Souris

Opérées pour provoquer un lymphœdème d'une patte, 360 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, et celles qui passent en fin de protocole une lymphographie sous anesthésie générale sont tuées sans réveil. Le projet étudie le rôle d'une enzyme dans la fibrose qui suit le lymphœdème après un cancer du sein, et dans la dissémination des métastases, sur des souris privées de cette enzyme dans certains tissus. Un score de douleur et de stress égal ou supérieur à 10 sur 12 entraîne la mise à mort immédiate. Le porteur présente un gonflement de 10 à 15 % de la patte opérée comme le "seul effet indésirable attendu", dans un protocole qui prévoit aussi un gavage et une injection de cellules tumorales.

Objectifs

Le systeme lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener a la circulation sanguine au niveau de la veine sous-claviere. Il est implique dans le transport des graisses et des macromolecules et joue un role important dans l’immunite en transportant les cellules de l’inflammation. Le reseau lymphatique est egalementimplique dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedeme, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoide et dans la dissemination metastasique. Le lymphoedeme est le resultat d’une obstruction ou d’une perturbation dusysteme lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedeme est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient apres la chirurgie du cancer, cependant aucune therapie visant la regulation du dysfonctionnement de ce reseau lymphatique n’est proposee. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence un remodelage pathologique de la matrice extracellulaire promouvant la fibrose induit par une augmentation de l'expression d'une enzyme. Dans cette étude, nous proposons d'étudier l'impact de cette enzyme sur la matrice extracellulaire entourant les vaisseaux lymphatiques et l'impact sur leur fonction de drainage, paramètre critique pour le développement du lymphoedème. Des études ont par ailleurs suggéré que cette enzyme jouait un rôle dans la carcinogenèse, nous étudierons donc également si elle peut influencer la lymphangiogenèse tumorale et avoir des conséquences sur la dissémination métastatique

Bénéfices attendus

Le lymphoedème secondaire touche environ 15% des femmes ayant eu un cancer du sein, soit près de 1600 nouveaux patients chaque année en France. Malgré la grande prédominance de cette pathologie, aucun traitement n’est actuellement disponible hormis des massages et bandages de contention. Ce projet permettra d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de restaurer la fonction lymphatique défaillante en normalisant le microenvironnement

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 interventions au total. Une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire (réalisée sous anesthésie gazeuse) durée : 20-30 minutes/animal. Une administration de substance sur animal vigil : gavage oral, durée : 1min/animal. Les animaux seront égalements soumis à une procédure d'injection de cellules tumorales (10min/animal) Enfin les animaux seront soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence, durée : 15 minutes/animal. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure

Impact sur les animaux

L'induction chirurgicale du lymphoedème ne touche aucun organe vital et n'impacte donc pas la survie des animaux. Cette chirugrie a déjà été utilisée dans de précédentes études validées dans la littérature scientifique et n'a révélé aucun impact sur la mobilité des animaux y compris dans l'utilisation du membre touché par la chirurgie. Le seul effet indésirable attendu est un gonflement (10 à 15% d'augmentation par rapport au diamètre moyen de la patte non opérée) de la patte opérée, à partir d'une semaine post-chirurgie et ce jusqu'à la mise à mort des animaux en fin de procédure. Un scoring des signes de douleur et de stress sera effectué suivant la grille de scoring mise en place par le service du bien-être animal de la zootechnie. Cette grille évalue 4 paramètres : apparence, prise de poids/alimentation, comportement naturel, comportement provoqué et permet d’établir un score de douleur/stress sur une échelle de 0 à 12. Tout animal obtenant un score égal ou supérieur à 10 sera immédiatement euthanasié.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet

Remplacement

Le lymphoedème est une pathologie où le tissu touché est drastiquement modifié et où de nombreux types cellulaires différents interagissent entre eux (cellules endothéliales, fibroblastes, adipocytes...), seul l'utilisation d'un modèle murin peut apporter une relevance physiologique à nos résultats. Néanmoins une fois les acteurs de la fibrose associée au lymphoedème identifiés dans ce modèle, leurs régulations seront etudiées dans différents modèles in vitro disponibles au laboratoire afin de limiter l'usage des animaux. Le laboratoire est par ailleurs activement engagé dans le développement de microvaisseaux lymphatique in vitro de type "organe sur puce" pour améliorer la relevance physiologique des modèles in vitro et limiter au maximum l'utilisation des animaux

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide de logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif. Nous reduirons donc au maximum l'utilisation d'animaux dans ce protocole

Raffinement

Durant l'ensemble du projet les animaux sont hebergés selon la reglémentation européenne et les recommandations du Service Bien-Etre Animal (SBEA) de la zootechnie.5 souris maximum sont hebergées par cage, dans des cages enrichies et aucun animal n'est isolé dans aucune des procédures afin de ne pas induire de stress. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse et des analgésiques sont administrés avant et après les opérations. Dès le lendemain de la chirurgie, un suivit post-opératoire est mis en place afin de détecter la douleur mais également une éventuelle absence de : 1/reprise de poids, 2/nidification, 3/toilettage. L'évolution de la plaie et de sa cicatrisation sera également surveillée afin de détecter rapidement une éventuelle infection. Ce suivi sera effectué en conformité avec les grilles de scoring établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). En résumé, ce suivi aura pour but de détecter si l'animal est capable de répondre à ses besoins physiologiques de base, dans le cas contraire tout animal en souffrance sera euthanasié en conformité avec les procédures établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA).

Choix des espèces

Le choix de l’espece s’est oriente vers la souris car l'invalidation genique de l’enzyme étudiée a ete generée seulement dans cette espece. Nous utiliserons en particulier dans ce projet des souris conduisant a une invalidation de cette enzyme de maniere tissu-specifique dans les cellules endotheliales lymphatiques et dans les fibroblastes. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberte, l'ensemble des procedures sera realisee chez des souris femelles a l'age de 6 semaines. Les procedures seront realisees de 6 a 12 semaines

Une sonde rectale introduite dix à quinze fois en trois à cinq heures, une hypothermie poussée jusqu'à 32 °C et jusqu'à quatre prélèvements de sang à la queue attendent chaque souris de ce projet. 384 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin de protocole pour prélèvements de tissus et de sang. Le porteur décrit une technologie qu'il compare à un cheval de Troie, des molécules-médicaments détournant les mécanismes naturels de passage des barrières de l'organisme pour atteindre le cerveau. Il qualifie ces manipulations de précises et rapides et écrit que la procédure ne comporte "pas d'anesthésie, pas d'analgésie", tout en retenant comme point limite l'apparition d'une hypothermie irréversible.

Objectifs

Les maladies et troubles neurologiques sont la première cause mondiale de handicap. À l'heure actuelle, les besoins médicaux restent malheureusement très insatisfaits, sans aucun traitement curatif, ou palliatif. Une des raisons majeures réside dans l’inefficacité de nombreux médicaments à passer la barrière protectrice du cerveau et ainsi à accéder aux régions à traiter. Dans ce contexte, nous avons développé un savoir-faire qui consiste en l’association de molécules à des pro-drogues ou médicaments, capables de passer les barrières biologiques protectrices de l’organisme et ainsi atteindre plus efficacement les tissus cibles (cerveau, muscles…). Notre technologie repose sur une stratégie de cheval de Troie : Nos médicaments sont capables de reconnaître des partenaires spécifiques, au niveau des barrières protectrices de l'organisme et utilisent leurs mécanismes naturels de passage cellulaire pour atteindre le tissu cible. À travers cette demande de projet, nous souhaitons développer et optimiser de nouveaux médicaments afin d’améliorer la délivrance d’agents au fort potentiel thérapeutique. Par différentes voies d'administration, nous tenterons de potentialiser l’effet de nos médicaments, sur une lignée murine humanisée pour le récepteur cible de ce projet.

Bénéfices attendus

La transposition de nos recherches sur un modèle murin humanisé pour notre cible permet d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos molécules et les possibles effets secondaires ou toxicités associées. De plus, elle assure de développer au maximum les études sur le modèle souris avant la phase préclinique et la transposition à l’homme, qui aurait nécessité des séries de tests sur divers modèles animaux. D'un point de vue médical, sur du plus long terme, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos vecteurs-médicaments constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les manipulations expérimentales seront réalisées sur animaux vigiles et de manière précises et rapides (≤ 2min). Elles incluent : L’annotation des queues au moyen d’un marqueur spécifique permettant l’identification des individus (1 fois /semaine). Les pesées : Une pesée sera réalisée avant chaque administration et une, avant l’euthanasie des animaux. La prise de température rectale (10 à 15 prises espacées de 15 à 30 minutes sur une durée de 3 à 5 h). La mise en contention avant toutes administrations intraveineuses (1 à maximum 4) ou prélèvements intermédiaires (maximum 4). Les administrations des conjugués : 1 à maximum 4. A noter : Dans le cas d’administration répétées, un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. Les administrations lors de l’euthanasie : 1 seul/individu. Les prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires seront réalisés en cours de cinétique (maximum de 4 prélèvements n’excédant pas ≤10% de la volémie sur 14 jours). Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : Un stress physique peut être induit lors de la mise en contention des animaux, la réalisation des différentes administrations intraveineuses, sous-cutanées (deux à quatre maximum par individu) ou intrapéritonéale (dose unique), l’introduction d’une sonde rectale (prise discontinue sur 5h maximum) lors du monitoring de la température et lors de la réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (au maximum 4 prélèvements /individu, n’excédant pas 10% de la volémie sur 14 jours). Un stress thermique peut quant à lui être généré par l’hypothermie induite (jusqu’à 32°C).

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour réaliser les prélèvements tissulaires et sanguins finaux. Si, en cours de cinétique, un individu atteint un point limite, l'animal sera également mis à mort en urgence après validation du vétérinaire et porteur de projet.

Remplacement

Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont de nos procédures toute une série de tests in vitro. Cette première série de tests permet notamment de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations) qui conditionnent le succès de nos vecteurs médicaments. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons donc de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques et homéostasiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités (Raffinement), mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de maximum 6 groupes par étude et 2 études par an, sur chacune des deux lignées de souris. Aussi, nous n’aurons besoin que de 96 animaux par an (4 *6*2*2), soit un total de 384 souris sur 4 ans (96*4). Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte (cages séparées). Le faible nombre d’individus (4, ici) sera suffisant pour obtenir une analyse statistique robuste. Les prélèvements de tissus en fin de procédure, nous permettrons d’optimiser cette dernière sur plusieurs types de post-expérimentations en apportant des données supplémentaires et ainsi, nous permettront d’éviter une utilisation abusive et inutile d’animaux (Réduction). De façon identique, la réalisation de prélèvements sanguins en cours de cinétique permet d'obtenir davantage de données pharmacocinétique, permettant ainsi de renforcer et d’optimiser l’étude et in-fine de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont répartis à raison de 4 individus maximum par cage (de même sexe) et maintenus dans un environnement familier (même cage pour les odeurs, taille standard pour portoir ventilé + couvercle filtrant), litières (copeaux de bois) avec un triple enrichissement. Toutes les administrations sont réalisées par un personnel formé, expérimenté et pratiquant en routine les études de biodistribution chez la souris, tout en respectant les recommandations de volume injecté en fonction des voies d’administration. Les prélèvements intermédiaires de sang sont réalisés après asepsie de l’extrémité de la queue. Une compresse de gaz imbibée d’eau oxygénée est appliquée immédiatement après le prélèvement. Les prélèvements terminaux sont réalisés sur des souris sous anesthésie générale profonde et ayant préalablement étaient analgésiées. Les points limite impliquant l’euthanasie immédiate des animaux sont les suivants : Apparition d’une hypothermie irréversible (température

Choix des espèces

Nous réalisons en amont de nos procédures des tests in vitro. Ces tests permettent de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires, mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques qui conditionnent le succès de nos vecteurs. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons de réaliser nos expériences sur la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. La souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques et homéostasiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Notre modèle de transposition sur la lignée humanisée est particulièrement avantageux et permettra une extrapolation plus pertinente au modèle humain. Pour notre procédure, nous utiliserons pour les deux lignées des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter-individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 27-30g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).

Tuées sans réveil à la fin des mesures de contraction musculaire, 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un vecteur viral injecté dans le muscle tibial d'une seule patte y fait progressivement disparaître la contraction, ce qui affecte la mobilité de l'animal pendant une durée que le porteur dit ne pouvoir fixer qu'après la première phase du projet. S'ajoutent deux à cinq prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse, une injection du peptide testé par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, puis une chirurgie pour atteindre le muscle et en mesurer les propriétés contractiles. Le porteur affirme que le recours à l'expérimentation animale est "nécessaire", les modèles cellulaires ne donnant pas selon lui de cellules musculaires assez matures.

Objectifs

La contraction des muscles squelettiques nécessite une augmentation de la concentration intracellulaire de calcium qui est contrôlée par l’interaction de deux protéines, A et B. L’interaction de ces deux protéines permet le déclenchement de la contraction musculaire et le dérèglement de cette interaction entraine des troubles graves de la contraction musculaire. L’objectif de ce projet est de tester la capacité d’un peptide d’intérêt à restaurer la contraction lorsque l’interaction entre ces deux protéines est perturbée par l’absence de l’une d’entre elles. L’absence dans tous les muscles de l’une ou l’autre de ces deux protéines entrainant la mort de l’animal, nous supprimerons l’expression de la protéine A dans un seul muscle de la patte. Une fois constatée une diminution significative de la contraction de ce muscle nous injecterons le peptide d’intérêt dans le muscle et observerons le retour de la contraction. Cette étude permettra d’approfondir la compréhension des mécanismes qui commande le couplage excitation-contraction du muscle squelettique. Différentes myopathies humaines ont pour origine un dérèglement des mécanismes de contrôle du déclenchement de la contraction. La caractérisation de molécules permettant de contrôler les différentes étapes de ce processus revêt donc une importance majeure non seulement au niveau fondamental mais également dans la mise au point de traitement de ces pathologies. Cette étude représente la première preuve de concept de l’utilisation « in vivo » de peptides capables de moduler au niveau intracellulaire les acteurs du déclenchement de la contraction.

Bénéfices attendus

Bénéfices attendus du projet. Ce projet devrait permettre : 1) De démontrer in vivo la capacité du peptide d’intérêt à rétablir le couplage entre l’excitation et la contraction des cellules musculaire squelettiques lorsque la protéine située à la surface de la cellule fait défaut. 2) D’établir la preuve de concept que le peptide d’intérêt est capable in vivo d’interagir avec sa cible et d’en contrôler l’activité. Cette démonstration ouvrirait la possibilité d’utiliser ce peptide dans différentes situations pathologiques causées par une déstabilisation de l’interaction entre les protéines A et B (RYR1 et CACNA1S).

Procédures

Les souris recevront une injection unique dans le muscle tibial crânial avec 30 µl de PBS ou d’un vecteur viral de type AAV (Adeno Associated Virus). La durée totale d’intervention est d’environ 10 mn.Des prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse seront réalisés régulièrement pendant toute la durée du protocole soit de 2 à 5 préléments maximum selon les groupes et leurs durée de suivi. Le temps d’intervention est d’environ 5 mn. Selon les groupes, les souris recevront une injection unique du peptide soit en Intra Veineuse, qui sera réalisée au niveau de la veine caudale sous anesthésie gazeuse (environ 5 mn) soit en IP qui sera réalisée sous contention en moins d’une minute. Pour les mesures de contraction du muscle, les animaux seront anesthésiés. Après une petite chirurgie pour atteindre le muscle squelettique EDL, celui-ci sera soumis à un protocole de contraction musculaire afin d'évaluer les propriétés contractiles de ce muscle d'intérêt. À la fin de ces mesures et afin de réaliser des analyses post mortem, les animaux seront immédiatement mis à mort.

Impact sur les animaux

Pour les injections en intramusculaire (IM) et en intraveineuse (IV) ainsi ques les prélèvements sanguins, les souris seront sous anesthésie gazeuse. Une légère douleur au point de ponction pourrait être ressenti après le réveil. L’injection en intra péritonéale (IP) sera réalisée sur animaux vigiles. Elle engendre une légère douleur au moment de la piqure. Une fois le muscle tibial crânial injecté avec le vecteur, les animaux subiront de façon progressive une diminution puis la disparition de la contraction de ce muscle. La mobilité en sera donc affectée, et cela, dans un temps qui sera défini lors de la Phase 1 du projet. C’est sur la base de cette nuisance que le choix d’injecté qu’un seul membre a été décidé. Pour les mesures contractiles du muscle, les animaux seront anesthésiés puis mis à mort (acte expérimental sans réveil).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post mortem.

Remplacement

La capacité du peptide d’intérêt à rétablir la contraction du muscle a été testé sur des cellules musculaires en culture. Cependant les modèles cellulaires ne permettent pas d’obtenir des cellules musculaires totalement matures et donc d’approcher la complexité des interactions entre protéines en place dans la cellule musculaire adulte. L’utilisation de la souris est donc justifiée pour évaluer ces différents paramètres physiologiques de la contraction musculaire et l’effet du peptide d’intérêt sur ces différents paramètres.

Réduction

Dans le contexte de cette étude, et en se basant sur notre expérience des données d’expression après injection d’un vecteur AAV dans le muscle chez la souris, le nombre d’animaux est réduit au strict minimum. Ainsi, un maximum de 200 souris réparties sur 3 phases sera utilisé afin d’avoir suffisamment de données pour déterminer dans un premier temps, la fenêtre d’injection possible du peptide, dans un second temps la voie d’administration et le temps de pénétration dans le muscle de ce peptide et dans un dernier temps, son efficacité ou non, in vivo. Selon les paramètres analysés, des tests statistiques de type non paramétriques (Mann & Whitney) pourront être utilisés pour comparer les souris traitées et non traitées.

Raffinement

Le bien-être animal et le raffinement des procédures passera par de bonnes conditions d’hébergements, un suivi quotidien des animaux, l’instauration de points limites pertinents et précoces ainsi que la mise en place de mesures adaptées (anesthésie, analgésie etc.) En cas d’observation d’un mal être de la part de l’animal, un examen clinique sera réalisé à l’aide d’une grille de score afin d’évaluer le degré de souffrance de l’animal. Ainsi, sera observé l’aspect physique global (poil, morphologie général, pertes de poids), l’aspect physique du facies (Paupières, Aspect des larmes, colorations des muqueuses/oreilles), l’aspect comportemental (agressivité, comportement, activité) et la respiration. Pour ce projet, l’observation se portera également sur les capacités motrices de l’animal ainsi que sa capacité à pouvoir se nourrir. Cette grille d’évaluation décisionnaire est générique et mis à disposition par notre SBEA. Selon le score enregistré, certaines actions seront mises en place selon le schéma suivant : score de 0, aucune action ; de 1 à 6, signes cliniques légers, réflexion sur l’environnement (milieu, social). Si un animal présente 3 signes associés, utilisation d'AINS ou analgésique faible ou anesthésique local ou opioïdes dose faible; de 7 à 13, signes cliniques modérés, utilisation d’opioïdes dose faible à moyenne, réflexion sur l’environnement (milieu, social…) et observation régulière (min 1f/j) ; de 14-20 signes cliniques sévère, observation (min 2f/j) et utilisation d’opioïde de dose moyenne à forte, s’il n’y a pas d’évolution dans les 24h malgré la prise en charge de la douleur, alors l’animal sera euthanasié ; ≥ 21, euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

Afin de répondre aux objectifs de ce projet, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire. En effets, les modèles « in vitro » ne peuvent reproduire la complexité du mécanisme qui commande le couplage excitation-contraction du muscle squelettique. Les vecteurs AAV sont fréquemment utilisés avec succès chez la souris. Ainsi nous allons utiliser ce modèle afin de pouvoir mimer grâce au vecteur AAV le dérèglement du couplage excitation-contraction et faire preuve de concept de la capacité d’un peptide à rétablir le déclenchement de la contraction « in vivo ». Afin de pouvoir réaliser notre étude sur des muscles tibiaux et EDL homogènes et de tailles adultes, des souris adultes d’environ 14 semaines seront utilisées.

Raccourcir le délai entre la découverte d'une cible thérapeutique et son test en clinique passe ici par l'immunisation de souris pour produire des anticorps monoclonaux. 2 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection intrapéritonéale toutes les deux semaines pendant six à huit semaines, parfois davantage, avec un adjuvant qui déclenche une réaction inflammatoire et des douleurs modérées, et subit un prélèvement de sang toutes les deux semaines. Celles qui donnent les meilleurs résultats sont tuées pour prélever leurs organes producteurs d'anticorps, les autres restent en hébergement quatre à huit semaines de plus, disponibles pour de nouvelles injections si la première série ne donne rien.

Objectifs

Les anticorps sont des protéines sécrétées par des cellules spécialisées du système immunitaire qui s’attachent aux substances étrangères au corps (bactéries, virus), appelées antigènes, afin de les neutraliser dans le but d'être évacuées ou détruites par d’autres composants du système immunitaire. Ce dernier se souvient ensuite de ces antigènes et peut libérer les mêmes anticorps si l’occasion se représente. Depuis les années 1980, le développement d'anticorps a profondément amélioré les traitements thérapeutiques dans un grand nombre de pathologies, comme le cancer et les maladies inflammatoires chroniques. Développés chez la souris, les premiers anticorps à visée thérapeutique étaient totalement murins et présentaient d'importants effets secondaires mais ils étaient précurseurs d'une révolution dans les soins. Les biotechnologies et les manipulations génétiques ont permis d'obtenir des anticorps modifiés de plus en plus proches des anticorps humains réduisant considérablement les effets indésirables. Aujourd'hui, plus d'une centaine d'anticorps sont disponibles dans des indications médicales de plus en plus larges et un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Cependant, un des freins majeurs dans l’arrivée sur le marché de nouveaux anticorps médicaments est le fossé existant entre la découverte d’une nouvelle cible potentielle par les laboratoires publics ou privés et la possibilité de tester cette cible en clinique. Autrement dit, le temps nécessaire de la génération des anticorps correspondant à leur validation au cours d’essais précliniques est conséquent et doit être raccourci. Ce projet s’insère dans la première étape de découverte des anticorps à visée thérapeutique qui seront ensuite validés.

Bénéfices attendus

Le projet faisant l’objet de cette demande permettra la découverte et l’obtention rapide d’un panel de nouveaux anticorps d’intérêt thérapeutique notamment dans le cancer et les maladies inflammatoires.

Procédures

Des injections et des prélèvement seront effectués sur les animaux: - Des injections intrapéritonéales réalisées sur animaux vigiles en 2 min maximum/animal à une fréquence d’une injection toutes les 2 semaines durant 6 à 8 semaines. Toutes les souris du projet seront concernées. Nous envisageons que cela correspondrait à 2500 animaux. En fonction de la difficulté d’immunisation, des injections supplémentaires peuvent être nécessaires suivant la même procédure. - Des injections en intraveineuse réalisées une seule fois / animal en 2 à 4 min sous anesthésie. Nous évaluons que cela correspondrait entre 250 et 500 animaux. – Des prélèvements sanguins sont réalisés sur animaux vigiles à une fréquence de toutes les 2 semaines (6 jours après chaque injection en intrapéritonéal à partir de la deuxième injection). Cette opération est réalisée en 2-3 min maximum/animal. Toutes les souris du projet seront concernées, soit 2500 animaux au maximum.

Impact sur les animaux

Suite aux procédures que nous réalisons dans ce projet, les animaux peuvent subir : - du stress lié à la manipulation lors des injections, des anesthésies et des prélèvements sanguins en submandibulaire - des douleurs modérées suite à l’injection de certains immunogènes pouvant altérer le comportement de l’animal notamment lors de l'utilisation d'ajuvant qui induit une réponse inflammatoire - des anesthésies lors d'injection par voie intraveineuse.

Devenir

Les animaux présentant les meilleurs résultats seront choisis pour réaliser les étapes finales de la procédure. Les animaux choisit seront sacrifiés pour prélever les organes produisant les anticorps et réaliser les étapes suivantes de recherches de d'anticorps. Les animaux restants seront gardés et surveillés en hébergement durant 4 ou 8 semaines supplémentaires jusqu’à obtenir les résultats à partir des premiers animaux. Si les premiers résultats ne permettent pas de découvrir des anticorps d’intérêts, les animaux ainsi gardés pourront être exploités ultérieurement pour la réalisation de nouvelles procédures expérimentales (nouvelles injections et prélèvements d'organes) afin d’éviter d’utiliser de nouveaux animaux. Si les résultats de séquençage sont concluants, les animaux seront euthanasiés dès que possible.

Remplacement

L’utilisation des animaux reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps car aucun autre modèle biologique ou chimique ne permet à l’heure actuelle de produire des molécules de structure aussi complexe et variée. Les biotechnologies ne permettent pas de mimer ou reproduire totalement la réponse "anticorps" du système immunitaire rendant l’utilisation d’animaux encore indispensables pour la découverte de nouveaux anticorps comme de potentiels médicaments en immunothérapie..

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par expérience sera calculé en se basant sur les données de la littérature de la cible d’intérêt thérapeutique afin d’évaluer la complexité de la cible et la nécessité d’effectuer plusieurs stratégies d’immunisation (c’est-à-dire de vaccination). Toutes les procédures expérimentales effectuées seront recensées numériquement permettant d’avoir une traçabilité et un suivi des expériences menées, incluant les souris utilisées, les antigènes testés, les résultats obtenus et leurs interprétations ainsi que toute observation ou information pouvant être utile par la suite. Par ailleurs, nous avons pour démarche de réduire le nombre d'animaux. Dans cette optique, les souris qui ne seront pas sélectionnées pour les étapes finales du protocole (prélèvement d'organes) seront conservés. Si les premiers résultats obtenus s'avérés insuffisants en termes d'obtention d'anticorps monoclonaux, ces animaux pourront ainsi être exploités ultérieurement pour la réalisation de nouvelles procédures (nouvelles injections et prélèvements d'organes) pour éviter d'utiliser de nouveaux animaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (mini-dome en cellulose et lanières en papier kraft pour former des nids), maintien des animaux en groupes de 3 à 5 afin d’éviter l’isolement et une période d’acclimatation de 7 jours est respectée systématiquement avant les manipulations. Afin d'atténuer la douleur chez l'animal, nous avons recours à l'anesthésie gazeuse lors de certains gestes techniques. Durant toute la durée d'une expérience, l’ensemble des animaux est observé quotidiennement pour s’assurer : des conditions adéquates de stabulation (paramètres environnementaux, litière, alimentation, boisson) et de l’état de santé des animaux (comportement, aspect physique), pesée 1 fois par semaine en temps normal et plus fréquemment en cas d’apparition de signes de détresse chez l’une des souris de l'expérience.

Choix des espèces

Des modèles génétiquement modifiés (dits transgéniques) développés chez la souris peuvent faciliter la génération d’anticorps de certaines cibles notamment l’utilisation de souris humanisées pour le développement d’anticorps humanisées. La maturité sexuelle des souris se situant aux alentours des 6 à 8 semaines selon le sexe, il convient d’utiliser des animaux jeunes âgés d’au moins 8 semaines pour les programmes d’immunisation. Généralement, les jeunes animaux sont de meilleurs producteurs d’anticorps que les animaux plus âgés parce que la fonction immunitaire atteint son apogée à la puberté et diminue lentement par la suite. Les souris seront donc âgées de 8 à 10 semaines lors du démarrage du protocole d’immunisation. Pour les modèles transgéniques difficiles à générer, une tolérance de 8-12 semaines sera admise.

120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent sous anesthésie une greffe de cellules cancéreuses colorectales sous la peau, puis deux injections d'immunothérapie directement dans la tumeur, dont le porteur indique qu'elles peuvent provoquer irritation, nécrose et saignement de la tumeur. La masse tumorale peut gêner leurs déplacements dans la cage, et l'objectif déclaré est de finaliser et publier des travaux menés les quatre années précédentes sur le rôle d'une protéine de l'autophagie dans les lymphocytes T. Les souris qui ne développent pas de tumeur ne sont pas épargnées pour autant, le porteur prévoyant de les affecter à des prélèvements d'organes et à l'apprentissage des gestes de base par les nouveaux expérimentateurs.

Objectifs

Elément important de l’arsenal thérapeutique contre les cancers, les immunothérapies visent, par différentes stratégies, à stimuler le système immunitaire pour l’aider à détruire les cellules cancéreuses. Notre programme a pour objectif de finaliser et publier des travaux réalisés par l’équipe au cours des 4 années précédentes qui étudient les fonctions de protéines de l’autophagie, un processus de dégradation des constituants intracellulaire, dans les réponses immunitaires antitumorales et l’efficacité d’immunothérapies anticancéreuses. Nous nous intéresserons en particulier au rôle de la protéine de l’autophagie dénommée FIP200 dans un type de cellules immunitaires, les lymphocytes T (des globules blancs), qui sont capable de détruire des cellules cancéreuses. Nous testerons si l’absence de FIP200 dans les lymphocytes T module leurs capacités anti-tumorales suite à l’administration d’une immunothérapie anticancéreuse basée sur l’activation de la protéine STING (Stimulatory of Interferon Genes) connue pour activer les réponses immunitaires antitumorales assurées par les lymphocytes T et actuellement en cours d’évaluation chez l’homme pour le traitement de cancers.

Bénéfices attendus

Nos travaux suggèrent que certaines protéines impliquées dans l’autophagie limitent les réponses immunitaires anticancéreuses, en particulier lors de la stimulation de la protéine STING par ses activateurs. Les expériences que nous proposons de réaliser à l’aide de souris exprimant ou non la protéine FIP200 dans leurs lymphocytes T, les rendant ainsi capables ou non d’autophagie, permettront de déterminer le rôle de l’autophagie des lymphocytes T dans leurs capacité antitumorales et dans l’efficacité des immunothérapies basées sur l’activation de STING. Pour cela, nous suivrons la croissance de tumeurs chez les souris dont les lymphocytes T sont capables ou non d’autophagie suite au traitement par immunothérapies et nous étudierons plus précisément les capacités de ces lymphocytes T infiltrant les tumeurs à produire des médiateurs immunitaires aux fonctions antitumorales

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection de cellules cancéreuses en sous-cutanée afin leur greffer une tumeur et à deux injections intratumorales d’immunothérapie basée sur l’activation de STING. Ces injections, de durée inférieure à 10 secondes seront réalisées sous anesthésie générale à l’aide d’isofluorane afin de limiter les nuisances

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales ont été définies de manière à minimiser les dommages, douleurs, de souffrance et d’angoisse. La croissance et la masse tumorale peuvent entrainer une potentielle gêne au mouvement pour l’animal au cours du temps, pouvant contribuer à une diminution de la mobilité dans la cage. Bien que nos précédents travaux n’aient pas mis en évidence d’effets secondaires fréquents (Benoit-Lizon et al, JITC, 2022), nous pourrons observer des signes de fatigue ou une perte de poids. Des signes d’irritation ou de nécrose, amenant au saignement de la tumeur, peuvent potentiellement apparaitre suite au traitement par voie intratumorale.

Devenir

A l’issue des procédures expérimentales, les animaux porteurs de tumeurs seront mis à mort soit pour nous permettre de collecter les tumeurs et les cellules immunitaires qui les infiltrent à un temps adapté à nos analyses, soit suivant les points limites définis de façon à limiter les nuisances (gênes, souffrance) qui peuvent survenir. Même si des régressions tumorales peuvent être observées suite au traitement, une reprise de la croissance tumorale après l’arrêt du traitement est toujours possible et nécessite la mise à mort de l’ensemble des souris. Bien que les procédures expérimentales permettent un développement tumoral chez la quasi-totalité des animaux, les animaux ne développant pas de tumeur resteront sous surveillance hebdomadaire pour s’assurer de l’absence d’un développement tumoral tardif et pourront être dédiés à des prélèvements d’organes et expériences menées ex vivo ainsi qu’à l’apprentissage des gestes de base pour les nouveaux expérimentateurs.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe dont la progression implique des interactions entre cellules cancéreuses et cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral dont la reconstitution la plus fidèle est possible seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire. En conséquence, pour être prédictifs, les évaluations de nouvelles thérapies anticancéreuses doivent être réalisées sur des organismes vivants. En outre, nous testons l’efficacité d’une stratégie d’immunothérapie, l’activation de la protéine STING, à l’action anticancéreuse connue mais qui semble apporter des résultats variables en pratique clinique. Il apparaît donc important de revenir au modèle murin pour identifier à l’échelle moléculaire les freins au succès de cette immunothérapie, en particulier ceux qui implique des interactions entre cellules immunitaires et cellules cancéreuses. Les données obtenues seront complétées d’expériences menées in vitro pour une approche globale.

Réduction

Le modèle cellulaire de cancer colorectal (MC38) utilisé pour ce projet chez des souris immunocompétentes est parfaitement maitrisé par les expérimentateurs de notre équipe tout comme les modalités de traitement, évitant ainsi de réaliser des étapes de mise au point et réduisant ainsi le nombre d’animaux. Les groupes expérimentaux sont constitués de n=6 individus pour le suivi de croissance tumorale (expérience répétée 2 fois) et n=3 individus (expérience répétée 3 fois) pour l’analyse détaillée des capacités antitumorales des lymphocytes T infiltrant les tumeurs. Nous disposerons ainsi d’une puissance statistique suffisante pour l’évaluation des effets de nos traitements et du rôle de l’autophagie dans leur efficacité grâce aux tests statistiques adéquats. Autant que possible, des expériences permettant de répondre à nos questions scientifiques seront réalisées in vitro à partir de lignées cellulaires et ex vivo à partir de cellules immunitaires isolées après mise à mort des animaux décrite dans le paragraphe dédié

Raffinement

Les souris seront hébergées dans un environnement adapté et enrichi. L’hébergement se fera en groupe pour favoriser les contacts sociaux et éviter le stress et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Du matériel d’enrichissement permettant la construction de nids (ex : coton) ou leur permettant de se cacher (contenant ou tube opaque) et de développer leur répertoire comportemental sera fourni. Afin de prendre les mesures nécessaires pour améliorer le bien-être animal, les souris seront observées quotidiennement par le personnel de l’animalerie et trois fois par semaine par les expérimentateurs lors de leurs interventions (injections, pesées, mesures du volume tumoral à l’aide d’un pied à coulisse). Les souris disposeront d’une phase d’habituation à être manipulées par les expérimentateurs pour réduire leur appréhension. Des antalgiques seront utilisés en cas de douleur observée. Si les points limites que nous avons établis sont atteints, les souris seront mises à mort selon la méthode décrite ci-dessus.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, il est nécessaire de fixer des paramètres génétiques (délétion de Fip200 dans les lymphocytes), ce qui n’est faisable qu’à partir d’un animal génétiquement modifié. La souris dont la génétique est bien connue, est quantitativement la plus représentée des espèces d’animaux transgéniques, il s’agit donc d’une espèce pertinente. En outre, l’étude des interactions entre cellules cancéreuses et cellules immunitaires du microenvironnement tumoral chez la souris est une approche validée par la communauté scientifique dans notre domaine de recherche. Ce modèle animal est le plus utilisé pour l’évaluation préclinique de l’efficacité anticancéreuse de nouvelles thérapies. D’un point de vue technique, les coûts limités de maintenance, et le taux de reproduction élevé de la souris permettront la création des groupes d’animaux requis sur une période de courte durée. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 6 et 12 semaines), âge auquel les animaux possèdent un système immunitaire mature permettant une meilleure stabilité et meilleure reproductibilité des expériences.

Une partie des souris utilisées est privée d'interféron gamma, donc incapable de contrôler le parasite qu'on lui inocule, et une autre partie est constituée de souriceaux de sept jours. 1 870 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'inoculation de Cryptosporidium et l'administration des molécules candidates passent par un à cinq gavages par animal, sans anesthésie ni analgésie, le porteur indiquant qu'un anti-inflammatoire modifierait la réponse immunitaire et donc la prolifération du parasite. Les adultes immunodéficients peuvent se retrouver prostrés au bout d'une dizaine de jours, et toutes sont tuées en fin d'expérimentation, l'hébergement en zone confinée avec un pathogène transmissible à l'humain interdisant selon le porteur toute autre issue.

Objectifs

Le présent projet vise à évaluer (1) l’efficacité de molécules candidates anti-cryptosporidiennes présélectionnées in vitro sur des modèles murins (adulte et nouveau-nés) selon plusieurs schémas de traitements, (2) à vérifier si un mécansime de resistance vis-à-vis de celles-ci peut se produire rapidement et si ces traitements impactent le microbiote intestinal. La voie orale représente la voie privilégiée pour que la molécule soit en contact direct avec le parasite qui se développe dans la partie apicale des cellules épithéliales intestinales et qui n’est jamais plus invasif. Nous fixons comme prérequis aux expérimentations in vivo l’obtention d’un index de sélectivité (IS) qui soit supérieur à celui de la molécule de référence ie un antiparaistaire connu soit un index de sélectivité IS faible entre 2 et 3. A titre d’exemple, une molécule que nous avons identifié a un IS élevé et publié.

Bénéfices attendus

Le besoin de posséder des molécules efficaces et sures est un besoin fort que ce soit pour traiter la cryptosporidiose humaine ou animale. Nous attendons de ce projet l’identification de quelques molécules candidates capables d’entrer dans la suite du processus de validation de nouveaux composés, ie des essais de non toxicité- non carcinogène fins réalisées par des partenaires externes et après avoir pris contact avec un industriel intéresssé pour mettre ce produit sur le marché (la demande est forte). Ces étapes voient nombre de composés recalés. Il est donc important d’avoir un arsenal de composés pour qu’in fine quelques uns aient la chance de passer toutes les étapes et d’entrer sur le marché afin d’améliorer le bien être et la santé des animaux et de l’homme. L’objectif à moyen terme est bien de disposer d’un nombre suffisant de molécules pour traiter la cryptosporidiose et faire face à certains mécanismes de résistance. Leur repositionnement vers d’autres parasites apicomplexes sera envisagé avec nos collaborateurs afin d’en accroitre encore la portée thérapeutique.

Procédures

Inoculation et/ou traitement par gavage par voie orale des souris vigiles contentionnés, 1 à 5 fois et moins de 5 min.

Impact sur les animaux

L’infection par C. parvum conduit à des diarrhées chez l’homme et les ruminants. Chez les rongeurs, on n’observe pas de diarrhée mais un ramolissement des fèces. Pour les animaux témoins immunodéficient en interféron, on peut observer des prostrations des animaux après une dizaine de jours. Un suivi quotidien est réalisé et si un ou plusieurs points limites sont obervées. L’infection n’induit jamais de mortalité chez les souriceaux. Les animaux post-traitements sont suivis régulièrement pour observer si un effet indésirable est observé (baisse d’appétit, allergie au produit...), et s’il est constaté une atteinte des points limites tels que définis dans le protocole experimental. Un stress léger est attendu lors de la contention par gavage.

Devenir

Les animaux sont entrés dans des protocoles expérimentaux en zone confinée avec des pathogènes zoonotiques (risque pour l'homme) de classe II. Ils sont donc euthanasiés en fin d’expérimentation et des prélèvements seront réalisés (sang, tissus...) afin de comprendre l'efficacité thérapeutiques des différents traitements.

Remplacement

Nos protocoles expérimentaux sont programmés pour que les essais in vivo ne soient réalisés qu’une fois l’effet démontré de la molécule in vitro sur des lignées de cellules épithéliales ainsi que sa toxicité (test de mortalité cellulaire), sa solubilité dans un tampon compatible avec une administration orale et que la molécule à évaluer démontre un meilleur potentiel que la molécule de référence. L’utilisation d’organoïde n’apporte que peu d’informations supplémentaires. En effet nos cibles thérapeutiques sont localisées dans le parasite lui-même et pas au sein de la cellule hôte. De plus, les organoides n’intègrent pas l’environnement enzymatique agressif du tube digestif qui est susceptible de modifier la biodisponibilité et engendrer une modification chimique du composé. Les composés administrés in vivo peuvent en effet être modifiés par l’environnement complexe du tube digestif (pH, enzymes, etc.) ce qui est difficilement prédictif.

Réduction

Le criblage initital in vitro (efficacité, toxixité, solubilité) permet de réduire considérablement l’utilisation du nombre d’animaux. D’autre part notre organisation chronologique des expériences types est mis en place pour réduire à nouveau substantiellement (petits échantillons, non paramétriques), le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés est d’autre part calculé au minimum pour pouvoir garantir l’utilisation de tests statistiques considérant le modèle cryptosporidium chez les rongeurs (modèle de souris sadulte immunodéficientes, modèle de souriceaux de 7 jours). Ces calculs sont basés sur notre longue expérience accompagnée d’une analyse de la littérature réalisée en amont notamment dans le cas ou le composé est repositionné par exemple, et sur un calcul de test de puissance sur nos données.

Raffinement

Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Points limites pour les souris selon l’âge de l’animal pendant au plus 24 à 48h, conduira de fait à l’euthanasie des animaux. Cela s’applique à toutes expériences et procédures citées dans ce document. Adulte (IFNg-/-) : Points limites = au moins un des points suivant en sus des poils hérissés : dos arqué, prostration, mobilité hésitante et aléatoire, yeux mi-clos. Souriceaux : Points limites = mobilité réduite, ou mise à l’écart du nid de façon prolongée par la mère. Toute atteinte du point limite déclenche l’euthanasie de l’animal Les animaux sont hébergés au minimum par 2 dans des cages sur litière et un enrichissement avec des feuilles de papier cellulose, bâtonnets de bois et maison rigide rouge. Et en plus des fils fins de papier kraft non blanchi sont mis pour que les femelles gestantes constituent leurs nids adin de positionner les souriceaux. Ils créent ainsi un tapis doux, élastique et confortable, ce qui en fait un matériau de nidification idéal. L’eau et l’aliment sont ad-libitum. On a une procédure légère à modérée et l’utilisation d’anti-inflammatoires agirait sur la réponse immune et donc sur la prolifération du parasite. Il est décrit dans la littérature, que l’anesthésie peut modifier la réponse immunitaire, le développement du parasite et leur voie de signalisation ce qui serait incompatible avec la finalité de la procédure et l’objectif du projet. Des interactions médicamenteuses peuvent aussi avec lieu entre les antiparasitaires testés et les des anesthésiants et analgésiants déjà décrits des études similaires. Une récompense positive, telle que popcorn ou graine de tournesol, est prévue après un acte.

Choix des espèces

Tout comme les chercheurs internationaux sur ce modèle, nous utilisons en première intention le modèle murin (avant les ruminants) qui reproduit bien l’infection et permet d’évaluer efficacement l’efficacité des drogues. Deux modèles sont utilisés, le modèle de souriceaux de 7 jours qui reproduit la susceptibilité des jeunes ruminants à cryptosporidium et le modèle de souris déficientes pour l'interféron gamma (une cytokine clé dans le contrôle du parasite) qui reproduit la susceptibilité des patients immunodéprimés. Le même parasite zoonotique, C. parvum infectant ces différentes espèces (ruminants, rongeurs, Humain) et nos antiparasitaires ciblant le métabolisme du parasite et non pas l’hôte, tous les modèles animaux susceptibles sont pertinents ; seules les conditions gastrointestinales varient ce qui nous conduit à une validation, en deuxième intention sur l’espèce d’intérêt ruminant. Nous utilisons des souris adultes entre 6 semaines et 15 semaines (souris déficientes pour inteféron gamma) et des souriceaux de 7 jours au démarrage de l’expérimentation (âge qui a été défini pour mimer celui des jeunes ruminants touchés par la cryptosporidiose et celui des jeunes enfants affectés par la maladie. Au-delà de 15 jours les souriceaux conventionels sont naturellement résistants à l’infection grâce au développement rapide de leur système immunitaire digestif.

Valider un composé candidat avant son passage en clinique suppose ici de déclencher une inflammation pulmonaire chez des souris dont le gène murin CRTH2 a été remplacé par son équivalent humain. 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des poumons et du sang. Elles reçoivent jusqu'à quatre administrations intranasales d'une molécule inflammatoire et d'un allergène sous anesthésie, jusqu'à trois administrations du composé testé et quatre prélèvements de sang, avec une perte de poids possible et une modification passagère du comportement. Le porteur vise un traitement de l'asthme sévère tout en indiquant que le modèle employé n'induit pas d'asthme, et précise que les innovations issues du projet seront protégées par des demandes de brevet avant toute publication.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est de démontrer l'effet thérapeutique d'un nouveau composé spécifiquement dirigé contre les cellules lymphoïdes innées ILC2 pulmonaires responsables du déclenchement de l'allergie dans les poumons. Le résultat attendu est l'élimination de ces cellules pathogéniques et donc une guérison de l'allergie pulmonaire. Les maladies allergiques sont une priorité de santé publique car elles touchent des millions de personnes et leur prévalence devrait augmenter dans les années à venir. Aucun médicament permettant une guérison totale des patients n'existe aujourd'hui. Cette étude préclinique permettra de valider ce nouvel outil thérapeutique. Ce projet nécessite l'utilisation de souris génétiquement modifiées dans lesquelles le gène humain codant pour CRTH2 remplace le gène murin. Les souris seront soumises à l'administration d’une molécule inflammatoire et d’un allergène, par voie intranasale pour déclencher une inflammation pulmonaire. Remarque : Ce modèle n'induit pas d'asthme mais une accumulation de cellules immunitaires dans les poumons. Les souris suivront, ensuite un protocole d'administration du composé thérapeutique. Une analyse du sang et des poumons (post-mortem) seront réalisées pour évaluer l'évolution de la pathologie induite et déterminer l'effet thérapeutique du composé.

Bénéfices attendus

Le résultat attendu sera l’élimination des cellules pathogéniques et donc la guérison de l’allergie pulmonaire. Ce projet a donc un impact sociétal fort puisqu’il permet de répondre aux besoins médicaux non satisfaits dans le cadre des allergies sévères. En effet, ce trouble inflammatoire chronique des voies respiratoires affecte le bien-être des patients à tout âge, et les symptômes sont traités par des traitements palliatifs coûteux. Il n'existe actuellement aucun traitement curatif de cette maladie. Notre projet vise à fournir de nouveaux traitements pour l’asthme sévère, forme la plus grave de l’inflammation allergique pulmonaire, en éliminant spécifiquement les cellules appelées ILC2 (Cellules Lymphoïdes Innées de type 2), acteurs clés de la maladie, et à améliorer le bien-être des patients. Notre projet a aussi un impact économique puisqu’il permettrait de développer un nouveau traitement innovant pour l'asthme sévère. Les innovations potentielles qui pourraient émerger du projet seront protégées par des demandes de brevet avant tout rapport ou publication des résultats scientifiques.

Procédures

• Sur animal vigile : Administration du composé thérapeutique (maximum 3 fois, 15s) ; • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Administration de l’IL33 recombinant avec ou sans Thymic Stromal Lymphopoietin (maximum 4 fois, 30s) ; Administration du composé thérapeutique (maximum 3 fois, 15s) ; Prélèvement de sang (maximum 4 fois, 30s).

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère lors de l’administration du composé. Possibilité d’effets indésirables liés au composé : Perte de poids transitoire, modification temporaire du comportement.

Devenir

Les animaux seront mis à mort soit lors de l’atteinte d’un point limite justifiant l’euthanasie soit en fin de procédure pour collecte et analyse d’organe.

Remplacement

Le projet vise à évaluer l'efficacité de composés à visée thérapeutique chez l’homme. Pour tester cet effet nous devons reproduire la pathologie humaine dans un modèle animal. La souris est de loin le modèle le plus fiable pour étudier les cellules du système immunitaire comme les ILC et les maladies influencées par ces mêmes cellules telles que l’allergie. L’utilisation de souris humanisées reste une des rares méthodes permettant la validation préclinique de médicaments en immunothérapie. Il n’y a donc pas d’alternative actuellement à l’utilisation des souris pour atteindre l’objectif de ce projet, qui est la guérison de l’inflammation pulmonaire avec des outils immunologiques. L’inflammation pulmonaire est une réponse immunitaire intégrant des systèmes de communications cellulaires complexes que l’on ne peut actuellement pas reproduire in silico, in vitro ou ex vivo. Il n’existe pas de méthodes in vitro (cultures cellulaires, organoïdes) pour étudier les maladies influencées par cellules ILC comme l’allergie, car elles ne permettent pas d’étudier une réponse immunitaire globale comme possible sur animal entier. Toutefois, dans le cadre de ce projet des études préliminaires à l’utilisation animale sont réalisées telles que les tests de cytotoxicité et d’affinité in vitro.

Réduction

Le plan de nos expériences sera construit de sorte à limiter le nombre de souris selon la loi des 3R par une approche conditionnelle (lot 1 testé, puis lot 2 testé selon le résultat obtenu sur le lot 1). Afin de réduire au minimum le nombre de souris et d'assurer la robustesse statistique, des groupes de 5 individus seront analysés à 4 conditions et à 2 temps donnés, l'expérience devra aussi être reproduite 2 fois.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux variables de 2 à 5 par cage, en fonction des impératifs liés à l’expérimentation avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, euthanasie de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Le volume et la fréquence des prélèvements de sang suivront strictement les recommandations émises par la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA). En fonction du site de prélèvement, ils seront réalisés sous anesthésie gazeuse associée à un analgésique local. Certaines injections pourront être réalisées sous anesthésie gazeuse et la taille des aiguilles utilisées sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. Des points limites précoces relatifs à l’apparence/comportement de l’animal ainsi qu’à la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de l’étude, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou l’euthanasie de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum 1 fois/semaine. Le composé injecté pourra induire une perte de poids des animaux plusieurs jours post-injection. Dans ce cas, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée ou gélifiée pourra être ajoutée au fond de la cage, afin de faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement) sera suivi lors des mesures de poids (minimum 1 fois/semaine). Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (jusqu’à 2 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.

Choix des espèces

Les expériences doivent être effectuées sur des souris, car elles disposent d’un système immunitaire qui est très similaire à celui de l'homme. La souris est, actuellement, le modèle le plus important et le plus fiable pour étudier les cellules du système immunitaire comme les ILC et les maladies influencées par ces mêmes cellules telles que l’allergie. L’utilisation de souris humanisées reste une des rares méthodes permettant la validation préclinique de composés en immunothérapie. La littérature sur les modèles allergiques se réfère exclusivement aux souris et aux rats. Il est donc nécessaire d'utiliser ce modèle approprié reflétant la pathologie humaine. Nous utiliserons une souris humanisée pour tester l’effet thérapeutique de nos composés à des fins cliniques. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 15 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature.