumis à des mesures de pression artérielle vigile (3 fois par jour pendant 3 jours, à raison de 15 minutes par session), non-invasives à la queue. La fonction cardiaque et aortique sera mesurée une fois, en fin de protocole, par échographie sous anesthésie gazeuse d'une durée moyenne de 30 minutes. A la fin de cette exposition, les animaux seront mis à mort par prélèvement du sang sous anesthésie générale (10 minutes de procédure). L'imagerie sera réalisée dans un des établissements utilisateurs et toutes les autres interventions se dérouleront dans l'autre établissement utilisateur.
Impact sur les animaux
Les animaux recevront une injection de médicament ce qui conduira à un léger stress. Les animaux se verront aussi prélever de sang toutes les semaines ou toutes les deux semaines ce qui entrainera un léger stress. La mesure sur animal éveillé de la pression artérielle peut induire un léger stress. Enfin les animaux seront placés dans le dispositif à hypoxie intermittente, ce qui entraîne un stress modéré et une perte légère de poids sur les 3 premiers jours, le temps qu’ils s’adaptent. Enfin le transport des animaux après les échographies entre les deux sites pourrait induire un stress d’un niveau léger en gravité.
Devenir
Les animaux de la procédure d’élevage seront tous maintenus en vie pour effectuer les reproductions. Tous les animaux de la procédure expérimentale seront mis à mort afin de pouvoir prélever leurs organes et effectuer des analyses supplémentaires.
Remplacement
L’étude du remodelage des vaisseaux nécessite des manipulations invasives ce qui exclut une étude in vivo chez l’homme. Nous utilisons des modèles cellulaires pour les premières étapes de nos travaux, mais ils ne sont pas en mesure de représenter la complexité d’un organisme entier. Nos travaux sont centrés sur les effets de l’hypoxie intermittente sur l’intégrité et le remodelage des vaisseaux. Des modèles alternatifs d’animaux de classes phylogénétiques inférieures (drosophile, zebrafish, c-elegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les souris sont le modèle de référence utilisé en recherche cardiovasculaire fondamentale ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature.
Réduction
Le nombre d’animaux par lot a été défini à minima, soit 12 par groupe, afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. Cette valeur a été obtenue par une approche statistique. Nous évaluerons la présence d’un effet sexe sur nos résultats après la première série d’expérimentations. S’il n’y a pas de différences entre les sexes alors nous rassembleront nos groupes d’animaux et réduirons leur nombre de moitié. Après la réalisation des procédures in vivo et l'euthanasie des animaux, nous allons collecter les organes et tissus de ces mêmes animaux pour les utiliser au cours des études ex vivo post-mortem, rationnalisant encore ainsi le nombre des animaux utilisés.
Raffinement
Une attention générale sera portée à la qualité des méthodes d'anesthésie et d'analgésie des animaux. De plus, une surveillance attentive sera réalisée pendant l'hébergement et lors de la réalisation des procédures expérimentales afin d'évaluer en permanence les nuisances subies (douleur, stress, ...), de façon à pouvoir appliquer immédiatement un renforcement analgésique et/ou anesthésique si nécessaire et faire en sorte que ces nuisances soient absentes ou réduites à leur niveau minimum. Les conditions d'expérimentation seront aussi optimisées pour le confort des animaux, avec habituation à la contention (pour les mesures de pression artérielle) et gel oculaire appliqué lors d'anesthésies longues (échographie). Des points limites prédictifs et précoces, gradés précis et adaptés, ainsi que des critères d'arrêt, sont définis, et un arbre décisionnel mis en place, permettant aux personnels de décider des actions à réaliser pour le bien-être des souris et l'application des points limites et critères d'arrêt définis. Les expérimentateurs et soigneurs seront formés pour appliquer ces procédures et règles de protection du bien-être animal, conformément à la règlementation. Le transport des animaux entre les 2 EU est fait par un expérimentateur compétent, en cage d'hébergement standard, temporairement occultée, avec eau, croquettes et enrichissement. Une fois réceptionnées, les souris seront transférées dans des cages propres pour une période d’acclimatation d’au moins 7 jours avant le début des expérimentations dans la salle où se trouve le dispositif à hypoxie intermittente. Le personnel responsable du bien-être animal veillera à leurs conditions d’hébergement, à leur adaptation à leur environnement et à la mise à disposition ad libitum en nourriture et eau. De plus, un enrichissement de leur milieu de vie adapté sera mis en place pendant la période d’acclimatation et d’expérimentation. Les conditions d’hébergement respecteront les normes relatives au bien-être animal en vigueur. Afin de limiter leur angoisse, ils seront acclimatés à l’expérimentateur pendant ces 7 jours. Tout comportement anormal sera signalé afin de mettre en place des soins adaptés. Le vétérinaire responsable des animaux sera contacté si un animal présente une souffrance inhabituelle. Les animaux seront examinés quotidiennement et pesés de manière hebdomadaire par les zootechniciens ou l’expérimentateur.
Choix des espèces
Nos travaux sont centrés sur les effets de l’hypoxie intermittente sur les parois des vaisseaux et le remodelage des vaisseaux. Des modèles alternatifs d’animaux de classes phylogénétiques inférieures (drosophile, zebrafish, c-elegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les souris sont le modèle de référence utilisé en recherche cardiovasculaire fondamentale ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature. Dans ce travail, il est prévu d’utiliser les souris sauvages et génétiquement modifiées, déjà existantes au laboratoire. Ces modèles sont parmi les plus reconnus comme souche référente dans la communauté scientifique. De plus, l’anatomie des vaisseaux de la souris est parfaitement connue et les outils qui permettront l’analyse sont déjà maîtrisés au laboratoire. Nous utiliserons des souris jeunes adultes âgées de 12 semaines au début de l’exposition, ce qui permet une meilleure connaissance de l’impact de l’hypoxie intermittente sur le système vasculaire sans être biaisé par l’effet de l’âge.
Profil et circuits socio-émotionnels de deux lignées de souris exprimant des mutations du récepteur nicotinique α5 impliquées dans l’alcoolisme
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
756 souris, dont des lignées porteuses de mutations du récepteur nicotinique α5 liées à la dépendance à l'alcool, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées sous anesthésie profonde pour conserver leur cerveau. Selon les groupes, elles ont accès chaque jour à un biberon d'alcool pendant 6 à 12 semaines, subissent une chirurgie du cerveau de 30 à 45 minutes, une stimulation de neurones par la lumière, jusqu'à quatre contentions de 15 minutes et une ou deux prises de sang sous la mâchoire. 612 souris passent un test social de 10 minutes par jour pendant cinq jours, présenté comme un test de reconnaissance des émotions sans autre description. L'objectif est de comprendre comment ces mutations modifient les émotions, le comportement social et la consommation d'alcool, chez les mâles comme chez les femelles. Le porteur affirme que les souris placées en contention "finissent par s'y habituer", et écrit que les tests quotidiens "contribuent aussi à leur bien-être".
Objectifs
Les problèmes liés à la consommation d'alcool sont très courants et dangereux dans notre société. Selon l'Organisation mondiale de la santé (OMS), 5 % des décès dans le monde sont causés par une consommation excessive d'alcool. Pour mieux comprendre ce problème et trouver des solutions, il est important de savoir comment notre corps et notre environnement influencent cette dépendance. Des études ont montré qu'une petite différence dans un gène, appelé CHRNA5, peut augmenter le risque de devenir dépendant à l'alcool. Toutefois, il reste difficile d'étudier ce lien chez les humains. Pour mieux comprendre, des chercheurs ont utilisé des rats qui avaient cette différence génétique. Ces rats avaient un risque plus élevé de rechute dans l’alcool après une période d’abstinence. De plus, ce gène joue un rôle important dans certaines parties du cerveau qui sont liées à la mémoire et aux relations avec les autres. Et les connexions entre ces zones du cerveau sont aussi liées à l’anxiété et au comportement social. L’objectif de cette recherche est d’étudier comment cette différence génétique affecte les émotions et les comportements sociaux, ainsi que la communication entre certaines parties du cerveau. Pour cela, nous utiliseront des souris spéciales qui ont cette même différence génétique, et les compareront à des souris normales. Nous observerons comment cela influence leurs comportements et leur consommation d'alcool, en étudiant aussi les différences entre les mâles et les femelles. Ensuite, nous enregistreront l’activité du cerveau des souris pour comprendre comment cette différence génétique change la manière dont les parties du cerveau communiquent entre elles. Puis nous essayeront de manipuler cette communication pour voir comment cela affecte les comportements sociaux des souris. Enfin, nous tenteront de remettre en place la version normale du gène dans le cerveau des souris pour voir si cela améliore leur comportement.
Bénéfices attendus
Des études ont montré qu'une petite différence dans un gène, appelé CHRNA5, peut augmenter le risque de devenir dépendant à l'alcool. Mais on ne sait toujours pas vraiment comment cela fonctionne. Malgré les graves conséquences de la dépendance à l'alcool sur la société, il existe très peu de traitements qui fonctionnent bien, et la plupart des personnes dépendantes rechutent après avoir essayé d'arrêter de boire. Les personnes qui souffrent de dépendance à l'alcool peuvent avoir des comportements très différents. Par exemple, certaines peuvent être anxieuses ou avoir des comportements antisociaux. Il est cependant compliqué de savoir si ces comportements sont causés par la consommation d'alcool ou s'ils étaient déjà présents avant. Notre projet a pour but de mieux comprendre comment les émotions et les comportements sociaux sont liés à la consommation d'alcool. Nous voulons savoir si ces comportements viennent de la consommation ou s'ils existaient avant. De plus, nous voulons prendre en compte les différences entre les sexes, car les réactions des hommes et des femmes peuvent être différentes. Ce projet pourrait nous aider à plusieurs niveaux. En tenant compte des émotions et pas seulement de la quantité d'alcool consommée, nous espérons comprendre comment cette différence génétique augmente le risque de dépendance. Si nous découvrons des comportements chez les animaux qui ressemblent à ceux observés chez les humains, cela pourrait nous aider à tester des traitements adaptés aux différents types de dépendance. Cela pourrait aussi conduire à des soins plus personnalisés, qui prendraient en compte la personnalité, le type de consommation d’alcool et le sexe de chaque personne, pour une meilleure efficacité. Enfin, nous cherchons à comprendre quelles parties du cerveau sont affectées par l'alcool et comment cela influence les comportements sociaux et émotionnels. Cela pourrait permettre de créer de nouveaux médicaments pour aider les personnes à arrêter de boire et à éviter les rechutes, en fonction de leur profil émotionnel et social.
Procédures
Les animaux passeront par plusieurs étapes dans cette étude : Ils auront accès à un biberon avec une solution d'alcool, une fois par jour, pendant 6 à 12 semaines (144 animaux). Ils subiront une petite opération sous anesthésie, d'environ 30 à 45 minutes, pour implanter un dispositif dans le cerveau (468 animaux). L’activité de leur cerveau sera mesurée sous anesthésie profonde pendant environ 1 heure après avoir stimulé une région spécifique du cerveau (144 animaux). Une technique utilisant la lumière permettra d'activer ou de désactiver certaines parties du cerveau chez des animaux éveillés, pendant 3 minutes (180 animaux, dont 90 pour l'activation et 90 pour la désactivation). Ils participeront à un test pour observer leur comportement social pendant 10 minutes par jour, sur une période de 5 jours (612 animaux). Ils seront soumis à un léger stress de restriction de leurs mouvements pendant 15 minutes, jusqu’à 4 fois au total, avec au moins une semaine de repos entre chaque session (144 animaux). Un petit échantillon de sang sera prélevé sous leur mâchoire. Certains animaux auront ce prélèvement une fois (288 animaux), d'autres deux fois, avec au moins une semaine d'écart entre les deux prélèvements (252 animaux).
Impact sur les animaux
Les animaux participeront à différents traitements et tests au cours de cette étude : Consommation d'alcool : Ils auront accès à un biberon contenant de l'alcool une fois par jour pendant 6 à 12 semaines. Cela peut leur donner une sensation de détente et d'euphorie. Opération du cerveau : Ils subiront une intervention sous anesthésie pour injecter un virus ou placer un dispositif dans leur cerveau, ce qui dure environ 30 à 45 minutes. Le jour suivant, ils peuvent perdre un peu de poids, mais ils le récupèrent généralement en trois jours. Ils ressentent une légère douleur, bien contrôlée par des médicaments contre la douleur qu’ils reçoivent avant et après la chirurgie. Il peuvent être confronté au saignement après la chirurgie, l’infection de la plaie qui est bien gérée par une désinfection à la Bétadine et un suivi par l’expérimentateur. Dans de rares cas le dispositif implanté dans leur cerveau peut se décrocher. Enregistrement de l'activité cérébrale : Nous allons enregistrer l'activité de certaines parties de leur cerveau pendant environ une heure, sous anesthésie générale profonde, après avoir stimulé une région spécifique. Activation ou inhibition du cerveau par la lumière : Nous utiliserons une technique spéciale qui permet d'activer ou de calmer certaines parties du cerveau des animaux éveillés pendant 3 minutes. L'activation peut causer une légère anxiété temporaire, tandis que l'inhibition a un effet de diminution du stress. Test de reconnaissance des émotions : Les animaux seront observés lors d’un test qui dure 10 minutes par jour pendant 5 jours, pour observer leur comportement et réaction emotionelle. Cela peut provoquer un léger stress. Stress modéré : Les animaux seront placés dans un dispositif qui limite leurs mouvements pendant 15 minutes, jusqu'à 4 fois, avec une semaine entre chaque session. Ce stress est modéré, et les animaux finissent par s'y habituer. Prélèvement sanguin : Un petit échantillon de sang sera prélevé sous leur mâchoire. Cela est rapide mais peut causer une légère douleur et un stress momentané au moment où l’aiguille entre dans la peau. Certains animaux subiront ce prélèvement une fois, et d'autres deux fois, avec une semaine d'intervalle.
Devenir
A la fin des procédures les animaux sont euthanasiés sous anesthésie générale profonde pour la conservation des tissus (cerveau), qui seront analysés ultérieurement.
Remplacement
Ce projet étudie la manière dont les souris reconnaissent les émotions et comment cela est lié à la consommation d'alcool. À ce jour, il n'existe pas d'autres méthodes pour faire ces recherches sans utiliser des animaux. De plus, nous voulons comprendre comment certaines mutations génétiques influencent ces comportements. C'est pourquoi nous devons utiliser des souris spéciales qui ont les mêmes mutations que celles que l'on retrouve chez l'humain
Réduction
Nous optimisons le nombre d'animaux utilisés en réalisant plusieurs tests sur chaque animal au lieu de multiplier les groupes. Ainsi, les animaux passeront par différentes étapes de manière séquentielle (comme des opérations, des prélèvements, ou des tests de comportement). Avant de lancer un protocole complet, nous faisons d'abord des essais sur un petit groupe de 4 à 5 animaux pour voir si cela vaut la peine de poursuivre. Cela nous aide à éviter d'utiliser trop d'animaux. Si les résultats sont prometteurs, nous passons à un groupe de 12 animaux, qui est le nombre minimum que l’on estime nécessaire pour avoir des résultats fiables. Nous vérifions également que les données sont bien réparties avant de les analyser avec des méthodes statistiques appropriées.
Raffinement
Nous ferons tout pour garantir le bien-être des animaux pendant l'étude. Lors des opérations, ils recevront une anesthésie pour les endormir et des médicaments pour soulager la douleur. Si l'opération dure longtemps, nous les hydraterons avec une injection pour qu'ils ne soient pas deshydratés au reveil. Tous les animaux vivront dans un environnement confortable, avec des matériaux pour construire des nids et des endroits où se cacher. Ils seront gardés ensemble pour maintenir leurs liens sociaux, et des techniciens vérifieront leur état chaque jour. Si un animal montre des signes de douleur, les techniciens préviendront immédiatement le responsable de l'étude pour prendre des mesures. Si nécessaire, nous donnerons des médicaments ou des crèmes pour les aider à guérir. Nous pouvons aussi leur fournir de la nourriture spéciale pour les aider à manger. Après certaines opérations, nous utiliserons des matériaux doux pour éviter d’endommager les implants. Les tests qui leur permettent d’interagir chaque jour contribuent aussi à leur bien-être. Tous ceux qui s’occupent des animaux sont formés pour le faire correctement. Enfin, si un animal doit être euthanasié, cela se fera de manière douce, sans douleur, pour minimiser ses souffrances.
Choix des espèces
La souris est un animal souvent utilisé pour étudier le cerveau chez les vertébrés. Son système nerveux est organisé de manière similaire à celui des humains, et elle partage environ 95% de ses gènes avec nous, ce qui permet de transposer les résultats obtenus chez la souris à l'humain de manière assez fiable. De plus, la souris peut être génétiquement modifiée, ce qui nous aide à comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans de nombreuses maladies. Par exemple, grâce à des modèles de souris génétiquement modifiées, nous pouvons étudier comment certaines mutations génétiques humaines affectent des molécules ou des récepteurs spécifiques dans le cerveau. Les souris adultes ont été choisies pour cette étude car elles présentent une maturation complète des systèmes physiologique et neurologique, nécessaire à l’analyse des processus socio-emotionnels. Plus spécifiquement, nous utiliserons des souris modifiées pour exprimer des mutations des récepteurs nicotiniques, liées à la dépendance à l'alcool chez l'humain. Les souris montrent également une variété de comportements sociaux et de réponses émotionnelles, ce qui en fait un modèle pertinent pour notre recherche sur les émotions et la consommation d'alcool.
Impact de l’immunité sur l’invasion intratumorale des bactéries dans le cancer du pancréas
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des souris reçoivent par chirurgie abdominale, sous anesthésie générale, une greffe de tumeur du pancréas, et une partie d'entre elles six injections qui éliminent leurs monocytes, macrophages et neutrophiles, trois avant la greffe et trois après. 60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec une prise de sang hebdomadaire sous anesthésie pendant trois semaines et un gavage tous les deux jours dont le contenu n'est pas précisé. L'objectif est de vérifier si les tumeurs de souris privées de ces cellules immunitaires sont davantage envahies par des bactéries. Le porteur ne décrit que des douleurs post-opératoires "modérées", une gêne "très passagère" au gavage et des risques d'infection accrus "légèrement", sans rien dire de la croissance des tumeurs, et classe pourtant l'ensemble en souffrance sévère. Toutes sont tuées à l'issue pour mettre leurs tumeurs en culture et y chercher des bactéries.
Objectifs
Le cancer du pancréas est généralement associé à un taux de survie relativement bas par rapport à d'autres types de cancer. Cette situation s'explique par plusieurs facteurs, notamment le diagnostic tardif, la nature agressive de la maladie et le manque de traitements efficaces dans les stades avancés. Le pancréas joue un rôle clé dans la digestion, en libérant des enzymes digestives, et dans la régulation de la glycémie, un élément crucial du métabolisme des glucides. Les traitements actuels pour le cancer du pancréas incluent la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie, les thérapies ciblées et l'immunothérapie, mais leur efficacité dépend du stade de la maladie. L'immunité innée et acquise protège généralement l'organisme, y compris contre les bactéries qui peuvent envahir les tumeurs. Dans ce projet, des bactéries ont été trouvées dans des tumeurs pancréatiques, même si elles étaient en petit nombre, suggérant qu'elles ont survécu aux divers composants du système immunitaire (cellules dendritiques, macrophages, neutrophiles, cellules NK, lymphocytes B et T). L'analyse métagénomique a révélé la présence de plusieurs ADN bactériens (impactant négativement le traitement contre le cancer) non détectés en culture, suggérant que ces bactéries ont pu être éliminées par le système immunitaire du patient, affaibli par le cancer. Deux études utilisant la transplantation de microbiote fécal (FMT) chez des souris ont montré que la modulation du microbiote influence la réponse immunitaire et la progression tumorale. FMT a permis d'améliorer la réponse à l'immunothérapie et de réduire la croissance tumorale dans un modèle de cancer du pancréas. Cela renforce l'hypothèse selon laquelle les bactéries intratumorales jouent un rôle dans la progression du cancer. L'objectif du projet est de démontrer que, dans un modèle de souris où l'immunité est complètement déplétée, la tumeur sera plus envahie par les bactéries par rapport à une souris immunocompétente.
Bénéfices attendus
Nous essayrons de comprendre ici si l’immunosurveillance, même affaiblie, empêche l’invasion bactérienne dans la tumeur afin de mieux comprendre le microenvironnement tumoral et son rôle dans la progression du cancer. Cela pourrait aider à identifier des biomarqueurs du statut immunitaire et orienter le développement de nouvelles thérapies, notamment en modulant le microbiome tumoral. Cette compréhension permettrait également d’optimiser l’utilisation de l’immunothérapie et de réduire les risques de complications infectieuses chez les patients. De plus, cela éclaire les interactions entre l’immunité et les bactéries, pouvant ainsi influencer la réponse aux traitements et les décisions cliniques.
Procédures
Les souris auront 1 prise de sang par semaine pendant 3 semaines, sous anesthésie générale (durée 5 minutes). La greffe des cellules tumorales se fera par chirurgie sous anesthésie générale et durera environ 5 min par souris. Le gavage oral dure moins d'une minute par souris et se renouvelle tous les 2 jours. La déplétion des monocytes, macrophages et neutrophiles (ou élimination) sera faite 7, 3 et 1 jour avant l'implantation de la tumeur et à 5, 9, 13 jours après l'injection de la tumeur, par injection (anesthésie locale, durée 10 secondes).
Impact sur les animaux
Douleur post-opératoires : l'ouverture de la cavité abdominale peut entraîner des douleurs post-opératoires modérées. Le prélèvement des fecès implique d'isoler l'animal pour une très courte durée, cela peut provoquer un léger stress temporaire (inférieur à 3 minutes). Le gavage oral est un geste technique car il nécessite de faire passer une sonde jusqu'à l'estomac, une gênelégère sera ressentie par l'animal mais sera très passagère (durée inférieure à 10 secondes). La déplétion des monocytes, macrophages et neutrophiles accroît légèrement les risques d'infections, altère la réponse immunitaire, entraîne des perturbations métaboliques (sasn effet clinique) et augmente modérément les risques d'inflammation intestinale.
Devenir
Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure, le but étant de cultiver les tumeurs pour évaluer la présence de bactéries intratumorales.
Remplacement
Nous n'avons pas de modèle de remplacement pour le moment, car ce modèle est encore trop récent dans notre laboratoire. Il est possible qu'à l'avenir, si le projet apporte des éclaircissements pertinents sur les cancers pancréatiques chez la souris (PDAC), nous générions des organoïdes afin de perfectionner les expériences futures. Actuellement, nous utilisons des anticorps déplétants, et dans ces conditions, un système vivant complet est nécessaire pour obtenir une déplétion efficace et observer les changements dans le comportement tumoral. Le principal problème étant que nous voulons savoir s'il y a également des bactéries communes dans l'intestin et les bactéries que nous trouverons dans le pancréas, dans ce cas-là, il est impossible à l'heure actuelle d'avoir un modèle nous permettant d'étudier cette possible interaction in vitro.
Réduction
Pour ces études, nous utilisons un modèle tumoral validé et déjà publié. Afin de mener à bien cette étude, nous avons prévu de regrouper les expérimentations de manière à minimiser le nombre d’animaux témoins, dans le respect des principes de la règle des 3R. Le nombre d’animaux est rigoureusement contrôlé pour optimiser les ressources tout en garantissant des résultats fiables. Pour garantir la fiabilité des données, les expériences seront réalisées en triplicata, avec des groupes de 4 souris chacun. Cependant, si des différences très significatives sont observées lors de la première répétition, les groupes suivants seront réduits, ce qui permettra de limiter l'utilisation d'animaux, tout en maintenant la robustesse statistique des résultats. Ce plan d'étude concilie l'exigence éthique et scientifique en optimisant le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions garantissant leur bien-être avec enrichissement environnemental adapté. Une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant le début de l’expérimentation afin de réduire le stress des animaux et d'assurer leur adaptation à l'environnement de laboratoire. Une surveillance quotidienne permettra d’observer tout changement comportemental et, si nécessaire, de mettre en place des adaptations ou des traitements. Toutes les injections seront administrées sous anesthésie locale afin de minimiser la douleur. Les souris seront pesées régulièrement, au moins une fois par semaine. Les points limites précoces seront strictement respectés et des soins adaptés seront prodigués, en consultation avec le vétérinaire, pour garantir le bien-être des animaux tout au long de l'étude.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. La génétique est proche de celle de l’Homme et bien connue. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, la plus susceptible d’apporter les résultats satisfaisants pour nous au vu des objectifs du projet. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines, ce qui correspond à leur maturité sexuelle et assure une stabilité hormonale. Cet âge est optimal pour garantir une réponse biologique cohérente et réduire les variations liées aux fluctuations hormonales. De plus, leur système immunitaire est pleinement développé, ce qui est essentiel pour l’étude de la progression tumorale et des réponses aux traitements, tout en permettant des interventions expérimentales sur une période prolongée.
Exploitation de l’activité des cytokines dans des environnements chimiques tumoraux complexes pour optimiser les immunothérapies dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Cancers
Manipulées tous les deux jours pendant deux semaines pour les habituer, des souris reçoivent ensuite une injection de cellules tumorales ou métastatiques, puis cinq jours d'injections du traitement étudié ou d'un placebo. Sur les 9790 souris du projet, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou sévère, 2240 reçoivent une nouvelle injection de cellules tumorales, 680 sont anesthésiées deux fois par semaine pour suivre leurs métastases par imagerie et 160 sont irradiées deux fois avant de recevoir des cellules immunitaires. Le but est de mettre au point des variantes de cytokines et de thérapies cellulaires adaptées à l'environnement chimique des tumeurs, comme leur acidité. Le porteur ne décrit que des douleurs et un stress "légers de courte durée", des tumeurs pouvant gêner les mouvements et une perte d'appétit, sans rien dire de l'irradiation ni de ce qui justifie le niveau sévère déclaré. Toutes sont tuées à l'issue, la récupération de sang et d'organes étant "essentielle", selon lui, pour juger de l'efficacité de ses thérapies.
Objectifs
Les cytokines (messagers du système immunitaire) et les thérapies cellulaires ont montré des résultats prometteurs dans le traitement de divers cancers. Cependant, l’efficacité de ces thérapies peut être considérablement influencée par l’environnement chimique extracellulaire (acidité, concentration élevée de certaines molécules, température, …) En effet, l'environnement qui entoure la tumeur est caractérisé par des propriétés chimiques uniques (comme une acidité élevée) qui peuvent avoir un impact sur le fonctionnement des cytokines et des cellules immunitaires. Il a été démontré que l’environnement acide altère l’activité de certaines cytokines et nuit à l’efficacité des thérapies cellulaires. De même, la concentration élevée de certaines molécules dans l’environnement des cellules peuvent moduler la fonction des cellules immunitaires et influencer l’efficacité des immunothérapies. Comprendre comment ces facteurs modulent les messagers du système immunitaire (ou cytokines) et l’activité cellulaire est crucial pour développer des stratégies thérapeutiques plus efficaces. Notre laboratoire se concentre sur l'étude de l'impact de l'environnement chimique extracellulaire sur la fonction de deux cytokines en particulier et sur les thérapies cellulaires. Nous visons à créer de nouvelles variantes de cytokines et de thérapies cellulaires optimisées pour fonctionner dans des microenvironnements spécifiques, caractéristiques des tumeurs, afin d'améliorer leur efficacité thérapeutique. Ainsi, en développant des variantes de cytokines conçues pour fonctionner de manière optimale dans ces microenvironnements spécifiques, nous visons à surmonter les limitations imposées par le microenvironnement tumoral et à améliorer l’efficacité des cytokines et des thérapies cellulaires.
Bénéfices attendus
Cette étude fournira des informations précieuses sur le rôle de l’environnement chimique extracellulaire dans l’efficacité des cytokines et des thérapies cellulaires dans le traitement du cancer. En comprenant d’abord comment les cytokines classiques (normales) sont affectées par le microenvironnement entourant les cellules, nous serons mieux placés pour concevoir et développer des cytokines modifiées qui seront adaptées pour fonctionner de manière optimale dans des microenvironnements spécifiques. Les résultats de cette étude pourraient conduire au développement de nouvelles stratégies visant à améliorer l’efficacité des cytokines et des thérapies cellulaires, bénéficiant ainsi aux patients atteints de cancer. De plus, comprendre l’impact de cet environnement sur la fonction des cellules immunitaires et l’efficacité du traitement contribuera à notre connaissance de l’immunologie tumorale et guidera la conception d’immunothérapies plus efficaces.
Procédures
Après leur arrivée et acclimatation (7 jours), les 9790 souris seront manipulées tous les 2 jours pendant 2 semaines avant le début des procédures pour réduire leur stress et les habituer à la manipulation humaine. Nous évaluerons d'abord la sûreté de nos traitements. Pour cela, 90 souris recevront les traitements à raison d'une injection par jour pendant 5 jours (1 min) puis 1 injection d'indicateur de toxicité sous anesthésie gazeuse (10 min). Ce projet comporte plusieurs parties dont plusieurs étapes sont communes. 9560 souris recevront une injection de cellules tumorales ou métastatiques (1 min). Puis, afin d'étudier les caractéristiques de notre traitement, les 9560 souris recevront ce dernier (ou placebo) par injection à raison d'une injection par jour pendant 5 jours (1 min). Parmi ces animaux, 2240 souris (140 naïfs et 2100 déjà exposées aux cellules tumorales) recevront une nouvelle injection de cellules tumorales 60 jours après la première (1 min). De plus, 680 souris recevront une injection 2 fois par semaine sous anesthésie gazeuse (anesthésie: 30 min) afin de suivre le développement des métastases par imagerie. Des prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse seront réalisés sur 3900 souris (3520 prélèvements uniques + 380 prélèvements 1 fois par semaine jusqu'à la fin du protocole, 3 min) En parallèle, l'ensemble de ces souris seront testées pour différents paramètres afin d'évaluer le mode de fonctionnement et l'efficacité de nos traitements. Test 1 : 1820 souris recevront 2 injections de traitement ou placebo à 3 jours d'intervalle (30 sec) Test 2 : 390 souris recevront le traitement ou placebo soit par injection 1 fois par jour pendant 11 jours soit par 1 injection tous les 3 jours jusqu'à la fin de l'expérience (30 sec) Test 3 : 900 souris recevront 2 injections de molécule d'intérêt (ou placebo) à 6 jours d'intervalle et 2700 souris recevront 1 injection de molécule d'intérêt (ou placebo) 2 fois par semaine jusqu'à la fin (30 sec) Test 4 : 50 souris recevront 1 injection d'une molécule permettant d'étudier la tumeur 13 jours après l'injection des cellules (30 sec) Test 5 : 720 souris recevront 1 injection 3 jours avant les traitements puis 2 fois par semaine jusqu'à la fin (30 sec). Test 6 : 160 souris seront irradiées 2 fois à 3h d'intervalle (irradiation: 10 min) puis 13 jours après l'injection des cellules et 1 jour avant le début de nos traitements, 160 animaux recevront 1 injection de cellules immunitaires (1 min)
Impact sur les animaux
Les injections de cellules tumorales entraîneront une douleur et un stress légers de courte durée et conduiront, en fonction du modèle, au développement de tumeurs pouvant entraver la liberté de mouvement des animaux. L'évolution de la pathologie induite (développement tumoral) pourrait causer une perte d'appétit et le cas échéant, une perte de poids. Les thérapeutiques envisagées seront administrées par injection ce qui entraînera une douleur et un stress légers de courte durée mais répétés à chaque administration de traitement. Les prélèvements sanguins seront source de stress pour les animaux lors de la contention et causeront une douleur et un stress légers de courte durée au moment de l'acte qui sera unique ou répété en fonction du modèle étudié.
Devenir
Pour l’ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort. En effet, la récupération d’échantillons (sang, organes) est essentielle pour déterminer l’efficacité de nos thérapies.
Remplacement
Dans la mesure du possible, nous menons des études in vitro poussées pour caractériser au mieux l'activité et le profil de sécurité de nos traitements d'intérêt avant de proposer des expériences sur les animaux. Ces études comportent l'évaluation de nos traitements d'intérêt dans différents environnement, leurs effets sur différents types cellulaires et leur absence de toxicité sur les cellules. En tirant parti de ces systèmes utilisant des cellules, nous générons des données précliniques robustes sur les mécanismes d'action, la puissance et les profils de sécurité de nos traitements d'intérêt fournissant ainsi une base scientifique solide pour les études in vivo proposées. Cette approche s'aligne sur le principe de remplacement car nous utilisons avec succès des méthodes sur cellules pour remplacer une partie importante des études sur les animaux qui auraient autrement été nécessaires.
Réduction
Pour chaque test que nous effectuons chez l'animal, nous recueillons un très grand nombre de données et d'informations à travers différents paramètres d'analyse. Cette approche permet d’obtenir un maximum d’informations pour chaque animal réduisant ainsi le nombre total requis d’animaux. Nous avons effectué des analyses statistiques pour déterminer le nombre minimum de souris requis par groupe pour obtenir des résultats robustes sur la base de nos données in vitro et in vivo déjà obtenues et des études publiées utilisant des modèles similaires. Pour l’analyse de nos données, nous prévoyons d'utiliser des méthodes statistiques appropriées pour analyser les différences entre les groupes de traitement. Nous utiliserons également des modèles statistiques afin de procéder au mieux à l’analyse des résultats obtenus.
Raffinement
Nous nous engageons à affiner nos protocoles et nos pratiques pour maximiser le bien-être des animaux et minimiser la souffrance et la détresse. Nos stratégies de raffinement englobent de multiples aspects du soin des animaux. Avant toute procédure, les animaux seront acclimatés un minimum de 7 jours dans leur zone d’hébergement. De plus, des actes d’habituation seront réalisés par les expérimentateurs afin de familiariser les animaux à la manipulation humaine. Tout acte pouvant entraîner souffrance, détresse ou stress sera réalisé sous anesthésie. Notre équipe examine attentivement le potentiel d'inconfort associé à chaque intervention et prend des mesures pour atténuer ces effets. Cela garantit que les animaux ne subissent pas de douleur ou de détresse inutile. Nous travaillerons également en étroite collaboration avec le personnel de l’établissement utilisateur ainsi que la structure de bien-être animal y étant rattachée afin de minimiser la souffrance et la détresse. Cela implique de maintenir des conditions environnementales appropriées et de fournir un espace et des ressources adéquats. L'enrichissement de l'environnement fera partie intégrante de notre programme de soins aux animaux. Des éléments et des structures d'enrichissement seront fournis pour permettre aux souris de présenter des comportements naturels, améliorant ainsi leur bien-être et favorisant des résultats expérimentaux plus pertinents sur le plan biologique.
Choix des espèces
Nous nous sommes concentrés sur le modèle murin qui a l’avantage de présenter des similitudes avec le modèle humain et pour lequel nous disposons d’un large panel d’outils moléculaires pour son étude. Le modèle murin est un modèle de choix pour l’étude du développement tumoral et de la réponse immunitaire. De plus, il s’agit du modèle le plus utilisé dans la communauté scientifique permettant ainsi les échanges internationaux des résultats. Les données disponibles dans la littérature faisant référence aux modèles de cancers que nous utilisons impliquent l'utilisation de souris âgées de 6 à 8 semaines d'âge. De plus, ces modèles sont bien établis au laboratoire, nous souhaitons donc garder les mêmes conditions expérimentales.
Cellules souches et réparation osseuse chez la souris- 7
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Des fractures, des défauts corticaux et des greffes osseuses sont provoqués chirurgicalement sur des souris sous anesthésie, en séances de trente à quarante-cinq minutes, complétées par des gavages, des injections de tamoxifène et des scanners aux rayons X de vingt minutes. 1 014 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Le porteur écrit qu'elles boitent les premiers jours puis retrouvent une activité normale, qu'elles gardent une apparence physique externe normale et que la réparation osseuse ne conduit pas à des dommages durables, alors qu'il déclare lui-même une part de ces procédures en gravité sévère. Toutes sont tuées à la fin des procédures pour l'analyse des tissus osseux, certaines expériences portant aussi sur des stades embryonnaires.
Objectifs
Ce projet de recherche vise à comprendre les mécanismes de la régénération osseuse pour développer de nouvelles thérapies cellulaires et pharmacologiques contre les maladies du système musculosquelettique, comme les défauts de consolidation après fracture. Actuellement, la chirurgie et les greffes osseuses sont les principaux traitements, mais la thérapie cellulaire pourrait offrir des solutions innovantes. En utilisant des modèles de souris transgéniques, nous explorons le rôle des cellules et des gènes impliqués dans la réparation osseuse. Ces modèles nous permettent également de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques et d’évaluer leur potentiel pour des applications humaines. Les procédures sont réalisées sous anesthésie, avec toutes les mesures pour assurer le bien-être animal. La réparation osseuse a lieu dans un environnement tissulaire complexe impliquant les os, les vaisseaux, les nerfs, les cellules inflammatoires et le muscle adjacent à l’os. Expérimentalement, il est impossible de reproduire la complexité de cet environnement dans un système cellulaire in vitro ou par modélisation mathématique. C’est pourquoi nous utilisons des modèles animaux nécessaires à la compréhension des mécanismes de la régénération osseuse. Dans ce projet nous nous concentrons sur le role des vaisseaux sainguins et des nerfs lors de fracture ou dans le cadre de maladies génétiques telles que les atteintes osseuses liées à la neurofibromatose de type 1. Il s’agit d’un projet multi-établissement concernant deux animaleries sur un même site, chaque animalerie étant couverte par une autorisation.
Bénéfices attendus
Les fractures sont les blessures les plus fréquentes du système musculosquelettique. Bien que la réparation osseuse soit un processus très efficace, environ 20% des fractures présentent un retard ou absence de réparation. Le traitement de ces défauts de réparation est complexe, nécessitant généralement une prise en charge chirurgicale. Ce projet va permettre de mieux comprendre les mécanismes de la régénération osseuse en condition physiologique et pathologique. D’un point de vue fondamental, il permettra une meilleure compréhension du rôle des différents acteurs cellulaires et de différentes voies de signalisation. Il s’agit également d’un projet permettant l’étude de nouveaux traitements sur les défauts de régénération osseuse. Les potentielles applications cliniques sont concrètes et ouvrivont la voie à l’utilisation de ces traitements chez les patients.
Procédures
Afin de répondre aux questions du projet, nous utilisons des modèles murins transgéniques, permettant le suivi et la déplétion des cellules d’intêret ou l’inactivation de gènes. L’administration du Tamoxifène ou de molécules est réalisée par injection intraperitonéale ou gavage. L’administration du gel d’endoxifène est faite sous anesthésie générale avec une analgésie péri- et post-opératoire (durée de la procédure entre 30 et 45 min). Une greffe , un défaut cortical ou une blessure osseuse sont induits sous anesthésie générale avec une analgésie péri- et post-opératoire (durée de la procédure entre 30 et 45 min). Des scans en imagerie par rayons X à haute résolution (microCT) sont réalisés sous anesthésie à l’isoflurane (3 à 4% en induction ; durée de scan est 20 minutes/souris).
Impact sur les animaux
Le processus de régénération osseuse est spontané. Le cal est formé en une semaine stabilisant la fracture et les animaux sont guéris après 3 semaines lorsque le cal est entièrement ossifié. Ils boitent les premiers jours mais ont une activité normale dans la cage (marchent, grimpent, boivent, se nourrissent etc...) et présentent une apparence physique externe normale.
Devenir
Les animaux sont sacrifiés à la fin de l’ensemble des procédures afin de permettre l’analyse tissulaire et cellulaire des tissus osseux.
Remplacement
Le processus de régénération osseuse est complexe et implique de multiples types cellulaires, dont l’activité coordonnée et les interactions sont indispensables. Ces évènements ont lieu dans un environnement tissulaire complexe impliquant des interactions entre l’os, les vaisseaux, le système immunitaire, le système nerveux et les muscles. Expérimentalement, il n'est pas possible de reproduire la complexité de cet environnement dans un système cellulaire in vitro, et il est nécessaire de recourir à l’utilisation de modèles murins. Toutefois, nous combinons les études in vivo avec des analyses cellulaires in vitro lorsque que nous cherchons à identifier des déficiences au niveau d’un type cellulaire particulier.
Réduction
Dans notre expérience et grâce à des analyses statistiques, nous avons déterminé les étapes de la régénération à analyser et une taille d'échantillon de 10 animaux par groupe pour fournir des résultats statistiques valables. Avec une taille d'échantillon de 10 dans chaque groupe de comparaison, la probabilité de détecter une différence est supérieure à 80 %. Nous utilisons différents tests statistiques et logiciels adaptés pour les analyses
Raffinement
Le processus de régénération osseuse est spontané et est complet en moins de 3 semaines. Les animaux sont suivis de façon régulière. Ils boitent les premiers jours mais ont une activité normale dans la cage (marchent, grimpent, boivent, se nourrissent etc...) et présentent une apparence physique externe normale. Nos expérimentations sont accompagnées d’une analgésie en péri- et post-opératoire. Des points limites ont été définis et permettent un suivi efficace des animaux et la mise en place de réponses adaptées le cas échéant grâce à une grille de scoring. Pour le bien-être animal, des enrichissements (coton, maisonnette, papier) sont placés dans les cages.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour étudier les mécanismes de la réparation osseuse, car les étapes de réparation ressemblent aux étapes observées chez l’homme. La souris permet d’analyser les bases génétiques de la réparation osseuse normale ou pathologique grâce aux nombreux outils cellulaires et moléculaires à notre disposition. La réparation osseuse est un processus physiologique très efficace en particulier chez la souris permettant de contrôler et traiter la douleur et ne conduisant pas à des dommages durables. Les procédures sont réalisées sur des animaux adultes entre 2 et 16 mois selon les procédures, mais aussi sur des stades embryonnaires afin de comprendre l’origine embryonnaire des cellules participant à la régénération osseuse.
Développement de modèles de souris pour valider la coopération oncogénique de différents gènes dans une pathologie hématopoïétique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Dix à douze prélèvements de sang hebdomadaires et jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie par animal : 1 856 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées entre la douzième et la quatorzième semaine suivant l'injection de cellules cancéreuses. Une partie reçoit ces cellules par voie intraveineuse, une autre sous la peau, pour reproduire les deux formes de la mastocytose. Le porteur signale que l'expansion des cellules dans la peau provoque des démangeaisons et que leur installation dans les membres inférieurs et le bassin gêne progressivement les déplacements, des mouvements d'étirement des pattes signalant selon lui une greffe qui prend. Il précise aussi que les souris d'élevage non utilisées sont tuées, en particulier les mâles, dont le taux de greffe est inférieur à celui des femelles.
Objectifs
Le projet vise à démontrer, chez l’animal, comment deux gènes mutés dans la même cellule contribuent au développement de la mastocytose, une maladie qui affecte plusieurs organes ou uniquement la peau. Nous pourrons ainsi valider les observations réalisées in vitro sur l'implication de nouveaux gènes dans la maladie et qui soulignent la nécessité de développer des traitements personnalisés ciblant les effets de ces gènes sur les patients. Avant de tester de nouveaux médicaments, il est crucial de comprendre comment ces gènes influencent la maladie.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet confirmeront la nécessité de développer des thérapies personnalisées ciblant les dérégulations qui ont lieu chez les patients. La réalisation de ce projet est indispensable avant de prévoir l’étude pré-clinique qui consistera à tester l’efficacité de nouvelles drogues. Cette stratégie a démontré son efficacité dans notre précédente étude.
Procédures
Une seule injection de cellules cancéreuses sera réalisée chez les souris, soit par voie intraveineuse (dans la veine) soit par voie sous-cutanée (sous la peau). L’injection, effectuée sous anesthésie générale dans les deux cas, dure seulement quelques secondes. Un petit échantillon de sang sera prélevé chaque semaine sur les souris ayant reçu une injection intraveineuse, avec un total de 10 à 12 prélèvements ; chaque prélèvement dure moins de 5 secondes. Ces animaux seront également examinés par imagerie 3 à 5 fois au total. Les deux méthodes d’analyse sont complémentaires pour le suivi précis de la cinétique de multiplication des cellules. Pour les souris ayant reçu une injection sous-cutanée, un seul prélèvement de sang sera réalisé à la 10ème semaine, pour vérification, car les cellules ne devraient pas migrer dans le sang. Le suivi de la greffe cutanée est fait par imagerie (8 au total). L’imagerie est réalisée sous anesthésie générale et dure maximum dix minutes.
Impact sur les animaux
L’anesthésie générale provoque une baisse de la température corporelle, un assèchement des yeux et un stress dû à la manipulation. L’injection des cellules pourrait provoquer une douleur légère et de courte durée après le réveil. L’imagerie peut entrainer du stress et une gêne de courte durée liée à l’anesthésie. Les prélèvements de sang, bien que brefs et sous anesthésie, peuvent provoquer du stress et une douleur légère durant les minutes qui suivent le réveil. L’expansion des cellules au niveau cutané peut provoquer des démangeaisons. L'expansion des cellules préférentiellement au niveau des membres inférieurs et du bassin, peuvent entrainer une difficulté progressive de se mouvoir. Des mouvements d’étirements des pattes indiquent une greffe réussie qui évolue, à surveiller de près.
Devenir
Les animaux utilisés sont mis à mort entre la 12ᵉ et la 14ᵉ semaine suivant l’injection des cellules, ce délai correspondant au stade où la greffe est suffisamment développée pour permettre l'analyse des souris. Les animaux d’élevage non utilisés sont mis à mort, notamment les mâles en raison d'un taux de greffe inférieur à celui des femelles.
Remplacement
Au cours des trois dernières années, nos recherches en laboratoire ont cherché à comprendre comment certains gènes interagissent dans la mastocytose, un type de cancer qui peut se manifester soit dans plusieurs organes, soit uniquement sur la peau. Cependant, ces études en laboratoire ont leurs limites, car elles ne reproduisent pas entièrement les conditions réelles, où l'environnement autour des cellules joue un rôle crucial dans le développement du cancer, sa propagation et la résistance aux traitements. Les souris sont essentielles pour recréer, même partiellement, les conditions pathologiques chez les humains et pour explorer comment les gènes interagissent afin de tester de futurs traitements. Par exemple, pour mieux étudier la forme cutanée de la maladie, nous utilisons des souris sans poils. Ce modèle nous aide à suivre de près comment les cellules cancéreuses envahissent la peau, de manière similaire à ce qui se passe chez les patients.
Réduction
Nous avons choisi deux types de souris pour notre étude en raison de leur pertinence pour notre travail et de leur utilisation fréquente en recherche. Le premier type nous aide à étudier le cancer quand il touche différents tissus dans le corps, tandis que le second est utilisé pour observer la forme du cancer qui se manifeste uniquement dans la peau. Grâce à notre expérience et aux informations recueillies de précédentes études, nous savons combien de cellules injecter, comment les tumeurs se développent avec le temps, à quelle fréquence nous devons prélever du sang, quand et comment réaliser l’imagerie et quand il est nécessaire de mettre fin à l’étude.
Raffinement
Dans le cadre de notre projet, nous mettrons en place des méthodes de raffinement qui visent à garantir que les modèles animaux sont traités de manière éthique et que leur bien-être est pris en compte. 1.Anesthésie pendant les procédures douloureuses d’injection ou de prélèvement de sang pour réduire la douleur et l'inconfort des animaux. 2.Monitoring de la santé : La surveillance régulière de la santé des animaux permet de détecter rapidement toute anomalie ou signe de détresse, ce qui permet une intervention précoce. 3. Enrichissement de l'environnement avec des éléments tels que des abris, des jouets, ou des matériaux à mâcher pour stimuler les comportements naturels et améliorer le bien-être des souris. 4.Protocoles de manipulation douce : Les procédures de manipulation des animaux doivent être effectuées avec précaution pour minimiser le stress, l'anxiété et la douleur. 5.Les étudiants travaillant avec les animaux sont formés pour mettre en œuvre les actes diminuant le stress. 6.Réduction du nombre d'animaux en utilisant le nombre minimal pour atteindre les objectifs du projet. 7.Respect les cycles circadiens et éviter les manipulations tardives.
Choix des espèces
Le modèle souris s'avère particulièrement approprié pour notre étude sur la mastocytose, car il répond à notre besoin de comparaison avec la pathologie observée chez les patients et repose sur des recherches préexistantes, éliminant ainsi la nécessité de mises au point supplémentaires. Les souris seront greffées entre 5 et 8 semaines d'âge. Les expériences antérieures montrent que ce stade est optimal pour une bonne prise de greffe dans les deux souches, bien qu'il soit possible de les greffer jusqu'à 12 semaines d'âge.
Etude du rôle d’EZH2 sur l’inflammation en imagerie à particule sur un modèle de polyarthrite murin
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse des tissus, chacune passant deux séances d'imagerie par semaine pendant six semaines, soit jusqu'à douze anesthésies, avec pose d'un cathéter dans la veine de la queue. Deux injections de collagène à trois semaines d'intervalle déclenchent chez elles une polyarthrite, puis viennent deux injections de traitement par semaine pendant trois semaines et une contention quotidienne de cinq à dix minutes. Le porteur indique que le gonflement des articulations peut gêner le déplacement et la préhension jusqu'à faire perdre du poids, et que l'irritation au point d'injection peut conduire l'animal à se gratter jusqu'à la plaie. Il attend de ces expériences l'identification d'une cible thérapeutique et le repositionnement d'un anticancéreux déjà commercialisé, bénéfices renvoyés à des étapes ultérieures quand les gonflements et les plaies, eux, sont prévus au protocole.
Objectifs
La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire chronique, caractérisée par une atteinte articulaire, souvent bilatérale et symétrique, évoluant par poussées vers la déformation et la destruction des articulations atteintes. Il s’agit du plus fréquent rhumatisme inflammatoire chronique, touchant entre 0,5 et 1% de la population mondiale, et touchant 4 fois plus les femmes que les hommes. Les premiers symptômes se traduisent par des douleurs articulaires, des rougeurs et des gonflements des articulations, en particulier des mains et des pieds. A l’heure actuelle, il n’existe pas de traitement de la PR, seulement des moyens de soulager la douleur ou réduire l’intensité des symptômes. Il est donc nécessaire de développer des médicaments à la fois efficaces contre la progression de la maladie mais aussi ses symptômes, ainsi que de développer des moyens diagnostics précoces. Différentes études suggèrent que la modulation d’EZH2, une histone méthyltransférase, pourrait être une cible thérapeutique intéressante pour le traitement de la PR. En effet, des études in vitro et in vivo ont démontré que l’inhibition d’EZH2 permet de réduire l’inflammation dans de nombreux contextes physiopathologiques. Plus particulièrement, le laboratoire a démontré que dans des modèles murins d’arthrose, une autre pathologie articulaire inflammatoire, l’inhibition d’EZH2 par un médicament, l’EPZ-6438, permet de réduire la progression de la maladie (destruction de l’articulation), et la douleur associée. Dans la mesure où, comme dans l’arthrose, l’expression d’EZH2 est augmentée dans l’articulation des patients arthritiques, il a été proposé que l’inhibition d’EZH2 pourrait réduire la progression de la PR. Dans ce contexte, le but de cette étude est d’évaluer l’effet de l’inhibition d’EZH2 dans un modèle expérimental de PR afin de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et d’envisager de nouvelles pistes de traitements. L'étude du rôle d'EZH2 sera effectuée in vivo grâce à l'imagerie à particules magnétiques (MPI). L'objectif est de tester un nouvel agent de contraste qui a montré une sensibilité de détection en MPI supérieure à celle en imagerie par résonnance magnétique (IRM).
Bénéfices attendus
Plusieurs laboratoires dont le nôtre ont démontré que l’inhibition d’EZH2 par l’EPZ-6438 ralentit la progression de l’arthrose en réduisant la dégradation du cartilage et l’inflammation articulaire, et améliore les fonctions motrices des souris ainsi que la douleur, ce qui suggère qu’EZH2 serait une cible thérapeutique intéressante dans le traitement de cette pathologie articulaire. Pour cette étude, nous nous attendons à des effets comparables voire plus prononcés dans la mesure où l’arthrite est une maladie articulaire à forte composante inflammatoire. Les bénéfices attendus sont donc l’identification d’une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la PR, capable d’induire une réduction des signes cliniques (réduction du gonflement et de l’inflammation sur les pattes des animaux). L’EPZ-6438 étant un traitement déjà utilisé en médecine humaine pour le traitement de certains cancers, une stratégie de repositionnement du médicament dans cette nouvelle indication pourrait être envisagée. Par ailleurs, la mise au point du protocole d’imagerie de l’inflammation par imagerie à particules magnétiques (MPI) devrait permettre d'imager de manière ultrasensible, spécifique et précoce l'inflammation articulaire. Cette nouvelle méthode de diagnostic pourrait être extrêmement utile pour le suivi des troubles articulaires inflammatoires.
Procédures
Les animaux recevront deux injections à 21 jours d’intervalle pour induire l'arthrite ainsi que deux injections par semaine pendant 3 semaines pour le traitement. Une contention régulière afin d’observer les animaux et les signes cliniques de la maladie seront nécessaires quotidiennement (5-10 min par jour et par animal). Des examens d'imagerie auront lieu deux fois par semaine pendant 6 semaines (moins d'une heure par jour, sous anesthésie). Pour l’imagerie, la pose d’un cathéter dans la veine de la queue est nécessaire (intervention sous anesthésie, 15min environ).
Impact sur les animaux
L’induction de l’arthrite se traduit généralement par le gonflement des articulations des pattes ainsi que par l’apparition de rougeurs. Ces gonflements, s’ils atteignent un stade élevé, peuvent induire des difficultés à se déplacer et à la préhension et donc des difficultés à se nourrir et à une réduction de la mobilité. Une perte de poids significative peut donc être attendue. L'injection de collagène à la base de la queue peut générer une irritation conduisant la souris à se gratter au point d'injection et à former des plaies. Aucun effet secondaire ou mortalité n’ont été mis en évidence sur les souris après administration répétées du médicament, l'EPZ-6438, par gavage ou par injection dans la littérature. Les examens d’imagerie se dérouleront sous anesthésie générale des animaux mais la pose du cathéter veineux dans la queue pour l'administration de l'agent de contraste peut provoquer un hématome.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure afin de procéder à des analyses des tissus.
Remplacement
Au sein de notre projet scientifique, nous étudierons l’impact d’un traitement contre la polyarthrite rhumatoïde, une maladie inflammatoire chronique qui touchent plusieurs articulations. La physiopathologie est complexe avec l’implication de nombreuses cellules immunitaires (lymphocytes, macrophages, etc) et articulaires (chondrocytes, synoviocytes), ne permettant pas de récapituler l’ensemble des processus in vitro. Ainsi, l’impact du traitement par un inhibiteur d'EZH2, l’EPZ-6438 sur l’évolution de la maladie (notamment gonflement des pattes et rougeurs) ne peut pas être évalué sur un modèle ex vivo ou in vitro. Des tests in vitro ont été réalisés sur l'agent de contraste utilisé en imagerie à particules magnétiques et ont permis de montrer que les propriétés magnétiques des microparticules conféraient un signal spécifique en imagerie à particules magnétiques (MPI). Toutefois, les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro et il est nécessaire d'estimer l'affinité de l'agent de contraste pour les molécules d'adhésion présentes au niveau des vaisseaux sanguins exprimées en conditions inflammatoires. D'après des études pilotes, on sait que l'agent de contraste cible efficacement l'inflammation dans d'autres pathologies et l'on souhaite savoir si ce ciblage sera détectable en imagerie MPI pour révéler l'inflammation articulaire dans la polyarthrite rhumatoide. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Dans des études précédentes, il a été montré que 10 animaux par groupe étaient suffisants pour obtenir une différence significative du signal en imagerie par résonance magnétique. Cependant, les données cliniques de l’arthrite indiquent que le sexe a une influence significative sur le développement de la pathologie et notamment la mise en place de la réponse du système immunitaire, nous souhaitons donc étudier l'effet du sexe. Nous prévoyons donc des groupes composés de males et de femelles. Deux modèles d'arthrite seront étudiés : un modèle de poussée et un modèle précoce de la maladie. L'incidence de l'arthrite dans le modèle de poussée est compris entre 80 et 100% tandis que l'incidence de l'arthrite dans le modèle précoce est compris entre 30 et 60%. Ainsi, un total de 60 animaux pour le modèle de poussée est nécessaire, mais 120 animaux seront nécessaires pour le modèle précoce de la maladie. Un total de 180 animaux sont donc nécessaire pour cette étude.
Raffinement
Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour évaluer et réduire au maximum tout risque de douleur. Des points limites ont été definis pour chaque procédure. Les gestes susceptibles d’entraîner une douleur ou un stress seront réalisés sous anesthésie et l'administration d'un analgésique est prévu pour limiter la douleur. Les conditions de vie seront améliorées au maximum (5 souris maximum par cage, ajout de matériel de nidication et igloo en carton).
Choix des espèces
Deux souches de souris seront utilisées dans ce projet. L'injection de collagène de type II chez la souris DBA/1J entraine le développement d’arthrites sévères par réaction auto-immune, ce qui représente un bon modèle des phases de poussée de la maladie. La deuxième souche de souris mime les phases précoces de la maladie chez l’homme, avec l’apparition d’une arthrite moins sévère. Les souris utilisées sont âgées de 7 semaines, elles sont alors adultes et ont fini leur croissance.