Souris
Etude in vivo chez la souris du mécanisme de régénération de la rétine
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
2 719 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 134 d'entre elles et modéré pour 1 585. Sur les 2 014 souris génotypées par biopsie de la queue, seules 880 portent le génotype recherché et reçoivent trois injections dans l'abdomen à 24 heures d'intervalle. 1 045 souris reçoivent une injection dans le globe oculaire sous anesthésie générale, répétée 48 heures plus tard pour 760 d'entre elles, et 705 autres reçoivent une molécule dans leur eau de boisson pendant trois à cinq jours. Les souris au génotype recherché sont tuées pour analyser leurs deux rétines, les mâles sans ce génotype sont tués aussi, les femelles sans ce génotype étant gardées pour la reproduction.
Objectifs
La rétine des mammifères n’a pas de capacité d’auto-réparation en cas de maladie neurodégénérative. Toutefois, certaines cellules de la rétine (dîtes « cellules de Müller ») ont gardé un certain degré de capacité régénérative que l’on peut stimuler grâce par exemple à l’ajout de facteurs de croissance. Ainsi traitées, elles sont capables d’effectuer les premières étapes de la régénération, et dans une faible mesure elles donnent ensuite naissance à quelques nouveaux neurones (neurogenèse). Afin d’étudier les processus de régénération, nous utilisons des explants de rétines de souris cultivés ex vivo. Nous pouvons ainsi facilement étudier le comportement des cellules de Müller dans différentes conditions expérimentales. Nous avons remarqué lors de la culture de tels explants rétiniens que les cellules de Müller n’ont pas toutes la même capacité à proliférer selon leur localisation dans la rétine. Notre objectif est d’une part de déterminer si cette répartition spatiale est également vérifiée in vivo et d’autre part de caractériser les mécanismes qui sous-tendent ces différences de capacité proliférative. In fine, ce projet devrait nous permettre de découvrir chez la souris des facteurs qui pourraient réveiller les propriétés régénératives de la rétine.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet devrait permettre de mieux comprendre pourquoi les mammifères sont dépourvus de capacité régénérative rétinienne efficace. Les expériences mises en œuvre ont pour but d’évaluer in vivo l’efficacité de facteurs favorisant la prolifération et la neurogenèse de la rétine de souris. La perte de vision chez l’homme est un problème de santé publique majeur. Ainsi, à long terme, nous espérons que ce projet contribuera au développement de stratégies thérapeutiques régénératives qui n’existent pas à l’heure actuelle.
Procédures
- Génotypage et identification : 2014 animaux (dont seuls 880 animaux ayant le génotype d’intérêt seront alors injectés en intrapéritonéal). - Injection intrapéritonéale : 880 animaux (3 injections à 24h d'intervalle). - Injection intravitréenne (dans les deux yeux, 4 minutes au total, sous anesthésie générale) pour 1045 animaux dont 760 auront la procédure répétées 48h après. - Ajout d’une molécule dans l’eau de boisson des animaux : 705 animaux.
Impact sur les animaux
- L’injection intrapéritonéale permettra d’induire l’expression d’une molécule fluorescente spécifiquement dans les cellules de Müller ou dans les microglies. La molécule que l’on utilise peut entraîner une perte de poids. - L’injection intravitréenne est un acte de chirurgie légère couramment utilisé en ophtalmologie, réalisé chez l’homme sous anesthésie locale, et sans traitement post- ou pré- opératoire anti-douleur ou anti-inflammatoire. Les risques de l’injection intravitréenne sont la déshydratation et l’infection oculaire. - L’ajout d’une molécule à l’eau de boisson des souris : Cette procédure sera mise en œuvre de façon chronique pendant 3 ou 5 jours lors des expériences visant à étudier la prolifération des cellules de Müller. Les effets secondaires possibles quand la durée de l’expérience excède une semaine (ce qui n’est pas notre cas) sont une leucopénie, une anémie, et des effets possibles sur la muqueuse gastrointestinale qui peuvent se manifester sous la forme de diarrhées.
Devenir
Les animaux ayant le bon génotype seront euthanasiés à la fin des procédures pour permettre les analyses sur les deux rétines des souris. Les mâles ne présentant pas le bon génotype seront euthanasiés. Les femelles ne présentant pas le bon génotype seront gardées et utilisées pour les accouplements.
Remplacement
La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie par le fait que la rétine est un tissu complexe composé de nombreux types de neurones dont les interactions sont cruciales pour générer un signal visuel qui sera transmis au cerveau par l’intermédiaire du nerf optique. Dans ce contexte on ne peut pas se passer de l’utilisation d’animaux car les mécanismes de mort cellulaire ou de régénération sont influencés par le micro-environnement (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique...) qui ne peut être reproduit en culture cellulaire. Pour ces différentes raisons, des méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour ce projet correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides. Nous avons réalisé un test de puissance afin de déterminer la taille de l’échantillon. Ainsi calculé, le nombre de souris par lot est de 5 souris. Nous utiliserons systématiquement les deux yeux de l’animal ce qui permet de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
- L’identification par tatouage digital est une méthode qui cause peu de perturbations chez l'animal quel que soit l'âge. La biopsie caudale est prélevée juste après le tatouage. En dessous de l’âge de 10 jours, la queue est moins ossifiée que chez un animal plus âgé, la biopsie caudale peut donc être plus courte que chez un animal plus âgé, entraînant une moindre réaction. - Injection intrapéritonéale : afin de prévenir la perte de poids transitoire liée à l’injection intrapéritonéale, nous mettrons à disposition dans la cage un booster qui se présente sous la forme d’un gel contenant des nutriments à haute valeur calorique et appétant. Cela permettra d’enrichir le lait maternel à destination des petits non sevrés injectés, et ce jusqu’à leur sevrage. Après sevrage des croquettes enrichies mouillées seront mises à disposition dans la cage et ce jusqu’à l’âge de 30 jours. - Injection intravitréenne : avant l’injection intravitréenne, en plus de l’anesthésie générale, une anesthésie locale oculaire sera réalisée, puis une goutte de gel hydratant sera déposée sur l’œil. Après l’injection, une goutte de gel hydratant sera déposée sur l’œil des animaux pour préserver la cornée et empêcher l’apparition de cataracte. Après l’injection intravitréenne, les souris seront déposées dans une cage de réveil posée sur un tapis chauffant afin d’éviter l’hypothermie. Les animaux seront ensuite surveillés jusqu’au réveil puis quotidiennement jusqu’à la fin de l’expérience. Une grille d’évaluation de la douleur est utilisée pour apprécier l’état des animaux. Si des signes de mal être ou de gêne se manifestent, ou en cas de perte d'appétit ou de prostration, les animaux seront soit soignés soit euthanasiés selon les critères de la grille établie. - Modification de l'eau de boisson : pour éviter l’aversion des souris envers l’eau de boisson modifiée, celle-ci sera supplémentée avec du glucose pendant les 3 ou 5 jours selon la procédure.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines y compris dans le domaine de l'ophtalmologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins présentant de manière spontanée une dégénérescence rétinienne mimant les pathologies humaines. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Nous utiliserons des souris âgées de 15 jours à 35 jours correspondant respectivement à un stade « adolescent » et « adulte ». En effet, les analyses réalisées précédemment au laboratoire dans d’autres projets ont toutes été réalisées dans cette fourchette de temps. Par ailleurs, dans le cas des procédures nécessitant l’injection intrapéritonéale, nous devons réaliser l’injection sur des souris de 15 jours pour laisser le temps nécessaire à l’expression de la molécule fluorescente (environ 15 jours sont nécessaires).
Induction d’un syndrome métabolique (obésité, diabète, stéatose hépatique non alcoolique) par un régime riche en graisse et/ou en sucre chez des rongeurs (souris, rats, hamsters)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 500
Hamsters dorés : 2050
20 550 rongeurs vont être utilisés, 18 000 souris, 500 rats et 2 050 hamsters dorés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, léger pour 50 hamsters. Ils reçoivent pendant 34 semaines au maximum une nourriture riche en graisse et une eau sucrée, jusqu'à développer obésité, diabète, dyslipidémie et stéatose hépatique, pouvant aller jusqu'à la fibrose, la cirrhose ou un cancer du foie. Une goutte de sang leur est prélevée à la queue ou à la veine saphène sans anesthésie, jusqu'à deux fois par jour. La majorité de ces animaux sont ensuite expédiés à un laboratoire de recherche pour être utilisés dans son propre projet, les hamsters sur lesquels le personnel s'est entraîné aux prélèvements étant tués, et le porteur écrit que l'effectif a été fixé à la demande de ses partenaires, sans qu'"aucune approche statistique" ait été réalisée.
Objectifs
A l’échelle mondiale, les maladies liés au surpoids représentent une part non négligeable des décès estimé à plus de 1,2 million par an. En 2016, 650 millions d’adultes étaient obèses, soit 3 fois plus qu’en 1975. En 2021, le diabète affecte plus de 537 millions de personnes. La dyslipidémie et la NASH (stéatose hépatique non-alcoolique) sont provoqués par le diabète et l’obésité. La dyslipidémie touche quelques milliers de patients chaque année en France et la société nationale française de gastro-entérologie considère qu’un quart de la population française est touché par la NASH. Par l'alimentation de rongeurs avec un régime riche en lipides et/ou glucides, il est possible d'induire ces phénotypes spécifiques : obésité, dyslipidémie, diabète et NASH. Ces rongeurs avec syndromes métaboliques seront utilisés pour évaluer les effets de médicaments.
Bénéfices attendus
Ce projet aura des bénéfices pour l’homme. Ce projet pourra amener à long terme des solutions thérapeutiques pour traiter les syndromes métaboliques du surpoids et du diabète. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.
Procédures
Les animaux auront à disposition un aliment standard et/ou un aliment riche en gras et une eau standard et/ou une eau additionnée de sucre, mis en ad libitum pendant 34 semaines maximum. Une mesure glycémique pourra être faite sur les animaux en aigue (2 mesures par jour et par animal avec 3 jours de récupération entre 2 séries de mesures) ou en chronique (une mesure par animal par semaine). Une goutte de sang (environ 50 µl) est recueillie après piqure, à l’aide d’une aiguille de taille adaptée sans anesthésie, de la queue au niveau de la veine caudale pour la souris et le rat, et à la veine saphène pour le hamster.
Impact sur les animaux
Au fil de la prise alimentaire riche en gras et de l’abreuvement riche en sucre, les animaux pourront exprimés des signes cliniques plus ou moins modérés. Les animaux vont développer une obésité et des syndromes métaboliques tels diabète, dyslipidémie, insulino-résistance, NASH pouvant aller jusqu’à une fibrose, une cirrhose ou un cancer du foie à long terme (après la phase préparatoire).
Devenir
La majorité des animaux sont expédiés à un laboratoire de recherche pour une utilisation dans son projet de recherche. Les hamsters d’entrainement pour le prélèvement sanguin seront mis à mort et pourront servir à de la formation post-mortem du personnel.
Remplacement
L’induction de modification métabolique chez l’animal fait intervenir plusieurs types cellulaires produisant des facteurs tendant à moduler ou amplifier la réponse. Toute cette cascade d’événement faisant intervenir des facteurs autocrines, paracrines ou exocrines aussi variés que complexes ne permet pas une étude significative et déterminante in vitro. Par ailleurs, l'objet de cette étude est d'évaluer l'impact sur une fonction vitale de l'organisme, ce qui ne peut être fait que sur un organisme vivant.
Réduction
Nous réalisons ce protocole alimentaire à la demande de nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux pour atteindre leur objectif scientifique. Aucune approche statistique n'a été réalisée.
Raffinement
Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long de cette phase préparatoire. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modèle. Enfin, les contentions et prélèvements seront réalisés par un personnel formé et expérimenté.
Choix des espèces
Les souris, rats et hamsters sont des espèces animales les plus pertinentes par la proximité physiologique avec l'Homme et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur les maladies métaboliques liés au surpoids car elles développent naturellement ce type de pathologie ayant une affinité à la nourriture grasse et sucrée similaire à l’Homme. Pour les hamsters syriens dorés, ils ont un métabolisme des lipoprotéines imitant la dyslipidémie humaine car il exprime la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP). Les animaux pourront commencer le régime alimentaire à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimum) et seront expédiés aux laboratoires de recherche à l’âge demandé.
Evaluation de probiotiques dans un modèle murin de maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Gavées chaque jour pendant huit semaines au maximum, ou piquées quotidiennement sous la peau ou dans l'abdomen, 2 376 souris reçoivent de la roténone, un pesticide qui provoque chez elles des lésions et des symptômes proches de la maladie de Parkinson. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré pour 1 080 d'entre elles et sévère pour 1 296, et toutes sont tuées à la fin pour prélever des organes. Perte de poids, troubles moteurs, troubles cognitifs et troubles digestifs sont attendus, puisque le modèle vise à reproduire la maladie. Le porteur annonce des tests évaluant les performances motrices et cognitives, sans préciser lesquels, et des isolements de deux heures pour mesurer le temps de transit intestinal.
Objectifs
La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative qui représente un problème majeur de santé publique. Son diagnostic clinique repose sur des symptômes moteurs : rigidité, tremblements, altération des réflexes posturaux et lenteur des mouvements volontaires. Il existe de nombreuses autres complications dues à cette maladie : troubles cognitifs et sensoriels, douleurs, troubles du sommeil par exemple. Quatre-vingts pour cent des patients atteints de la maladie de Parkinson ont également des troubles gastro-intestinaux, qui précèdent généralement l’apparition des troubles moteurs, et qui empirent avec la progression de la maladie. Il s’agit généralement de constipation, mais aussi de reflux ou d'un ralentissement de la vidange de l'estomac. Les causes de la maladie de Parkinson restent mal connues même si l’on sait que des facteurs environnementaux tels que l’exposition à des pesticides favorisent son développement. Le modèle de maladie de Parkinson induit par l’administration de roténone (pesticide) chez la souris est très documenté. Ce modèle induit des lésions comparables à celles retrouvées chez les malades : troubles moteurs, perte de neurones dopaminergiques, et accumulation d’α-synucléine, une protéine qui va former des agrégats dans le cerveau des malades. De plus, il a été montré que la roténone induit des symptômes gastro-intestinaux et une altération du microbiote intestinal chez le rongeur. Des études précliniques montrent que les probiotiques pourraient avoir un effet bénéfique dans les différents symptômes de la maladie de Parkinson. Le projet ici proposé s’articule en 2 étapes : la première consiste à développer un modèle préclinique de la maladie de Parkinson chez la souris via une administration de roténone, la seconde consiste à tester sur ce modèle les effets potentiellement bénéfiques de probiotiques avec ou sans substances pharmacologiques ayant des propriétés similaires aux médicaments utilisés pour compenser les déficits affectant les patients.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’évaluer l’efficacité de probiotiques associés ou non avec des substances pharmacologiques sur les symptômes neurologiques et gastro-intestinaux induits par la maladie de Parkinson. Cette maladie touche environ 1% de la population de plus de 60 ans et représente un problème majeur de santé publique, d’autant plus que son incidence croît en raison du vieillissement de la population. Les traitements actuels ont une efficacité qui ne perdure pas dans le temps avec de nombreux effets secondaires, il est donc important de développer de nouveaux traitements.
Procédures
Les traitements nécessiteront des gavages quotidiens ou des administrations sous cutanées ou intra péritonéales quotidiennes sur animaux vigiles. Ces administrations seront effectuées par du personnel expérimenté pour limiter le stress de l'animal. Les gavages seront effectués à l'aide de sondes souples pour limiter les irritations et auront lieu pendant 8 semaines maximum. Des test comportementaux qui évaluent les performances motrices et cognitives seront également réalisés sur des animaux vigiles. Ceux ci auront lieu pendant une semaine maximum et pourront varier entre 2 et 10 minutes. Enfin, certains animaux pourront être isolés (2 heures maximum) afin d’évaluer le temps de transit intestinal.
Impact sur les animaux
Dans ce modèle, différents symptômes sont attendus puisqu’il s’agit de reproduire les symptômes de la maladie de Parkinson décrits dans la littérature scientifique : perte de poids, troubles moteurs, cognitifs et troubles gastro-intestinaux. Certains traitements nécessiteront des gavages quotidiens sur animaux vigiles. Ceux-ci seront effectués par du personnel expérimenté pour limiter le stress de l'animal et avec des sondes souples pour limiter les irritations et auront lieu pendant 8 semaines maximum. Un stress dû à l’isolement des animaux lors de la mesure du temps de transit peut également avoir lieu.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes pour des études histologiques.
Remplacement
La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative complexe avec des symptômes qui touchent différents organes. Les méthodes expérimentales in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire l’ensemble des symptômes de cette maladie, il est donc nécessaire de travailler sur un organisme entier.
Réduction
La variabilité des réponses aux effets d’un traitement donné par voie orale chez le rongeur justifie une taille minimale de groupe de 12 animaux par condition expérimentale. Un effectif inférieur exposerait à un risque de devoir reproduire les procédures pour valider la solidité des résultats.
Raffinement
Les animaux seront hébergés à plusieurs afin de maintenir leur socialisation et dans des cages enrichies. Les administrations par voie orale seront effectuées sur des animaux vigiles par du personnel expérimenté, à l’aide de sondes souples pour limiter les irritations. Les symptômes moteurs induits par une administration de roténone seront évalués quotidiennement, et un raffinement de l’hébergement sera mise en place si ceux-ci sont importants (e.g. croquettes posées sur le sol de la cage ou la mise à disposition d’aliment semi-liquide pour faciliter la prise alimentaire). Les animaux seront observés attentivement en respectant les points limites mis en place. Ils seront mis à mort en cas d’atteinte des points limites mis en place pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse.
Choix des espèces
Après une étude de la littérature scientifique, la souris est le modèle fréquemment décrit. Etant donné les modèles décrits dans la littérature, des animaux mâles adultes seront utilisés pour toutes les procédures.
Développement d’un modèle murin de délétion du gène codant un récepteur sensible au froid dans le foie.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Quinze souris vont être utilisées pour vérifier qu'un virus injecté supprime bien un gène dans le foie, une mise au point technique dont le résultat servira à d'autres projets du laboratoire. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger et les quinze souris seront tuées pour prélever leurs organes. Chacune reçoit une injection unique du virus sous anesthésie générale, en moins de cinq minutes. Le porteur écrit avoir volontairement réduit les effectifs et n'attendre aucun effet indésirable, le projet servant à valider un outil pour des travaux ultérieurs sur le rôle d'un récepteur au froid dans les cardiopathies.
Objectifs
Parmi les récepteurs sensibles aux variations de température, le principal récepteur au froid est une protéine nommée « TRPM8 ». Plusieurs projets actuellement menés au laboratoire ont pour but de déterminer son rôle dans 1) l’apparition des complications cardiaques au cours de pathologies cardiovasculaires associées au diabète, 2) l'effet cardioprotecteur de l'hypothermie thérapeutique, dans le cadre de l’infarctus du myocarde et 3) les modifications des conditions mécaniques de circulation du sang observées lors d’une hypothermie et d’une anesthésie. Nous avons déjà acquis de nombreux résultats préliminaires prometteurs démontrant un rôle clef de TRPM8 dans le développement d’une pathologie cardiaque associée au diabète. Ces résultats suggèrent que ce rôle de TRPM8 découlerait en partie de son activité dans le foie. Pour aller plus loin dans les investigations, nous avons donc besoin de supprimer TRPM8 dans le foie, grâce à l’utilisation d’un virus permettant la modification du gène codant cette protéine, spécifiquement dans le foie de l’animal infecté. La validation de ce modèle technique nous permettra par la suite de réaliser les expériences clefs pour continuer nos projets. L’objectif du présent projet est donc de valider l’efficacité d’une approche virale de suppression de TRPM8 spécifiquement dans le foie.
Bénéfices attendus
A court et moyen-terme, l’outil validé dans ce projet (virus adéno-associé) sera utilisé pour poursuivre nos projets visant à préciser les mécanismes d’action de TRPM8 et son potentiel thérapeutique dans le cadre des cardiopathies.
Procédures
Les animaux seront soumis à une unique injection (du virus d’intérêt) sous anesthésie générale (introduction d’une aiguille – moins de 5 minutes)
Impact sur les animaux
L’anesthésie réalisée au moment de l’intervention peut induire un léger inconfort/stress de courte durée au moment de l’induction de l’anesthésie et au réveil (le cas échéant). L’intervention, qui consiste en l’introduction d’une l’aiguille pour l’administration du virus, induit une douleur légère de courte durée. Aucun effet indésirable n’est attendu en lien avec l’administration du virus aux doses prévues, (compte tenu des doses envisagées et de la construction du virus). Aucun effet indésirable n’est attendu non plus concernant la répression de TRPM8 dans le foie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le nécessaire prélèvement des organes.
Remplacement
Ce projet consiste à vérifier l’efficacité d’un virus à réprimer un gène d’intérêt spécifiquement dans le foie, chez un modèle de souris génétiquement modifié à cet effet. La mise au point de cette approche servira ultérieurement dans un projet de maladie chronique qui ne peut pas être réalisée par un autre moyen que l’expérimentation sur animal.
Réduction
Les effectifs ont été calculés afin de pouvoir évaluer la reproductibilité de la diminution de l'ADN génomique TRPM8. L'objectif est de voir une différence importante (minimum 50%). La précision de la mesure et sa validation statistique pourra être complété ultérieurement lorsque le modèle mis au point pourra être déployé pour étudier le rôle de TRPM8 dans le foie. De ce fait, les effectifs prévus ici sont volontairement très réduits. Grâce à l’expérience déjà acquise sur l’utilisation d'un autre virus au laboratoire, s’ajoutant aux données de la littérature, une seule dose de virus sera testée. De même, les voies d’administration et la durée d’infection sont déjà optimisées, maximisant les chances de réussite du projet. Le projet est organisé en étapes (la réalisation de la seconde étape est conditionnée à l’issue de la première), évitant ainsi toute utilisation pas ou peu pertinente d’animaux.
Raffinement
L’intervention (introduction d’une aiguille en vue de l’injection du virus) est réalisée sous anesthésie générale et couverture analgésique adaptée. L’anesthésie envisagée est une anesthésie gazeuse, permettant une durée d’anesthésie la plus courte possible. Pour toute la durée de l’anesthésie, la température corporelle de l’animal sera maintenue par le biais d’une couverture chauffante rétro-régulée (sonde rectale). Les animaux en réveil sont placés en couveuse chauffée. Des points limites spécifiques ont été mis en place.
Choix des espèces
Les modèles pathologiques d'infarctus du myocarde et de cardiopathie diabétique développés chez la souris miment très bien les pathologies humaines et permettent l’étude des mécanismes d’intérêt par les modèles génétiquement modifiés (animaux invalidés pour le gène du récepteur au froid notamment). Les animaux participant à ce projet auront entre 8 et 20 semaines (jeunes adultes). Ceci est concordant avec les autres projets du laboratoire en cours et donc avec la population d’étude.
Évaluation des mécanismes d’oncogenèse dans un modèle de leucémie chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
Les souris de ce projet subissent une biopsie du bout de la queue pour le génotypage, jusqu'à cinq ponctions de sang dans la joue sur animal vigile et, pour une partie d'entre elles, une injection de cellules leucémiques dans la veine caudale. 8 570 souris vont ainsi être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, celles qui développent la leucémie montrant fatigue et perte de poids quand les cellules cancéreuses dépassent 80 % des cellules du sang. Le porteur écrit qu'une partie des souris issues des croisements sera replacée dans l'élevage pour réduire le nombre d'animaux utilisés, et écrit aussi que tout animal inclus dans l'étude sera mis à mort. Les souris immunodéprimées, précise-t-il, "ne pourraient être remises en liberté" à l'issue du projet.
Objectifs
Les leucémies aiguës sont des cancers du sang très agressifs qui affectent principalement les enfants et les jeunes adultes. Ces cancers ont souvent un mauvais pronostic. Une des causes fréquentes de cette maladie est l'expression anormale d'une protéine spécifique, trouvée dans 25 à 50 % des cas. Cette protéine collabore avec une autre pour contrôler de nombreux gènes, mais son rôle exact dans la leucémie reste inconnu. Pour mieux comprendre la maladie et trouver de nouveaux traitements, des souris portant une combinaison de ces deux facteurs seront générées. De plus, le rôle d'un élément régulateur sera recherché grâce au croisement avec un autre modèle de souris transgénique. Dans ces deux modèles l'apparition de la leucémie sera suivie, les cellules et processus impliqués seront recherchés. Enfin, dans un troisième modèle, nous injecterons des cellules contrôles ou leucémiques chez des souris immunodéficientes pour étudier les mécanismes d'émergence de la leucémie.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de recréer chez la souris un type de leucémie très fréquent chez les patients. Il nous aidera à mieux comprendre les mécanismes biologiques à l'origine de cette leucémie spécifique et à voir comment les changements moléculaires se développent dans cette maladie. En comprenant mieux ces processus, nous pourrons identifier les partenaires de la protéine clé impliquée et proposer des traitements ciblés pour améliorer la prise en charge et le pronostic des patients.
Procédures
- Prélèvement caudal pour génotypage dans les dix jours suivant la naissance des animaux transgéniques : biopsie de la pointe extrême de la queue, 1 fois par animal, dure 2 à 3 secondes. - Prélèvements sanguins dans la veine de la joue sur souris vigile, uniquement pour une partie des animaux, de façon mensuel, hebdomadaire ou bi-hebdomadaire; maximum 5 fois/animaux; prélèvement dure moins d'une minute. - Injection de cellules dans la veine de la queue d'une partie des animaux, 1 fois/animal. L'injection dure entre 30 secondes et 1 minute.
Impact sur les animaux
La biopsie caudale et l'injection de cellules dans la veine caudale peuvent entraîner un léger saignement et une douleur légère. Les animaux au phénotype dommageable peuvent développer des signes cliniques dus à la progression de la leucémie lorsque les cellules cancéreuses représentent plus de 80% des cellules sanguines, principalement fatigue et perte de poids. Les prélèvements sanguins induisent une douleur de courte durée. La contention afin de réaliser les prélèvements sanguins et injections caudales de cellules peut entrainer un stress momentané chez les animaux. Les souris immunodéficientes présentent des altérations génétiques les rendant particulièrement vulnérables aux infections microbiennes.
Devenir
Afin de récupérer les cellules leucémiques toute souris transgénique ou ayant été injectée avec des cellules leucémiques sera mise à mort. Par ailleurs, les souris présentant une immunodepression ne pourraient être remises en liberté à l'issue du projet. Par conséquent, tout animal inclu dans cette étude sera mis à mort l'issue de cette dernière.
Remplacement
Les cellules utilisées en laboratoire pour étudier les leucémies sont différentes de celles trouvées dans le corps humain. Reproduire exactement la manière dont la leucémie se développe en laboratoire est difficile. De plus, il est compliqué d'obtenir suffisamment de cellules leucémiques directement des patients pour les études. Elles sont fragiles et ne peuvent pas survivre très longtemps en dehors du corps. Notre projet vise à comprendre comment la leucémie progresse dans différents organes comme le thymus ou la rate. Puisque nous ne pouvons pas obtenir ces échantillons directement des patients, nous utilisons des souris génétiquement modifiées pour simuler la maladie. C'est la meilleure façon de comprendre les leucémies avant de tester des traitements chez les humains.
Réduction
Le calcul du nombre d'animaux nécessaires au projet a été fait en tenant compte des statistiques de transmission de chacun des transgènes. Une partie des animaux issus des croisements n'auront pas le génotype souhaité et seront utilisés comme contrôle ou replacés dans l'élevage dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les effectifs ont été determinés afin d'être analysés avec des tests statistiques adaptés et permettre d'obtenir des résultats significatifs.
Raffinement
Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été définis et seront attentivement suivis. Pour prendre soin des souris, elles auront du coton, des bâtonnets de bois et des tunnels rouges pour jouer et construire des nids. Elles vivront en petits groupes pour éviter les disputes et le stress. Quand nous ferons des biopsies pour vérifier leurs gènes, nous désinfecterons leur queue pour éviter les infections et surveillerons la guérison. Les injections seront faites sous anesthésie locale avec des aiguilles très fines pour limiter la douleur. Les souris ayant un risque de développer une maladie seront suivies par ponction sanguine jugale afin d'anticiper et de prévenir l'apparition du phénotype dommageable induit par la leucémie. Si une souris perd trop de poids, nous lui donnerons de la nourriture spéciale. Les animaux seront observés tous les jours par les membres qualifiés de l'animalerie et au moins une fois par semaine par les responsables du projet.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix validé scientifiquement par la littérature pour étudier la leucémie. Nous ne pouvons pas utiliser d’autres espèces animales pour mimer la leucémie. Des souris adultes seront utilisées dans ce projet.
Développement de 5 modèles bioluminescents de cancer chez des souris immunodéprimées
- Recherche appliquée
- Cancers
Deux séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse de trente minutes par semaine pendant trois semaines, une injection hebdomadaire dans la veine de la queue ou dans l'abdomen, neuf pesées et neuf mesures de tumeur au pied à coulisse : 248 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever les tumeurs. Des cellules cancéreuses humaines leur sont greffées sous la peau du flanc gauche. Le projet met au point cinq modèles de cancer rendus luminescents, pour des études d'efficacité qui viendront ensuite. Le porteur explique avoir besoin d'animaux au système immunitaire fortement déprimé pour éviter le rejet des cellules humaines, et retient des souris de cinq à six semaines pour favoriser la prise tumorale.
Objectifs
La dissémination métastatique est une cause majeure de mortalité chez les sujets atteints de cancer. C’est un processus séquentiel dont les principales étapes comprennent le détachement de cellules cancéreuses de la tumeur primaire et l’invasion du tissu de l’hôte, leur pénétration et leur transport dans la circulation, puis leur adhérence à la paroi vasculaire de l’organe cible, leur extravasation et leur prolifération. Un cancer disséminé est le plus souvent résistant aux thérapies anti-cancéreuses actuellement disponibles car le processus métastatique est détecté tardivement et le microenvironnement des métastases renforce la résistance aux médicaments. Afin d’établir de nouveaux traitements efficaces chez les patients atteints de ces cancers,il est nécessaire de disposer de modèles animaux permettant de localiser précocement les métastases afin de pouvoir par la suite évaluer l’efficacité in vivo des différents traitements anti-cancéreux. L’imagerie du petit animal, désormais reconnue internationalement comme stratégique pour l’innovation comme pour le développement pharmaceutique, est une technologie en pleine expansion. Elle présente de nombreux intérêts, comme la détection précoce des tumeurs et des foyers métastatiques dans l’ensemble de l’animal, évitant le biais des mesures au pied à coulisse où il faut attendre que la tumeur fasse une certaine taille et qui ne permet pas le suivi des métastases.L’imagerie par bioluminescence est une approche basée sur la détection de lumière visible émise par des cellules ou des tissus exprimant la luciférase et peut être utilisée dans des études de croissance tumorale et d’études de la dissémination de métastases. Ce projet vise à développer et évaluer en suivi par imagerie par bioluminescence 5 modèles tumoraux d’indications différentes, métastatiques ou non, modifiés génétiquement afin d’exprimer le gène de la Luciférase puis injectés en sous-cutané dans des souris immunodéprimées. Les données issues de ce travail préliminaire offriront une plus grande précision sur leur localisation, la mesure uniquement des cellules tumorales vivantes (et non du tissu conjonctif) et l’identification des zones de nécrose au sein de la tumeur, procurant des informations précieuses sur la dynamique de progression de la tumeur,l'efficacité des nouveaux traitements thérapeutiques et une meilleure compréhension des mécanismes biologiques à l’œuvre dans chaque type tumoral
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. En cas de succès, ce serait une réelle avancée en termes de stratégie de développement préclinique. Ce projet permettra par la suite que de nombreux traitements soient testés en clinique.
Procédures
Une injection sous cutanée au niveau du flanc gauche, 30 secondes maximum - 1 injection intraveineuse à raison d’une par semaine dans la veine de la queue, 30 secondes ou 1 injection intrapéritonéale à raison d’une par semaine, 30 secondes ou 1 injection intrapéritonéale unique, 30 secondes. Au maximum 9 pesées et 9 mesures de la taille de la tumeur (1 min) à raison de 3 par semaine. Une anesthésie gazeuse d'une durée de 30min pour les séances d'imagerie à raison de 2 par semaine pendant 3 semaines.
Impact sur les animaux
Une perte de poids peut être envisagée (cumul de la pousse tumorale et des traitements). L’injection de cellules en sous cutané entrainant une croissance de la tumeur peut entrainer une gêne à la locomotion. Les injections en intrapéritonéal et en intra-veineuse hebdomadaires vont entrainer du stress (contention) et une douleur à l’injection. Le suivi tumoral au pied à coulisse sera réalisé sur les animaux en contention et donc générera du stress et éventuellement une douleur au niveau de la tumeur. Les traitements de référence sont très bien connus dans notre laboratoire et aucun des traitements n’a pas montré jusqu’à présent d’effets indésirables chez la souris aux doses choisies. Les anesthésies liées à l'imagerie peuvent éventuellement entrainer une hypoventilation,une hypotension ou une baisse de température.
Devenir
L'ensemble des animaux des procédures 1 et 2 seront mis à mort afin de prélever les tumeurs pour analyses.
Remplacement
Des tests in vitro ont été effectués au préalable et ont permis de confirmer la bonne croissance des cellules et l’expression suffisante du gène permettant la bioluminescence des cellules tumorales, mais nous avons à présent besoin de tester notre suivi en imagerie sur un animal vivant et entier. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion de la luciférine dans la tumeur et au sein de l’organisme nécessite de travailler sur un organisme entier et vivant. Pour cette raison nous devons effectuer ces études chez la souris.
Réduction
L’effectif des groupes a été déterminé de la façon suivante : il s'agit d'une étude préliminaire afin de déterminer la faisabilité et la pertinence du suivi ainsi que le nombre d’animaux minimum nécessaire à la réalisation de tests statistiques dans le cadre de nos futures études d’imagerie par bioluminescence. Nous estimons d’après notre connaissance des modèles et la littérature que nous aurons besoin de 8 souris par groupe pour la première procédure, et de 12 animaux par groupe pour la 2e procédure afin de pouvoir comparer l’efficacité du traitement de référence au groupe non traité et ainsi montrer que cette méthode est fiable pour un suivi d’efficacité. Nous utiliserons une analyse statistique afin de déterminer si une différence entre les deux groupes traité et non traité existe. Nous aurons donc besoin selon nos estimations de 248 animaux au total.
Raffinement
Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation de 7 jours et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en pratiquant la contention une fois par jour pendant 5 jours. Les expérimentateurs ont été formés à l’utilisation de l’imager et possèdent l’expertise en termes de technicité quant à la mise en place et le suivi des modèles utilisés ainsi que pour l’administration de traitements en intraveineuse et intrapéritonéale. Par ailleurs, l'état des animaux sera évalué par une grille de scoring sur des critères comportementaux (activité, isolement…), physiques (poils hérissés, dos voûté…) qui permettent de détecter rapidement une souffrance ou l’atteinte d’un point limite. Les critères observables sont évalués quotidiennement, les critères mesurables (poids, taille des tumeurs) sont évalués trois fois par semaine. Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Si jugé nécessaire, un traitement antalgique ou anti-inflammatoire sera immédiatement mis en place . Il sera mis à la disposition des souris des cotons pour faire leur nid et des tunnels.
Choix des espèces
Nous souhaitons travailler sur des tumeurs issues de cellules humaines afin d’être au plus près de la réalité clinique, nous avons donc besoin d’animaux présentant un système immunitaire fortement déprimé afin d’éviter le phénomène de rejet. La souris est l’espèce la plus adaptée pour cet objectif, la souche que nous utiliserons est un modèle qui permet une prise tumorale efficace avec de nombreuses lignées humaines. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale. Nous priviligierons des souris femelles, mais dans un souci de comparaison de prise tumorale, nous souhaitons inclure, pour 3 lignées de tumeurs non spécifiques des femelles, et des mâles, ainsi nous pourrons complétement exclure ce sexe si pas de résultats comparables avec celui des femelles.
Etude de l’innocuité de particules photoactivables pour la libération de biomolécules dans le cerveau
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une partie des souris viendra d'autres protocoles de l'animalerie, où elles étaient déjà vouées à la mise à mort. 336 souris au total vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie du crâne d'environ trente minutes pendant laquelle des particules chargées de médicaments et libérables par la lumière sont injectées dans une zone précise du cerveau, puis elle est suivie jusqu'à 28 jours avant d'être tuée. Le porteur affirme que la biocompatibilité de ces particules "ne peut être vérifiée que chez l'animal entier", tout en indiquant n'avoir jamais observé d'effet indésirable sur le comportement ou le tissu cérébral en plusieurs années.
Objectifs
Le projet de recherche dans lequel s'insère le présent projet consiste à développer une nouvelle approche pour la libération contrôlée de molécules dans le cerveau. Pour cela, nous utilisons des particules microscopiques qui contiennent les médicaments souhaités et qui peuvent les libérer à la demande, sous l'action d'une lumière délivrée à une couleur précise. L'objectif à long terme de ce projet est de proposer une nouvelle approche thérapeutique pour plusieurs maladies du cerveau. De nombreuses étapes du projet sont réalisées sans le recours à l'expérimentation animale, en vue de réduire le nombre total d'animaux utilisés. Cependant, la validation de la sécurité biologique de notre technologie nécessite l'utilisation de souris, d'où la présente demande.
Bénéfices attendus
Dans un premier temps, la mise au point de cette technologie permettra à plusieurs équipes de recherche en neurosciences de tester leurs hypothèses de recherche avec une approche pharmacologique plus ciblée que les outils disponibles aujourd'hui. Dans un second temps, ce projet rentrera dans le cadre d'une recherche translationnelle, pour que cette approche pharmacologique soit utilisée pour améliorer la prise en charge thérapeutique de certaines pathologies dont l'origine dans le cerveau est localisée, comme certaines épilepsies, les glioblastomes, les accidents vasculaires cérébraux, ou encore la maladie de Parkinson.
Procédures
Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales de type stéréotaxique (à l'aide d'un atlas anatomique), visant à injecter des médicaments encapsulés dans des zones précises du cerveau. Pour chaque animal, la procédure chirurgicale dure environ 30 min entre le moment où ils sont endormis et le moment où ils se réveillent. Chaque animal ne subira qu'une chirurgie.
Impact sur les animaux
Les chirurgies à réaliser présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. Cependant, nous avons maintenant plusieurs années de recul et nous n'avons jamais observé d'effet indésirable chez les animaux injectés avec les particules, que ce soit sur leur comportement, ou sur leur tissu cérébral.
Devenir
Tous les animaux suivront la même procédure, afin de quantifier la biocompatibilité des médicaments encapsulés injectés dans le tissu nerveux, jusqu'à 28 jours après injection. L'issue de la procédure est la mise à mort de l'animal.
Remplacement
Le projet scientifique dans lequel s'insère ce projet prévoit un grand nombre d'expériences utilisant des modèles de culture cellulaire, et ce précisémment en vue de remplacer les modèles animaux. De plus, de nombreuses expériences du projet ont déjà été réalisées en solution ou dans des gels d'agarose, afin de caractériser les propriétés des particules développées pour le projet, sans avoir recours à l'expérimentation animale. Cependant, la biocompatibilité des particules pour le cerveau ne peut être vérifiée que chez l'animal entier, d'où la présente demande d'autorisation.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes, évitant la répétition des expériences. A chaque fois que ce sera possible, nous utiliserons pour nos expériences des animaux déjà présents à l'animalerie, issus d'un autre protocole, et qui ne peuvent plus être utilisés différemment (donc destinés à l'euthanasie). Par ailleurs, des expériences de biocompatiblité ont déjà été réalisées avec un suivi longitudinal, chez des animaux suivis pendant une longue période avec de l'imagerie in vivo. Même si cette approche apporte des réponses essentielles, elle n'est pas suffisante pour quantifier avec précision le devenir des particules dans le cerveau, d'où la nécessité du présent projet.
Raffinement
Dans ce projet, nous appliquerons les conditions d'hébergement optimales pour les animaux, ainsi que les points limites et les points d'arrêts précoces et adaptés, tels que définis par la structure Bien-Etre Animale de l'établissement utilisateur. Ainsi, les souris seront hébergées par 5 avec présence de différents enrichissements et une surveillance quotidienne sera réalisée (comportement général, disponibilité en eau et nourriture). En cas de nécessité, les soins à apporter seront réalisés rapidement, avec sollicitation des vétérinaires du site si besoin. Pour les chirurgies, les soins pré- et pos-opératoires seront appliqués et notifiés. Tout au long du projet, l'anesthésie, l'analgésie et l'euthanasie seront mises en place de façon appropriée par des expérimentateurs formés et expérimentés. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille basée sur des scores de 0 à 3 et seront consignés sur une fiche de scorage. Dans le cas d'un score préoccupant (>9), l'animal sera euthanasié dans les 48h au plus tard si son état ne s'améliore pas malgré les soins délivrés.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille, elles peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. C'est aussi le modèle le plus couramment utilisé pour les études qui se rapprochent du présent projet. De plus, les outils utilisés (anticorps, microscopes etc.) sont les plus développés (et donc les plus efficients) pour la souris. En outre, nous sommes dans une démarche de ré-utilisation d'animaux déjà présents à l'animalerie pour nos expériences, or l'animal le plus présent dans notre animalerie est de loin la souris (pas de rats ou d'autres animaux actuellement pour notre laboratoire). Nous utiliserons des animaux adultes, car les chirurgies stéréotaxiques sont plus faciles à réaliser chez des animaux déjà adultes. Ainsi, nous utiliserons les animaux entre 8 semaines et 8 mois d'âge.
Origine et suivi des cellules du système cardiovasculaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
Les souris de ce projet portent une recombinase qu'une injection déclenche, pour marquer certaines cellules du cœur et suivre leur descendance. 224 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une ou deux injections dans l'abdomen, sur deux jours consécutifs quand la seconde est jugée utile, les femelles gestantes étant injectées entre le sixième et le treizième jour de gestation. Toutes sont ensuite tuées pour prélever des organes, alors que le porteur écrit n'avoir jamais observé d'effet délétère chez les animaux injectés.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'étudier les gènes et cellules qui participent au développement du système cardiovasculaire chez l'embryon et au maintien de l'homeostasie du cœur chez l'animal adulte afin de mieux appréhender l'étiologie des cardiopathies congénitales et acquises qui se développent après la naissance. Le développement du cœur et l’homéostasie cardiaque dépendent de l'expression d'un nombre important de gènes et la contribution de différents types cellulaires. Dans cet objectif, nous utiliserons des souris transgéniques chez lesquelles on peut induire l'activité d'une recombinase qui permet la détection des cellules recombinées et de leurs dérivées. Différentes lignées sont ciblées: les progéniteurs cardiaques, les cellules dérivées de l’épicarde, les cellules des crêtes neurales et enfin les cardiomyocytes. Les études sur le développement cardiaque nécessiteront l’induction au cours de la gestation tandis que les études après la naissance seront réalisées par des inductions chez les mâles et femelles. Ce projet permettra d'étendre nos connaissances sur le développement et le maintien du système cardiovasculaire ainsi que sur l'étiologie des pathologies congénitales et acquises.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'étendre nos connaissances sur le développement cardiaque depuis les stades précoces du développement cardiaque. Il étudiera l’importance de ces évènements précoces sur le maintien du système cardiovasculaire. Les résultats attendus doivent également permettre de mieux aborder l’étiologie des pathologies cardiaques congénitales et acquises.
Procédures
Les animaux seront soumis à une ou deux injections intrapéritonéales. Si deux injections sont réalisées, elles seront réalisées sur 2 jours consécutifs.
Impact sur les animaux
Nous n'avons jamais observé d'effet délétère sur les animaux injectés lors de nos expériences précédentes. Une possible infection peut apparaître au site d'injection, mais cela n’a jamais été observé lors de nos expériences précédentes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organe.
Remplacement
L'utilisation de modèle in vitro ne permet pas de reproduire le développement cardiaque ni celle du coeur dans leur compléxité physiologique chez l'animal. Les stratégies de remplacement n'existent pas et l'utilisation d'animaux génétiquement modifiés telle que présentée ici est la seule approche qui nous permette actuellement de répondre à nos objectifs de suivi des cellules qui contribuent au développement et à l'homéostasie du coeur.
Réduction
Nous nous efforçons à limiter le nombre d’animaux par groupe en tenant compte des controles et à utiliser au maximum les données de chaque animal. L’utilisation d’outils statistiques permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaires. Nos études précédentes nous montrent qu’il faut en moyenne 10 souris par groupe pour avoir des données exploitables. Nous arrêterons de générer des animaux aussitôt que nos résultats seront exploitables statistiquement..
Raffinement
La réglementation est appliquée selon la législation en vigueur pour tous les animaux en procédure pour ce qui concerne l’hébergement, la surveillance et la mise à mort. Les injections sont toujours des actes planifiés à l'avance et rapides ce qui permet de limiter le stress de l'animal. L'apparition d'infection au site d'injection si elle a lieu sera traitée par un antiseptique. Si l’animal présente un signe de souffrance il recevra une injection d'anti-inflammatoire. Une grille de score avec les différents points limites est disponible et adaptée aux besoins du projet.
Choix des espèces
Chez la souris, le développement et le fonctionnement physiologique du coeur sont similaires à ceux décrits chez l’Homme. Les souris génétiquement modifiées représentent donc un modèle pertinent pour nos recherches fondamentales afin d'appréhender au mieux les maladies humaines. Les femelles gestantes seront injectées au plus tôt au stade embryonnaire de 6.0 jours après l'accouplement, stade qui correspond à l'identification des premiers progéniteurs cardiaques, et au plus tard avant le 13ème jour embryonnaire, la gestation chez la souris étant de 21 jours. Lorsque l'étude s'adressera à des animaux après la naissance, les injections seront réalisées entre le stade P0 et P3 ou au stade adulte lorsque requis, entre 8 et 12 semaines. Les animaux seront injectés deux fois sur deux jours consécutifs lorsque nécessaire afin de s'assurer de la recombinaison de l'ensemble des cellules ciblées. La nécessité de deux injections pour une recombinaison fiable résulte de l'expérience acquises au cours des années et est en faveur de la règle des 3R car cela permet d'obtenir des résultats plus stables rapidement et de réduire le nombre d'animaux injectés.
Etude d’une molécule clef dans la lamination du cortex cérébral chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Sur les 656 souris de ce projet, 336 sont des embryons prélevés par césarienne au terme de la gestation pour leur retirer le cerveau, 245 sont tuées parce qu'elles n'ont pas le génotype recherché et 18 mâles géniteurs le sont parce que leur génotype interdit de les utiliser ailleurs. Les 57 femelles gestantes, contenues puis injectées dans la veine de la queue, sont tuées au stade embryonnaire de 18,5 jours. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 263 animaux et modéré pour 393. Le tamoxifène injecté peut dérégler l'équilibre hormonal de la gestation et faire mourir les embryons in utero, et le porteur justifie l'ensemble en indiquant qu'aucun organoïde de cerveau, murin ou humain, n'a à ce jour reproduit la formation des six couches de neurones du cortex.
Objectifs
Des anomalies génétiques chez l’homme affectant les processus de prolifération, de migration et de différentiation cellulaire peuvent aboutir à des malformations du cerveau. L’effet des mutations dans des gènes orthologues sur le développement embryonnaire est modélisé chez la souris. Ce projet vise en particulier à étudier le rôle clef d’une molécule dans la formation des couches de neurones dans le cortex cérébral et à déterminer si la quantité de cette protéine est un facteur déterminant dans la sévérité du phénotype. Pour contrôler la quantité, une stratégie d’invalidation génétique conditionnelle est utilisée reposant sur l’injection de tamoxifène chez la femelle gestante pour induire la perte de fonction de la molécule ciblée au cours du développement embryonnaire. 336 embryons seront collectés par césarienne et mis à mort pour prélever leur cerveau et une biopsie cutanée. Des études histologiques et biochimiques seront réalisées sur ces cerveaux pour quantifier la sévérité de la malformation corticale et le génotypage sera effectué sur la biopsie cutanée.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans des anomalies du cortex cérébral observées chez l’homme. L’utilisation d’un modèle génétique contrôlé chez la souris permet de reproduire ces malformations corticales et les connaissances acquises sur les mécanismes permettent de tester chez l’animal des approches thérapeutiques qui pourraient être appliquées à l’Homme.
Procédures
Les femelles gestantes (57) subiront une contention permettant l'injection intraveineuse (10 secondes) dans la veine caudale d'un produit.
Impact sur les animaux
L’injection par voie intra-veineuse de la souris adulte peut entrainer une douleur légère de courte durée. Le tamoxifène, antagoniste des œstrogènes peut altérer l’équilibre hormonal pendant la gestation et entrainer une mortalité prénatale avec une résorption des embryons.
Devenir
Toutes les 656 souris du projet seront mises à mort. - 245 souris issues du croisement des lignées simples car elles n’auront pas les génotypes d’intérêt. - 57 femelles gestantes pour collecter les embryons au stade embryonnaire 18.5 après leur fécondation. - 336 embryons collectés pour prélever leur cerveau et une biopsie cutanée. - 18 mâles géniteurs utilisés pour les croisements contrôlés car ils ne pourront pas être réutilisé pour d’autres projets en raison de leur génotype unique.
Remplacement
Les questions scientifiques adressées dans ce projet ne peuvent être étudiées qu’in vivo, sur des cerveaux prélevés sur des embryons. Il s’agit ici d’études sur le développement du cortex cérébral, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère en développement. Aucun modèle in vitro même les plus sophistiqués comme les organoïdes de cerveau ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part. Jusqu’à présent la lamination complète du cortex c’est-à-dire la formation des 6 couches de neurones n’a jamais été observé dans les organoïdes de cerveau qu’ils soient d’origine murine ou humaine.
Réduction
La stratégie de croisement contrôlée permettra de générer tous les génotypes nécessaires à l’étude et tous les embryons générés seront analysés sans sélection. Il a été montré dans ce type d’études de modèles animaux qu’un échantillon de 7 animaux par condition est suffisant pour mettre en évidence une différence de 20%.
Raffinement
Les animaux progéniteurs sont maintenus dans un environnement enrichi avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social avant leur croisement. Après croisement contrôlés, les femelles gestantes sont regroupées par paire. Les males reproducteurs sont placés avec des femelles âgées qui ne sont plus fertiles pour éviter leur isolement en attendant les croisements contrôlés suivants. Au stade embryonnaire 9,5 jours après le coït (E9,5), la queue de la femelle gestante à injecter en intraveineux (IV) est imprégnée de crème analgésique pendant 15 minutes. La souris est ensuite maintenue dans une boite de contention et sa queue chauffée sous une lampe afin de provoquer une dilatation de la veine caudale et faciliter l’injection du produit par voie IV. Les femelles injectées sont regroupées et surveillées quotidiennement en application des points limites stricts et spécifiques du projet jusqu’au stade de leur mise à mort à E18.5. Les embryons collectés à E18.5 sont endormis par le froid avant leur mise à mort.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle pour mener les études sur le développement du cerveau, principalement en raison de la similarité́ des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation du projet tels que les modèles génétiquement modifiés. L'expérimentation est menée sur des embryons en fin de gestation, stade qui nous permet de voir l'effet des modifications génétiques sur cette étape critique du développement dans le cerveau.
Etude chez la souris de l’efficacité in vivo de nouvelles molécules thérapeutiques contre les bactéries multi-résistantes aux antibiotiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
3 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections de bactéries multirésistantes dans l'abdomen, une première série servant à établir la dose qui tue la moitié des animaux, et 840 d'entre elles subissent en plus deux injections d'antigènes puis un prélèvement de sang par semaine sous anesthésie pendant quatre semaines. L'objectif déclaré est de tester sept anticorps et sept vaccins contre des bactéries que l'ONU et l'OMS classent comme prioritaires. Les souris encore vivantes sont gardées sept jours au plus après l'infection avant d'être tuées, et le porteur affirme que le recours au modèle animal est "indispensable" pour mesurer l'effet du traitement en présence d'un système immunitaire complexe.
Objectifs
Les bactéries résistantes aux antibiotiques constituent aujourd'hui un problème de santé public mondial majeur menaçant en particulier le milieu hospitalier. A l'heure actuelle, il y a de moins en moins de nouveaux antibiotiques et de plus en plus de résistances aux antibiotiques. Il faut donc de nouveaux traitements efficaces contre ces infections dont les taux de mortalité sont de plus en plus élevés. Devant cette faille thérapeutique internationale, il est crucial d'orienter les recherches vers de nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques comme l'immunothérapie (utilisation de vaccins et d'anticorps). Ce projet vise donc à tester un panel d'anticorps et de vaccins afin de lutter contre ces infections. Des souris seront utilisées pour tester ces nouveaux traitements. Ce projet couvre un domaine exceptionnellement large (l'antibiorésistance) concernant potentiellement toutes les bactéries provoquant des infections chez l'homme. L'efficacité de 7 anticorps ainsi que 7 vaccins sera testée contre les bactéries pathogènes classées comme prioritaires par l'ONU (Organisation des Nations Unies) et l'OMS (Organisation Mondiale de la Santé. Les antibiotiques seront aussi testés dans ce projet. Il y aura d'abord une étude pilote sur un nombre restreint de souris afin de pouvoir définir la dose bactérienne provoquant la mort de 50% des animaux. Ensuite, les nouveaux vaccins et anticorps seront testés ainsi que leur efficacité à protéger les souris. Ce projet s'assurera aussi qu'il n'y a pas d'interférence entre l'immunothérapie et l'antibiothérapie.
Bénéfices attendus
Ces travaux couplés à une étude in vitro permettront de déterminer précisément l’action favorable liée à l’utilisation de thérapies innovantes comme les anticorps monoclonaux ou polyclonaux ou des antigènes, en présence ou en absence d’une antibiothérapie lors d’une infection par des bactéries, y compris les bactèries multi-résistantes. Ces nouvelles thérapeutiques visent non seulement à lutter efficacement contre les infections causées par ces bactéries mais aussi à réduire la pression de sélection induite par les antibiotiques, ce qui permettra de diminuer l’émergence et la dissémination de la résistance aux antibiotiques.
Procédures
- 3000 souris recevront une injection intrapéritonéale 1 fois pour chaque concentration bactérienne testée, 3 fois pour chaque anticorps et 2 fois pour chaque antigène testé. Chaque injection durera quelques secondes. - 840 souris recevront une injection en sous-cutané des antigènes à deux reprises. Chaque injection durera quelques secondes - 840 souris seront anesthésiées pour les prélèvements sanguins une fois par semaine durant les prélèvements sanguins et chaque anesthésie durera moins de 3 min. - Le sang de 840 souris sera prélevé sous anesthésie générale une fois par semaine et pendant 4 semaines. Chaque prélèvement durera quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les souris vont développer des infections à des bactéries pathogènes notamment les bactéries multi-résistantes aux antibiotiques. Ces infections seront instaurées par injection en intrapéritonéale qui malgré tout reste une injection invasive pouvant causer un inconfort temporaire comme une faible douleur et un peu de stress. De plus, les infections peuvent provoquer une augmentation de la température corporelle, des difficultés respiratoires ou encore une perte de poids. Par ailleurs, certains lots de souris vont subir des anesthésies par inhalation de gaz qui peut causer des irritations des voies respiratoires temporaires comme la toux ou des mouvements de détresse ainsi que des risques de perturbation de la thermorégulation.
Devenir
Les souris survivantes seront mises à mort à la fin du projet car elles ne pourront pas rester en vie après une bactériémie.
Remplacement
Des études préliminaires in vitro ont permis d’établir les doses optimales d’anticorps à utiliser. Cependant l’emploi du modèle animal est indispensable afin d’étudier l'efficacité du traitement en présence ou en absence d’un système immunitaire complexe, l’impact du microbiote ou une antibiothérapie couplée à l’utilisation d’anticorps monoclonal ou polyclonal. De plus, s’agissant du développement d’une nouvelle stratégie curative l’expérience sur l’animal est justifiée avant l’application sur l’homme. Les souris seront utilisées pour étudier l'effet d'une immunothérapie sur la prévention et le traitement des infections bactériennes, où les mécanismes impliqués ne peuvent pas être modélisés de manière adéquate in vitro ou avec d'autres espèces.
Réduction
Ce projet utilisera une lignée consanguine de mâles et de femelles dont le fond génétique est contrôlé et homogène pour minimiser la variabilité des phénotypes et donc le nombre d’animaux à utiliser. Il se limitera à l’étude des souches bactériennes les plus importantes en tant que souches multirésistantes aux antibiotiques. Le projet utilise pour chaque expérience le nombre minimal d'animaux permettant d'observer une différence significative. Selon l'expertise du laboratoire, il est estimé qu’une réponse sur un nombre de 10 animaux est suffisante pour obtenir une différence statistique.
Raffinement
Pour réduire le stress et l’angoisse des souris, de l’enrichissement sera ajouté dans chaque cage d’hébergement (coton et maison en carton). Les animaux seront hébergés en groupe de cinq maximum, dans des cages équipées afin d'offrir un environnement enrichi et approprié. Les souris auront un accès (à volonté) à l'eau et à la nourriture pour assurer leurs hydratations et leurs besoins nutritionnels. Une surveillance sera effectuée 1 à 2 fois par jour par les membres de ce projet ou le cas échéant par le personnel qualifié de l'animalerie. Afin de limiter au maximum les souffrances liées à la bactériémie, les souris seront gardées maximum 7 jours post-infection avant la mise à mort. Les prélèvements de sang seront faits sous anesthésie légères et peu invasives afin de minimiser le stress et la douleur lors des injections/prélèvements.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal bien établi et largement utilisé en recherche biomédicale en raison de sa génétique bien caractérisée et de sa similitude avec l'organisme humain en termes de physiologie et de pathologie. Ces caractéristiques permettent de réaliser des études reproductibles et de haute qualité, fournissant des résultats pertinents et transposables aux humains. De plus, la souris est reconnue comme un modèle d'infection systémique à E. coli et d'autres bactéries permettent de disséquer les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents aux maladies humaines. Nous utiliserons des animaux adultes âgés de 5 à 6 semaines.
Etude moléculaire des troubles du neurodéveloppement chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Les souriceaux de plus de sept jours sont tatoués aux coussinets et prélevés à la queue avant dix jours de vie, et une partie, déjà isolée deux fois cinq minutes à six jours pour enregistrer ses vocalisations, passe à l'âge adulte, sur environ deux mois, six tests : open field, labyrinthe en croix surélevé, test à trois compartiments, reconnaissance d'objet, réflexe de sursaut et conditionnement de peur par chocs électriques aux pattes. Des femelles gestantes subissent trois contentions de 45 minutes par jour pendant six jours, d'autres une ouverture de l'abdomen sous anesthésie pour marquer des cellules du cerveau des embryons par électroporation. 3 424 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier le rôle d'une protéine dans le développement du cerveau et les troubles du neurodéveloppement. Le porteur situe les sons du test de sursaut à 120 décibels, puis à 110. Toutes les souris seront tuées, dont 1 680 une fois leur rôle de reproduction achevé.
Objectifs
Notre étudions une molécule sécrétée dans le milieu extracellulaire qui contrôle des étapes cruciales du développement du cerveau. En effet, des altérations de niveaux de cette protéine d’intérêt sont observés dans de nombreuses pathologies psychiatriques dont l’autisme, la schizophrénie et la dépression mais aussi la lissencéphalie et l'épilepsie. Or plusieurs populations cellulaires sécrètent cette protéine lors d'étapes successives du développement du cerveau. L'objectif du projet est d’identifier les rôles respectifs de ces populations sources de notre potéine d'intérêt dans le développement du cerveau et l’étiologie des troubles du neuro-développement en combinant des approches moléculaires, histologiques, électrophysiologiques et comportementales.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ces travaux nous permettront de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’étiologie des troubles du neurodéveloppement, pour envisager de nouvelles approches diagnostiques ou thérapeutiques.
Procédures
Tous les souriceaux de plus de 7 jours subiront un stress léger lié à la contention et au tatouage (1 min) ainsi qu’une douleur légère liée au prélèvement à la queue (10 sec) entre P7 et P10. Cette intervention n’aura lieu qu’une fois, sauf cas exceptionnel de prélèvement dégradé. -Les animaux qui réaliseront les tests comportementaux subiront les stress accumulés liés à leur isolement pendant 2x 5 min pour enregistrer des vocalisations à P6, puis aux tests comportementaux successifs à l’âge adulte sur environ 2 mois, avec au moins 3 jours de repos entre chaque test : OF (20 min), EPM (7 min), 3-chambers (30 min), NOR (30 min), tests d’inhibition du réflexe de sursaut (32 min) et de conditionnement par la peur (8min/jour pendant 4 jours). Plus spécifiquement, ces deux derniers tests imposent aux animaux de subir ponctuellement des sons à très hauts décibels (120 db) ou des chocs électriques sur les pattes (0,6mA), qui même si modérés et très ponctuels, induisent une réaction de stress visible (posture de freezing). - Pour l’étude des conséquences du stress prénatal, les femelles gestantes subiront un stress répété par contention (3 x 45 min / jour pendant 6 jours). - Les femelles gestantes subissante une électroporation in utero subiront une analgésie (voie sous-cutanée, 10 sec) et une anesthésie générale profonde (voie respiratoire), suivies d’un acte chirurgical de 45 min comprenant une ouverture de l'abdomen et des points de sutures, puis des injections sous cutanées d’analgésique d'une durée de 30secx2 fois x 3 jours. - Les animaux subissant les actes de perfusion intracardiaque subiront un stress lié aux injections intrapéritonéales d’analgésique et d’antalgique (2 x10 sec). Lot1: Tatouage (1 min) et prélèvement (10 sec); Lot 2: Tatouage (1 min) et prélèvement (10 sec) en juvénile puis perfusion intracardiaque à P25 (2 injections de 10 sec); Lot 3 : Tatouage (1min), isolation pour vocalisations (2x5min) et prélèvement (10sec) en juvénile, puis OF (20 min), EPM (7 min), 3-chambers (30 min), NOR (30 min), tests d’inhibition du réflexe de sursaut (32 min) et de conditionnement par la peur (8min/jour x 4 jours); Lot 4a: perfusion intracardiaque à P4 ou P7 (2injX10 sec); Lot 4b: Eléctroporation in utero (1injX10sec, chirurgie sous anesthésie générale profonde 35min, suture 10min, 2 injX10secX3 jours), tatouage (1 min) et prélèvement (10 sec) puis perfusion intracardiaque (2injX10sec); Lot 5: stress prénatal (3X45min X6jrs)
Impact sur les animaux
Les souriceaux subiront après la naissance une contention pour permettre un tatouage des coussinets des phalanges et un prélèvement à la queue qui peuvent entrainer un stress et une douleur légers. Les actes chirurgicaux peuvent entrainer une souffrance si elle est mal prise en charge par le traitement analgésique. A noter que l'étape d’anesthésie en elle-même peut également provoquer un stress chez l’animal. Pour réaliser l’enregistrement des vocalisations, certains souriceaux devront être isolés pendant 2 fois 5min , ce qui est une source de stress. De même, les tests comportementaux successifs adultes sont une source de stress, notemment les tests d’inhibition du réflexe de sursaut ou de conditionnement par la peurqui imposent aux animaux de subir des sons à très hauts décibels (110db) et des chocs électriques sur les pattes, qui même si modérés, induisent une réaction de stress notable (posture de freezing). Pour l'étude des conséquences du stress prénatal sur l'épigénétique, certaines femelles gestantes subiront un stress répété par contention. Afin de marquer les astrocytes, certaines autres gestantes subiront une analgésie (voie sous-cutanée) et une anesthésie générale profonde (par voie respiratoire) de 45 minutes, suivies d’un acte chirurgical comprenant une ouverture de l'abdomen et des points de sutures, puis des injections sous cutanées d’analgésique d'une durée de deux minutes 2 fois par jours pendant 3 jours. Aucun phénotype dommageable n’a été observé ou décrit dans la littérature pour les génotypes décrits.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans le cadre de l'étude seront mis à mort, soit à des fins d'études histologiques (lot 2, 384 animaux; lot 4, 368 animaux), épigénétiques (loy 5, 224 animaux), électrophysiologiques (Lot 1b, 384 animaux) ou comportementales (lot 3, 384 animaux), soit après avoir achevé leur rôle de reproduction (lot 1a, 1680 animaux).
Remplacement
A l’heure actuelle, il n'existe pas de méthode de remplacement permettant de reproduire in vitro la complexité du cortex en développement et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part, ce qui rend l’utilisation d’un modèle murin indispensable à la réalisation de ce projet. Notamment, les effets du stress périnatal impliquent des interactions précises, transitoires et adaptatives entre les hormones, les neurotransmetteurs et les neuro-modulateurs, mais aussi avec les systèmes inflammatoires, digestifs et sanguins qui sont encore mal connues et ne peuvent être reproduites in vitro.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous optimisons les croisements des lignées transgéniquespour obtenir un pourcentage maximal d’animaux d’intérêt et nous optimisons au maximum les échantillons obtenus en réalisant plusieurs séries de coupes par cerveau pour réaliser plusieurs marquages différents sur un même cerveau. Pour les études histologiques, un test de puissance G réalisé à partir de résultats antérieurs sur un autre modèle de souris nous préconise une taille de groupe de 6 individus par genre. Pour les études comportementales, nos résultats antérieurs préconisent une taille de groupe de 12 individus. Les analyses statistiques seront réalisés par un test adapté.
Raffinement
Des points limites strictes et spécifiques à chaque procédure sont appliqués. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton de nidification et bâtonnet de bois) et sont regroupés en groupes sociaux de 2 à 6 individus par cage. La mise à mort par perfusion de paraformaldéhyde est réalisée sous anesthésie générale profonde et après une injection sous-cutanée de l’analgésique buprénorphine. La chirurgie d’électroporation in utero est réalisée sous anesthésie profonde préalable par l’isoflurane (4% pour l’induction et 2% pour le maintien de l’anesthésie) et sur une plaque chauffante (37°C), et ce après une injection sous-cutanée de l’analgésique buprénorphine, la désinfection du site d’incision et l’ajout d’une gel ophtalmique pour la protection des yeux. Après l’opération, l’animal reçoit à 24 et 48h l’analgésique Meloxicame en sous-cutané.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le fonctionnement des circuits neuronaux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. En effet, seuls les Mammifères présentent un néocortex organisé en couches inversées, grâce à la présence précoce des cellules sécrétant notre protéine d'intérêt à la surface du cortex. De plus, de nombreux modèles génétiquement modifiés sont disponibles chez la souris. Le génotypage et les prélèvements seront réalisés sur les souriceaux entre 4 et 10 jours, âge auquel on peut tatouer les coussinets des phalanges sans douleur. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Pour étudier les rôles des sous-populations cellulaires sources de Reln dans la formation des couches corticales nous allons étudier les stades embryonnaires E12.5, E14.5 et E16.5, puis les stades postnataux P0 et P25. En effet, les neurones corticaux sont générés entre E12.5 et E16.5, atteignent majoritairement leur position à P0 mais continuent à migrer et à se différencier dans les couches corticales jusqu’à P25. Les effets des quantités de Reln sur la prolifération et la maturation des astrocytes seront analysés aux stades post-nataux P4 et P7 (avant et après la phase de prolifération) et P25 (pour pouvoir visualiser une arborescence mature). Les effets du stress prénatal sur l’expression de Reln seront évalués à P0, quand les deux sources principales de Reln corticale sont simultanément présentes. Enfin les rôles spécifiques des sous-populations sur le comportement seront analysés à P6 pour les vocalisations néonatales (âge du pic de vocalisation induite par l’isolation) et à l’âge adulte (P60-P120) pour les autres tests comportementaux qui nécessitent une maturation achevée des circuits.
Test d’efficacité d’une molécule pharmacologique sur un modèle murin de la Maladie de Niemann-Pick type C (NPC)
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou sévère, une partie étant tuée sous anesthésie sans réveil. Les souris mutées, qui perdent du poids et de la coordination et vivent en moyenne 125 jours, reçoivent des injections hebdomadaires à partir de dix jours de vie, sont prélevées sous anesthésie, et passent des tests de fonctions sensori-motrices chaque semaine de 7 à 16 semaines d'âge, d'activité locomotrice et d'anxiété, de troubles de la marche, de coordination motrice et d'inhibition de la préimpulsion. Le porteur attend à court terme "une preuve de concept in vivo" et renvoie à "plus long terme" le développement d'un traitement contre la maladie de Niemann-Pick de type C1. Il affirme que l'étude de candidats médicaments sur les maladies neurodégénératives "ne peut se faire sans l'utilisation de modèles animaux", et précise que la molécule a d'abord été choisie sur des cellules.
Objectifs
Notre projet a pour objectif de tester l’efficacité in vivo d’une molécule sur un modèle murin de maladie de Niemann-Pick de type C1 (NPC1), qui récapitule le tableau clinique de la pathologie humaine.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet nous permettra d’obtenir une preuve de concept in vivo que la nouvelle approche thérapeutique envisagée est efficace sur plusieurs signes cliniques prédictifs du cours de la pathologie humaine. À plus long terme, ce projet se poursuivra par un développement thérapeutique de cette molécule visant à obtenir la preuve clinique de son efficacité chez l’homme, avec pour objectif final de proposer un traitement efficace pour les patients atteints de NPC1.
Procédures
Injections sous-cutanées (3/animal, 1 x par semaine, 1 min par injection) puis injections intrapéritonéales (1 x par semaine pendant 12 semaines, 1 min par injection), prélèvements sanguins (intracardiaque, 5 min par prélèvement sous anesthésie générale ; 3 fois à la veine temporale sous anesthésie gazeuse, 3 minutes par prélèvement). Tests comportementaux : Observations cliniques et évaluation des fonctions sensori-motrices 15 minutes chaque semaine (7 à 16 semaines d'âge), mesure de l'activité locomotrice et anxiété 5 fois 30 min, mesure des troubles de la marche (5 sessions de 3 jours, 5 minutes par jour), test de coordination motrice 4 fois 20 minutes, mesure de l'inhibition de la préimpulsion 3 fois 45 min.
Impact sur les animaux
Les souris mutés présentent un phénotype dommageable ; ce modèle animal présente une perte de poids, une diminution de la coordination motrice, une mortalité prématurée avec une durée de vie moyenne de 125 jours. Pour la première procédure, ces animaux seront mis à mort suite à une anesthésie (nuisance légère). Pour la procédure deuxième, les animaux subiront 3 injections sous-cutanées indusiant une légère nuisance (1 par semaine pendant 3 semaines). Pour la troisième, les animaux subiront 3 injections sous-cutanées (1 par semaine pendant 3 semaines) puis 1 injection intrapéritonéale par semaine pendant 12 semaines induisant une nuisance modérée. Les souris subiront 3 prélèvements sanguins d’environ 3 minutes induisant une nuisance modérée.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des procédures afin de prélever les tissus en vue d'analyse post-mortem, excepté pour l'étude pilote ou seul le sang sera prélevé.
Remplacement
L'étude de l'effet thérapeutique de candidats médicaments sur des processus complexes tels que les maladies neurodégénératives ne peut se faire sans l'utilisation de modèles animaux. En effet, il n'existe pas actuellement de modèles non-animaux permettant de récapituler l'ensemble des mécanismes physiologiques complexes à l'œuvre dans la mise en place d'une neurodégénérescence fatale, comme dans la maladie de Niemann-Pick de type C1. Cependant, le choix de la molécule optimale testée dans cette étude a préalablement été réalisé sur un modèle cellulaire.
Réduction
Ce projet implique des souris homozygotes présentant la mutation induisant la maladie de NPC1 et des souris non mutés qui seront considérées comme des contrôles ne présentant pas la maladie de NPC1. Dans l’étude précoce, les groupes expérimentaux seront constitués comme suit : 5 souris homozygotes mutées traitées avec le véhicule et 5 souris contrôles traitées avec le véhicule, pour chaque sexe, seront nécessaires à la caractérisation préliminaire du modèle dans le laboratoire. Dix souris homozygotes mutées traitées avec le composé, 10 souris homozygotes mutées traitées avec le véhicule et 10 souris contrôles traitées avec le véhicule, pour chaque sexe, seront nécessaires à la vérification des caractéristiques décrites dans le papier princeps. Le nombre de souris défini dans l’étude précoce repose sur les conditions nécessaires optimales à l’analyse des biomarqueurs. Il intègre à la fois la taille des effets attendus (diminution de 80 % de la protéine NPC1 chez les souris mutés, effet du traitement 40-45 % espéré) et la variabilité technique connue (30 %). À chaque étape, la variabilité réelle obtenue sera calculée. Dans le cas où l’étude précoce mettrait en évidence une « surestimation » par rapport à la variabilité technique théorique, une réduction du nombre d’animaux lors de l’étude d’efficacité tardive sera envisagée. Pour l’étude d’efficacité tardive afin de réduire le nombre d’animaux, nous avons décidé de ne pas réaliser de groupe contrôle non muté. Le groupe muté non traité permet d’évaluer les caractéristiques liées à la pathologie. Les résultats du groupe muté traité seront préférentiellement rapportés aux souris du groupe muté (point de départ de la pathologie). En cas de « situation optimale », les souris mutés sous traitement auront des niveaux de protéine NPC1 équivalents aux souris WT. Le choix de 16 animaux par groupe a été défini en fonction de la haute variabilité des tests comportementaux.
Raffinement
Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Une étude toxicologique préliminaire a été réalisée afin de déterminer la dose maximale non toxique de la molécule à administrer aux animaux. Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites, le cas échéant, pouvant entraîner l'euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Les animaux seront maintenus en groupes, dans des conditions d'animalerie optimales. Ils disposeront sans limitation de nourriture, de boisson et d'un milieu enrichi (nids en quantité suffisante, bâton et balles à ronger). Si un animal présente un trouble locomoteur, de la nourriture mouillée et un biberon à longue tétine seront ajoutés à la cage. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique.
Choix des espèces
La souris est l’animal de choix pour la création et l’étude de modèles avec une perte de fonction d’un gène (mutation). De plus, la souris est un modèle animal adapté à l’étude de la locomotion, phénotype d’une dégénérescence neuronale. Enfin, il n’existe pas de modèles in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier un phénotype locomoteur et/ou la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. Le traitement avec la molécule médicament débutera à 10 jours post-natal et sera donné 1 fois par semaine. Dans la littérature, l'ensemble des études ayant testé l'efficacité de notre molécule dans différentes pathologies ont commencé le traitement avant le sevrage des animaux, c'est pourquoi nous allons suivre ce même schéma expérimental.