Souris

Les souris utilisées sont génétiquement hypercholestérolémiques et développent rapidement des plaques d'athérosclérose dès qu'elles reçoivent un régime gras. Elles sont 2 148, toutes tuées pour prélever des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une pneumonie leur est provoquée par instillation dans la trachée sous anesthésie générale, et le sang est prélevé plusieurs fois par incision de l'extrémité de la queue sur animal éveillé, entre dix semaines et huit mois d'âge. Le porteur annonce une première étape vers la prévention de l'athérosclérose après une pneumonie, et justifie l'effectif en une phrase, un nombre "réduit au minimum" pour permettre une analyse statistique fiable.

Objectifs

Les pneumonies font partie des maladies infectieuses principales, qu’elles soient acquises dans la communauté (comme la grippe ou la COVID-19) ou au cours d’une hospitalisation. Les maladies cardiovasculaires sont quant à elles l’une des causes les plus fréquentes de mortalité dans le monde. Il a été observé que l’incidence des maladies cardiovasculaires augmente après une infection, mais les mécanismes reliant l’un et l’autre n’ont pas encore été mis en évidence. L’idée principale du projet est d’étudier la relation causale entre la progression des maladies cardiovasculaires et les altérations observées suite à une pneumonie au niveau de la réponse immunitaire et de l’ensemble des microorganismes vivant en communauté complexe au sein du poumon. Ceci permettrait d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes impliqués et nous permettrait de contribuer, sur une plus grande échelle, à de nouvelles pistes pour mieux identifier les patients à risque, à trouver de nouvelles cibles thérapeutiques, et globalement à améliorer le rétablissement des patients et diminuer l’impact des infections. Notre objectif pour cette partie est de mettre en place et caractériser un modèle murin de pneumopathie dans un contexte de prédisposition aux maladies cardiovasculaires, ici l’athérosclérose, une maladie fréquente et caractérisée par le dépôt d’une plaque essentiellement composée de lipides (aussi appelée athérome) sur la paroi des artères. À terme, ces plaques peuvent entrainer une lésion de la paroi artérielle (sclérose) et conduire à l’obstruction des vaisseaux ou à leur rupture avec des conséquences souvent graves. Pour cela, nous allons : 1) Étudier la réponse de l’hôte à une pneumonie après le développement de plaques d’athérosclérose et d’une hypercholestérolémie, et caractériser le paysage immunitaire pendant et après la guérison de la pneumonie. 2) Étudier la progression des maladies cardiovasculaires après résolution d’une pneumonie et étudier la composition des cellules immunitaires dans les lésions d'athérome Pour ces deux parties, nous chercherons également à identifier les médiateurs immunitaires affectant la susceptibilité à la progression des maladies cardiovasculaires.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de comprendre comment l'athérosclérose influence la réponse immunitaire des poumons pendant la pneumonie, ce qui contribuera à améliorer les soins aux patients souffrant de maladies cardiovasculaires et d'infections respiratoires. En caractérisant les réponses immunitaires, le projet mettra en lumière les interactions complexes entre l'athérosclérose et les infections pulmonaires, ce qui pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Ce projet constitue la première étape pour prévenir la progression de l'athérosclérose et améliorer les résultats du traitement après la pneumonie.

Procédures

Une partie des animaux de ce projet sont soumis à une administration intra-trachéale (IT) sous anesthésie générale. Pour toutes les souris, plusieurs prélèvements de sang par une coupure minime à l’extrémité de la queue sera réalisé à différents temps, sur animaux vigiles. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanées (SC) de morphinique pourraient être réalisées sur animaux vigiles. Tous les gestes d’IT, SC et prélèvements sont très rapides et ne durent au maximum que quelques minutes.

Impact sur les animaux

Les modèles d’inflammation respiratoire aigüe sont des modèles entraînant quelques nuisances attendues et contrôlées (type perte de poids et poils hérissés) avec une récupération de l’état général des souris à partir de 2 jours après l’infection. Une petite douleur consécutive à l’instillation intratrachéale peut survenir, due à l’insertion de la sonde de gavage. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3 jours) et modérée (environ 10%) est observée, sans perte de motricité. Les souris présentent une hypercholestérolémie et développent une athérosclérose lorsqu’elles sont nourries avec un régime hyperlipidique, sans impact négatif sur la vie de l’animal. Plusieurs prélèvements de sang seront réalisés par incision minime à l’extrémité de la queue sur animaux vigiles après application d’une crème anesthésiante.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications cardiovasculaire et immunologiques.

Remplacement

Dans ce projet, l'utilisation de modèles animaux est essentielle car les paramètres étudiés ne peuvent pas être remplacés efficacement par des procédures in vitro. Les interactions complexes entre la réponse immunitaire pulmonaire pendant et après la pneumonie et l'athérosclérose nécessitent une approche globale que seul un modèle animal peut fournir. Les modèles animaux sont donc indispensables à une compréhension approfondie de ces phénomènes.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement, et un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place. Celui-ci permet notamment d’évaluer l’aspect physique global (perte poids et état de la peau, présence de plaie), le comportement des animaux (prise d’eau et de nourriture ; absence d’activité et perte de mobilité) et la modification des selles et des urines. Un système de score a été établi en fonction des signes cliniques observés, et selon les résultats obtenus, une ou plusieurs injections de morphinique seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage est préalablement enduite d’analgésique pour anesthésier localement la trachée. Une crème anesthésiante est utilisée comme anesthésiant local lors des prélèvements sanguins. Les volumes de sang et les temps de récupération ont été définis selon les recommandations (prélèvement inférieur à 7.5% du volume sanguin total et temps de récupération minimal d’une semaine). Dans ces conditions, les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle.

Choix des espèces

Les modèles murins d’infections sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les données déjà générées dans ce projet de recherche. De plus, le modèle murin est le modèle de choix et utilisé de longue date pour caractériser les mécanismes impliqués dans la régulation du métabolisme du cholestérol et des maladies cardiovasculaires. Nous disposons d’un modèle de souris hypercholestérolémiques et prédisposées au développement rapide de la plaque d’athérosclérose lorsqu'elles sont nourries avec un régime hyperlipidique. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte : ils auront 10 semaines au début des procédures et environ 8 mois à la fin. À ce stade, les paramètres cardiovasculaires sont stables et le système immunitaire est mâture. Ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale.

Une section chirurgicale du nerf vague au cou, cinq gavages quotidiens, des injections dans l'abdomen trois fois par semaine et un régime qui attaque les canaux biliaires : 8 832 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La finalité déclarée est de comprendre les liens entre cellules immunitaires, nerf vague et cholangite sclérosante primitive, maladie rare qui touche six à dix personnes sur cent mille en France et pour laquelle aucun médicament n'a fait la preuve de son efficacité. Le porteur prévoit qu'une perte de poids de 20 % conduira à interrompre le régime quelques jours, avant de le reprendre pour atteindre la durée totale prévue. L'effectif est rapporté à un calcul de puissance, sans qu'un seul chiffre soit donné.

Objectifs

La Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) est une maladie hépatique chronique, rare (6 à 10/100 000 habitants en France) caractérisée par une inflammation du foie, une prolifération des cholangiocytes et une fibrose péri-portale. Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre les cellules immunitaires, l’inflammation, le nerf vague et la pathogenèse de la CSP. A ce jour, aucune approche pharmacologique n’a démontré son efficacité dans le traitement de cette maladie. Les stratégies thérapeutiques actuelles se concentrent sur le ralentissement de la maladie et la prévention des complications qui lui sont associées. Des études suggèrent que certaines cellules immunitaires pourraient induire les lésions hépatobiliaires au cours de la CSP, notamment la fibrose. Toutefois, les mécanismes, notamment ceux à l’origine de la fibrose, demeurent encore mal connus. Afin de mieux appréhender les interactions complexes opérant au cours de la CSP, une perspective globale en examinant le rôle potentiel de diverses populations cellulaires dans la mise en place de la fibrose sera adoptée. D’autre part, le rôle du nerf vague dans la CSP sera étudié. En effet, la modulation de l'activité vagale pourrait influencer la mobilisation des cellules immunitaires, notamment les monocytes, bien que les mécanismes précis de ces interactions restent encore mal compris. Pour mieux appréhender ces interactions complexes, une approche chirurgicale consistant à réaliser une vagotomie cervicale unilatérale chez des souris, qui seront ensuite soumises à un régime pour induire la CSP, sera réalisée. Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre l’inflammation, le nerf vague, la pathogenèse de la CSP et sa résolution. En décryptant ces mécanismes, les bénéfices attendus du projet sont d'ouvrir de nouvelles perspectives permettant le développement de nouveaux traitements et ainsi contribuer à une meilleure prise en charge de la CSP. Les informations obtenues grâce à cette recherche pourraient ainsi contribuer à une avancée significative dans la prise en charge de la CSP. La CSP constitue un facteur de risque important pour le développement de cancers des canaux biliaires, du foie et de la vésicule biliaire. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à cette maladie pourrait permettre de réduire l'incidence de ces cancers.

Bénéfices attendus

La Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) est une maladie rare qui touche entre 6 à 10 personnes pour 100 000 habitants en France. Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre les cellules immunitaires, l’inflammation, le nerf vague et la pathogenèse de la CSP. Aucune approche pharmacologique n’a démontré son efficacité dans le traitement de cette maladie. Les stratégies thérapeutiques actuelles se concentrent sur le ralentissement de la progression de la maladie et la prévention des complications. Les informations obtenues grâce à cette recherche pourraient ainsi contribuer à une avancée significative dans la prise en charge de la CSP. La CSP constitue un facteur de risque important dans le développement de cancers des canaux biliaires, du foie et de la vésicule biliaire. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à cette maladie pourrait permettre de réduire l'incidence de ces cancers.

Procédures

Les souris seront soumises à : 1.une administration de molécule pour les modèles murins inductibles (via soit 5 gavages quotidiens pendant 5 jours, d'une durée de moins de deux minutes par gavage ; soit nourriture changée une fois par semaine ou eau de boisson changé tous les deux jours ; soit injection intrapéritonéale 3 fois par semaine, d'une durée de moins de deux minutes par injection, tout au long de la mise sous régime) 2.un régime alimentaire spécial (tous les jours pendant 28 jours maximum) 3.des traitements par injection d'anticorps en intrapéritonéale sur animal vigile (une à deux fois par animal, durée de quelques secondes) 4.une intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie (une fois par animal, durée de 10minutes) 5.un prélèvement sanguin sur animal vigile (une fois par animal, durée de quelques secondes) 6.Une euthanasie par une méthode réglementaire (durée de quelques secondes). Tous les prélèvements tissulaires se feront suite à l’euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Les régimes alimentaires spéciaux pourront entraîner une modification du poids pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. Le régime induisant la Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) peut provoquer une perte de poids. Les manipulations des animaux pourront induire un stress de courte durée. Les injections pourront induire une douleur de courte durée aux animaux. Les gavages pourront induire une irritation de l'oesophage. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire. La procédure chirurgicale pourra induire une douleur en post-opératoire malgré la prise en charge prévue ainsi que des risques d'infections dans de rares cas. Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur de courte durée aux animaux ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l'euthanasie de l'ensemble des animaux.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas de substitut non animal capable de reproduire avec précision les mécanismes complexes impliqués dans la genèse de la Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) et les réponses immunitaires associées. Parmi les différentes espèces, la souris s’avère être la plus appropriée pour étudier cette pathologie. De plus, l’utilisation de modèles murins est nécessaire pour explorer la pathologie au sein d’un organisme complet, ce qui ne peut être fidèlement reproduit en se basant uniquement sur des cultures de cellules isolées.

Réduction

8832 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Lorsque cela sera possible et afin de limiter le nombre total de souris utilisées, nous essaierons de mettre en commun des souris contrôles pour l’étude de différents modèles murins.

Raffinement

Le bien-être animal sera une priorité constante tout au long de la durée du projet, en minimisant la douleur et le stress. Les animaux seront hébergés en groupe avec des éléments d’enrichissement (lanières de papier kraft et bâton en bois au minimum). Une période d’acclimatation d’une semaine précédera les expérimentations. Une vérification visuelle quotidienne de l’état général des souris sera effectuée en ouvrant chaque cage. L’accès à l’eau et à la nourriture sera mis à disposition ad libitum. Tout signe d’inconfort, de détresse ou de comportement anormal (agressivité subite, inactivité, vocalisation, mutilation, isolement, diminution de l’appétit) ainsi que toute modification physique (pelage ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) sera étroitement surveillée. Les critères absolus d’inconfort (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires), qui ne devraient pas être déclenchés par la procédure utilisée, mèneront à l’euthanasie immédiate de l’animal. Une grille de suivi sera mise en place avec pesée hebdomadaire des animaux. En cas d'observation d'une perte de poids trop rapide (20 pourcents par rapport à l’initiation des régimes), des mesures appropriées seront prises. Plus spécifiquement, le régime sera interrompu pendant quelques jours afin de permettre une récupération, puis le régime induisant la cholangite sclérosante primitive sera repris pour atteindre la durée totale prévue du régime. Cette approche vise à assurer une tolérance optimale du régime, comme démontré dans des études antérieures.

Choix des espèces

Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre les cellules immunitaires, l’inflammation, le nerf vague et la pathogenèse de la Cholangite Sclérosante Primitive (CSP). La souris a été sélectionnée comme modèle expérimental en raison de sa capacité à reproduire de manière précise les mécanismes impliqués dans le développement de la CSP. En effet, le modèle murin permet de modéliser et d’intégrer les réponses immunitaires comme observé chez l’Homme. La souris offre l’avantage d’être un modèle bien établi pour l’étude de la CSP et permet également d’utiliser un certain nombre de lignées transgéniques générées au préalable. Les animaux âgés d’au moins 8 semaines seront utilisés pour l'entrée dans la procédure expérimentale afin que les animaux aient un métabolisme, un système immunitaire et vasculaire mature. Les souris pourront entrer en procédure dès leur 8ème semaine d’âge et en ressortiront après 1, 2 ou 4 semaines de régime.

110 souris vont être utilisées, chacune recevant deux injections le même jour à deux heures d'intervalle, une fois par semaine, pendant cinq à huit semaines. Toutes sont tuées à quinze ou dix-huit semaines de vie pour prélever le foie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le produit injecté provoque une maladie des petits vaisseaux du foie, avec accumulation de liquide dans le ventre, altération de l'état général et modification du comportement, la dernière semaine ajoutant trente minutes d'anesthésie pour une imagerie hépatique. Le porteur indique avoir utilisé des tests statistiques pour fixer l'effectif, sans donner ni le calcul ni la taille des groupes.

Objectifs

La maladie des petits vaisseaux du foie appelée MVPS est une maladie rare (2,5 cas pour 100 000 habitants) caractérisée par l'atteinte des petits vaisseaux dans le foie mais sans lésion de cirrhose (foie dur et fibreux non fonctionnel). La maladie des petits vaisseaux du foie touche des individus jeunes, en moyenne de 45 ans. Elle est souvent associée à d'autres maladies comme des maladies du sang (cancer du sang), des maladies du corps qui s'attaquent à lui-même (appelées maladies auto-immunes) ou encore des maladies génétiques. Les mécanismes à l'origine du développement de la maladie des petits vaisseaux du foie sont inconnus. Sa progression peut conduire au développement d'une hyperpression dans les grosses veines situées avant le foie et qui sont censées le traverser pour ramener le sang au cœur, cette hyperpression s’appelle une hypertension portale. Cette pression dans les veines abdominales peut entrainer des ruptures de ces veines avec des saignements dans le tube digestif, l’accumulation de liquide dans le ventre appelé ascite, ou encore la formation d'un caillot dans ces veines empêchant la circulation du sang. Il n'existe actuellement aucun traitement de la maladie des petits vaisseaux du foie. Comme cette maladie est encore largement incomprise, les progrès dans la recherche de traitement sont difficiles. Si l’implication des cellules formant les vaisseaux du foie est depuis longtemps suspectée puisqu’il s’agit d’une maladie des vaisseaux, l’une des nouvelles voies de recherche est l’étude d'autres cellules : les cellules de défense de l'organisme. Ces cellules, qui jouent un rôle contre les bactéries, peuvent être au repos dans le foie ou activer une réaction inflammatoire en cas de signal de danger de l’organisme. Elles ont été étudiées ces dernières années et leur nombre ainsi que leur activation semblent jouer un rôle dans le développement de nombreuses maladies dont certaines du foie comme la cirrhose. Notre hypothèse est donc que ces cellules pourraient, par leur interaction avec les cellules formant les vaisseaux du foie, être des acteurs clés dans le développement de la maladie des petits vaisseaux du foie. L'objectif est donc d’étudier leur impact dans son développement et sa progression. A terme, en cas d'implication, elles pourraient devenir des cibles thérapeutiques. La première étape pour ces études est de développer la maladie des petits vaisseaux chez les souris.

Bénéfices attendus

Il existe plusieurs bénéfices à ce projet : en effet, la maladie des petits vaisseaux du foie touche des sujets jeunes et est encore largement incomprise. Améliorer sa compréhension est très important à la fois pour : 1/ prévoir quels patients risquent de développer cette maladie, quelle sévérité attendre et donc prévoir un suivi plus approprié. 2/ en cas d’implication des cellules de défenses de l'organisme dans le développement de la maladie des petits vaisseaux du foie, ces cellules pourraient devenir des cibles thérapeutiques ce qui permettrait d’éviter ou de ralentir le développement de la maladie des petits vaisseaux du foie.

Procédures

Les expériences dans notre étude durent 5 à 8 semaines. Tout d’abord nous déterminerons le nombre nécessaire et l’endroit (ventre de la souris ou veines de la souris) des injections du produit permettant le développement de la maladie vasculaire chez la souris. Pour cela, un premier groupe de souris âgées de 10 semaines recevra une fois par semaine, vigiles, des injections dans le ventre du produit entrainant la maladie (l'injection dure 30 secondes, il y a 2 injections le même jour dans le ventre à 2 heures d'intervalle). Ces injections seront réalisées pendant 5 semaines. La dernière semaine des injections les souris auront une imagerie du foie sous anesthésie (environ 30 minutes d'anesthésie totale), avec injection d’un produit de contraste permettant de bien voir le foie. Ces souris seront anesthésiées puis euthanasiées à 15 semaines de vie, une prise de sang directement dans la veine qui revient au coeur (veine cave) sera réalisée pour obtenir un volume de sang suffisant. Un second groupe de souris âgées de 10 semaines recevra une fois par semaine, sous anesthésie, une injection du produit dans les veines de la queue (5 minutes d'anesthésie environ, le temps d'injection étant d'une minute environ). 2 injections le même jour seront réalisées chaque semaine, à 2 heures d'intervalle. Ces injections seront réalisées pendant 8 semaines et les souris recevront également pendant ces 8 semaines un régime alimentaire spécial. La dernière semaine des injections les souris auront une imagerie du foie sous anesthésie (environ 30 minutes d'anesthésie totale), avec injection d’un produit de contraste permettant de bien voir le foie. Ces souris seront anesthésiées puis euthanasiées à 18 semaines de vie, une prise de sang dans la veine cave sera réalisée. Enfin, un dernier groupe de souris âgées de 10 semaines recevra une fois par semaine, sous anesthésie, une injection du produit dans les veines de la queue (procédure idem groupe de souris précédent). La dernière semaine des injections les souris auront une imagerie du foie sous anesthésie (environ 30 minutes d'anesthésie totale), avec injection d’un produit de contraste permettant de bien voir le foie. Ces injections seront réalisées pendant 5 semaines et les souris recevront également pendant ces 5 semaines un régime alimentaire spécial. Ces souris seront anesthésiées puis euthanasiées à 15 semaines de vie, une prise de sang dans la veine cave sera réalisée.

Impact sur les animaux

Les souris qui reçoivent le produit pour développer une maladie des petits vaisseaux du foie peuvent présenter une altération de l’état général avec perte ou une prise de poids (en cas de formation de liquide dans le ventre). Pour les souris recevant les injections dans le ventre vigiles, les injections répétées de produit peuvent générer un stress ainsi que des douleurs temporaires au moment de l’injection. Le stress induit par le développement de la maladie (liquide dans le ventre, altération de l’état), les manipulations et les injections peuvent entraîner une modification du comportement de la souris.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés puis nous préléverons leur foie pour les analyses.

Remplacement

Les pathologies du foie sont des pathologies complexes sous l'influence de nombreux facteurs notamment environnementaux. Cette pluralité des facteurs de risque et d’interactions à l'origine du développement de la maladie des petits vaisseaux du foie, rend particulièrement difficile l’étude chez l’humain. Grâce au modèle des souris nous nous affranchirons ainsi de nombreux facteurs environnementaux à l’origine du développement de la MVPS et pourrons étudier l’effet d’un seul facteur (par exemple la génétique).

Réduction

Pour limiter le nombre de souris, nous réaliserons certains tests pour étudier les cellules de défenses sur le sang de patients atteints de la maladie des petits vaisseaux du foie. Nous réaliserons également des études préliminaires des interactions des cellules immunitaires avec les cellules des vaisseaux du foie sur des cellules isolées en laboratoire. Pour les souris, une seule souris fournira des prélèvements de sang et de foie pour plusieurs analyses différentes ce qui permet de diminuer le nombre de souris nécessaires. Nous avons également réduit le nombre d’animaux au strict minimum afin d’être en mesure d’obtenir des résultats interprétables. Nous avons utilisé des tests statistiques pour déterminer le nombre de souris minimum que nous inclurons dans le projet pour mettre en évidence une différence entre les groupes.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour assurer le bien-être des animaux : surveillance quotidienne par du personnel qualifié dans l’animalerie, hébergement dans des cages en groupe afin de limiter le stress (présent tout de même du fait des manipulations des souris), enrichissement de l’environnement avec du coton ou des batônnets en bois. Toutes les procédures pouvant faire souffrir ou occasionner plus de stress (comme les imageries) seront réalisées sous analgésie et anesthésie. L’état général de la souris sera évalué par une grille d’évaluation (étude du comportement de l’animal, mesure de son poids, état du poil...) remplie une fois par semaine, pour prendre en charge la douleur de manière anticipée. En cas d'altération de l'état général, un antalgique sera administré pendant 72h. En l'absence d'amélioration de l'état général la souris sera euthanasiée.

Choix des espèces

Le modèle de souris permet d’utiliser des souris génétiquement modifiées. Les techniques pour modifier l’ADN, développées chez les souris et les nombreux outils actuellement adaptés à la souris en font un modèle de choix pour l’étude. Enfin la maladie des petits vaisseaux du foie étant une maladie multifactorielle, la proximité génétique de la souris par rapport à l’homme nous permettra de nous affranchir en partie de certaines variables occasionnées par d’autres espèces. Le début des procédures sur les animaux se fera à partir d’un âge de 10 semaines (ce qui correspond à l’âge adulte chez l’homme et qui est l’âge auquel apparaît cette maladie chez l’homme) et au maximum jusqu’à 18 semaines de vie (âge de développement de la maladie par injections du produit).

Tester si des cellules souches au métabolisme standardisé freinent la dégradation du cartilage suppose d'abord de détruire ce cartilage. 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses radiologiques et histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux injections de collagénase sont pratiquées dans le genou droit à deux jours d'intervalle sous anesthésie gazeuse, puis une injection de cellules une semaine plus tard. L'arthrose ainsi provoquée peut plonger les souris dans la prostration, les isoler de leurs congénères et leur faire cesser le toilettage social, un signe clinique déclenchant des croquettes humidifiées, deux un analgésique, trois la mise à mort.

Objectifs

L’arthrose (OA) est une pathologie dégénérative et inflammatoire affectant 50 % de la population mondiale de 65 ans et plus. Cette pathologie atteint l’ensemble des tissus de l’articulation et est caractérisée par des douleurs et une raideur articulaire importante. Alors que l’OA est la plus commune des maladies rhumatismales, seuls des traitements palliatifs non spécifiques existent et ne permettent pas d’enrayer la dégradation articulaire. Il apparaît donc primordial de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques spécifiques de l’OA. Dans ce contexte, les cellules souches adultes et leur potentiel thérapeutique ont été largement étudiés. Des études pré-cliniques et cliniques ont montré des résultats prometteurs. Cependant, des inconvénients majeurs ont été mis en évidence, la fuite des cellules du site d’injection, leur faible viabilité après l’injection et la variabilité de l’efficacité des cellules en fonction des donneurs. Les travaux de nos collaborateurs ont montré que le métabolisme des cellules joue un rôle primordial pour leurs propriétés thérapeutiques. L’un des objectifs du projet est de standardiser le métabolisme des cellules afin de maximiser leurs propriétés thérapeutiques et rendre plus reproductible les résultats obtenus avec différents donneurs de cellules. L’objectif de ce projet vise à montrer l’effet immunosuppresseur des cellules traitées quel que soit le donneur de cellules dans un contexte arthrosique et de suivre le devenir des cellules injectées. Les données recueillies permettront d’envisager une étude chez un plus gros animal que la souris. Selon les résultats obtenus, nous envisagerons ensuite d'encapsuler les cellules traitées dans un hydrogel afin de les protéger d’une fuite du site d’injection et de la mort cellulaire afin de prolonger leur effet thérapeutique.

Bénéfices attendus

La prise en charge des patients atteints d’arthrose (OA) est à ce jour peu efficace et, compte-tenu de l’absence de traitement curatif permettant de réduire ou de stopper la dégradation articulaire, le traitement de l’OA représente un enjeu économique et social majeur. Ce projet permettra de mettre en évidence l’importance du statut métabolique des cellules souches mésenchymateuses (MSC) in vivo pour le traitement de l’OA et de suivre le devenir des MSC injectées dans l’articulation. Ces travaux pourront, à long terme, permettre de proposer des stratégies thérapeutiques pour des essais cliniques chez le chien (animal présentant naturellement de l’OA comparable à l’Homme) puis chez l’Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux injections intra-articulaires de 5 µL de la molécule permettant d’induire une dégradation précoce du cartilage ou d'une solution saline pour les groupes « contrôle » dans le genou droit à deux jours d’intervalle. Puis, une semaine après, une partie des animaux recevront une injection de 8 µL de cellules dans ce même genou pour étudier leur effet thérapeutique. Ces injections dureront quelques secondes par animal et seront effectuées dans des conditions d’asepsie strictes, sous anesthésie gazeuse et associées à un traitement anti-douleur pré- et post-opératoire. Les souris sont anesthésiées par inhalation d’anesthésique durant toute la procédure.

Impact sur les animaux

Lors du développement de l’arthrose (OA), de la douleur peut être ressentie par l’animal. Celui-ci peut alors entrer dans un état de prostration (état dans lequel l’animal est inactif, immobile et en repli sur lui-même), s’isoler des autres animaux dans la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Une infection pourrait intervenir au niveau du point d’injection de la collagénase puis des cellules. De façon générale, différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué tel qu’un changement mineur, une boiterie, une mobilité réduite, …) seront attentivement observés afin d’apporter les soins nécessaires et le plus rapidement possible aux animaux.

Devenir

A l’issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus et procéder à des analyses radiologiques, histologiques et cellulaires.

Remplacement

L’articulation se compose de différents tissus et types cellulaires ainsi que d’un liquide synovial. L’ensemble de ces composants agissent ensemble pour maintenir un état sain stable. Cependant dans certains cas pathologiques, ces différents composants peuvent interagir et participer au maintien d’une pathologie comme dans le cas de l’arthrose. Cette dernière a des causes et des conséquences multiples pour lesquelles il n’existe pas, à ce jour, de modèle in vitro (expérience en laboratoire, réalisée hors d’un organisme vivant) permettant de reproduire simultanément tous ces paramètres associés. C’est pourquoi, ce type d’étude nécessite une preuve d’efficacité in vivo dans des modèles utilisant des animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au strict minimum mais suffisant pour démontrer des différences statistiquement significatives et reproductibles entre les groupes. De précédentes études ont été réalisées pour le suivi de cellules marquées notamment après injection sous la peau. Ainsi nous n’utiliserons pas d’animaux pour la mise au point technique de la détection des cellules marquées. De plus, des études in vitro ont permis d’optimiser le protocole de standardisation des cellules souches adultes afin de limiter le nombre de groupes de souris lors de la procédure d’expérimentation animale.

Raffinement

De façon générale, un suivi quotidien par un personnel impliqué dans la procédure pendant la première semaine post-injection puis hebdomadaire des animaux permettra d’évaluer leur état de santé. Dans les cas particuliers du suivi post-injection, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant les 3 premiers jours. Si des signes cliniques sont observés, la gestion de la douleur se fera comme suit : 1 signe notable = visite 3 fois / semaine, mise à disposition de croquettes humidifiées dans la cage ; 2 signes notables = administration de analgésique ; 3 signes notables ou un signe sévère (point limite) = euthanasie. S’ajoute à cette observation une surveillance réalisée par les animaliers lors de l’entretien des cages des animaux (une fois tous les 10 jours). Le reste du temps, les souris sont hébergées en groupes sociaux de 5 souris par cage avec de l’enrichissement du type frisottis et d’un dôme. Les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Pour le cas particulier des injections, les souris sont anesthésiées par inhalation d’anesthésique durant toute la procédure et sont suivies quotidiennement pendant les 3 premiers jours post-injection.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris est justifiée car il s’agit d’un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens pré-cliniques. De plus, de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Dans le cas de l’arthrose (OA), plusieurs modèles murins ont été développés, faisant de cette espèce la plus décrite dans la littérature internationale pour l’étude de cette pathologie. D’autre part, elle permet la constitution de groupes d’animaux suffisamment larges pour pouvoir effectuer des calculs statistiques pertinents et reproductibles. Enfin, des études précédentes dans notre laboratoire ont montré la faisabilité du modèle et qu’il était possible d’injecter des volumes suffisants et de manière précise dans l’articulation permettant d’obtenir des résultants pertinents et reproductibles. Notre protocole démarrera chez des souris arrivées à maturité squelettique et âgées de 9 semaines minimum. Cet âge correspond à l’âge à partir duquel une induction de l’arthrose (OA) est possible et documentée dans la littérature.

Les souris dont la tumeur dépasse 1 500 à 2 000 mm3, se nécrose, ou qui perdent plus de 15 % de leur poids sont tuées. 2 707 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever organes, sang et tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans la veine des cellules leucémiques prélevées sur des patients ou une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc, puis deux prises de sang par semaine à la veine jugulaire sous anesthésie, la tumeur étant mesurée au pied à coulisse deux fois par semaine. Le porteur écrit que la diminution de la tumeur chez la souris "présage" sa diminution chez l'humain lors des futurs essais cliniques.

Objectifs

Malgré les progrès permanents dans la compréhension des cancers et dans les traitements disponibles, de nombreux patients ne répondent pas aux traitements classiques ou rechutent après différentes périodes de rémission. L’objectif est de proposer de nouveaux traitements contre les cancers du poumon et les leucémies aigües myeloïdes. Le microenvironnement tumoral (MET) dans les cancers est aujourd’hui reconnu comme ayant un fort impact sur la résistance des cancers aux thérapies. Parmi les composantes cellulaires du MET, il y a les macrophages et les lymphocytes T (LT) auxquels nous nous intéressons plus particulièrement dans l’équipe. Les LT sont normalement capables d'éliminer les cellules tumorales et les macrophages associés aux tumeurs (TAM) sont capables d'aider la tumeur à grossir. Nous cherchons donc à activer les LT et désactiver les TAM au sein de la tumeur grâce à de nouvelles molécules plus efficaces et surtout plus spécifiques que celles déjà existantes. L’objectif de ce projet est donc d’optimiser des traitements classiques et/ou de proposer de nouveaux traitements contre les cancers du poumon et les LAM.

Bénéfices attendus

L’inoculation des différentes molécules dans les modèles murins considérés permettra de réduire les masses tumorales et/ou d’activer les cellules immunitaires cytotoxiques impliquées dans l’éradication de la tumeur. Le but est de mieux comprendre le développement tumoral, d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques, ou de comprendre les mécanismes d'action de certains médicaments, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèle in vitro reflétant la pathologie humaine. L'utilisation d'animaux permet d'appréhender tous ces mécanismes au niveau de la tumeur mais également au sein de son microenvironnement. A terme, la validation de certains médicaments conduiront à des essais cliniques chez l'homme. Les bénéfices attendus sont une meilleure prise en charge de l'évolution de la tumeur, donc une diminution de la tumeur sous l'effet des molécules thérapeutiques utilisées dans ce projet. La diminution de la tumeur chez la souris présage donc une diminution de la tumeur chez l'humain lorsque que ces mêmes molécules seront testées en essais cliniques.

Procédures

Afin que la souris développe une LAM (leucémie aigue myéloïde) humaine, après anesthésie, les cellules primaires de patients seront injectées très doucement par voie intraveineuse dans la veine caudale. La prise de la maladie sera suivie par 2 prélèvements sanguins par semaine à la veine jugulaire pour minimiser l'impact sur les animaux quiauront été anesthésiés au préalable. La mise en place du modèle de cancer de poumon sera faite par injection en sous-cutané dans le flan des animaux des cellules tumorales. Afin de suivre les cellules greffées nous injecterons une molécule fluorescente spécifique des cellules ciblées par voie intraveineuse dans la queue de l'anima, l'animal sera ensuite anesthésié et observé en imagerie non invasine. Afin d'éliminer de manière totale les cellules tumorales, des molécules de thérapie ciblée seront injectées par voie intraveineuse (veine caudale) ou en intrapéritonéal.Les animaux seront surveillé pour leur bien-être, la tumeur sera mesurée au pied à coulisse 2 fois/semaine. Les animaux ne subiront pas de chirurgie. La durée de chaque intervention (acte expérimental) est d'environ 3 minutes pour chaque souris.

Impact sur les animaux

L'injection de cellules tumorales peut avoir un impact sur les animaux: une injection en sous-cutané pourra conduire à une croissance tumorale importante, à une légère perte de poids. Les animaux peuvent être stressés par le prélèvement sanguin au niveau de la veine jugulaire. L'injection de molécules en intrapéritonéal ou en intraveineux peut engendrer un léger stress (poils légèrement hérissés).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de prélever les organes, le sang et les tumeurs afin d'étudier l'impact du traitement appliqué.

Remplacement

La stratégie d’expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées par observation en imagerie in vivo non invasive dans la mesure du possible. Ainsi, nous remplacerons dans la mesure du possible les mesures invasives par de l'imagerie, permettant de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Le recours à l'expérimentation animale pour nos projets est essentiel car elle nous permet de prendre en compte le microenvironement tumoral de la tumeur qui intervient d'une manière très importante dans les mécanimes que nous étudions et notamment ceux reliés à l'immunothérapie qui est basée sur le système imunitaire dans sa globalité.

Réduction

Le nombre d’animaux sera de 6 animaux maximum par groupe. Dans le cas d'une étude d'efficacité de thérapies anti-cancéreuses, il s'agira de distinguer les groupes d’animaux recevant la molécule à tester ou le traitement thérapeutique de référence. Nous respecterons ainsi la règle des 3R. Le nombre de 6 animaux à été déterminé afin d'avoir des tests statistiques fiables. Afin de réduire le nombre d'animaux, les doses de molécules thérapeutiques à utiliser seront préalablement définies grâce a des expériences in vitro notamment avec des modèles 3D (sphéroides) que nous avons mis en place au laboratoire.

Raffinement

Les manipulations des animaux sont effectuées en environnement stérile. L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée au modèle et aux potentiels effets indésirables des procédures : les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l’animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Pour l'analyse des animaux à l'IVIS (In Vivo Imaging System), les animaux seront anesthésiés. Les animaux, quelque soit le mode d'injection, seront observés tous les jours afin d’évaluer leur état général. Tout animal présentant une souffrance ou une détresse sera euthanasié par élongation cervicale. Pour cela, le comportement général de l’animal sera observé (posture, réaction à un stimulus externe tel que le bruit, manque d’appétit, hérissement des poils) et des mesures seront réalisées (poids, taille de la tumeur). Si l’animal perd plus de 15% de poids ou si la taille de la tumeur correspond à une prise de charge tumorale supérieure à 10% (volume max: 1500-2000 mm3) ou si la tumeur est nécrosée (score 2: >-50%), l’animal sera euthanasié . Les personnes en charge du projet ont été formés aux gestes qu'ils vont mettre en oeuvre.

Choix des espèces

Le modèle souris est à la base de la compréhension de la pathologie cancéreuse et sont devenus les modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. Ils sont très utilisés dans le criblage de nouvelles molécules, car, du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’Homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules aux traitements. Ils présentent de plus des avantages pratiques tels que la croissance rapide, le cycle de reproduction court, la facilité de transport, de manipulation et d’adaptation aux différentes conditions expérimentales ainsi qu’un coût peu élevé. Enfin, ils ont déjà été décisifs pour la découverte de plusieurs molécules qui sont utilisés en clinique. La procédure utilise des animaux âgés d’environ 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes.