Souris

Tuées au plus tard une semaine après l'irradiation de leurs deux yeux, pour que les lésions vasculaires de leur rétine passent en histologie, 341 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ce troisième volet appartient à un projet réparti sur trois établissements utilisateurs. L'irradiation se fait sous anesthésie générale, précédée d'une injection intrapéritonéale, et le prélèvement de sang terminal sous anesthésie profonde. Le porteur annonce un groupe contrôle unique pour toutes les conditions d'irradiation, sans indiquer combien d'animaux le composent ni comment les 341 souris se répartissent entre les doses testées.

Objectifs

Les patients exposés à des radiothérapies anticancéreuses doivent faire face à un large spectre de pathologies rétiniennes. L’objectif de notre équipe est de modéliser, grâce à plusieurs outils d’irradiation à notre disposition, les toxicités de l’œil déclenchées par l’irradiation, en particulier la rétinopathie radique, chez la souris. La rétinopathie radique est une pathologie sévère de l’œil, qui chez les patients ayant subi une radiothérapie conduit à la baisse des capacités visuelles et peut entrainer leur cécité. Malgré des techniques de radiothérapie de plus en plus précises, la rétine est encore très souvent incluse dans le champ d’irradiation et cela peut entrainer cette pathologie sévère. Le développement de nouvelles techniques de détection, notamment l’imagerie, permet aujourd’hui un dépistage facilité mais qui reste relativement tardif. Dans ce projet, nous souhaitons développer plusieurs modalités d’irradiation, afin de pouvoir définir pour chaque condition expérimentale, 1) le ciblage et 2) la quantité de dose reçue par l’oeil. Une fois ces paramètres établis, nous pourrons utiliser ces conditions optimales pour modéliser la rétinopathie radique chez la souris. Ainsi, nous pourrons la caractériser par analyses histologiques en montrant les atteintes vasculaires et ischémiques sur le long terme.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet consiste en la validation de paramètres expérimentaux qui permettront, par la suite, de développer et d’étudier un modèle de rétinopathie radique, une pathologie qui affecte les patients après radiothérapie oculaire, cérébrale et de la face. A long terme, ce projet permettra de réaliser une étude de grande ampleur afin de mieux comprendre la physiopathologie de ces lésions rétiniennes dans le contexte de l’irradiation ; et d’identifier des traitements pouvant en limiter la progression.

Procédures

Chaque animal recevra une irradiation des deux yeux (excepté les animaux contrôles) au cours de ce projet. La mise à mort aura lieu au maximum une semaine après cette irradiation, un prélèvement de sang terminal sera réalisé sous anesthésie générale, avant une surdose médicamenteuse.

Impact sur les animaux

Les animaux seront anesthésiés par injection intrapéritonéale (pour l’induction chimique). Cette injection entraîne une douleur légère de courte durée. L’irradiation seule ne provoque pas de nuisance immédiate chez l’animal mais peut engender un léger stress notamment lors de la contention pour l’anesthésie. Les déplacements vers l’irradiateur pourront provoquer un certain stress chez les animaux mais il sera de courte durée et il n’y aura pas de modifications des groupes sociaux. Le prélèvement de sang terminal sera réalisé sous anesthésie générale profonde.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyse histologique afin d'étudier les atteintes vasculaires et ischémiques.

Remplacement

Depuis de nombreuses années, notre équipe a développé de nombreux modèles de culture cellulaire afin de pouvoir étudier les effets de l’irradiation dans ces modèles in vitro. Ces modèles 2D ont été récemment complétés par le développement de modèles 3D complexes. Ces modèles 3D permettent de recréer des conditions tissulaires tout en limitant l’utilisation d’organismes vivants et de tester les effets d’irradiation, et ainsi de cribler certaines conditions expérimentales pour prédire les effets in vivo.

Réduction

L’utilisation des modèles in vitro 2D et 3D permet d’optimiser le design expérimental de nos études in vivo, et ainsi de limiter l’utilisation des animaux à leur strict nécessité. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, certains tests seront réalisés sur cadavres (conservés dans cet objectif) : validation de set-up (positionnement de l’animal), mesure de doses (à l’aide de sonde de mesure/chambres d’ionisation). Ainsi les mesures pourront être répétées à plusieurs reprises sans utilisation d’animaux supplémentaires. Une étude bibliographique a été réalisée afin d’optimiser la mise en place de notre modèle. Celle-ci nous a permis d’affiner les doses qui seront testées, mais également de valider le nombre d’animaux utilisés par groupe expérimental. En outre, un seul groupe d’animaux non irradiés sera utilisé comme groupe contrôle pour l’ensemble du projet et des conditions d’irradiation, afin de réduire l’utilisation des animaux au maximum. Enfin, comme lors de nos études précédentes, nous procéderons à une analyse statistique après chaque expérience, et l’expérience sera reproduite uniquement si la significativité (p< 0.05) n’est pas encore atteinte.

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon des conditions d’hébergements réglementaires au sein de l’établissement utilisateur, à savoir : hébergement en groupe sociaux dans des cages de taille conforme sur portoir ventilé (avec hygrométrie, température et cycle jour/nuit 12h/12h contrôlés). Les animaux auront de l’eau et de la nourriture à disposition à volonté et auront également à disposition dans les cages, 2 éléments d’enrichissement à minima : papier kraft pour la constitution du nid, tunnel en polycarbonate rouge et/ou maison en cellulose pour l’abri. Les transports vers les irradiateurs seront anticipés au maximum pour laisser un temps d’acclimatation aux animaux. Les animaux recevront les mêmes conditions d’hébergements (cages identiques ou plus grandes, maintien de l’enrichissement et suivi de la sciure usagée pour limiter au maximum le stress lors de ces déplacements). Les irradiations seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse ou fixe. Les mises à mort seront réalisées sous anesthésie profonde. Le suivi clinique approfondi des animaux sera fait tous les trois jours maximum post-irradiation, ce qui permettra d’évaluer l’apparition de points cliniques limites.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le plus répandu dans l’étude des rétinopathies vasculaires, et a fait l’objet de nombreuses études et publications scientifiques. Ce modèle est peu coûteux et facilement maintenu en captivité. Nous avons également à notre disposition différents modèles de souris à comparer sur la mise en place de cette pathologie : souris sauvages ou génétiquement modifiés afin d’étudier l’impact de l’angiogénèse sur la rétinopathie radique. Enfin, nous disposons d’irradiateurs adaptés à la souris et permettant l’étude de nouvelles modalités d’irradiation encore en développement chez l’homme. Les études seront menées sur jeunes adultes matures, c’est-à-dire des animaux de 6-8 semaines au moment de l’irradiation. Ce stade est privilégié car nous devons disposer d’un réseau vasculaire formé et mature. L’impact du vieillissement (souris agées) fera l’objet d’une étude ultérieure.

Une biopsie de l'extrémité de la queue pour le génotypage, puis une injection dans l'abdomen chaque jour pendant trois jours : 876 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont tuées quinze jours plus tard pour que leurs deux rétines soient mises en culture, le porteur présentant ce travail sur explants comme une façon d'éviter les injections dans l'œil sur animal vivant. L'objectif déclaré est de comprendre pourquoi la rétine des mammifères ne se régénère pas, avec l'espoir de stratégies thérapeutiques qui n'existent pas aujourd'hui. Les souris reproductrices, elles, sont gardées vivantes et utilisées pendant toute leur période de fertilité pour fournir les animaux du projet.

Objectifs

La rétine des mammifères n’a pas de capacité d’auto-réparation en cas de maladie neurodégénérative, contrairement à certaines espèces de grenouilles ou de poissons qui ont des capacités de régénération remarquables grâce à des cellules rétiniennes appelées cellules de Müller. Cependant, ces cellules de Müller ont conservé un certain potentiel de régénération chez les mammifères. En effet, dans certaines conditions expérimentales, elles sont capables de proliférer et de régénérer des neurones rétiniens, mais de façon très limitée. Notre objectif est donc de mieux comprendre ce qui empêche ou favorise les capacités régénératives des cellules de Müller afin de pouvoir efficacement activer ces cellules et ainsi proposer des pistes thérapeutiques. Dans ce contexte, nous avons montré que les microglies (cellules immunitaires de la rétine) sont des régulateurs de l’activité régénérative des cellules de Müller. La voie de signalisation Notch joue un rôle crucial dans divers processus cellulaires. Cependant, sa fonction dans la microglie en lien avec la régénération rétinienne n'a pas encore été étudiée. Pour comprendre le rôle de la voie Notch dans ces cellules, nous utiliserons des explants de rétines de souris cultivés dans des boîtes de Pétri. Ce modèle nous permet d’étudier le comportement des cellules de Müller en conditions de dégénérescence rétinienne dans divers contextes (plus ou moins d’inflammation, voie Notch activée ou inhibée). À terme, ce projet vise à améliorer notre compréhension des mécanismes par lesquels la microglie régule le potentiel de régénération rétinienne des cellules de Müller.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet devrait permettre de mieux comprendre le rôle d’une voie de signalisation majeure dans la régénération de la rétine et ses liens avec le contrôle de l’inflammation. La perte de vision chez l’homme est un problème de santé publique majeur. Ainsi, à long terme, nous espérons que ce projet contribuera au développement de stratégies thérapeutiques régénératives qui n’existent pas à l’heure actuelle.

Procédures

Biopsie de l’extrémité de la queue (2mm) pour génotypage, procédure qui dure 5 secondes, 1 fois par souris. Injection intrapéritonéale qui dure moins de 30 secondes, 1 fois par jour pendant 3 jours.

Impact sur les animaux

La biopsie de l’extrémité de la queue peut générer une faible douleur de courte durée. La molécule injectée peut provoquer une perte de poids. Le maintien de l’animal lors de la biopsie et de l’injection (contention) peut provoquer un peu de stress.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés 15 jours après la procédure pour permettre les analyses sur les deux rétines des souris. Les animaux reproducteurs qui permettront de générer les souris qui subiront la procédure seront gardés en vie et utilisés tout au long de leur période de fertilité pour produire des souris pour ce projet.

Remplacement

La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie par le fait que la rétine est un tissu complexe composé de nombreux types de neurones et de cellules gliales dont les interactions sont cruciales et l’objet même de notre étude. Des organoïdes de rétine existent mais elles ne présentent pas de cellules microgliales. Dans ce contexte on ne peut pas se passer de l’utilisation d’animaux pour produire les explants rétiniens.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides. Nous utiliserons des tests non paramétriques qui permettent d’aboutir à des conclusions statistiques avec un nombre faible d’échantillons. Nous utiliserons systématiquement les deux yeux de l’animal ce qui permet de réduire le nombre d’animaux. Nous avons planifié les croisements de manière à utiliser tous les animaux d’une portée (dont les animaux contrôles). Pour générer les animaux qui subiront la procédure d’injection, nous utiliserons des reproducteurs tout au long de leur période de fertilité ce qui diminuera le nombre d’animaux ayant à subir le prélèvement de la queue pour génotypage.

Raffinement

Dans le but de réduire le plus possible la douleur, souffrance ou angoisse, nous utilisons des méthodes d’évaluation avec une grille de suivi et avons établi des points limites précoces pour éviter la souffrance des animaux. Pour les injections de 4-hydroxytamoxifène, nous utiliserons des aiguilles qui sont les plus fines possible pour assurer une injection efficace tout en minimisant la douleur. Durant l’injection, les animaux seront maintenus par des chercheurs entraînés à ce geste pour minimiser le stress et les animaux seront habitués au préalable à ce type de contention. Dans le cas où nous constatons une perte de poids suite à l’injection du produit, nous disposerons dans la cage un aliment spécial nommé Booster qui permettra d’enrichir le lait maternel à destination des petits non sevrés. Grâce à l’utilisation des explants, nous évitons de créer de la dégénérescence rétinienne chez des animaux vivants et nous évitons de leur faire subir des injections intravitréennes qui nécessitent anesthésie profonde et analgésie.

Choix des espèces

La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines y compris dans le domaine de l'ophtalmologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins présentant de manière spontanée une dégénérescence rétinienne mimant les pathologies humaines qui pourront être utilisées dans la suite du projet. De plus, notre objectif est de comprendre pourquoi la régénération rétinienne ne se fait que très peu chez les mammifères contrairement à d’autres modèles de vertébrés tels que le poisson-zèbre ou le xénope. Ainsi, bien que la voie de signalisation que nous étudions soit conservée dans le règne animal, c’est son fonctionnement particulier dans la rétine des mammifères qui est l’objet de notre étude. Nous réalisons les expériences ex vivo sur les explants rétiniens prélevés sur des souris à 1 mois qui est le stade où la neurogénèse est terminée dans la rétine mais où un potentiel de régénération est toujours présent. Ce potentiel diminue fortement à des stades plus tardifs. Pour cela, nous devons injecter le produit activateur de l’expression de nos gènes d’intérêt 15 jours avant pour permettre l’accumulation des protéines codées par les gènes induits.

Les deux yeux de chaque souris reçoivent une irradiation destinée à reproduire la rétinopathie radique, une pathologie qui peut rendre aveugles les patients traités par radiothérapie. 341 souris vont être utilisées dans ce deuxième volet du projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Toutes sont tuées au plus tard une semaine après l'irradiation, pour que les lésions vasculaires et ischémiques soient recherchées sur leur rétine. Le porteur décrit une pathologie "sévère" de l'œil comme objet du modèle, et affirme dans le même document que l'irradiation seule ne provoque pas de nuisance immédiate chez l'animal.

Objectifs

Les patients exposés à des radiothérapies anticancéreuses doivent faire face à un large spectre de pathologies rétiniennes. L’objectif de notre équipe est de modéliser, grâce à plusieurs outils d’irradiation à notre disposition, les toxicités de l’œil déclenchées par l’irradiation, en particulier la rétinopathie radique, chez la souris. La rétinopathie radique est une pathologie sévère de l’œil, qui chez les patients ayant subi une radiothérapie conduit à la baisse des capacités visuelles et peut entrainer leur cécité. Malgré des techniques de radiothérapie de plus en plus précises, la rétine est encore très souvent incluse dans le champ d’irradiation et cela peut entrainer cette pathologie sévère. Le développement de nouvelles techniques de détection, notamment l’imagerie, permet aujourd’hui un dépistage facilité mais qui reste relativement tardif. Dans ce projet, nous souhaitons développer plusieurs modalités d’irradiation, afin de pouvoir définir pour chaque condition expérimentale, 1) le ciblage et 2) la quantité de dose reçue par l’oeil. Une fois ces paramètres établis, nous pourrons utiliser ces conditions optimales pour modéliser la rétinopathie radique chez la souris. Ainsi, nous pourrons la caractériser par analyses histologiques en montrant les atteintes vasculaires et ischémiques sur le long terme.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet consiste en la validation de paramètres expérimentaux qui permettront, par la suite, de développer et d’étudier un modèle de rétinopathie radique, une pathologie qui affecte les patients après radiothérapie oculaire, cérébrale et de la face. A long terme, ce projet permettra de réaliser une étude de grande ampleur afin de mieux comprendre la physiopathologie de ces lésions rétiniennes dans le contexte de l’irradiation ; et d’identifier des traitements pouvant en limiter la progression.

Procédures

Chaque animal recevra une irradiation des deux yeux (excepté les animaux contrôles) au cours de ce projet. La mise à mort aura lieu au maximum une semaine après cette irradiation, un prélèvement de sang terminal sera réalisé sous anesthésie générale, avant une surdose médicamenteuse.

Impact sur les animaux

Les animaux seront anesthésiés par injection intrapéritonéale (pour l’induction chimique). Cette injection entraîne une douleur légère de courte durée. L’irradiation seule ne provoque pas de nuisance immédiate chez l’animal mais peut engender un léger stress notamment lors de la contention pour l’anesthésie. Les déplacements vers l’irradiateur pourront provoquer un certain stress chez les animaux mais il sera de courte durée et il n’y aura pas de modifications des groupes sociaux. Le prélèvement de sang terminal sera réalisé sous anesthésie générale profonde.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyse histologique afin d'étudier les atteintes vasculaires et ischémiques.

Remplacement

Depuis de nombreuses années, notre équipe a développé de nombreux modèles de culture cellulaire afin de pouvoir étudier les effets de l’irradiation dans ces modèles in vitro. Ces modèles 2D ont été récemment complétés par le développement de modèles 3D complexes. Ces modèles 3D permettent de recréer des conditions tissulaires tout en limitant l’utilisation d’organismes vivants et de tester les effets d’irradiation, et ainsi de cribler certaines conditions expérimentales pour prédire les effets in vivo.

Réduction

L’utilisation des modèles in vitro 2D et 3D permet d’optimiser le design expérimental de nos études in vivo, et ainsi de limiter l’utilisation des animaux à leur strict nécessité. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, certains tests seront réalisés sur cadavres (conservés dans cet objectif) : validation de set-up (positionnement de l’animal), mesure de doses (à l’aide de sonde de mesure/chambres d’ionisation). Ainsi les mesures pourront être répétées à plusieurs reprises sans utilisation d’animaux supplémentaires. Une étude bibliographique a été réalisée afin d’optimiser la mise en place de notre modèle. Celle-ci nous a permis d’affiner les doses qui seront testées, mais également de valider le nombre d’animaux utilisés par groupe expérimental. En outre, un seul groupe d’animaux non irradiés sera utilisé comme groupe contrôle pour l’ensemble du projet et des conditions d’irradiation, afin de réduire l’utilisation des animaux au maximum. Enfin, comme lors de nos études précédentes, nous procéderons à une analyse statistique après chaque expérience, et l’expérience sera reproduite uniquement si la significativité (p< 0.05) n’est pas encore atteinte.

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon des conditions d’hébergements réglementaires au sein de l’établissement utilisateur, à savoir : hébergement en groupe sociaux dans des cages de taille conforme sur portoir ventilé (avec hygrométrie, température et cycle jour/nuit 12h/12h contrôlés). Les animaux auront de l’eau et de la nourriture à disposition à volonté et auront également à disposition dans les cages, 2 éléments d’enrichissement à minima : papier kraft pour la constitution du nid, tunnel en polycarbonate rouge et/ou maison en cellulose pour l’abri. Les transports vers les irradiateurs seront anticipés au maximum pour laisser un temps d’acclimatation aux animaux. Les animaux recevront les mêmes conditions d’hébergements (cages identiques ou plus grandes, maintien de l’enrichissement et suivi de la sciure usagée pour limiter au maximum le stress lors de ces déplacements). Les irradiations seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse ou fixe. Les mises à mort seront réalisées sous anesthésie profonde. Le suivi clinique approfondi des animaux sera fait tous les trois jours maximum post-irradiation, ce qui permettra d’évaluer l’apparition de points cliniques limites.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le plus répandu dans l’étude des rétinopathies vasculaires, et a fait l’objet de nombreuses études et publications scientifiques. Ce modèle est peu coûteux et facilement maintenu en captivité. Nous avons également à notre disposition différents modèles de souris à comparer sur la mise en place de cette pathologie : souris sauvages ou génétiquement modifiés afin d’étudier l’impact de l’angiogénèse sur la rétinopathie radique. Enfin, nous disposons d’irradiateurs adaptés à la souris et permettant l’étude de nouvelles modalités d’irradiation encore en développement chez l’homme. Les études seront menées sur jeunes adultes matures, c’est-à-dire des animaux de 6-8 semaines au moment de l’irradiation. Ce stade est privilégié car nous devons disposer d’un réseau vasculaire formé et mature. L’impact du vieillissement (souris agées) fera l’objet d’une étude ultérieure.

Avant de créer un modèle de rétinopathie provoquée par les rayons, il faut régler les machines : 341 souris vont être utilisées pour caler le ciblage et la dose reçue par l'œil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une irradiation des deux yeux, puis est tué au plus tard une semaine après, après un prélèvement de sang terminal sous anesthésie. Le porteur indique que l'irradiation seule ne provoque pas de nuisance immédiate, alors que la pathologie visée conduit chez les patients à une baisse de la vision et parfois à la cécité. Le suivi clinique est annoncé tous les trois jours au maximum, de quoi repérer l'apparition de points limites.

Objectifs

Les patients exposés à des radiothérapies anticancéreuses doivent faire face à un large spectre de pathologies rétiniennes. L’objectif de notre équipe est de modéliser, grâce à plusieurs outils d’irradiation à notre disposition, les toxicités de l’œil déclenchées par l’irradiation, en particulier la rétinopathie radique, chez la souris. La rétinopathie radique est une pathologie sévère de l’œil, qui chez les patients ayant subi une radiothérapie conduit à la baisse des capacités visuelles et peut entrainer leur cécité. Malgré des techniques de radiothérapie de plus en plus précises, la rétine est encore très souvent incluse dans le champ d’irradiation et cela peut entrainer cette pathologie sévère. Le développement de nouvelles techniques de détection, notamment l’imagerie, permet aujourd’hui un dépistage facilité mais qui reste relativement tardif. Dans ce projet, nous souhaitons développer plusieurs modalités d’irradiation, afin de pouvoir définir pour chaque condition expérimentale, 1) le ciblage et 2) la quantité de dose reçue par l’oeil. Une fois ces paramètres établis, nous pourrons utiliser ces conditions optimales pour modéliser la rétinopathie radique chez la souris. Ainsi, nous pourrons la caractériser par analyses histologiques en montrant les atteintes vasculaires et ischémiques sur le long terme.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet consiste en la validation de paramètres expérimentaux qui permettront, par la suite, de développer et d’étudier un modèle de rétinopathie radique, une pathologie qui affecte les patients après radiothérapie oculaire, cérébrale et de la face. A long terme, ce projet permettra de réaliser une étude de grande ampleur afin de mieux comprendre la physiopathologie de ces lésions rétiniennes dans le contexte de l’irradiation ; et d’identifier des traitements pouvant en limiter la progression.

Procédures

Chaque animal recevra une irradiation des deux yeux (excepté les animaux contrôles) au cours de ce projet. La mise à mort aura lieu au maximum une semaine après cette irradiation, un prélèvement de sang terminal sera réalisé sous anesthésie générale, avant une surdose médicamenteuse.

Impact sur les animaux

Les animaux seront anesthésiés par injection intrapéritonéale (pour l’induction chimique). Cette injection entraîne une douleur légère de courte durée. L’irradiation seule ne provoque pas de nuisance immédiate chez l’animal mais peut engender un léger stress notamment lors de la contention pour l’anesthésie. Les déplacements vers l’irradiateur pourront provoquer un certain stress chez les animaux mais il sera de courte durée et il n’y aura pas de modifications des groupes sociaux. Le prélèvement de sang terminal sera réalisé sous anesthésie générale profonde.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyse histologique afin d'étudier les atteintes vasculaires et ischémiques.

Remplacement

Depuis de nombreuses années, notre équipe a développé de nombreux modèles de culture cellulaire afin de pouvoir étudier les effets de l’irradiation dans ces modèles in vitro. Ces modèles 2D ont été récemment complétés par le développement de modèles 3D complexes. Ces modèles 3D permettent de recréer des conditions tissulaires tout en limitant l’utilisation d’organismes vivants et de tester les effets d’irradiation, et ainsi de cribler certaines conditions expérimentales pour prédire les effets in vivo.

Réduction

L’utilisation des modèles in vitro 2D et 3D permet d’optimiser le design expérimental de nos études in vivo, et ainsi de limiter l’utilisation des animaux à leur strict nécessité. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, certains tests seront réalisés sur cadavres (conservés dans cet objectif) : validation de set-up (positionnement de l’animal), mesure de doses (à l’aide de sonde de mesure/chambres d’ionisation). Ainsi les mesures pourront être répétées à plusieurs reprises sans utilisation d’animaux supplémentaires. Une étude bibliographique a été réalisée afin d’optimiser la mise en place de notre modèle. Celle-ci nous a permis d’affiner les doses qui seront testées, mais également de valider le nombre d’animaux utilisés par groupe expérimental. En outre, un seul groupe d’animaux non irradiés sera utilisé comme groupe contrôle pour l’ensemble du projet et des conditions d’irradiation, afin de réduire l’utilisation des animaux au maximum. Enfin, comme lors de nos études précédentes, nous procéderons à une analyse statistique après chaque expérience, et l’expérience sera reproduite uniquement si la significativité (p< 0.05) n’est pas encore atteinte.

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon des conditions d’hébergements réglementaires au sein de l’établissement utilisateur, à savoir : hébergement en groupe sociaux dans des cages de taille conforme sur portoir ventilé (avec hygrométrie, température et cycle jour/nuit 12h/12h contrôlés). Les animaux auront de l’eau et de la nourriture à disposition à volonté et auront également à disposition dans les cages, 2 éléments d’enrichissement à minima : papier kraft pour la constitution du nid, tunnel en polycarbonate rouge et/ou maison en cellulose pour l’abri. Les transports vers les irradiateurs seront anticipés au maximum pour laisser un temps d’acclimatation aux animaux. Les animaux recevront les mêmes conditions d’hébergements (cages identiques ou plus grandes, maintien de l’enrichissement et suivi de la sciure usagée pour limiter au maximum le stress lors de ces déplacements). Les irradiations seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse ou fixe. Les mises à mort seront réalisées sous anesthésie profonde. Le suivi clinique approfondi des animaux sera fait tous les trois jours maximum post-irradiation, ce qui permettra d’évaluer l’apparition de points cliniques limites.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le plus répandu dans l’étude des rétinopathies vasculaires, et a fait l’objet de nombreuses études et publications scientifiques. Ce modèle est peu coûteux et facilement maintenu en captivité. Nous avons également à notre disposition différents modèles de souris à comparer sur la mise en place de cette pathologie : souris sauvages ou génétiquement modifiés afin d’étudier l’impact de l’angiogénèse sur la rétinopathie radique. Enfin, nous disposons d’irradiateurs adaptés à la souris et permettant l’étude de nouvelles modalités d’irradiation encore en développement chez l’homme. Les études seront menées sur jeunes adultes matures, c’est-à-dire des animaux de 6-8 semaines au moment de l’irradiation. Ce stade est privilégié car nous devons disposer d’un réseau vasculaire formé et mature. L’impact du vieillissement (souris agées) fera l’objet d’une étude ultérieure.

426 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. 406 reçoivent une injection de nanoémulsions, 358 subissent des prises de sang étalées jusqu'à six mois, 252 une perfusion intracardiaque, et 68 passent en imagerie par résonance magnétique pour des séances de vingt à soixante minutes. Le projet vise à valider un agent de contraste au xénon destiné à détecter l'inflammation cérébrale, le diagnostic clinique restant annoncé comme une perspective. Le porteur affirme que ces procédures ne peuvent pas être remplacées par des méthodes n'impliquant pas d'animaux vivants et "susceptibles d'apporter le même niveau d'information".

Objectifs

L'inflammation joue un rôle essentiel dans la pathogenèse de nombreuses maladies cérébrales, tels que les accidents vasculaires cérébraux (AVC), la maladie d'Alzheimer, ou la sclérose en plaques. Différentes techniques sont utilisées dans le but de détecter l'inflammation. Parmi ces techniques on trouve l'imagerie par résonance magnétique (IRM), une technique d'imagerie clinique puissante grâce à une résolution spatiale potentiellement élevée, un faible caractère invasif et un excellent contraste tissulaire. Cependant elle souffre d'une faible sensibilité. Afin de remédier à ces contraintes, l’utilisation de plusieurs types d’agent de contraste (AC) ont été proposés. Le xénon hyperpolarisé (Xe-HP) apparaît ces dernières années comme un agent de contraste prometteur. L'utilisation du Xe-HP en IRM présente plusieurs avantages grâce à son hyperpolarisation : son signal peut être amélioré jusqu'à cinq ordres de grandeur, et donc détectable à de très faibles concentrations. Le xénon est un gaz inerte et non toxique soluble dans les solutions organiques, aqueuses et les fluides biologiques comme le plasma sanguin. Cependant, comme ce gaz n'est pas spécifique, il doit être vectorisé pour atteindre sélectivement une autre cible biologique. Dans ce sens, le cryptophane A et ses dérivés ont été largement utilisés comme hôtes moléculaires pour concevoir un biocapteur à base de xénon. Néanmoins, ces molécules organiques ne sont pas optimales pour les applications biologiques surtout que leur solubilité dans l'eau a été rapportée comme étant basse, et que les dérivés de cryptophane A forment des agrégats dans l'eau à de faibles concentrations. Par conséquent, des nanoassemblages de cryptophanes ont été décrits afin à la fois de bien contrôler le comportement du cryptophane in vivo et d'améliorer sa concentration locale. Nous avons donc utilisés et testés des nanoémulsions chargées de cryptophane in vitro pour optimiser l’application de l’IRM du xénon dans le diagnostic de maladies inflammatoires. Ainsi, l’objectif principal de ce projet sera d’évaluer la capacité des nanoémulsions chargées en cryptophanes, utilisées en association avec du Xe-HP in vivo, à servir d’outil diagnostic IRM, et de breveter l’outil issu de cette évaluation pour un transfert vers l’industriel.

Bénéfices attendus

Ce projet qui vise à transformer les avancées scientifiques fondamentales en produits /services utiles au monde socio-économique. On s’attend donc à valider nos nanoémulsions chargées de cryptophane comme un outil innovant de l’IRM du Xénon. Ceci permettra de les utiliser en toute sécurité pour le diagnostic clinique de diverses maladies tel que les maladies inflammatoires.

Procédures

IInjections vigiles des nanoémulsions (NE) ou du chlorure de sodium (NaCl 0.9%) (Jour 0 (J0) ; Durée : 1min/injection ; n=406) Prélèvements de sang (premier jour après l’injection J1, premier mois M1, troisième mois M3, sixième mois M6 ; Durée : 1min/prélèvements ; n=358 Imagerie IVIS® (Spectrum in vivo imaging system) (J0+1H, J0+6H, J1, J2, M1, M6 ; Durée : 5min/session ; n=252) Perfusion intracardiaque (J0+1H, J0+6H, J1, J2, M1 ; n=252) Imagerie par Résonance Magnétique (IRM ; Durée : 20-60min/Session ; n=68)

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient du stress léger lié à la manipulation pour l’ensemble des procédures. Une hypothermie Modérée lors des phases d’anesthésies.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus nécessaires pour des analyses cytologiques et histologiques

Remplacement

Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies de diagnostic chez l'animal. Les principaux tests réalisés in vitro sont des tests de viabilité cellulaire au WST-1 (Water-Soluble Tetrazolium-1) évalués à 1h, 24h, 48h et 72h d’incubation avec des nanoémulsions chargées ou non de cryptophane. Les résultats ne montrent aucune mortalité cellulaire associée. Une évaluation de la stabilité métabolique (microsomes et plasma) des cryptophanes a été aussi effectuée. Le cryptophane montre une bonne stabilité plasmatique (t1/2> 6h) et est dégradé au niveau des microsomes hépatiques de souris. Ces résultats semblent indiquer que si le cryptophane était relargué dans la circulation sanguine, il serait néanmoins métabolisé.des tests in vivo sont nécessaires pour confirmer ces résultats. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’imagerie et de l’inflammation ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal.

Réduction

Notre projet ne permettant pas d’utiliser d’autres moyens que l’expérimentation animale, nous nous sommes assuré d’utiliser le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisés est déterminé en fonction de la spécificité et de la sensibilité des méthodes utilisées et la littérature. Dans chaque phase du projet, le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquation avec les tests statistiques prévus lors de ce projet. Le nombre minimum d’animaux pour chaque procédure a été défini à partir de nos expériences précédentes, données disponibles dans nos publications et surtout des données disponibles dans la littérature (des expérimentations qui ont été appliquées avec des procédures et des buts similaires à ce qui est dans notre projet ). Le nombre d’animaux pourra être revu à la baisse selon l’aisance de l’expérimentateur (habileté, expérience dans les différentes techniques prévues). L’ensemble des échantillons prélevés lors des procédures pourra être partagé et utilisé, permettant une réduction du nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux stables (n=5) avec un enrichissement minimum (maison en carton, produits de nidification tels que des lanières de paipier kraft et/ou des carrés de coton nestlets) dans des cages standards aux normes européennes (type IV). Nous utiliserons la litière de peuplier "aspen small", plus douce et variée et moins poussiéreuse et allergisante, permettant de réduire le niveau de stress des animaux. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié, ce qui permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les souris seront pesées et acclimatées pendant une semaine dans le laboratoire avant le debut de protocoles. Une fois entrés en protocole, les animaux de la première procédure seront pesés tous les trois jours et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si leur score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7. Toutes injections auront lieu en intraveineuse en vigile avec une application d’un antalgique local en spray pour minimiser la douleur. Pour toutes les imageries in vivo, Les animaux seront sous anesthésie générale induite par isoflurane. Pendant l’imagerie, les animaux seront maintenus sous anesthésie générale avec un masque en respiration spontanée et ils seront thermo-régulés. Après toute anesthésie, Les animaux seront ensuite replacés dans leur cage dans des enceintes chauffées où leur réveil spontané se fera sous surveillance régulière de l’expérimentateur. Ils seront ensuite pris en charge par l’équipe animalière.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation cérébrale et les caractéristiques de la pathologie sont donc bien connus. L’anatomie et la physiologie de la souris sont également bien connues (notamment en imagerie par IRM) et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires, afin d’être comparable aux données présentes dans la littérature.

178 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune portant sous la peau une greffe de cellules de mélanome mesurée au pied à coulisse deux à trois fois par semaine. Une fois la tumeur passée 50 mm3, les injections de traitement se succèdent tous les deux jours, avec une séance de bioluminescence hebdomadaire sous anesthésie. La molécule testée bloque un récepteur immunitaire, dans l'espoir déclaré d'un transfert vers la clinique pour les patients en échec thérapeutique. Le projet déclare un niveau de souffrance léger, tout en indiquant qu'une tumeur à un stade avancé peut gêner les déplacements des animaux.

Objectifs

Des études ont montré que les patients atteints de mélanome malin avancé présentaient des concentrations sériques élévées de la protéine CSF1, et une corrélation de cette expression avec la progression de la maladie. L'analyse de biopsies de mélanomes primaires et métastatiques ont révélé une corrélation de l’expression de cette protéine CSF1 et de son récepteur avec l'abondance de lymphocytes T spécifiques de la tumeur. Des études in vitro ont également montré que les lymphocytes T spécifiques de la tumeur, induisaient après activation, la sécrétion de CSF1 par divers types de cellules du microenvironnement tumoral. Enfin, des études précliniques ont montré que le blocage du récepteur du CSF1 combiné au blocage d'un point de controle immunitaire retardaient la croissance tumorale dans certains modèles de cancer de souris, dont le mélanome. L’ensemble de ces données suggère que l'induction de la protéine CSF1 dans le mélanome représente un mécanisme de résistance adaptatif conservé déclenché par des lymphocytes T activés, qui est corrélé à la progression de la maladie. L’objectif de cette étude est donc d’évaluer l’efficacité thérapeutique d'une molécule soluble bloquant le CSF1 Récepteur dans deux modèles de mélanomes, réfractaires à d'autres thérapies.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont dans un premier temps la mise en place d’un modèle de mélanome le plus représentatif de la pathologie et de la problématique thérapeutique qui permettra l’évaluation thérapeutique de notre molécule bloquant le CSF1R mais qui pourra également par la suite servir à tester d’autres stratégies en développement dans notre équipe ou par des collaborateurs. L’étude de l’efficacité de notre molécule soluble bloquant le CSF1 Récepteur nous permettra dans un premier temps de l’optimiser en fonction des résultats obtenus puis dans un second temps d’envisager un transfert vers la clinique afin de proposer un nouveau traitement au patients atteints de mélanome, particulièrement ceux en échec thérapeutique.

Procédures

Injection des cellules tumorales en sous-cutané (15 minutes par souris, animaux anesthésiés). Suivi de la croissance tumorale 2-3 fois par semaine par mesure avec un pied à coulisses et prise de poids (animaux anesthésiés). Injection des traitements tous les 2 jours lorsque la tumeur est >50mm3 (animaux vigiles). Suivi de la croissance tumorale par mesure bioluminescence 1 fois par semaine (animaux anesthésiés).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont principalement liés à l’implantation de la tumeur. L’implantation de la tumeur, bien que réalisée sous anesthésie et analgésie, peut conduire à une douleur légère et de courte durée aux animaux. Une fois la tumeur développée à un stade avancé il est possible qu’elle provoque une gêne aux déplacements des animaux mais sans conséquence sur leur alimentation …. Les points limites de l’expérience seront bien sûr adaptés dans le cas, peu probable, où le développement de la tumeur induirait un changement important du comportement lié à la douleur ou autre. De plus, la réalisation du traitement nécessitera de multiples injections qui peuvent également induire une douleur légère et éphémère ainsi qu’un stress.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à l'atteinte de points limites. Des prélèvements sanguins et post-mortem (tumeur, rate) seront effectués sur l'ensemble des animaux afin de réaliser une analyse comparative entre les groupes, et ainsi évaluer les effets de notre molécule sur les réponses anti-tumorales intervenant dans ce modèle.

Remplacement

La nature de cette étude ne permet pas de s’affranchir de l’utilisation d’animaux ; le même niveau d’information ne pouvant être apporté par des études in vitro ou in silico, étant donné la complexité de la réponse immune. Toutefois, l’utilisation d’animaux démarrera seulement une fois que notre molécule sera parfaitement caractérisée et son efficacité validée in vitro dans plusieurs modèles en 2D de mélanome.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, chaque étape sera réalisée successivement et les modèles/protocoles les plus pertinents seront finement sélectionnés à chaque étape. Chaque protocole sera réalisé dans un premier temps sur un petit nombre d’animaux avec le nombre minimum de groupe. Si la stratégie fonctionne, elle sera alors reproduite pour confirmer les résultats et le cas échéant des groupes contrôles seront ajoutés et le nombre d'animaux augmenté à 10 animaux final par groupe. Ce nombre est suffisant pour réaliser des tests statistiques pour évaluer la survie des animaux. D’autres tests statistiques seront également réalisés sur les données de mesure au pied à coulisse, de bioluminescence ainsi que les analyses sur organes en fin de protocole, afin d’exploiter au maximum les résultats obtenus.

Raffinement

Afin de prévenir au maximum le stress des animaux, les souris sont maintenues en groupe sociaux, dans un environnement enrichi (frisottis + tunnels) et observées quotidiennement afin d’identifier tout changement de comportement lié au stress ou à la douleur et sacrifiées en cas de souffrance. L’implantation des cellules tumorales et le suivi des animaux par bioluminescence seront réalisés sous anesthésie générale et analgésie locale. Les points limites seront définis sur de nombreux critères incluant le poids et le comportement des animaux en plus de la taille/aspect de la tumeur et résumé dans un tableau pour obtenir la définition des poids limites la plus précise possible et éviter toute souffrance inutile aux animaux.

Choix des espèces

Les souris sont de bons modèles d'étude, notamment pour évaluer le bénéfice de nouvelles stratégies antitumorales, de par leur facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. L'utilisation préalable de ces animaux par des équipes scientifiques internationales permet à d’autres travaux de recherche de débuter avec une base solide (connaissances théoriques, modèles, équipement,...). Ce projet sera réalisé sur des souris immunocompétentes afin de pouvoir analyser le système immunitaire infiltrant la tumeur. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8-12 semaines) pour des raisons de maturité du développement squelettique et nerveux, facilitant les gestes liés aux greffes de cellules tumorales, à la réalisation du traitement et renforçant également la pertinence des effets thérapeutiques (transfert clinique chez des patients adultes).