Souris
Effets neuromodulateurs d’une stimulation électrique transpinale non-invasive à courant continu sur la Sclérose Latérale Amyotrophique. Etude sur la souris SOD1(G93A).
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumises à six heures de chirurgie et d'enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie profonde, une partie des 820 souris utilisées est tuée sans reprise de conscience, 340 d'entre elles relevant de procédures sans réveil et 480 d'un niveau de souffrance modéré. D'autres reçoivent une injection de virus dans un muscle ou une stimulation électrique de la moelle épinière de quinze minutes. Toutes portent une mutation reproduisant la sclérose latérale amyotrophique et sont tuées entre 45 et 55 jours pour que la moelle épinière soit prélevée, le porteur précisant aussi que la mise à mort évite de "laisser les symptômes moteurs se développer". La stimulation transpinale est présentée comme une méthode "non-invasive et non douloureuse" pour de futurs patients, alors que l'évaluer suppose ici d'ouvrir et de tuer des souris.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), appelée aussi Maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative touchant spécifiquement des cellules de la moelle épinière, appelées motoneurones, qui commandent les muscles. La maladie se déclare à l’âge adulte, elle provoque la paralysie du patient et son issue est fatale. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. La stimulation électrique transpinale à courant continu (tsDCS) est une méthode non-invasive et non-pharmacologique, qui agit sur les cellules de la moelle épinière, et dont les effets bénéfiques ont déjà été montrés en réhabilitation motrice, dans le traitement du syndrome de la jambe sans repos, et dans le traitement de la douleur. Le présent projet a pour objectif d'étudier si la tsDCS peut aussi avoir une éffet bénéfique dans le traitement de la SLA. Cette étude sera réalisée dans un modèle murin de la SLA. Comme cette étude implique non seulement les cellules qui commandent les muscles mais aussi les cellules environnantes qui jouent un rôle important dans l'évolution de la maladie (autres neurones et cellules gliales dans la moelle épinière, cellules musculaires), il est nécessaire d'effectuer l'étude sur des animaux afin de préserver les relations anatomiques et fonctionnelles entre ces différents types de cellules. Il n'y a pas, pour ce projet, d'alternative à l'utilisation d'animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de démontrer si la tsDCS a un effet bénéfique ou non sur les cellules de la moelle épinière qui commandent les muscles (motoneurones) à un stade précoce de la SLA. Dans le cas où l'évolution de la maladie serait ralentie dans les motoneurones par la tsDCS, nous pourrions proposer cette méthode non-invasive et non douloureuse comme moyen thérapeutique utile dans la prise en charge des patients SLA.
Procédures
Stimulation électrique transpinale à courant continu (tsDCS) sous analgésie et anesthésie profondes: cette intervention dure 15 minutes et ne sera réalisée qu'une seule fois par animal. Chirurgie et enregistrements électrophysiologiques sous analgésie et anesthésie profondes: cette intervention dure au total 6 heures environ et ne sera réalisée qu'une seule fois par animal. Injection intramusculaire d'un virus sous analgésie et anesthésie profondes: cette intervention dure 15 minutes et ne sera réalisée qu'une seule fois par animal.
Impact sur les animaux
Certains animaux recevront une injection intramusculaire. La douleur éventuelle générée par cette injection sera prévenue par un traitement antidouleur qui sera donné systématiquement avant l'injection, et pendant les deux jours qui suivent durant lesquels les animaux seront surveillés afin de vérifier qu'ils ne présentent aucun signe de souffrance. Toutes les autres interventions (chirurgie et électrophysiologie, tsDCS) seront réalisées sous analgésie et anesthésie profondes pour éviter toute douleur, et les animaux seront mis à mort dès la fin de l'intervention en maintenant la profondeur de l'analgésie et l'anesthésie.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de pouvoir prélever la moelle épinière et l'étudier, et pour ne pas laisser les symptômes moteurs se développer.
Remplacement
L'étude des effets de la tsDSC sur les propriétés électriques des motoneurones ne peuvent s'étudier que sur l'animal vivant entier pour plusieurs raisons: 1°) la SLA est une maladie de l'adulte, or à ce stade les motoneurones spinaux, qui sont les plus grandes cellules du système nerveux central, ne peuvent pas s'étudier dans des systèmes cellulaires in vitro dans lesquels ils ne survivent pas (tranches de moelle épinière, moelle épinière entière ex-vivo). 2°) Les propriétés des motoneurones spinaux dépendent étroitement de leur environnement cellulaire en particulier des circuits spinaux, des astrocytes (mais aussi des oligodendrocytes et des cellules gliales) et de leur interaction avec les fibres musculaires à la périphérie. 3°) Les lignes de champ électrique produites par la tsDSCT dépend étroitement des propriétés électriques et géométriques des tissus environnants les motoneurones et la moelle épinière.
Réduction
Chaque procédure est conçue pour apporter le plus possible de résultats avec des lots dont les effectifs ont été réduits au minimum pour obtenir des résultats fiables. Les données obtenues dans chaque procédure seront soumises à des analyses statistiques modernes qui permettront de déterminer quels sont les effets de la stimulation tsDCS sur les différents paramètres considérés.
Raffinement
Les expériences sont conçues pour apporter le moins d'inconfort possible aux animaux. Toutes les interventions (stimulation électrique transpinale à courant continu, injection intramusculaire de virus, chirurgie et enregistrements électrophysiologiques) seront réalisées sous analgésie et anesthésie profondes. Un traitement antidouleur sera donné systématiquement avant l'injection intramusculaire d'un virus, et pendant les deux jours qui suivent l'injection pendant lesquels les animaux seront surveillés afin de vérifier qu'ils ne présentent aucun signe de souffrance. Dans les autres interventions, sans réveil, la profondeur de l'analgésie et de l'anesthésie seront surveillées en continu en utilisant des points limites appropriés. Si la souffrance ne pouvait pas être soulagée, les animaux seraient immédiatement mis à mort. De plus, les expériences sont conçues pour obtenir le plus d'informations possibles sur chaque animal.
Choix des espèces
La découverte d’un lien génétique chez certains patients a permis de développer des modèles murins de la SLA. Nous utiliserons ici des souris transgéniques modèles de la SLA. Histologiquement, ces souris présentent une dégénérescence progressive des neurones moteurs spinaux et aussi des neurones du cortex moteur, reproduisant les atteintes spinales et corticales caractéristiques de cette maladie. Cette souris est un modèle de choix pour étudier les mécanismes physiopathologiques de la SLA et l'effet de thérapies potentielles, comme dans ce projet, la stimulation électrique transpinale à courant continu (tsDCS). Les trois procédures du projet se termineront lorsque les souris seront âgées de 45 à 55 jours. Dans cette tranche d'âge, les animaux sont adultes mais les symptômes moteurs de la SLA ne sont pas encore apparus. Nous voulons en effet étudier les conséquences électrophysiologiques et cellulaires d'une stimulation tsDCS chez un animal mature (adulte) avant l'apparition des symptômes.
Evaluation de déterminants moléculaires de la transformation d’un cancer cutané de type A en un cancer de type B plus agressif dans un modèle souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour savoir si un carcinome épidermoïde peut se transformer en carcinome à cellules de Merkel, un cancer cutané dont la survie à cinq ans atteint 40 %, 80 souris immunodéficientes reçoivent une injection sous-cutanée de cellules tumorales humaines. Celles qui développent des tumeurs sont ensuite injectées trois fois par semaine dans l'abdomen, avec une molécule inhibitrice ou un produit témoin, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur alterne les côtés d'injection pour éviter la douleur répétée au même point et donne des cacahuètes en récompense après le geste. Toutes les souris tumorisées sont ensuite tuées pour l'examen histologique de la tumeur, l'usage d'un "modèle murin immunodéficient" étant présenté comme "indispensable" faute d'autre matériel que des lignées tumorales humaines.
Objectifs
Le carcinome à cellules de Merkel (CCM) est un cancer neuroendocrine primitivement cutané, rare et agressif dont le taux de survie à 5 ans n’est que de 40%. L’intégration du génome d’un virus appelé Polyomavirus à cellule de Merkel ou l’exposition aux UV induit la transformation neuroendocrine d’une cellule saine en cellule tumorale de type neuroendocrine. Dans certains types tumoraux, le phénotype neuroendocrine est associé à une aggresivité tumorale accrue. A ce jour, la cellule dans laquelle a lieu la transformation reste inconnue. Des résultats préliminaires de notre équipe suggèrent que les CCM UV-induits dériveraient d’un autre type de tumeur cutanée appelé carcinome épidermoïde (CE) suite à l’acquisition d’altérations génétiques et épigénétiques. L’objectif de ce présent projet est de déterminer si les dérégulations génétiques et épigénétiques permettent la transformation d’un CE en CCM.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’évaluer l’impact de différents facteurs moléculaires de la transformation neuroendocrine. Les enjeux sont doubles : i) physiopathologique en permettant une meilleure caractérisation des étapes précoces du développement tumoral et ii) diagnostique et thérapeutique par l’identification des facteurs moléculaires précoces contribuant au développement des CCM qui favoriseront la prise en charge diagnostique des patients et pouvant conduire à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques potentiellement utilisables en clinique.
Procédures
Des injections sous cutanées de cellules de carcinome épidermoïde (CE) seront réalisées aux souris vigiles afin d’établir le modèle tumoral. Par la suite, les animaux présentant des tumeurs seront injectés 3 fois par semaine avec une molécule inhibitrice ou avec un contrôle par voie intrapéritonéale. Ces deux types de gestes ne durent que quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir un stress lors de la contention pour les injections en intrapéritonéales ou lors des pesées. Une douleur peut également survenir au point d’injection.
Devenir
L’évaluation histologique de la tumeur pour évaluer son caractère neuroendocrine impose la mise à mort de l’ensemble des souris tumorisées, mise à mort réalisée après sédation.
Remplacement
Afin d’étudier l’impact des différents déterminants moléculaires sur le phénotype tumoral et l’agressivité tumorale, l’évaluation sur modèle murin est obligatoire.
Réduction
L’utilisation d’une dose unique de molécule inhibitrice (précédemment utilisée par notre équipe dans le cadre d’expérimentations animales précédantes) nous permet de réduire le nombre de groupes d’animaux et ainsi le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Les injections en intrapéritonérales sont rapides et peu douloureuses, le geste technique est déjà maitrisé au sein de notre laboratoire. De plus, bien que les injections soient fréquentes (une injection tous les deux jours), elles se feront en alternance entre le côté gauche et le côté droit pour éviter d’engendrer des douleurs répétées au même point d’injection. Après les injections intra-péritonéales de molécule inhibitrice, les souris recevront sous forme de récompense des friandises (cacahuètes en coque). Une sédation précèdera la mise à mort afin de limiter le stress des animaux.
Choix des espèces
Le seul modèle disponible étant des lignées tumorales humaines, l’utilisation d’un modèle murin immunodéficient est indispensable. Les souris immunodéficientes utilisées sont un modèle de référence dans les études de xénogreffes. Les souris seront receptionnées à l’âge de 6 semaines, et utilisées à 7 semaines, après leur semaine d’acclimatation. Elles seront ainsi dans un stade physiologique de croissance, stade utilisé usuellement dans ce modèle de xénogreffe.
Etude de l’impact de la surexpression de la fascine sur la carcinogenese hépatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
160 souris vont être utilisées pour une seule injection dans l'orbite de l'œil, longue de moins d'une minute, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles peuvent développer des dysfonctionnements hépatiques et subir une gêne oculaire, puis toutes sont tuées pour que le foie et les autres organes cibles soient prélevés. L'objet déclaré est de vérifier si une protéine, la fascine, favorise le développement des cancers du foie pédiatriques. Le bénéfice annoncé se limite à "envisager le développement de nouvelles thérapeutiques", quand le porteur affirme que la culture cellulaire est "loin d'être un modèle représentatif" et qu'un "modèle physiologique complet" reste requis.
Objectifs
Notre travail au laboratoire s’intéresse particulièrement aux cancers du foie pédiatriques qui sont mutés pour une protéine qui favorise le développement des tumeurs. Une des cibles de cette protéine a un impact délétère sur la formation des canaux biliaires, structure importante dans la sécrétion de la bile dans le foie. Notre premier objectif est d’étudier ce phénomène chez l’animal pour voir les effets sur l’organisme en entier. Notre deuxième objectif est de vérifier l’implication de cette protéine dans le développement des tumeurs du foie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait de confirmer le potentiel oncogénique de notre protéine d’intérêt et ainsi envisager le développement de nouvelles thérapeutiques pour les cancers hépatiques.
Procédures
Les animaux subiront une injection retro-orbitale rapide (moins de 1 minute) ,160 animaux concernés.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un stress dû à la contention/préhension des animaux,2/ une gêne oculaire suite à l’injection en retro-orbitale, 3/ Les souris pourront développer des dysfonctionnements hépatiques.
Devenir
A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort par du personnel expérimenté afin de prélever les organes cibles et ainsi réaliser les analyses protéiques et histologisques nécessaires à la conclusion de l'étude La mort des animaux sera confirmée par l’absence de réflexes, de signes respiratoires et cardiaques
Remplacement
Tous les tests cellulaires in vitro réalisés en amont de cette étude montrent les rôles importants de notre protéine d’intérêt dans les cancers du foie. Toutefois la culture de cellules in vitro est loin d’être un modèle représentatif, le microenvironnement tumoral permettant l’interaction des systèmes physiologiques avec la tumeur manque et nous éloigne de résultats pouvant directement être bénéfiques en clinique chez l’homme. Afin de confirmer nos premières observations in vitro nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel pour cette dernière étape : le modèle animal
Réduction
Nous combinerons nos lots témoins dans le but de restreindre le nombre d'animaux. Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes.
Raffinement
Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, les animaux seront hébergés en groupe et l’enrichissement de leur milieu de vie sera systématique. Les animaux recevront une surveillance quotidienne et des soins adaptés (administration d’analgésiques et anesthésiques en pré et/ou postopératoire), mesure hebdomadaire du poids des souris, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt)
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris immunocompétentes âgées de 8 à 12 semaines, modèle animal qui permet un développement reproductible des tumeurs avec un microenvironnement efficient, gage d’utilisation de moins d’animaux pour nos expériences
Utilisation de nouveaux outils moléculaires visant à retarder le déclin cognitif dans un modèle de souris Alzheimer 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
555 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour des analyses biochimiques ou histologiques. Chacune subit une chirurgie du crâne d'environ quarante-cinq minutes pour qu'un virus soit injecté dans le cerveau, puis des tests comportementaux quotidiens de un à huit jours, dont un conditionnement à la peur par chocs électriques de 0,4 mA appliqués une seconde. Une partie de ces souris est transgénique et modélise la maladie d'Alzheimer, l'objectif étant de tester trois molécules candidates censées retarder le déclin de la mémoire. Le porteur qualifie la douleur du conditionnement de "fugace" et écrit qu'elle n'induit "aucune douleur ni mal-être durables", tout en affirmant que l'évaluation de la mémoire "ne peut se faire que sur des animaux".
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une pathologie neurodégénérative, touchant environ un million de personnes en France. On estime environ 225 500 nouveaux cas diagnostiqués chaque année. A l’heure actuelle, il existe quatre traitements disponibles dont la Rivastigmine et la Mémantine. Néanmoins, ces molécules ne traitent que les symptômes de la maladie d’Alzheimer et ne permettent pas de guérir ou de stopper la progression de la maladie. Au bout de quelque années ces traitements deviennent donc inefficaces et la balance bénéfices/risques n’est plus positive dû aux effets secondaires de ces molécules (troubles digestifs, cardiovasculaire, insomnie etc.). Comprendre et traiter les mécanismes sous-jacents à la maladie d’Alzheimer est donc d’intérêt public. La maladie d’Alzheimer se caractérise par un déficit précoce de la mémoire épisodique, qui permet la mémorisation de nos expériences passées. Ce type de mémoire repose en partie sur le processus de pattern separation, qui permet la discrimination de souvenirs plus ou moins similaires. Des défauts en pattern separation ont été observés chez des patients atteints de la maladie d’Alzheimer ainsi que chez les modèles animaux de cette pathologie. De plus, la mémoire de travail (court terme ; ex : retenir un numéro de téléphone) est une des premières atteintes dans la maladie d’Alzheimer. Ces troubles cognitifs sont associés à une dysfonction précoce du cortex et de l’hippocampe, impliqués respectivement dans la modulation de la mémoire de travail et du pattern separation. Notre équipe a récemment découvert des molécules qui améliorent le pattern separation chez la souris adulte saine, sans aucun effet délétère. Nous souhaitons maintenant tester l’effet de ces molécules dans des tests comportementaux permettant d’évaluer le pattern separation et la mémoire de travail, chez des souris transgéniques modèle pour la maladie d’Alzheimer. Les expériences seront réalisées dans 2 établissements utilisateurs différents. L’ensemble de ces analyses comportementales nous permettra de tester et valider l’effet nos molécules candidates sur l’amélioration de la mémoire dans des modèles murins sain et de vieillissement pathologique, afin de retarder le déclin cognitif des souris modélisant la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
Nos résultats préliminaires montrent que les souris non-transgéniques injectées avec un virus exprimant une de nos molécules candidates, ont une amélioration du pattern separation par rapport aux souris contrôles. Ainsi, en injectant les souris modélisant la maladie d’Alzheimer avec ce même virus à 4-5 mois ou 8-9 mois, nous espérons retarder l’apparition du déclin cognitif précoce (6 mois) ou retarder son évolution (10 mois). En testant 3 molécules candidates, nous espérons identifier le meilleur candidat afin de restaurer à la fois le pattern separation et la mémoire de travail affectés chez les souris modélisant la maladie d’Alzheimer. Ce projet permettra donc la mise en évidence et la caractérisation de molécules pouvant retarder le déclin cognitif, nous offrant ainsi de nouvelles pistes thérapeutiques. Les résultats obtenus nous permettrons d’avoir une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires et cellulaires engagés dans la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Nous souhaitons tester des molécules candidates chez la souris adultes et les utiliser ensuite chez des souris modélisant la maladie d'Alzheimer, afin de retarder le déclin cognitif. Pour se faire, nous injecterons directement dans le cerveau des virus non-infectieux qui vont permettre l'expression de molécules candidates. Les animaux seront injectés sous anesthésie avec un volume très restreint de virus (maximum 1µl). La durée de la chirurgie est d'environ 45 minutes. Une fois injectés, les capacités cognitives des animaux seront testées quotidiennement avec des tests comportementaux évaluant la mémoire épisodique et la mémoire de travail. Le test de conditionnement à la peur peut générer de la douleur (faible et brève) et de la peur. Ces tests comportementaux sont d’une durée allant de 1 à 8 jours. Le cerveau des animaux sera finalement prélevé pour vérifier la localisation de l'injection et la présence de la molécule candidate injectée.
Impact sur les animaux
1) Nous devons pratiquer une chirurgie stéréotaxique pour injecter des virus dans une zone précise du cerveau, impliquée dans le pattern separation. Cette chirurgie, rapide et standardisée entraîne une douleur post-opératoire légère pendant environ 48h, qui sera suivie et contrôlée. Les virus injectés n’ont aucun effet dommageable connu ou prévisible sur l’animal. 2) L’évaluation des capacités cognitives de nos souris nécessite l’utilisation de tests comportementaux. Le test de conditionnement à la peur nécessite l’utilisation de charges électriques très brèves et de faible intensité, suffisants pour intaurer de la peur uniquement liée au contexte du test et de la douleur fugace chez l’animal, mais n’induisant aucune douleur ni mal-être durables.
Devenir
A l’issu de chaque procédure les animaux seront euthanasiés et seront utilisés pour des analyses biochimiques ou histologiques.
Remplacement
Ce projet s’intègre dans un projet plus global combinant différents travaux de recherche complémentaires allant de l’étude biochimique ou biomoléculaire au comportement. Beaucoup d’études « in-vitro » sont donc effectuées sur des cellules en culture en amont de l’utilisation de lignées d’animaux pour limiter au maximum leur utilisation. De plus, ce projet fait suite à un projet déjà réalisé dans le laboratoire pour lequel des données préliminaires sur animaux sains sont encourageantes. L'évaluation de la cognition et de la mémoire doit se faire via des études comportementales qui ne peuvent se faire que sur des animaux.
Réduction
Afin d’utiliser le nombre minimal d'animaux mais de garantir la validité scientifique et statistique des résultats, nous avons évalué via la bibliographie et une étude empirique qu’un nombre minimum de 15 animaux par groupe est nécessaire pour nos tests comportementaux. Par ailleurs, nous utiliserons les mêmes animaux pour tous les tests comportementaux avec une évaluation de l’état de l’animal avant le début de chaque test. Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés lors des tests comportementaux, nous n’utiliserons qu’un groupe contrôle pour les tests concernant les souris modèles pour la maladie d'Alzheimer, ce qui nous permet de passer de 7 groupes de souris à 4 groupes.
Raffinement
Pour améliorer au maximum le bien-être des animaux, toutes les mesures sont mises en place tout au long du projet. Les animaux provenant de notre institut sont tous transportés entre les établissements, qui se trouvent dans le même bâtiment, sur des chariots en limitant au maximum bruits et secousses. Le transport est réalisé au moins une semaine avant le début des expérimentations pour permettre une acclimatation des animaux à leur nouvel environnement et réduire les biais expérimentaux liés au stress du transport. De plus, les animaux seront placés dans la salle de test 30 minutes avant le début des tests comportementaux pour les acclimater. Les animaux sont élevés en cage collective enrichie avec un nid végétal (carrés de cellulose + papier kraft), surveillés régulièrement et des points limites de l’établissement et du projet suffisamment précoces ont été mis en place. De plus concernant la chirurgie, un anti-inflammatoire et un anesthésique local sont administrés avant la chirurgie ainsi qu’un anesthésique gazeux pendant la chirurgie. Nous effectuons également un suivi post-opératoire biquotidien pendant 48h (weekend compris), pour lequel nous avons établi des points limites précoces et des mesures conservatoires adaptées à chaque point limite (e.g. administration d’un antalgique si l’animal est prostré, désinfection d’une plaie paraissant infectée, injection de glucose si l’animal perd trop de poids malgré la nourriture humide mise à disposition dans sa cage, chambre de réveil chauffée à 30°C, etc…). Nos animaux sont habitués à la manipulation 7 jours avant le début des tests comportementaux et ils sont pesés et observés tous les jours lorsqu’ils sont en test comportemental. Si une perte de poids et/ou l’animal paraît faible, froid, prostré etc., de la nourriture humidifiée est mise à disposition dans la cage. Si l’état de l’animal se dégrade, nous effectuons une injection de glucose 5% et nous demandons l’avis du vétérinaire référent. Pour réduire la peur et la douleur dans le test du conditionnement à la peur, le choc électrique est réduit à une durée (1 sec) et une intensité (0.4 mA) minimales.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris, animal pour lequel la manipulation génétique est possible, ce qui permet de produire des modèles mimant les pathologies humaines telles que la maladie d’Alzheimer. Les lignées sélectionnées pour notre projet sont déjà bien référencées et caractérisées. De plus, notre laboratoire possède une expertise et le matériel nécessaire pour étudier le pattern separation et la mémoire de travail chez la souris, ce qui facilitera la mise en place des tests comportementaux chez ces lignées murines. Nous souhaitons utiliser un seul stade de développement pour la procédure 1. En effet nos virus nécessitent 4 semaines pour s’exprimer totalement au sein de la structure cérébrale d’intérêt. Il est donc nécessaire d’utiliser des animaux âgés de 4-5 mois pour pouvoir étudier le comportement et la morphologie chez la souris adulte âgées d’au moins 5-7 mois. Pour la procédure 2, nous souhaitons utiliser 3 stades de développement différents. Les souris saines seront injectées avec nos virus à l’âge de 6 semaines pour être testées à 10 semaines en comportement, afin de répliquer les résultats obtenus précédemment chez les souris adultes de 10 semaines injectées avec une molécule candidate à 6 semaines (amélioration du pattern separation). Les souris modèles pour la maladie d'Alzheimer seront utilisées de 4 à 7 mois et de 8 à 11 mois. En effet, nous voulons injecter nos souris Alzheimer avant l’apparition du déclin cognitif précoce (4-5 mois) ou tardif (8-9 mois) et les tester à des âges subséquents (5-7 mois ; 9-11 mois) pour évaluer l’effet de nos protéines candidates sur la prévention du déclin cognitif.
Développement d’une nouvelle combinaison thérapeutique dans des modèles murins de cancer du sein triple négatif
- Recherche appliquée
- Cancers
Inoculées de cellules tumorales dans la glande mammaire, 1 215 souris immunodéficientes reçoivent jusqu'à quinze injections intraveineuses, jusqu'à quatre prélèvements de sang, jusqu'à trois séances d'imagerie nucléaire par semaine et, pour certaines, une ablation de tumeur. Pour 480 d'entre elles, le niveau de souffrance déclaré est sévère, les 735 autres relevant d'un niveau modéré. Le porteur ne décrit pourtant que des nuisances "légères", douleur locale à l'inoculation, gêne fonctionnelle liée à la tumeur, stress de quelques secondes aux injections, et affirme qu'aucune nuisance n'est attendue de l'imagerie ni des anesthésies. Toutes sont tuées à l'issue pour des analyses immunohistochimiques, l'objectif étant de tester une radiothérapie interne au lutétium-177, seule ou combinée à un inhibiteur de réparation de l'ADN.
Objectifs
L’identification et la validation de nouvelles cibles spécifiques du cancer du sein triple négatif (CSTN) constituent un enjeu important dans les approches thérapeutiques de plus en plus personnalisées. L’analyse des tumeurs du CSTN a révélé la présence de plusieurs cibles thérapeutiques potentielles. Parmi celles-ci, l’antigène membranaire spécifique de la prostate (PSMA). Depuis quelques années, la médecine nucléaire a ouvert de nouvelles opportunités pour le traitement des cancers métastatiques en développant les approches de Radiothérapie Interne Vectorisée (RIV). Elle repose sur l’utilisation combinée deux radionucléides différents : l'un pour l'imagerie (Gallium-68) pour visualiser la cible, et l'autre pour la thérapie (Lutetium-177). Les résultats encourageant du traitement RIV 177Lu-PSMA chez les patients atteints d'un cancer de la prostate nous permettent d'envisager d'utiliser cette thérapie pour les patientes atteinte de CSTN que nous combinerons à un traitement courant chez ces patientes, les inhibiteurs de réparation de l’ADN (PARPi). L’objectif principal de ce projet sera l’évaluation de l’efficacité de la RIV 177Lu-PSMA seule ou combiné avec des PARPi dans des modèles murins de CSTN. Pour cela, il sera nécessaire de caractériser l’expression de PSMA dans plusieurs modèles murins de CSTN puis d’évaluer la biodistribution du 177Lu-PSMA dans ces modèles. Enfin, nous évaluerons le potentiel de la thérapie 177Lu-PSMA seule ou combinée à des PARPi en vue d’une utilisation clinique.
Bénéfices attendus
La caractérisation de l’expression de PSMA dans les modèles de CSTN contribuera à élargir les connaissances scientifiques pour les futurs développements de thérapie ciblant le PSMA dans le CSTN. L’ensemble des résultats de ce projet permettra d’obtenir des données précliniques préliminaires indispensables pour le transfert clinique du 177Lu-PSMA chez des patientes atteintes de CSTN métastatiques en mono-thérapie ou en combinaison avec les PARPi.
Procédures
Les animaux sous anesthésie gazeuse seront soumis à une inoculation de cellules dans la glande mammaire (durée estimée de 1 à 5 min). Des prélèvements sanguins (veine latérale de la queue) pourront être réalisés sur (durée estimée 1-2min ; maximum 4 prélèvements espacés de minimum de 13 jours) et des injections intra-veineuses (veine caudale, durée estimée 1-2min ; maximum 15) pourront être réalisées sur des animaux vigiles. Les animaux sous anesthésie gazeuse seront soumis à des examens d'imageries nucléaires sur un équipement dédié au petit animal (durée moyenne d'un examen : 20 min ; maximum 3 imageries par semaine). Les animaux sous anesthésie gazeuse seront soumis à une ablation des tumeurs (durée maximale estimée de 15 min).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : - Une douleur ou inflammation locale liée à l’inoculation des cellules (nuissance légère). - Une gêne fonctionnelle liée à la présence de la tumeur(nuissance légère). - Le stress modéré lors des injections (molécules radioactives ou PARPi), réduite à une dizaine de secondes car réalisée par un expérimentateur expert (nuissance légère). Aucune nuisance liée à l’imagerie in vivo ou aux anesthésies n’est attendue.
Devenir
A l'issue des procédures, les animaux seront mis à mort en vue de la réalisation d'analyses mécanistiques comme des études immunohistochimiques sur les tissus.
Remplacement
Plusieurs étapes de screening réalisées en amont des expériences demandés dans cette procédure seront effectuées afin de réduire le nombre de molécules à évaluer et donc le nombre d’animaux. En effet, l’ensemble des PARPi subiront un screening in vitro pour sélectionner celui qui montre les effets les plus importants. Concernant la RIV PSMA, des études ex vivo sur coupes histologiques de patientes atteintes de CSTN seront réalisés afin de montrer l’affinité du radiopharmaceutique pour sa cible. Ces approches alternatives ne permettent pas de prendre en compte l’organisme vivant dans sa totalité et ne peuvent, à l’heure actuelle, se substituer à l’utilisation de modèles animaux. En effet, les modèles animaux vivant sont, dans les derniers stades d’études, nécessaire pour explorer et évaluer l’effet antitumoral, que ce soit la dissémination de métastases dans la circulation sanguine, mais aussi l’impact du système immunitaire, par le biais d’imagerie.
Réduction
Ces travaux ont été précédés par des études in vitro permettant de sélectionner les doses les plus adaptées. Une forte expertise du laboratoire s’étendant sur plusieurs années d’expériences concernant les modèles animaux permet d’affiner le nombre d’animaux. De plus le nombre d’animaux de ce projet a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en obtenant des données statistiquement suffisantes. Les modèles de tumeur inoculées en position orthotopique dans la glande mammaire (MFP) sont des modèles maitrisés par le laboratoire. Toutes les procédures seront réalisées sur des groupes randomisés avec un groupe témoins négatif (recevant du véhicule) L’ensemble des résultats, y compris négatifs, feront l’objet d’une publication afin d’éviter la reproduction d’expérience.
Raffinement
Pour le bien-être des animaux inclus dans ce projet, des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux. Pour cela nous mettons à disposition un enrichissement de milieu avec coton pour la nidification bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette dans chacune des cages. L’hébergement en groupe est maintenu. Les conditions d'hébergement seront optimales (température, hygrométrie, luminosité). Le nombre d’animaux est adapté à la taille de la cage et en adéquation avec la règlementation. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel de l’animalerie qui est sensibilisé aux différents modèles. Après leur arrivée à l’animalerie, une période d’acclimatation de 7 jours est définie afin d’acclimater les animaux à leur nouvel environnement. Pour limiter l’anxiété des animaux, ils seront habitués à la contention et à l’appareillage de contention pour les injections intra-veineuses dès la fin de la période d’acclimatation.La surveillance quotidienne permettra de visualiser les points limites, basés sur l’observation de l'état général des animaux et la détermination du score clinique (grille de score en annexe) prenant en compte notamment l’apparence, le poids, le comportement naturel et provoqué, l’hydratation, la douleur et la taille de la tumeur (déterminé 3 fois par semaine).
Choix des espèces
Le modèle souris est adapté pour les études concernant le développement de traitements en cancérologie. De plus, les souris immunodéficientes porteuses de greffe de lignée tumorale humaine (xénogreffe) sont adaptées pour les études fondamentales et appliquées de développement de traitements des cancers humains. Les animaux utilisés seront des adultes femelles de 6-8 semaines pesant environ 20 grammes. L'inoculation des cellules tumorales doit être réalisée chez des souris pour lesquelles les organes génitaux sont arrivés à maturité, ce qui justifie l'utilisation d'animaux plus âgés (6 à 8 semaines). Les animaux seront réceptionnés à 6 semaines à l'animalerie, et auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 7-9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 7-9 semaines est communément choisi pour ce type de projet.
Analyse des fonctions cardiovasculaires de souris porteuses d’une mutation génétique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Porteuses de la même mutation du récepteur alpha de l'hormone thyroïdienne qu'un enfant diagnostiqué en 2022, 40 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour l'analyse du foie, du cœur, du tissu adipeux et du cerveau. Les mesures in vivo se limitent à un électrocardiogramme sans pose d'électrode et à une prise de tension à la queue, vingt-cinq minutes par animal et par jour pendant trois jours, la contention se faisant dans l'obscurité à 30 degrés. Les études in vitro et in silico de cette mutation montrent un effet modéré, ce qui fait douter, de l'aveu du porteur, que les troubles du patient lui soient imputables, et il conclut pourtant que l'analyse in vivo est "irremplaçable". Quarante souris sont ainsi tuées pour éclairer le cas d'un seul patient, avec un bénéfice annoncé au conditionnel, orienter son traitement et anticiper d'éventuels troubles futurs.
Objectifs
Des cliniciens ont découvert en 2022, chez un enfant de sexe masculin montrant un fort retard de croissance, une mutation génétique altérant le récepteur alpha de l’hormone thyroïdienne. Il s’agit du cinquantième cas décrit pour cette maladie génétique rare encore mal connue. Etant donné son jeune âge, on peut anticiper la survenue future chez ce patient de troubles typiques des autres patients atteints de cette maladie : difficultés cognitives, troubles cardiovasculaires, désordres métaboliques, malformations du squelette. Toutefois, des études in silico et in vitro de cette mutation particulière montrent qu’elle a un effet modéré sur la réponse des cellules à l’hormone thyroïdienne. On peut donc douter du fait que les troubles pathologiques observés soient imputables à la mutation découverte chez ce patient. Ce projet vise à analyser les fonctions physiologiques d’une souche de souris porteuse de la même mutation génétique. L’objectif du projet est de définir en quoi les souris porteuses de la mutation diffèrent des souris témoins. En substituant à un seul patient un groupe de souris porteur de la même mutation, nous pourrons établir un lien de cause à effet entre la présence de la mutation génétique et les pathologies observées. Une grande partie de l’analyse sera effectuée post mortem et consistera à analyser l’expression des gènes dans les organes sensibles à la maladie génétique en question : foie, cœur, tissu adipeux, cerveau. Une partie de l’analyse sera consacrée à l’évaluation de possibles troubles du système cardiovasculaire chez les mêmes souris, qui ne peuvent être analysés qu’in vivo. Cette dernière partie fait l’objet de la présente demande.
Bénéfices attendus
- Si la présence de la mutation découverte chez le patient humain a des conséquences pathologiques chez la souris, on pourra en déduire que la mutation est bien à l’origine des symptomes observés chez le patient étudié. Cette information sera utile pour orienter le traitement de ce patient. - L’analyse des souris inclut une analyse post mortem approfondie des organes connus pour être sensibles à cette maladie génétique. Elle renseignera sur les mécanismes pathologiques impliqués, et permettra d’anticiper l’apparition future de troubles physiologiques chez le patient d’origine. Elle fournira éventuellement des données immédiatement transposables pour le traitement du patient, en particulier en cas d’apparition d’altérations du système cardiovasculaire. - Une fois validée en tant que modèle pertinent de la maladie génétique, la souche de souris porteuse de la mutation permettra de tester des approches thérapeutiques innovantes immédiatement transposables aux patients porteurs de mutations identiques ou similaires.
Procédures
Un électrocardiogramme non invasif (souris vigile se déplaçant librement, sans pose d'électrode) et une mesure de la tension artérielle de la queue seront effectuées à l’age adulte pendant 3 jours consécutifs (25 minutes/souris et par jour).
Impact sur les animaux
Les souris subiront un stress mineur lié à un environnement nouveau (nouvelle animalerie, placement dans le dispositif de mesure de l'électrocardiogramme). Elles subiront également un stress aigu temporaire lié à la contention, dans l'obscurité et à 30°C, nécessaire à la mesure de la tension artérielle.
Devenir
Les animaux seront tous utilisés pour des analyses post mortem, ciblées sur des organes connus pour être sensibles aux mutations du récepteur alpha de l'hormone thyroïdienne.
Remplacement
Les études in vitro déjà réalisées ne permettent pas de prédire les conséquences de la mutation sur le système cardiovasculaire, mais l’étude de la littérature sur le sujet laisse présager d’un effet modéré. D’une manière plus générale, la complexité du système cardiovasculaire n’est actuellement pas modélisée de manière satisfaisante dans des systèmes de culture cellulaire ou in silico. Par ailleurs, l’observation isolée des rares cas humains ne permet pas d'identifier la cause des symptômes observés. Pour ces raisons, l’analyse in vivo est donc irremplaçable.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé par comparaison avec des études préalables, effectuées sur des modèles proches. Le nombre de 10 animaux par groupe permet d’effectuer une analyse statistique dont la puissance est compatible avec la détection d’un effet mineur de la mutation.
Raffinement
Les souris seront introduites dans l’animalerie trois semaines avant l’analyse, pour leur donner le temps de s’habituer à leur environnement et réduire leur stress. Elles seront également soumises à deux séances d’habituation aux dispositifs expérimentaux, afin de réduire le niveau de stress associé aux mesures. La méthode d’analyse des fonctions cardiovasculaires prévue est non invasive et ne nécessite pas d’anesthésie. Elle est la plus pertinente par rapport à la pratique clinique humaine.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce de mammifères chez laquelle nous sommes capables de réaliser aisément des modifications génétiques. La pertinence des modèles non mammifères pour l’étude des mutations des récepteurs de l'hormone thyroïdienne est incertaine. L'étude sera réalisée sur des adultes âgés de 12-15 semaines. Le système cardiovasculaire évolue lentement au cours de la croissance post-natale. A l’âge choisi, les paramètres sont stabilisés. Les mesures publiées pour d’autres mutations du récepteur alpha de l'hormone thyroïdienne ont été effectuées à cet âge, ce qui favorisera les comparaisons.
Evaluation de l’effet thérapeutique des cellules CAR-T anti-CD19 dans un modèle murin de Sclérodermie systémique
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
338 souris reçoivent une ou deux injections intrapéritonéales de chimiothérapie, puis une injection intradermique cinq jours par semaine pendant quatre semaines qui leur induit une sclérodermie systémique. Elles développent une fibrose de la peau au point d'injection et une fibrose pulmonaire que le porteur qualifie de modérée, accompagnées de démangeaisons et parfois d'irritations cutanées dans les minutes qui suivent chaque piqûre. Vient ensuite l'injection intraveineuse de cellules CAR-T anti-CD19 ou d'un anticorps de référence, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées pour le prélèvement du sang, des poumons, de la rate et de la peau.
Objectifs
La sclérodermie systémique (SSc) est une maladie auto-immune rare et hétérogène qui est caractérisée par le développement anormal d’une fibrose de la peau pouvant aussi atteindre les organes internes et d’anomalies vasculaires. C’est la maladie auto-immune avec la plus grande mortalité individuelle au sein des maladies systémiques et la première cause de mortalité associée à la SSc est l’atteinte pulmonaire. Les progrès thérapeutiques et de gestion des complications ont permis au cours des dernières décennies une amélioration de la survie liée à cette pathologie. Néanmoins, la mortalité reste trop élevée : 15% à 5 ans du diagnostic et 30 % à 10 ans. Le développement de nouvelles thérapeutiques est donc une nécessité. L’objectif du projet est d’évaluer la possibilité d’utiliser le traitement par immunothérapie dans la sclérodermie systémique. Ce traitement utilise des cellules immunitaires prélevées chez le patient et génétiquement modifiées pour les rendre plus efficaces pour reconnaitre et éliminer les cellules responsables de la maladie après leur réinjection chez le patient. Cette thérapie cellulaire déjà approuvée dans le traitement de certains cancers est en cours de développement dans le traitement des maladies auto-immunes. Nous évaluerons si cette thérapie est efficace pour contrer les troubles majeurs de la sclérodermie systémique que sont la fibrose cutanée et pulmonaire.
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet montrera les effets bénéfiques du traitement par immunothérapie de la sclérodermie systémique tout en apportant de nouvelles connaissances sur les mécanismes d’actions de ce traitement.
Procédures
Les souris seront soumises à une ou deux injection(s) intrapéritonéale(s) de traitement de chimiothérapie ou à une injection intraveineuse d’un anticorps. Les souris pourront également être soumises à une injection intra-dermique (5 jours/semaine) pendant 4 semaines du traitement induisant la sclérodermie systémique. Enfin, elles pourront recevoir une injection intraveineuse de l’immunothérapie ou de l’anticorps de référence.
Impact sur les animaux
L'injection intra-dermique permettant d’induire la sclérodermie systémique peut entrainer une gêne (démangeaisons) dans les 2-3 minutes post-injection et aussi parfois des irritations cutanées, qui pourront être apaisées par l'application d'un spray anti-inflammatoire. Ces souris développent une fibrose cutanée au point d'injection et une fibrose pulmonaire modérée, limitée à la région sous-pleurale qui n'entraine pas de signes de difficulté ou de souffrance respiratoires. Les risques d’embolie pulmonaire et de forte réaction inflammatoire liées à l’injection de l’immunothérapie ne sont a priori pas attendues ici grâce au conditionnement des souris qui sera réalisé au préalable et au contexte non tumoral de cette étude.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements de tissus et d'organes (sang, poumons, rate et peau).
Remplacement
Il est important de voir les effets thérapeutiques du traitement CAR-T (traitement utilisant des lymphocytes T de souris contenant une molécule récepteur antigène chimérique leur permettant de reconnaître une cible plus efficacement) au niveau de l’animal entier portant une maladie surtout quand celle-ci touche plusieurs tissus ou organes et qu’elle est caractérisée par une auto-immunité (présence d’auto-anticorps dans la circulation sanguine), impossible à reproduire in vitro. La souris possède de nombreuses caractéristiques physiopathologiques communes avec l’homme, indispensables à l’extrapolation des résultats.
Réduction
Le choix des conditions expérimentales est fixé en lien avec les questions scientifiques du projet et les principes de réduction. Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n’utiliser que le nombre d’animaux strictement nécessaire. Les expérimentations seront réalisées successivement afin de limiter au mieux le nombre d’animaux utilisés puisqu’en fonction des premiers résultats, les étapes suivantes seront réalisées ou non. L’expérience précédente que nous avons sur ce modèle nous a permis de dimensionner nos groupes d’animaux à 10 souris afin de garantir l’obtention de données exploitables et de réaliser toutes les analyses sur tissus qui permettront de caractériser l’effet thérapeutique obtenu et d’investiguer les mécanismes d’action du traitement testé. Ainsi, pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, un nombre maximal de 338 souris sera utilisé.
Raffinement
La mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel permettront de limiter le stress et la souffrance des animaux. Ils bénéficieront également d'un enrichissement constitué de coton et/ou « maisons » en carton afin de les stimuler, diminuer le stress et afin de se construire un «nid». Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux (apparence physique, comportement) et un suivi bihebdomadaire des signes cliniques permettront d’avoir recours à des anti-douleurs adaptés si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux, et à l’euthanasie dès que nécessaire.
Choix des espèces
Parmi les rongeurs, il n'existe pas d'autres modèles de sclérodermie systémique que le modèle murin. Par ailleurs, le modèle murin est indispensable pour suivre l'apparition des effets systémiques et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps.
Élevage de souris transgéniques utilisées pour l’étude du rôle des cellules immunitaires dans le développement des maladies inflammatoires de la peau
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Un fragment de queue de moins de cinq millimètres est coupé aux ciseaux au moment du sevrage, et les phalanges sont tatouées pour identifier chaque animal. 5 200 souris vont être utilisées dans cet élevage de douze lignées génétiquement modifiées, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus faible. Le porteur décrit pourtant une rigidification progressive de la peau à partir de quarante semaines, avec perte de mobilité et démangeaisons, et, chez les lignées dépourvues de certaines cellules immunitaires, des infections pouvant évoluer vers une dégradation brutale de l'état général et une atteinte sévère de l'organe touché. Les souris de mauvais génotype sont tuées immédiatement, les reproductrices deux mois après leur dernière portée, les autres à vingt ou trente semaines selon le sexe, et celles qui conviennent partent vers d'autres protocoles expérimentaux.
Objectifs
Ce projet explore le rôle des cellules du système immunitaire dans la régulation de l’inflammation de la peau en condition normale et au cours des maladies inflammatoires cutanées. Ces maladies, dont les causes sont mal connues, sont caractérisées par l’apparition d’une inflammation et d’une modification de la structure de l’organe. Ceci affecte la peau notamment, mais aussi possiblement d’autres organes comme les poumons, le cœur et les reins. Une dérégulation du système immunitaire est aussi souvent associée à cette maladie. Dans ce contexte, nous souhaitons utiliser des lignées de souris comme modèle d’étude de l’inflammation cutanée et les combiner avec des lignées de souris dépourvues de certains types de cellules immunitaires ou au contraire nous permettant de suivre ces cellules dans les souris. L'objectif de ce projet est donc la description des élevages de ces différentes lignées de souris génétiquement modifiées, des méthodes d’identification (tatouage aux phalanges) et de détermination des gènes modifiés par technique invasive (biopsie de queue) en deux temps nécessaires à la préservation de l’intégrité des oreilles (organe d’intérêt pour nos expériences), ainsi que des méthodes de raffinement mises en place. Les animaux produits dans ce projet seront utilisés dans d’autres projets de recherche fondamentaux mais aussi à visée thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre l’élevage des lignées de souris nécessaires pour étudier le rôle des cellules du système immunitaire dans la régulation de l’inflammation de la peau et comment ces cellules, lorsque dérégulées, peuvent participer à l’apparition de modification de la structure de la peau. Au-delà des aspects de recherche fondamentale, l’utilisation de ces lignées de souris pourraient nous permettre d’ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour aider les patients souffrant de ce type maladie.
Procédures
Ce projet consiste en l'élevage de 12 lignées de souris génétiquement modifiées utilisées comme modèles d’étude de maladies inflammatoires de la peau et/ou dépourvues de certains types de cellules du système immunitaires. Un fragment de tissu sera prélevé au niveau de la queue (moins de 5mm) au moment du sevrage (à 3-4 semaine, âge de séparation d'avec la mère) à l’aide de ciseaux préalablement désinfectés (durée du geste: 10 secondes) pour déterminer les gènes modifiés dans chaque souris.
Impact sur les animaux
La coupure d’un bout de la queue nécessite de tenir les souris, source de stress, et peut conduire à un léger saignement. Le développement progressif des modifications de la structure de la peau peut entrainer un inconfort pour les souris et une perte de mobilité (phénomène observé 40 semaines après la naissance) dû à la rigidification progressive de la peau ; ainsi qu’une réaction inflammatoire locale source de démangeaison. L’absence de certains types de cellules du système immunitaire peut peut augmenter la vulnérabilité aux infections par des microbes, qui restent cependant très rare en condition d’élevage dans les laboratoires, puisque l’atmosphère est contrôlée pour éviter l’entrée des microbes. Dans certains cas les signes cliniques restent modérés, mais l’infection peut évoluer rapidement vers une dégradation brutale de l’état général, un amaigrissement et une réduction musculaire marquée, et une atteinte sévère de l’organe atteint puisque les souris ne sont pas capables de se débarrasser de l’infection.
Devenir
Les souris produites au cours de ce projet seront soit incluses dans d’autres protocoles expérimentaux, soit utilisées ou stockées pour générer de nouveaux accouplements. Les souris ne présentant pas les bonnes modifications de gènes seront immédiatement euthanasiées. Les souris utilisées pour des accouplements seront euthanasiées lorsqu'elles n'auront plus donné de portées depuis 2 mois. Les souris stockées pour de futurs accouplements seront euthanasiées lorsqu’elles seront âgées de plus de 20 semaines pour les femelles et de plus de 30 semaines pour les mâles (souris trop âgées pour être utilisées en accouplement).
Remplacement
L’étude à l’échelle du tissu et de l’organisme est indispensable pour découvrir les mécanismes moléculaires et cellulaires qui régulent l’inflammation de la peau au cours des maladies inflammatoires de la peau. Cette approche globale et intégrative nécessite l’utilisation de modèles animaux qui ne peuvent être totalement remplacés par des approches in vitro. Cependant, dans les études que nous menons, des techniques alternatives (cocultures cellulaires, organes-sur-puce) sont largement employées et remplaceront l’utilisation d’un modèle animal dans la mesure et autant que possible. Ces techniques in vitro permettent de reconstituer dans des boites de culture au laboratoire des organes ou partie(s) d’organes en utilisant différents types de cellules afin d’étudier certains mécanismes sans utiliser d’animaux.
Réduction
Nous adapterons l'élevage au besoin des projets de recherche de l’équipe. Nous connaissons bien l'ensemble de ces lignées de souris en termes de nombre et taille des portées, ce qui permet de gérer les élevages de façon raisonnée. Une attention particulière sera portée à génotyper et sélectionner les animaux de génotypes d’intérêt dès le sexage pour former les groupes expérimentaux dès le sevrage.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes pour respecter leur comportement naturel. Ils seront hébergés en portoirs ventilés réglés avec une surpression (nourriture irradiée conditionnée en double emballage) et leur manipulation se fera systématiquement sous une hotte afin d'éviter leur contamination par des microbes. Les souris seront surveillées quotidiennement (par les animaliers) et une fois par semaine par les expérimentateurs afin de détecter des signes de souffrance liés à l’apparition progressive des modifications de la structure de la peau et/ou d’une infection en tenant compte de leur apparence et de leur comportement (activité/mobilité spontanée des souris sans manipulation/attitude prostrée). En cas de suspicion de dégradation de l’état de la souris, une stimulation de la souris (main dans la cage pour entrainer le déplacement de la souris) sera faite afin de vérifier sa mobilité, et d’identifier des réactions de défense/agressivité, signes de douleur). Les contrôles cliniques seront alors rapprochés (tous les 2 jours) et en cas de dégradation de l'état général, la souris sera immédiatement euthanasiée. Des contrôles sanitaires (3 à 4 fois par an) permettront de s'assurer du maintien de la barrière et de l'absence d'agents pathogènes dans leur pièce d'hébergement. Concernant la méthode pour déterminer les gènes modifiés dans les souris et qui nécessite de couper un petit bout de la queue des souris, nous surveillerons dans les minutes qui suivent le prélèvement l'absence de saignement. Dans le cas contraire, une compression sera réalisée afin de favoriser la coagulation sanguine.
Choix des espèces
Le modèle souris a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. Les modèles murins de maladies inflammatoires de la peau sont largement décrits dans la littérature scientifique. Ils sont robustes et reproductibles et représentent d’excellents modèles des pathologies humaines. De plus, la bonne connaissance des modèles murins, notamment d’un point de vue génétique, permet le développement d’outils (souris génétiquement modifiées) permettant l’étude du rôle des cellules du système immunitaire in vivo, en prenant en compte le microenvironnement tissulaire. Enfin, nous avons une bonne connaissance du comportement de la souris et la possibilité de les prendre en charge facilement. Les souris seront mises en accouplement entre 6 et 8 semaines d’âge (maturité sexuelle), sans dépasser 20 semaines pour les femelles et 30 semaines pour les mâles au début du croisement.
Effets de candidats médicaments dans un modèle de dysménorrhée chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 500
Des molécules fournies par des clients, dont le porteur écrit ignorer la nature et les effets secondaires possibles, sont testées ici sur un modèle de règles douloureuses. 500 souris et 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des hormones pendant dix jours et jusqu'à vingt administrations de composés, puis une injection d'ocytocine qui provoque des crampes abdominales, avant d'être placés seuls en cage pendant une heure pour que ces crampes soient comptées. Le porteur indique qu'aucun test statistique n'a servi à fixer les dix animaux par groupe et s'en remet à son expérience du modèle.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur des rongeurs dans un modèle de dysménorrhée primaire.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de dysménorrhée.
Procédures
Les animaux vont avoir des administrations d’hormones et de candidats médicaments pendant 10 jours maximum. Ces gestes sont très rapides (moins d’une minute, 10 administrations pour les hormones et jusqu’à 20 administrations pour les composés médicaments) et seront réalisés par du personnel qualifié pour diminuer le stress des animaux. Une administration d’ocytocine (30 sec, 1 fois) provoquera des crampes abdominales et les animaux seront observés dans des cages individuelles pendant 1 heure pour compter ces dernières et observer le comportement de l’animal.
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). De plus, les animaux vont ressentir les mêmes symptômes que la pathologie induite à savoir des crampes abdominales.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet et des tissus seront prélevés.
Remplacement
Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement des dysménorrhées. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe au début de l’expérimentation mais de par notre forte expérience en expérimentation animale et dans ce modèle, les publications scientifiques publiées, un nombre minimum e 10 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. A la fin de l’expérience, des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre les groupes.
Raffinement
Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, nestlet…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure…Pour les procédures sous anesthésie, l’animal sera placé sur des plaques chauffantes thermorégulées afin d’éviter toute hypothermie. Si un animal présentait un symptôme d’un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.
Choix des espèces
Ce modèle est bien décrit dans la littérature chez le rat et la souris. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 6 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.
Entretien d’une lignée de souris portant une invalidation conditionnelle du gène codant la SELENOT (NesCre/SELENOT-/-)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées après génotypage quand leur génotype ne convient pas, ou en fin de carrière reproductive quand les portées cessent, les 750 souris de cet élevage subissent des procédures classées au niveau de souffrance le plus faible. La seule intervention décrite est une biopsie de la queue de trois millimètres, réalisée sous cinq minutes d'anesthésie pour identifier les porteuses de la construction génétique recherchée. L'élevage entretient une lignée dépourvue de la protéine SELENOT dans le système nerveux central, le porteur précisant que l'invalidation de cette protéine dans tout l'organisme tue la souris. Il justifie le choix de l'espèce par sa taille, ses coûts d'entretien réduits et ses fortes performances reproductives.
Objectifs
La SELENOT est une nouvelle enzyme impliquée dans la neuroprotection et dans des régulations neuroendocrines. Ce projet permettra de répondre à la question du rôle de la SELENOT, nouvel acteur de l'activité cérébrale, dans la fonction de différents neurones. L’invalidation de la SELENOT dans le système nerveux central chez le modèle animal pour l’étude de son rôle dans les mécanismes de neuroprotection et de régulation neuroendocrine pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de différentes pathologies d'origine centrale.
Bénéfices attendus
Les maladies neurodégénératives et métaboliques connaissent une progression significative et constituent un enjeu majeur de santé publique, alors qu'il n'existe pas de thérapies curatives pour ces pathologies. L'identification de nouveaux acteurs clés du métabolisme cellulaire pouvant intervenir dans ces pathologies et représenter de nouvelles cibles thérapeutiques est un objectif prioritaire de la recherche actuelle en Neurosciences. L'utilisation d'animaux dépourvus de la SELENOT grâce à la lignée Nes-Cre/SELENOT-/- représente un atout majeur pour l'identification de la fonction de cette nouvelle enzyme dont l'invalidation globale est létale chez la souris, témoignant d'un rôle primordial de cette protéine. Nous avons d'ores et déjà développé un outil thérapeutique potentiel dérivé de la SELENOT qui pourrait être utilisé pour le traitement de pathologies neurodégénératives ou métaboliques.
Procédures
Les animaux destinés à la reproduction subiront une biopsie caudale (prélèvement d'un bout de queue de 3 mm destiné au génotypage des animaux) sous anesthésie : un seul prélèvement, 5 minutes d'anesthésie.
Impact sur les animaux
Une biopsie caudale est nécessaire pour génotyper les animaux; cette biopsie peut entrainer des douleurs de sévérité légère chez l'animal.
Devenir
L'ensemble des animaux générés dans ce projet sera destiné à la reproduction et à l'entretien d'une lignée de souris. Les animaux de génotype adéquat seront placés en accouplement tant que les couples donneront naissance à des portées à un rythme régulier et dans des conditions assurant le bien-être des animaux. Les couples âgés ou ne produisant plus de portées seront mis à mort. Les animaux de génotype inadéquat donc inutilisables, seront mis à mort après le génotypage.
Remplacement
Les études sur le rôle de la SELENOT dans le système nerveux central et son impact sur la fonction d'organes vitaux en périphérie ne sont possibles que dans un système intégré et nécessiteront donc l'utilisation d'un modèle animal afin d'avoir une approche physiologique de l'implication de la SELENOT dans les régulations nerveuses et neuroendocrines impliquant certains neurones au niveau central.
Réduction
La stratégie de reproduction choisie dans le cadre de ce projet vise à réduire le nombre d'animaux générés en choisissant de travailler sur les animaux homozygotes pour la construction (SELENOTfl/fl), plutôt qu'hétérozygotes. Le nombre d'animaux de génotype non adéquat, générés dans la descendance des croisements est ainsi divisé par deux.
Raffinement
L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie et la douleur au réveil sera traitée par des analgésiques. C’est le cas lors du prélèvement de biopsies caudales nécessaires au génotypage des animaux qui sera réalisée sous anesthésie à l'isoflurane 5%.
Choix des espèces
La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coûts d’entretien réduits, fortes performances reproductives. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études de physiologie permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. La souris est également un modèle permettant des approches génétiques complexes qui n’existent pas chez d’autres modèles mammifères. Ainsi, des souris de la lignée C57Bl/6J ont été utilisées afin de générer les animaux portant la construction transgénique Nes-Cre.SELENOT-/-. La reproduction des animaux est faite à partir de 8 semaines de vie.
Evaluation des effets de nouvelles entités pharmacologiques sur la douleur nociceptive et/ou neuropathique chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 2400
Des administrations répétées, jusqu'à deux par jour pendant quatre semaines, précèdent des tests de douleur sur 3 600 souris et 2 400 rats. Ces 6 000 animaux subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 5 500 sont tués et 500 pourront être réutilisés dans d'autres projets s'ils n'ont reçu que les traitements contrôles. Les voies d'administration vont de l'orale à l'intradermique, et chaque animal est isolé de ses congénères jusqu'à soixante minutes pour les phases de test, d'habituation ou de récupération. Le porteur annonce des modèles comportementaux censés reproduire chez le rongeur le symptôme de la douleur humaine, et des tests provoquant des douleurs de moins de trente secondes, sans nommer un seul de ces tests.
Objectifs
La douleur est une expérience complexe, sensorielle et émotionnelle, aigue ou chronique, mettant en jeu des récepteurs et nerfs présents dans tout l’organisme ainsi que des régions cérébrale spécifiques. Indépendamment de la cause, la douleur doit être prise en charge afin de soulager le patient avec des traitements qui reposent essentiellement sur les médicaments antalgiques (3 niveaux en fonction de l’intensité de la douleur incluant le paracétamol, la codéine, la morphine). D’autres substances peuvent aussi être utilisées telles que les anesthésiques locaux, des antispasmodiques, des antidépresseurs ou encore des relaxants musculaires. Mais ces traitements symptomatiques peuvent entrainer des effets indésirables selon les substances utilisées : nausées, somnolence, dépendance… Ce projet a pour objectif d’étudier les effets de nouvelles entités pharmacologiques synthétisées ou acquises au sein du laboratoire dans des modèles comportementaux chez le rongeur permettant de mimer le symptôme la douleur chez l’homme. Ce projet implique l’obtention de données comportementales chez l'animal nécessaires pour envisager la poursuite du développement de produits pharmacologiques chez l’humain.
Bénéfices attendus
A court terme, il s’agira de démontrer à l’aide de données chez l'animal l’efficacité potentielle de nouvelles entités pharmacologiques : les procédures mises en œuvre permettront de mesurer la capacité de nouvelles molécules à moduler les symptômes de la douleur chez le rongeur, de les comparer et ainsi de choisir la meilleure selon des critères de sélection pour l’application thérapeutique choisie. A long terme, ce projet permettra de générer des données scientifiques pré-cliniques robustes indispensables au processus de développement de nouveaux candidats médicaments, notamment avant le passage en phase de tests chez l'Homme.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à des administrations dont la voie (orale, intrapéritonéale, intra-veineuse, intra-musculaire, sous-cutanée ou intra dermique ) , la fréquence d’administration (aigüe ou chronique, dans ce cas pas plus de 2 administrations/jour) ainsi que la durée (période maximale de 4 semaines) seront adaptées en fonction des objectifs de recherches. Les délais d'administration avant les phase de test seront de 0 à 4h. Pour chaque administration, une courte contention (
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, les animaux recevront des administrations de composés/inducteurs avant les évaluations comportementales. Il est possible que la courte contention alors nécessaire (
Devenir
Les animaux traités avec des composés pharmacologiques qui risqueraient d’interagir avec d’autres expérimentations dans le but d’une réutilisation seront mis à mort. Certains animaux, les animaux contrôles de la procédure 1, pourront cependant être réutilisés pour d’autres projets en fonction des objectifs de recherche si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée. La décision sera prise par le responsable projet (une personne compétente désignée par lui) ou le vétérinaire.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de nouvelles entités pharmacologiques sur le symptôme de la douleur dans le cadre du développement de nouveaux médicaments. Il n’existe à ce jour pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet c’est pourquoi l’utilisation de modèles in vivo est indispensable avant toute administration à l’homme, la souris et le rat étant ici les espèces les plus adaptées.
Réduction
Un effectif minimum et suffisant de 12 animaux par groupe expérimental est prévu afin d’obtenir une robustesse satisfaisante des tests statistiques. En fin de procédure, les animaux (en particulier les contrôles) seront au maximum réutilisés dans d’autres projets comportementaux ou bien pour des analyses histologiques faisant l’objet d’autres projets.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en animalerie centrale et restent 5 jours en acclimatation avant toute expérimentation. Tout au long des études, les animaux sont hébergés en groupe (nombre maximal défini par la règlementation en cours) dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement de milieu (tunnel, Sizzle pad pour nidification…) ou isolés de leurs congénères pour les tests lors de périodes les plus courtes possibles (moins de 60 min) selon les besoins de la procédure. Le change des cages se fait 1 à 2 fois par semaine. Les animaux sont observés chaque jour, et font l’objet d’un suivi par l’expérimentateur chaque semaine avec entrée des observations (et des éventuelles actions prises) dans une base de données. Les membres de la SBEA (Structure Bien-être Animal) effectuent une observation mensuelle de tous les animaux. En cas d’atteinte d’un des points limites définis plus loin, l’animal est écarté de l'étude pour subir les soins essentiels ou être euthanasié si nécessaire. Le raffinement sera aussi obtenu grâce au recours à des procédures les moins invasives possibles ainsi qu’à la familiarisation des animaux aux procédures expérimentales (période d’habituation aux pièces et dispositif expérimental, phase de familiarisation aux manipulations, administrations…).
Choix des espèces
Le rat et la souris sont déjà largement caractérisés d’un point de vue comportemental et neurochimique et ils ont un système nerveux suffisamment évolué pour envisager raisonnablement une extrapolation à l’homme de certains résultats. De nombreux parallèles existent en effet entre les caractéristiques comportementales étudiées chez le rat ou la souris et les caractéristiques du comportement humain. Ce sont les espèces animales les plus pertinentes et couramment utilisées pour évaluer les effets de substances sur la douleur. Les animaux sont utilisés au stade adulte chez la souris comme chez le rat. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets de produits sur l’animal à d’autres stades de développement. De plus, les tests de douleur décrits dans ce projet sont classiquement réalisés dans la littérature sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités motrices et cognitives fonctionnelles.
Génération de molécules pro-coagulantes injectables en intraveineux, à durée de vie allongée chez un modèle murin hémophile A
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris de ce projet sont hémophiles A sévères et portent en plus un récepteur plaquettaire humain, ce qui les expose à une hémorragie au moindre geste. 890 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune reçoit jusqu'à six injections intraveineuses hebdomadaires sous anesthésie et jusqu'à quatre prélèvements de sang, pour tester des molécules destinées à remplacer le facteur VIII chez les patients hémophiles. Une partie subit un prélèvement de sang de grand volume et est tuée immédiatement après, une autre une section de la veine de la queue sous anesthésie, suivie elle aussi d'une mise à mort immédiate, pour mesurer si les molécules testées arrêtent le saignement.
Objectifs
Ce projet de recherche a pour but de générer de nouvelles molécules thérapeutiques, destinées à remplacer le Facteur VIII (FVIII) de la coagulation utilisé actuellement en thérapie chez les patients hémophiles A. La demi-vie dans le sang de ces molécules est augmentée tandis que leur capacité à induire une réponse immunitaire est réduite comparé au FVIII thérapeutique. Ces nouvelles molécules sont des protéines de FVIII modifiées ou des fragmetns d’anticorps (Région variable d’anticorps de camélidés). La validation de ces nouvelles molécules nécessite leur essai dans des modèles murins d’hémophilie A. Notre modèle de souris hémophiles A exprime aussi un récepteur plaquettaire humain à la surface de leur plaquettes sanguies ce qui permet de tester l’interaction du FVIII à la surface des plaquettes. Des résultats préliminaires positifs chez la souris permettront d’envisager leur essai chez l’homme.
Bénéfices attendus
La demi-vie des FVIII thérapeutiques de première génération n’excède pas 15 heures, ce qui oblige les patients à se traiter tous les deux jours pour prévenir les hémorragies et les dégradations articulaires. L'hémophilie A affecte 1 naissance de garçon sur 5000. C'est la plus fréquente des maladies hémorragiques graves. Des FVIII thérapeutiques à demi-vie allongée ont été générés au cours des 10 dernières années, mais, à l’exception notable d'un FVIII thérapeutiq dont la demi-vie atteint 35 heures, leurs demi-vies sont inférieures à 19 heures. Avec ces molécules, les patients doivent continuer à s’injecter fréquemment, entre 1 et 3 fois par semaine. En ciblant les plaquettes, nous espérons bénéficier de leur demi-vie de 7 à 9 jours, ce qui allègerait considérablement le traitement des patients et améliorerait leur qualité de vie. Ainsi, des résultats positifs représenteraient une avancée notoire pour le traitement de l’hémophilie A.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections intraveineuses de molécules thérapeutiques innovantes à tester sur animaux anesthésiés. Six injections maximum seront réalisées de manière hebdomadaire, ces injections demandent moins de 1 minute d’immobilisation de l’animale. Les animaux seront également soumis à des prélèvements de sang sous anesthésie: 4 prélèvements maximum d’une durée inférieure à 1 minute. Afin d’évaluer les interactions des molécules thérapeutiques avec les plaquettes sanguines, un grand volume de sang est nécessaire et dans ce cas, les souris subiront un prélèvement de sang important sous anesthésie/ analgésie et seront euthanasiées immédiatement après. Certains animaux subiront également une section de la veine de la queue sous anesthésie et seront euthanasiés immédiatement après afin d’évaluer l’effet bénéfique des molécules thérapeutiques pour stopper le saignement.
Impact sur les animaux
Le modèle utilisé est un modèle préclinique de l'hémophilie A sévère, des risques hémorragiques liés à l'absence du FVIII de la coagulation sont possibles en cas de blessure, de traumatisme, lors des injections ou prélèvements. Les procédures ont donc été adaptées à ce modèle. L'induction d'une douleur ou d'une lésion lors des injections et des prélèvements est possible. L'induction d'une détresse respiratoire ou d'une hypothermie sont possibles lors de l'anesthésie, de même qu'un stress lors du réveil.
Devenir
L'euthanasie des animaux est requise à l'issue des procédures afin d'évaluer l'activité pro-coagulante de nouvelles molécules thérapeutiques mais également leur demi vie dans l'organisme et leur capacité à stopper un saignement sans déclencher une réponse du système immunitaire. Dans le cadre de l'élevage, les animaux seront euthanasiés en fin de période reproductive ou s’ils ne disposent pas du génotype nécessaire dans les expériences du présent projet.
Remplacement
Le projet fera appel à un modèle expérimental chez la souris. En effet, seule une approche expérimentale in vivo permet de rendre compte de la complexité des systèmes biologiques (notamment les mécanismes d'éliminations des molécules thérapeutiques circulantes). Aucun système in vitro actuel ne permet de déterminer les paramètres pharmaco-cinétiques de molécules, leur effet hémostatique ou leur immunogénicité.
Réduction
Le nombre de répétitions des expériences sera défini de manière rationnelle. Si une expérience donne des résultats statistiquement significatifs avec une puissance appropriée, elle ne sera pas répétée. Les organes, sérum et cellules des souris euthanasiées en fin d’expérience seront conservés. Ainsi, aucune expérience supplémentaire ne devra être faite si des questions nouvelles surviennent. Un total maximum de 890 animaux est prévu pour ce projet.
Raffinement
Les souris seront hébergées en accord avec les lois d’éthique françaises. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées avec le personnel de l’animalerie. Les animaux disposent de nourriture et de l’eau ad libitum. L’environnement est enrichi par ajout de nids végétaux et de tunnels en carton. Les souris seront hébergées avec un maximum de 5 souris par cage. Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour évaluer et réduire au maximum tout risque de douleur. Les conditions de vie seront améliorées au maximum (ajout de nids végétaux et de tunnels en carton). Tout geste (injection/ prélèvement) susceptible d'entraîner une douleur/ souffrance sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Des points limites ont été définis et les animaux malades seront soignés ou euthanasiés.
Choix des espèces
La seule alternative connue à l’utilisation d’un modèle murin est l’utilisation d’un modèle canin hémophile. Cependant, la souris est la seule espèce qui permet d’avoir un nombre d’individus de même âge suffisant, de génotype homogène, qui permet l’obtention de résultats statistiquement fiables, et pour lequel les outils nécessaires à l’étude de la réponse immunitaire sont disponibles sans restriction. Nous avons généré et validé in vitro deux nouvelles molécules dont nous avons démontré : l’activité pro-coagulante et la capacité à se lier à un récepteur plaquettaire. Pour démontrer l’efficacité hémostatique et pharmaco-cinétique de nos molécules et évaluer leur immunogénicité, nous devons utiliser des souris hémophiles A exprimant ce récepteur plaquettaire. Des souris adultes, âgées de 7-14 semaines en début d’expérimentation (systèmes immunitaires et hémostatiques matures) seront utilisées. L’utilisation de ce modèle est la seule solution pour apporter la preuve de concept de la faisabilité de notre approche avant de breveter nos molécules et d’envisager des essais en clinique humaine.