Souris

Biopsiées de la queue vers six jours de vie pour le génotypage, 1 512 souris génétiquement modifiées subissent ensuite une chirurgie pouvant durer quatre heures sous anesthésie, puis une chirurgie terminale de dix minutes pour le prélèvement des tissus. Le niveau de souffrance déclaré est modéré. L'objet annoncé est de cartographier les connexions d'une structure cérébrale qui contrôle les neurones dopaminergiques, avec des retombées renvoyées aux "futures recherches" sur la maladie de Parkinson, la douleur chronique, la dépression et l'addiction. Ni le titre, "Identification de circuits anatomiques", ni le texte ne nomment cette structure, et l'effectif de 1 512 souris est dit "calculé mathématiquement" sans autre précision.

Objectifs

Les neurones dopaminergiques sont le point de départ du système de récompense du cerveau. Ces neurones ont des rôles multiples, allant de l'évaluation de la valeur gratifiante, aversive et motivationnelle d'un stimulus à la locomotion, et sont donc impliqués dans des pathologies telles que la dépression, la douleur chronique et la maladie de Parkinson. Il y a une quinzaine d'années, on a découvert une structure qui est aujourd'hui considérée comme le principal contrôle inhibiteur des neurones dopaminergiques. Cette structure a été initialement caractérisée chez le rat et, jusqu'à présent, son étude est restée non spécifique et limitée à cette espèce. Cette situation a maintenant changé : un marqueur sélectif de la structure a été identifié, ce qui a permis de localiser la structure chez la souris et de créer une colonie de souris transgéniques pour son étude spécifique. Ce projet vise à identifier spécifiquement les connexions anatomiques de la structure avec les régions cérébrales connues pour être impliquées dans le traitement des informations motrices, douloureuses et gratifiantes / aversives.

Bénéfices attendus

L'objectif principal de cette étude est fondamental. Identifier et mieux comprendre la place de la structure dans les circuits impliqués dans les fonctions pour lesquelles elle semble avoir un rôle majeur, c'est-à-dire dans la motricité, la douleur, la récompense et l'aversion. Ceci nous permettra d'orienter les futures recherches, vers la compréhension du rôle physiologique de la région et par conséquent des pathologies associées à ses fonctions, telles que la maladie de Parkinson, la douleur chronique, la dépression et l'addiction.

Procédures

Les animaux seront soumis à une biopsie de queue (maximum 1mm) sur animal vigile autour de 6 jours post natal pour réaliser leur génotypage. Les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie de maximum 4h et une chirurgie terminale en vue de prélèvements de tissus ou organes (durée 10 min).

Impact sur les animaux

L’identification par tatouage et la biopsie de queue nécessaire aux génotypages des animaux (maximum 1mm, autour de 6 jours post natal) induisent une douleur légère de courte durée. La chirurgie peut entraîner une douleur postopératoire modérée et une inflammation locale transitoire.

Devenir

les animaux seront mis à mort pour prélèvement

Remplacement

Compte tenu du sujet de notre étude, il est impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. Il n'existe actuellement aucun modèle qui reproduise la complexité des réseaux de structures cérébrales. Les études neuroanatomiques nécessitent que l'animal entier soit vivant.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire le nombre d’animaux, mais en obtenant le maximum d’information scientifique. Le nombre d'animaux a été calculé mathématiquement pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.

Raffinement

Les animaux seront suivis afin de déceler tout signe de mal-être. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont utilisées. Après la chirurgie, des grilles d’évaluation seront utilisées pour le suivi des animaux. Des soins, une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire et/ou une séparation des animaux seront réalisés si besoin après concertation avec le vétérinaire ou la cellule chargée du bien-être animal. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures pour limiter ou soustraire l’animal à la souffrance. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans des cages enrichies favorisant leur comportement naturel.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement pour cibler spécifiquement les neurones de la structure cérébrale étudiée. Ceci implique l'utilisation de souris spécifiques et ne permet pas l'utilisation d'autres espèces. Étant donné que les études anatomiques nécessitent des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés. Génotypage entre 6 et 8 jours (12 jours maximum), chirurgie à partir de 8 semaines.

Tués parce que le retrait de la canule implantée dans leur crâne provoquerait des lésions incompatibles avec une vie dans de bonnes conditions, 1 000 rats et 500 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie cérébrale de une heure à une heure trente pour l'implantation de canules en profondeur, puis six à sept heures relié par des câbles à une seringue et à un collecteur, dans un espace restreint, séance qui peut être répétée une seconde fois à deux ou trois jours d'intervalle. Des candidats médicaments leur sont administrés en bolus, en une fois ou chaque jour pendant une semaine, pour mesurer leur effet sur des neurotransmetteurs. Le porteur indique que les modèles alternatifs développés au laboratoire ne mesurent que certaines molécules sécrétées par des cultures de neurones, et que le choix entre rat et souris dépend aussi de la quantité de molécule disponible.

Objectifs

La concentration de molécules (e.g. neurotransmetteurs) spécifiques dans des régions cérébrales précises est modifiée dans certaines maladies psychiatriques ou neurologiques ; étudier ces facteurs peut informer sur l'efficacité de candidats traitements dans le traitement de ces pathologies, ou sur leur mécanisme d'action. Le projet consiste à évaluer l'effet de nouveaux candidats médicaments sur l'activité métabolique cérébrale chez le rongeur. La méthode de microdialyse cérébrale peut être réalisée sur animal anesthésié ou vigile. Cette méthode consiste à recueillir et à analyser des substances chimiques présentes dans le milieu extra cellulaire interstitiel du parenchyme cérébral. Outre l'évaluation de l'efficacité de nouvelles thérapies, la microdialyse cérébrale peut aider à la compréhension d’événements neurologiques.

Bénéfices attendus

La recherche de nouvelles thérapies est indispensable pour améliorer les conditions ou l’espérance de vie des patients atteints de maladies psychiatriques ou neurologiques. La technique de microdialyse est une méthode translationnelle qui permet d'évaluer l'effet de nouvelles substances pharmacologiques sur les concentrations de substrats cérébraux telles que des neurotransmetteurs ou des acides aminés sans avoir recours à une extraction tissulaire. Cette méthode permet de mieux comprendre les relations entre neurotransmission et modifications comportementales chez le rongeur.

Procédures

La collecte de dialysats cérébraux nécessite une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (entre 1h et 1h30) afin de placer la ou les canules dans des régions cérébrales situées en profondeur. La phase de collecte des échantillons est en général de l'ordre de 6 à 7 h (animal connecté en permanence pour la collecte de dialysat) et peut être répétée maximum 2 fois à intervalles de 2 à 3 jours. Les animaux recevront des administrations de candidats traitements en général par bolus (durée de l'ordre de la seconde), de manière aigue ou chronique (une administration par jour sur une durée de 7 jours maximum).

Impact sur les animaux

La phase d'anesthésie peut induire un léger stress. Des douleurs peuvent être liées à l'implantation du ou des guides canules au niveau cérébral (ces animaux seront placés sous traitement analgésique qui sera adapté sous contrôle vétérinaire). Des problèmes de cicatrisation peuvent également être observés, notamment si l'animal se gratte. Les phases d'administration et de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, notamment du fait de la contention de ce dernier. Il n'est pas attendu d'effets néfastes suite à l'administration d'un candidat médicament. Pendant le test, les animaux sont reliés à une seringue et un collecteur de fraction par l'intermédiaire de câbles/cathéters en polyéthylène, sur plusieurs heures dans un espace restreint. Les cables sont légers mais limitent le déplacement de l'animal pendant toute la durée du test ce qui peut générer un stress chez l'animal.

Devenir

Les rongeurs seront mis à mort à la fin des expériences car des prélèvements de tissu (cerveau) seront réalisés, pour dosage de biomarqueurs ou pour vérifier le placement de la sonde. De même, le retrait du guide canule implanté pourrait entraîner des lésions non compatibles avec une vie dans de bonnes conditions.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, des modèles alternatifs ont été développés au laboratoire mais ne permettent de mesurer que la présence de certaines molécules secrétées par des cultures primaires de neurones. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi d'évaluer l'effet de substances pharmacologiques sur l'activité métabolique cérébrale.

Réduction

Les analyses statistiques seront affinées pour utiliser le nombre minimum d'animaux. Les tests qui seront appliqués ne sont pas encore complétement définis car la technique d'analyse des dialysats est toujours en cours de développement (bien que la partie in vivo chez le rongeur soit mise en place). Des études de variabilité et d'homogénéité seront réalisées pour déterminer les analyses les plus pertinentes (paramétriques ou non paramétriques). Des essais ont été réalisés pour tester le même animal à deux reprises et limiter le nombre d'animaux utilisés. Cependant, les animaux ne pourront pas être utilisés plus de deux fois pour garantir une diffusion homogène des molécules entre deux tests. Des prélèvements de sang ou d'organes peuvent être également ajoutés à la fin des expériences pour compléter les analyses et éviter l'utilisation d'autres animaux.

Raffinement

Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Pour la phase chirugicale, une anesthésie sera associée à un protocole d'analgésie. Un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement oculaire. Une solution analgésique est également injectée au niveau de la zone à inciser au niveau du crâne. L’animal sera placé sur une couverture chauffante au début de l’anesthésie jusqu'à reprise de la marche pour maintenir sa température corporelle. Les animaux sont maintenus en 2 par 2 pendant toute la durée de l'étude (excepté la phase de test), avec un environnement enrichi dans les cages d'hébergement. Des points limites stricts ont été définis pour chaque procédure.. Dans certains modèles, l'activité métabolique permet de compléter l'analyse comportementale et raffiner le modèle.

Choix des espèces

Les études de mesure de l'activité métabolique cérébrale sont effectuées chez le rongeur (souris ou rat) car ces modèles sont translationnels. Le choix de l’espèce (souris ou rat) est souvent lié aux études préalables réalisées (études de pharmacocinétique par exemple) et aussi en fonction de la disponibilité de la molécule. On utilisera de préférence la souris lorsque la molécule est en quantité limitée. Les voies métaboliques peuvent également être différentes entre les espèces, les spécificités de chaque candidat médicament peuvent amener à choisir une espèce plutôt que l'autre. Les rongeurs (rats, souris) sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique.

Injectées de cellules cancéreuses sous la peau puis laissées sans aucun traitement antalgique, 520 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent en plus une injection intraveineuse de lymphocytes et sept injections dans l'abdomen sur trois semaines, sur animal vigile, et sont tuées quand la tumeur atteint le volume limite fixé. L'objet est de savoir si le métabolisme des lipides modifie les propriétés antitumorales de certains lymphocytes. Le porteur détaille par ailleurs le transfert des souris par tunnel plutôt que par la queue et l'enrichissement des cages, tout en écrivant que l'analgésie est écartée pour ne pas interférer avec la réponse inflammatoire.

Objectifs

Le projet vise à déterminer l’importance des lipides dans la régulation de la réponse immunitaire anti-cancéreuse conduite par les lymphocytes CD4+. Ces cellules immunitaires ont des singularités permettant de les classer en différents sous-types de lymphocytes CD4+ avec des fonctions favorisant ou prévenant la progression tumorale. Les signaux environnementaux comme la disponibilité de nutriments conditionnent la présence d’un sous-type de lymphocytes plutôt qu’un autre modulant le devenir de la tumeur. Dans ce projet, nous souhaitons caractériser le rôle des lipides dans l’engagement des lymphocytes CD4+ vers un sous-type particulier et dans l’amélioration de ses propriétés anti-tumorales.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait de comprendre le rôle des lipides dans l’induction d’un sous-type de lymphocytes CD4+ particulier et dans la régulation de la croissance tumorale. La thérapie cellulaire par transfert adoptif de lymphocytes T est une approche prometteuse dans la lutte contre le cancer et manipuler le métabolisme des lipides pourrait améliorer les performances anti-tumorales de ces cellules. Par ailleurs, le développement d’agents anti-cancéreux modulant l’action de ces lipides pourrait être également bénéfique aux patients atteints de cancer.

Procédures

Les souris seront soumises à une unique injection rapide (moins de 20 secondes) en sous-cutanée de cellules cancéreuses sous anesthésie et une unique injection intraveineuse sur souris vigiles d’une durée inférieure à 20 secondes. Les injections intrapéritonéales sur souris vigiles seront réalisées tous les 3 jours pendant 3 semaines (7 injections par souris).

Impact sur les animaux

La transplantation en sous-cutanée des cellules cancéreuses se fera sur souris anesthésiée pour prévenir toute douleur. Pour éviter une accumulation d’anesthésie, les injections IP répétées (avec au maximum 7 injections sur 20 jours) et intraveineuse des lymphocytes sont réalisées sur souris vigiles entrainant une douleur modérée de courte durée ; un stress léger chez les souris vigiles peut également apparaître au moment de la contention. Tout autre effet indésirable conduira également à la mise à mort de la souris (nécrose tumorale, changement de comportement ou d’apparence). Les animaux seront suivis quotidiennement et une prise de poids hebdomadaire sera effectuée sans incidence douloureuse.

Devenir

Après transfert des cellules cancéreuses par transplantation sous-cutanée, les souris seront et traitées pendant deux semaines. Elles seront suivies quotidiennement et maintenues en cage à l’animalerie. Elles seront ensuite mises à mort car le volume tumoral aura atteint le point limite.

Remplacement

L’objectif de l’étude est d’évaluer l’effet du métabolisme des acides gras sur les propriétés anti-tumorales de lymphocytes. Les données in vitro suggèrent des modifications phénotypiques partielles et incertaines sur une action anti-tumorale amplifiée. Ces lymphocytes ont la capacité d’interagir avec différents acteurs cellulaires intra-tumoraux et d’autres tissus pouvant moduler la croissance tumorale. Les modèles actuels d’organoïdes ne miment que partiellement l’ensemble de ces interactions cellulaires et les caractéristiques physico-chimiques du microenvironnement tumoral. L'utilisation de modèles murins de cancer est donc nécessaire car l’effet du système immunitaire sur la tumeur ne peut être modélisé in vitro et ne peut donc être évalué que chez l’animal vivant pour suivre la progression tumorale. De plus, les similarités physiologiques et métaboliques entre la souris et l'Homme permettront de transposer les résultats obtenus à la situation des patients atteints de cancer. Enfin, le modèle animal d’invalidation du gène d’intérêt n’est disponible que chez la souris.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux utilisés, nous avons déterminé l'effectif nécessaire par groupe en s'appuyant sur notre expérience antérieure en prenant en compte la variabilité interindividuelle et à l'aide d'un outil statistique prédictif permettant d’obtenir un résultat fiable et analysable.

Raffinement

Plusieurs mesures sont prises pour réduire au minimum l’inconfort et le stress des animaux utilisés dans ce projet. D’abord, tous les animaux sont hébergés en groupe (5 individus par cage) afin de permettre l’expression des comportements sociaux. Toutes les cages contiennent un enrichissement structural du milieu permettant la construction de nids. Toutes les manipulations sont effectuées par du personnel expérimenté, dans un environnement calme qui minimise le stress des animaux. Les souris seront soumises à une habituation à la contention pour minimiser le stress lors de l’injection intraveineuse. Dans la mesure du possible, les animaux sont transférés d’une cage à l’autre grâce à la technique du tunnel (au lieu de la préhension par la queue) ce qui réduit le stress des animaux. Les souris seront maintenues sans traitement antalgique pour ne pas interférer avec la réponse inflammatoire et éviter des modifications de croissance tumorale. Elles seront néanmoins anesthésiées pour la transplantation sous-cutanée des cellules cancéreuses pour éviter toute douleur. Les souris seront surveillées quotidiennement et tout signe de douleur ou souffrance conduira à leur mise à mort. Au total, 520 souris femelles seront utilisées.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de la carcinogenèse par sa proximité avec la physiopathologie chez l’Homme. En outre, les souches consanguines de souris, telle que la souche C57Bl6 a un phénotype homogène, ce qui permet d’identifier plus facilement les effets induits par les manipulations expérimentales. D’un point de vue technique, le taux de reproduction élevé de la souris permettra la création des groupes d’animaux requis sur une période de courte durée. Des souris âgées d’au moins 8 semaines seront utilisées pour une prise tumorale homogène et faciliter l’injection des cellules cancéreuses.

2 304 souris vont être utilisées, chacune recevant une injection de cellules tumorales dans le crâne, puis deux injections par jour pendant trois jours, une irradiation de la tête de cinq minutes, deux injections par jour pendant cinq jours encore, une résection de tumeur de vingt minutes et un gavage cinq fois par semaine pendant trois semaines. Le niveau de souffrance déclaré est modéré. Le porteur indique que la croissance de la tumeur cérébrale finit par provoquer une perte de poids et une dégradation de l'état général, et que les gestes sur animal vigile causent du stress. Toutes sont tuées pour le prélèvement du cerveau, le bénéfice annoncé se limitant à "mieux comprendre" comment les cellules tumorales utilisent l'énergie environnante.

Objectifs

Chez l’Homme, le glioblastome est un cancer décelé tardivement et de ce fait nécessite une résection du centre de la tumeur solide, suivie d'une chimiothérapie couplée à de la radiothérapie. Cependant ces traitements induisent une résistance des cellules tumorales restantes, entrainant dans 90 pour cent des cas une récidive du cancer et la mort du patient. Nous cherchons à savoir quels sont les facteurs impliqués dans l’évolution de cette pathologie afin de développer de nouvelles thérapies qui vont prolonger la vie des patients. Pour celà, nous allons mettre en place une procédure expérimentale à partir des premières cibles identifiées dans nos précédentes études sur modèles cellulaires.

Bénéfices attendus

Ces études vont permettre de mieux comprendre les processus par lesquels les cellules tumorales utilisent l’énergie environnante pour proliférer et ainsi pouvoir agir sur ce levier afin d’inhiber la croissance de la tumeur.

Procédures

- Injection intra-craniale de cellules tumorales : 1 fois, environ 10 minutes. - Traitements par chimio- et radiothérapie : 2 injections par jour pendant 3 jours puis une irradiation de la tête (5 minutes) puis 2 injections par jour pendant 5 jours. - Résection de la tumeur : 1 fois, environ 20 minutes. - Prélèvements sanguins (2 à 3 fois au total) : 10 secondes sur animal endormi. - Gavage : 10 secondes, 5 fois par semaine pendant 3 semaines, -injection du substrat pour imagerie : 1 injection intra-péritonéale sur animal vigile, chaque semaine, 5 secondes.

Impact sur les animaux

Les actes de chirurgie et les prélèvements induisent du stress et de la douleur pour l’animal. La croissance de la tumeur induit à terme une perte de poids et une dégradation de l’état général de l’animal. Les traitements par gavage ou injection sur souris vigiles induisent du stress.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à l'issue de l'expérience, les cerveaux seront prélevés afin d’étudier les effets des traitements. L’analyse des tissus cérébraux est nécessaire pour étudier l’implication des potentielles cibles thérapeutiques identifiées pendant nos études.

Remplacement

Nos recherches sont basées sur des résultats validés sur modèles cellulaires mais les hypothèses doivent être vérifiées sur l’animal car le cerveau est un organe très complexe et aucun modèle non-animal n’est suffisamment représentatif pour être complet.

Réduction

Des analyses multiples sur les mêmes échantillons seront effectuées afin de réduire le nombre d'animaux. Plusieurs paramètres seront analysés sur le même animal. Le suivi longitudinal de la croissance tumorale sur l’ensemble des animaux permet également de réduire le nombre total utilisé. Le nombre d’animaux par groupe expérimental est calculé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nous utilisons un modèle de souris où les tumeurs se développent de manière très reproductible, gage d’utilisation de moins d’animaux pour nos expériences.

Raffinement

Les animaux seront logés dans des cages collectives avec enrichissement pour améliorer leur bien-être. Une anesthésie et des analgésiques adaptés seront utilisés pour minimiser la douleur (avant, pendant et après des procédures invasives). Les conditions d'hébergement seront vérifiées quotidiennement ; une grille de score et des points limites adaptés sont mis en place pour évaluer la douleur des animaux et les réponses à y apporter.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris de 7 à 9 semaines (jeunes adultes) pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs mois, donc l’implantation dans de jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés.

Une souris qui perd 15 % de son poids ou présente des difficultés respiratoires après l'infection par le SARS-CoV-2 est mise à mort sans délai. 96 souris vont être utilisées, toutes tuées à la fin du protocole pour prélever poumons, cerveau et sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous la peau du dos, huit prises de sang hebdomadaires, de deux à dix doses de vaccin par le nez sans anesthésie et une inoculation du virus par voie nasale sous anesthésie générale. Le porteur indique qu'après l'infection, les souris perdent en moyenne 15 % de leur poids entre trois et cinq jours, puis montrent une léthargie et des difficultés respiratoires pouvant entraîner la mort au huitième jour. Il annonce étudier les symptômes du covid long, "y compris les atteintes cérébrales", et ne décrit aucun test neurologique ou comportemental pour les mesurer.

Objectifs

Le COVID-19, causé par le virus SARS-CoV-2, a affecté des millions de personnes dans le monde, entraînant non seulement des problèmes respiratoires mais aussi des symptômes neurologiques graves, y compris des atteintes cérébrales. Des recherches récentes ont montré que ces complications persistent chez certains patients, formant ce qu'on appelle le 'covid-long'. La vaccination a démontré son efficacité à la fois dans la prévention et le traitement du covid-long. Nous proposons d'évaluer le potentiel thérapeutique de notre vaccin dans un modèle murin, qui reproduisent les symptômes du covid-long, y compris les atteintes cérébrales. Ce modèle animal nous permettra d'étudier comment notre vaccin peut moduler les symptômes persistants du COVID-19, en particulier ceux affectant le système nerveux central. Ce vaccin, conçu pour cibler plusieurs variants du virus, pourrait offrir des perspectives prometteuses pour le traitement de ces formes graves de la maladie.

Bénéfices attendus

Les resultats de ce projet feraient l’objet d’une publication scientifique mais pourraient également servir de données preclinique à une demande d’essais clinique thérapeutique chez l’homme pour le traitement des symptomes liés au covid-long avec le candidat vaccin LVT-001 qui sera déjà évalué en clinque fin 2024 en prophylactique.

Procédures

Tous les animaux, soit 96 souris. Des puces d’identification dorsales en voie sous-cutanée (12 minutes par animal, 1 fois). Des prises de sang à la veine submandibulaire (5 minutes par animal, 8 fois soit une fois par semaine). Inoculation du vaccin par voie nasale sans anesthésie générale. (10 minutes par animal, entre 2 à 10 fois selon les lots). Challenge infectieux par voie nasale sous anesthésie générale (10 min par animal, 1 fois). Prélèvement d'urine (20 seconde maximum par animal, 1 fois).

Impact sur les animaux

Pour le challenge viral par voie nasale, une perte de poids moyen de 15% est observée en premier lieu entre 3 et 5 jours post infection et suivie très rapidement par une léthargie, des difficultés respiratoires pouvant entrainer la mort 8 jours post infection. Pour éviter toute souffrance aux animaux, une perte de poids moyen de 15% et/ou l’apparition de difficultés respiratoires entrainera la mise à mort sans délai. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon nos observations bi/quotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. Les administrations en voie intra-péritonéale pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantations de la puce télémétrique. Les prises de sang peuvent également entrainer une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (poumons, cerveau, tête, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pur le recrutement cellulaire et sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution qui pourrait restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique, déjà éprouvé notamment pour l’étude de la réponse immunitaire humorale et cellulaire. Ce nombre d’animaux repose également sur notre experience precedente d’utilisation du même modèle animal dans le cadre d’essais de protection prophylactique avec le même candidat vaccin.

Raffinement

Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes et bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger) dans la zone d'hébergement défini par la structure chargée du bien-être animal de l’établissement. Les souris sont hébergées, avant infection, en animalerie sur des portoirs ventilés puis en isolateur après infection expérimentale (environnement confiné). Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Tout type de médication pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Des critères d’arrêt sont prévus dans le projet afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire. Après chaque prise de sang et chaque instillation nasale sur animaux vigiles, une récompense positive alimentaire de type bouchée fruitée ou rondelle de banane séchée ou popcorn ou graines de tournesol sera réalisée.

Choix des espèces

Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par la vaccination post-infection dans l’étude du covid long. Le modèle murin est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux Covid. Il a été récemment étendu à l’étude des symptômes et pathologies liées au Covid long avec notamment sa propension à reproduire l’infection du SNC par le virus. Ainsi ce modèle est le plus relevant pour l’étude de thérapie contre le covid long. Adulte et immunocompétent : afin d’être représentatif en préclinique de la cible clinique du protocole, le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents.

4 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des traitements plusieurs fois par semaine pendant une à douze semaines selon les groupes, avec des prélèvements de sang répétés, dans des modèles d'hépatite auto-immune. Les effets décrits incluent une perte de poids, un pelage très sale, une peau froide au toucher, des muqueuses pâles, des plaies suintantes, des lésions d'automutilation et des masses ulcérées, description qui s'accorde mal avec la souffrance seulement modérée déclarée. Le porteur ajoute que ce passage par la souris sert à réduire le nombre de formats d'anticorps, de doses et de voies d'injection qui seront ensuite testés sur des primates.

Objectifs

Les maladies auto-immunes dont les maladies inflammatoires n’ayant pas de traitements satisfaisants aujourd’hui, la recherche de nouvelles thérapies est nécessaire. Ce projet s’inscrit dans ce but afin de tester des nouvelles cibles thérapeutiques et d’en comprendre les mécanismes. La plupart des maladies auto-immunes sont caractérisées par une activation exacerbée des cellules T, des cellules B et des myeloïdes ainsi que la production d’anticorps auto-réactifs, donc d’anticorps dirigés contre le soi. Les traitements actuellement utilisés tels que les anti-inflammatoires stéroïdien ou non stéroïdien, ainsi que les anti-TNF induisent des effets secondaires. L’utilisation par exemple du rituximab qui est un anticorps anti-CD20 induit une élimination des cellules B de façon transitoire. Ce traitement ne cible pas les cellules plasmatiques sécréteurs d’auto-anticorps à l’origine en partie des maladies auto-immunes. L’objectif étant de développer une nouvelle thérapie qui ciblerait les cellules T/B et les myeloides impliquées la chronicité de l’inflammation. Le traitement habituel de l'hépatite auto-immune consiste à administrer des corticoïdes et des immunosuppresseurs. Mais cela entraine de nombreux effets secondaires d'ou la nécessité de trouver des alternatives.

Bénéfices attendus

Actuellement les traitements pour les patients atteints de maladies inflammatoires sont des corticoïdes, des immunosuppresseurs ou, depuis quelques années, de l’immunothérapie utilisant principalement les anti-TNFa. Les corticoïdes induisent néanmoins de nombreux effets secondaires surtout sur le long terme tels qu’une prise de poids, de l’hypertension, une intolérance aux sucres, des troubles endocrinien entre autres. Les immunosuppresseurs, eux, inhibent totalement le système immunitaire et rendent sensibles les patients à de nombreuses maladies virales ou autres. Pour finir, les immunothérapies sont utilisées lorsque les patients ne répondent pas/plus aux immunosuppresseurs ou corticoïdes. Elles utilisent principalement des anti-TNFa mais aussi des anti-intégrines et permettent de ralentir l’évolution de la pathologie. Néanmoins, environ 60% des patients échappent de façon primaire ou secondaire à ces traitements. Cela a aussi été observé chez l’animal avec environ 50% d’échappement primaire ou secondaire chez la souris. De plus, ils induisent eux aussi quelques effets secondaires puisqu’ils inhibent une partie du système immunitaire, rendant le sujet fragile aux maladies du quotidien. L’utilisation par exemple du rituximab qui est un anticorps anti-CD20 induit une élimination des cellules B de façon transitoire. Ce traitement ne cible pas les cellules plasmatiques sécréteurs d’auto-anticorps à l’origine en partie des maladies auto-immunes. L’objectif étant de développer une nouvelle thérapie qui ciblerait les B et/ou les cellules T pathogéniques. Chez l’animal nous espérons pouvoir observer un blocage, une élimination ou réduction des cellules pathogéniques. Si ces études in vivo sont bénéfiques pour l’animal nous envisageons de pouvoir débuter un essai clinique chez l’Homme afin de traiter les patients ayant des maladies auto-immunes ou inflammatoires et de leur proposer une nouvelle stratégie thérapeutique. Les nouvelles thérapies passent par le modèle animal avant d’envisager de tester la molécule dans un essai clinique.

Procédures

Les traitements administrés aux animaux durent quelques secondes et seront réalisés plusieurs fois par semaine durant plusieurs semaines. Des prélèvements sanguins seront réalisés durant plusieurs semaines et durent quelques secondes. Les traitements administrés aux animaux (X semaine) ainsi que les prélèvements sanguins (X semaine) seront variables en nombre de semaines (Procédure 1 : 3 semaines, Procédure 2: 5 semaines ; Procédure 3 ; 1 à 12 semaines) mais pas en durée (toujours quelques secondes) et dépendra de chaque groupe de souris et du succès du traitement.

Impact sur les animaux

Il va s’en suivre une perte de poids associée à un score clinique important c'est à dire une modification du comportement et de l'apparence physique. Lorsque le score clinique est elevée, il y a une apparence physique altérée (poils très sales, coloration anormale de la peau, froid au toucher, pâleur des muqueuses, plaie de l’œil, lésion sévère (automutilation, plaie suintante, masse ulcérée…) et un comportement modifié (agitation/torpeur, impossibilité de mouvement, dos cambré/voussure du dos).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés une fois l'expérience terminée ou les points limites atteints. L'injection peut entrainer une perte de poids, un changement dans le comportement chez la souris. Cela va se produire dans les groupes contrôles et dans les groupes dont les molécules n'ont pas d'effets bénéfiques. Dans les groupes ou un effet bénéfique pourrait être observé, les souris seront quand même euthanasiées car cela n'est pas possible d'utiliser les mêmes souris pour un second protocole car l'âge de la souris ne sera plus adéquat.

Remplacement

Les nouvelles thérapies passent par le modèle animal avant d’envisager de tester la molécule dans un essai clinique. Vu la complexité du système immunitaire et des différences entre espèces, il est nécessaire d’étudier l’impact d’une molécule ainsi que ses effets thérapeutiques sur un modèle proche de l’Homme. Pour cette première nécessité le primate est souvent utilisé, ici, nous avons la possibilité d’éviter l’utilisation de primate, donc nous étudierons ces paramètres chez la souris. Avant l’utilisation chez l’animal, nous sélectionnerons préalablement nos molécules par différents tests in vitro notamment d’affinité et d’avidité pour les récepteurs mais aussi d’efficacité sur des cellules humaines. En effet, les molécules sont testées in vitro afin de déterminer si elles ont la capacité d'induire l'effet attendue c'est à dire, la sécrétion de cytokines anti-inflammatoires, le blocage de molécules activatrices sur différents types cellulaires, ou l'activation de molécules inhibitrices afin de réguler l'inhibition des cellules cibles. Les modèles d'hépatites qui reproduisent au mieux ce qui se produit chez l'homme ont été décrit chez la souris.

Réduction

Les tests statistiques qui seront réalisés seront des tests non paramétriques pour comparer chaque groupe en fonction du groupe contrôle. Il pourra également être réalisé des tests pour comparer tous les groupes les uns avec les autres ou tous les groupes en fonction du groupe contrôle. Nous avons réduit chaque groupe au minimum de 5 souris nécessaire à l’obtention d’une différence statistique. Le nombre d’animaux sera réduit autant que possible.

Raffinement

Si un animal se retrouve dominant et attaque ses congénères, il sera isolé dans une cage individuelle avec un dôme. Les animaux seront manipulés pour s’habituer aux expérimentateurs mais le protocole ne commencera qu’une semaine après l’arrivée. En amont de l’expérience le protocole sera entièrement planifié afin d’éviter du stress à l’animal et les points limites seront définis afin d’anticiper toute souffrance. Les animaux montrant des signes de douleurs lors de l’expérience recevront des molécules leur permettant d’atténuer la douleur et elles seront mélangés dans l’eau de biberon pour la nuit. Lorsque les points limites seront atteints, les animaux seront mis à mort par dislocation des cervicales après anesthésie. Les animaux ne seront pas maintenus au-delà des délais décrits pour chaque modèle, limitant leur utilisation si cela n’est pas nécessaire.

Choix des espèces

Des formats d’anticorps ont été validés in vitro. Les animaux sont indispensables car ils permettent de tester in vivo l’efficacité ou la non-efficacité de (des) format(s), ainsi que les effets secondaires possiblement liés avant de le tester en clinique chez l’Homme si celui (ceux)-ci est (sont) efficace (s). En outre, avant de passer aux travaux généralement réalisés chez le primate, il est impératif de valider au préalable l’efficacité de cette thérapie chez la souris afin de réduire au maximum le nombre de format d’anticorps, la dose ainsi que la voie d’injection qui pourrait être testés chez le primate. Les souris seront utilisées autour de 8 semaines.

Sept jours d'antibiotiques dans l'eau de boisson, une injection intraveineuse de cellules tumorales pulmonaires, cinq gavages de microbiote fécal ou cinq administrations intranasales sous anesthésie, puis jusqu'à vingt séances d'imagerie chacune précédée d'une injection dans l'abdomen : 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur mentionne des diarrhées, une déshydratation, des microlésions du tube digestif, de rares fausses routes lors des gavages et une gêne respiratoire transitoire. L'objectif est de voir si un transfert de microbiote fait apparaître des amas de lymphocytes dans la tumeur et améliore la réponse à une immunothérapie à laquelle 60 % des patients ne répondent pas. Toutes sont tuées pour que les tumeurs soient récupérées et l'organisation du système immunitaire autour des cellules tumorales examinée.

Objectifs

Les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (ICI) ont révolutionné le traitement de nombreux cancers. Cependant, environ 60 pourcents des patients ne répondent pas aux ICI nécessitant de trouver d’autres thérapies pour soigner cette majorité de patients non répondeurs aux ICI. La présence de cellules immunitaires dans la tumeur est primordiale pour répondre aux ICI. En particulier, les lymphocytes organisés en agrégats (communément appelés structures lymphoïdes tertiaires, TLS) sont associés à une meilleure survie des patients et une meilleure réponse aux ICI. Très récemment, il a été montré que des bactéries peuvent stimuler l’activité des TLS. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer la capacité des bactéries d’un microbiote intestinal à induire la formation de TLS pour améliorer l’efficacité des ICI dans un modèle pré-clinique.

Bénéfices attendus

Le cancer du poumon est le 3ème cancer le plus fréquent et la 1ère cause de décès par cancer en France (source : site de l’INCa). Seulement 40 pourcents des patients répondent aux immunothérapies. Le présent projet portera sur un modèle murin de cancer du poumon. L’étude du transfert du microbiote fécal chez la souris déterminera : 1) si ce traitement induit la formation des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) et 2) si la réponse à l'inhibiteur de point de contrôle et la survie des animaux sont améliorées. Les résultats de ce projet pourraient permettre d'améliorer les traitements en médecine humaine pour le cancer du poumon.

Procédures

Les animaux seront soumis à : un traitement antibiotiques dans l'eau de boisson (animal vigil, traitement en continu pendant 7 jours); des injections intraveineuses pour inoculation de tumeurs (animal vigil, 1 fois, 1 minute); des gavage pour implanter le microbiote sur certains groupes (animal vigil, 5 fois, 1 minute); des administrations intranasales sur d'autres groupes (animal anesthésié, 5 fois, 5 minutes); puis un suivi par imagerie (animal anesthésié, 20 fois maximum, 15 minutes) avec injection intrapéritonéale au préalable (animal vigil, 20 fois maximum, 1 minute) pour les animaux avec tumeurs ainsi qu'un suivi du microbiote intestinal (animal vigil, 3 fois, 2 minutes).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables possibles sont : L’antiobiothérapie via l'eau de boisson pourra engendrer des diarrhées et une déshydratation. Les injections pourront induire une douleur de courte durée aux animaux. Les gavages peuvent induire des microlésions ou des irritations et dans de rares cas une fausse route. Les administrations intranasales et l'imagerie seront effectuées sous anesthésie qui pourra engendrer une baisse de la thermorégulation. Ces administrations pourront également engendrer une gêne respiratoire transitoire. L'induction de tumeur pourra induire une douleur modérée ainsi qu'une réduction de la mobilité. Le recueil des fèces se fera par contention manuelle douce qui pourra toutefois engendrer un léger stress.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées pour qu'on puisse récupérer les tumeurs et étudier la façon dont le système immunitaire s'organise autour des cellules tumorales.

Remplacement

Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des organisations en 3 dimensions de cellules immunitaires se développant à proximité des vaisseaux sanguins. L’étude des TLS ne peut se faire à ce jour que chez l’animal. Ainsi, les modèles souris sont considérées comme un modèle nécessaire et indispensable pour étudier la fonction des TLS dans le développement d’une réponse immunitaire contre la tumorale.

Réduction

300 animaux seront utilisés pour ce projet. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. En effet, les groupes sont constitués de 5 ou 10 animaux, groupes établis grâce à un calcul de puissance mathématique et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques pour permettre une interprétation fiable des résultats. L'utilisation de l'imagerie dans ce projet, permet un suivi longitudinal (plusieurs mesures sur le même animal) et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des portoirs ventilés (5 animaux maximum par cage) et ne seront expérimentés qu'après une semaine minimum de stabulation. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (isolement limité à la fin d’une seule expérience) en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique (ou biberon d’eau lors de l’antibiothérapie) et un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière Kraft, carré de coton, bâtonnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Les conditions de températures et d'hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Dans la réalisation de ce projet, l'ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie). Tout sera mis en oeuvre pour limiter au maximum les nuisances. Les animaux sont manipulés par du personnel formé et compétent dans des pièces dédiées à chaque type d'intervention. Pour les injections, les volumes injectés seront réduits au minimum. L'évolution tumorale sera suivie et mesurée. Quand l'acte technique le nécessite, les animaux seront sous anesthésie. Les animaux seront vérifiés quotidiennement. Ils seront également pesés deux fois par semaine et leur état de santé sera reporté sur une grille de suivi individuel. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de la procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie).

Choix des espèces

En accord avec la littérature scientifique sur le microbiote, les structures lymphoïdes tertiaires et les réponses anti-tumorales et la disponibilité de l'ensemble des réactifs nécessaires à la procédure, ce projet sera entièrement réalisé chez la souris. De plus, différents protocoles développés chez la souris sont décrits de façon détaillée dans la littérature. Ils sont donc applicables sans avoir besoin d’utiliser des animaux supplémentaires pour réaliser la mise au point des protocoles expérimentaux. Le projet utilisera des souris non génétiquement modifiées car particulièrement adaptées à l'étude des réponses anti-tumorales. Les animaux seront reçus à l'âge de 11 semaines puis mis en acclimatation pendant une semaine minimum avant de débuter l'expérimentation. Cet âge a été choisi car à ce stade de développement, les souris sont sevrées, ont atteint une taille adulte et disposent d'un système immunitaire mature. Les expériences dureront de 13 jours à 2 mois maximum.