Souris
Consommation de fer héminique issu des produits carnés : conséquences sur la physiologie et la sensibilité du côlon chez la souris adulte et sa descendance en comparaison d’un apport en citrate de fer.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
548 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 264 opérées une heure sous anesthésie générale pour l'implantation d'électrodes sur les muscles abdominaux, puis hébergées seules dès le réveil. Sur ces souris maintenues éveillées, une pression est appliquée dans le côlon pendant dix secondes et répétée par paliers croissants pendant qu'on compte leurs contractions abdominales, stimulus que le porteur qualifie lui-même de douloureux. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 284 animaux et modéré pour 264, d'autres souris passant 23 heures en cage à métabolisme, d'autres étant mises à reproduire pour étudier l'effet du régime maternel sur la descendance. L'objet est de savoir si le fer héminique de la viande rouge, de la charcuterie ou d'un substitut végétal à base de léghémoglobine de soja aggrave la sensibilité du côlon, les retombées annoncées pour les patients atteints du syndrome de l'intestin irritable se limitant à des recommandations nutritionnelles à préciser.
Objectifs
Le syndrome de l’intestin irritable est une pathologie intestinale chronique répandue (5-10% de la population), altérant la qualité de vie des patients par l’inconfort digestif et les douleurs abdominales générées. C’est également une cause majeure de consultations médicales dans le monde occidental. Le diagnostic pour ces patients repose en partie sur l’évaluation de leur sensibilité viscérale, qui se trouve exacerbée en réponse à l’application d’une pression appliquée sur la paroi du côlon par rapport à la sensibilité perçue par une personne saine. Bien que les causes de ce syndrome restent peu comprises, il est établi que la composition du régime alimentaire influence fortement l’aggravation des symptômes. Les viandes rouges et charcuteries ne sont actuellement pas connues comme des aliments associés à l’exacerbation des symptômes de sensibilité viscérale chez ces patients, mais une étude chez la souris montre que la consommation d’un régime riche en fer héminique engendre une sensibilité viscérale accrue en réponse à un stimulus douloureux. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif de répondre à 3 questions : 1- La sensibilité accrue induite est-elle équivalente quelle que soit la forme du fer héminique consommé ? La sensibilité viscérale induite sera mesurée chez des souris chez lesquelles le fer héminique du régime sera apporté sous forme (i) purifiée, (ii) d’hémoglobine ou (iii) de viande. 2- La mise sur le marché d’une préparation à base de léghémoglobine de soja, à savoir une molécule de la même famille que l'hémoglobine de la viande, mais d'origine strictement végétale, est envisagée en Europe pour produire des substituts de viande. Au regard de la proximité de ces deux molécules, ce produit destiné à végétaliser davantage nos régimes est-il susceptible d’engendrer des effets sur la physiologie et la sensibilité du côlon ? 3- Sur le plan nutritionnel pendant la gestation et la lactation, un apport suffisant en fer, même héminique, est crucial. Une consommation maternelle excessive en produits carnés riches en fer héminique (environ 20% des femmes) est-elle susceptible de prédisposer sa descendance à des troubles digestifs tels qu’une sensibilité viscérale augmentée ?
Bénéfices attendus
En termes de santé publique, ces études permettront de mettre en lumière un nouveau facteur alimentaire à prendre en compte dans le régime des patients atteints du syndrome de l’intestin irritable, à savoir la consommation de viandes rouges et charcuteries, ou encore la consommation de substituts de viandes préparés à base de léghémoglobine. Ces données contribueront par ailleurs à préciser les bénéfices/risques et les recommandations nutritionnelles en fer au sein de la population générale, et chez la femme enceinte et allaitante, pour qui durant ces périodes, l’apport en fer est essentiel.
Procédures
Sur les 548 souris nécessaires à la réalisation de ce projet, 152 d’entre elles seront dédiées à la reproduction pour une exposition nutritionnelle périnatale. 228 souris nourries avec un régime dont la source de fer consommée (ou celle consommée par leur mère) sera contrôlée, seront placées chacune 23 heures en cage à métabolisme en fin d’étude. 264 souris nourries en parallèle avec ces mêmes régimes seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (analgésiques/myorelaxants) à raison de 1h maximum par intervention pour placer un dispositif de mesure des contractions abdominales. Pour la mesure de sensibilité viscérale, le nombre de contractions sera compté en réponse à l’application d’une pression intra-colique pendant 10 secondes et répétée 4 fois par palier croissant.
Impact sur les animaux
Des groupes de souris, dont la source du fer consommé (ou consommé par leur mère selon la fenêtre d’exposition concernée) sera contrôlée, seront placés 23 heures en cage à métabolisme en fin d’étude. Le stress modéré induit par la stabulation sur grille et l’isolement transitoire, pourrait modifier la mesure de la sensibilité viscérale, c’est pourquoi ces groupes de souris seront uniquement destinés à la collecte des échantillons fécaux et urinaires. En parallèle, pour la mesure de la sensibilité viscérale, les souris exposées à ces différentes sources de fer seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (analgésiques/myorelaxants) à raison de 1h par intervention pour implanter le dispositif de mesure sur les muscles abdominaux, ce qui suppose un inconfort lors de la phase de réveil, de récupération et lors des contentions effectuées pour l'administration des traitements post-opératoires (injections sous cutanées) et la vérification des points de suture. La préservation de ce dispositif implique un hébergement en cage individuelle à partir du réveil, et donc un stress lié à un isolement transitoire. La mesure de sensibilité viscérale requière que la souris reste vigile. Le stimulus douloureux ressenti résultera d’une augmentation de la pression intra-colique appliquée pendant 10 secondes à 5 reprises par palier espacés chacun de 10 minutes. Cette mesure est donc associée à un inconfort, un stress et une mobilité réduite de la souris.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les souris seront mises à mort et divers prélèvements seront effectués post-mortem pour des analyses histologiques et biochimiques ultérieures.
Remplacement
Les modèles cellulaires ont montré que des molécules formées dans le côlon lors de la consommation d’un régime riche en produit carné, pouvaient induire une cytotoxicité différente selon que la cellule exposée soit saine ou pré-tumorale. Cependant, aucune étude in vitro ou ex-vivo à ce stade du projet nous permet d’évaluer les conséquences d’un régime sur la physiologie digestive et plus particulièrement sur la sensibilité viscérale, que ce soit chez la souris adulte ou chez sa descendance. Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité des répercussions de cette exposition directe ou indirecte à ces contaminants d’origine alimentaire néoformés dans le contenu du côlon. La mesure de la sensibilité viscérale en réponse à l’application d’une pression intra-colique reste par ailleurs la méthode employée chez les patients pour fiabiliser le diagnostic du syndrome de l’intestin irritable.
Réduction
Les études antérieures associées à ce projet nous ont permis d’améliorer la procédure de sensibilité viscérale sur le plan technique (expérience de l’expérimentateur) et du bien-être de l’animal. Ces améliorations ont permis de diminuer le nombre d’animaux requis pour aboutir à des résultats significatifs et fiables : de 15 souris initialement par groupe, 12 souris par groupe sont aujourd’hui considérées comme nécessaire. Ce nombre sera réduit à 6 pour les lots parallèles destinés aux prélèvements fécaux et urinaires. Par ailleurs, le nombre minimum requis de souris utilisées pour la reproduction afin d'étudier l’impact des régimes maternels sur la santé digestive de la descendance est calculé au plus juste selon une convention établie dans le cadre des études développementales (concept du DoHAD). Malgré tout, cette phase d’élevage occasionne parfois des individus surnuméraires : les femelles restées non gestantes, les mâles après la phase de reproduction ainsi que les nouveaux nés surnuméraires. Ils serviront de témoin d’exposition pour la collecte d’échantillons, préservant ainsi les femelles gestantes et leur descendance d’un cumul d’interventions. Une saisine a déjà été anticipée en parallèle pour réaffecter ces souris surnuméraires à d’autres mesures complémentaires comme la mesure de la motricité intestinale. La reproductibilité et fiabilité des résultats sera assurée par une répétition indépendante des expérimentations. Une analyse statistique univariée par facteur sera réalisée et des approches multivariées couplées à des analyses de corrélations permettront d'exploiter au maximum l'ensemble des données qui seront générées.
Raffinement
Pour assurer une fiabilité des résultats tout en limitant le nombre d’animaux utilisés, une attention particulière est accordée au bien-être des souris et de leurs conditions d’hébergement : des manipulations douces d’habituation lors des pesées hebdomadaires seront effectuées, et pour minimiser le stress lié aux périodes d’hébergement en cage individuelle, les cages transparentes seront alignées et laissées sans couvercle filtrant pour maximiser les échanges visuels, olfactifs et auditifs. Des planches de fibre de coton déchiquetables (nestlets) leur seront distribuées pour satisfaire leur besoin de nidification et d’exercice, facilitant leur thermorégulation au sein du nid et celle de leur portée dans le cas de l’étude périnatale. Des buchettes en peuplier disposées sur la litière (ou sur la grille en cage à métabolisme) leur permettront de satisfaire le besoin de ronger. Une observation des souris à l’occasion notamment de la distribution quotidienne des régimes permettra de détecter à temps toute anomalie éventuelle et de minimiser la durée de toute souffrance constatée par des soins appropriés. Toutes les mesures susceptibles de réduire la douleur sans affecter l’objectif scientifique seront mises en application (anesthésie, prise en charge de la douleur post opératoire, tapis chauffant, hébergement transitoire en armoire chauffée en période post-opératoire, réhydratation).
Choix des espèces
La souris est un modèle courant pour la mesure de la sensibilité viscérale. Nous avons retenu une souche pour laquelle nous avons une grande expérience et une bonne base de connaissance à propos de sa physiologie digestive (barrière intestinale, système immunitaire, microbiote et sensibilité viscérale), comme de son comportement face aux produits d’anesthésie. En outre, le modèle choisi présente l’avantage d’être particulièrement sociable, la souche de souris choisie ne nécéssite pas en effet de contention pour la manipuler, et les femelles portent une grande attention envers leur descendance, ce qui limite le cannibalisme. Quelle que soit l’étude considérée, la mesure de la sensibilité viscérale requiert un tractus digestif mature. Des animaux adultes âgés de 9-11 semaines seront donc utilisés. En amont et pour permettre d’avoir des phases d’exposition aux différents régimes, nous réceptionnerons donc des souris âgées de 6 semaines pour les études chez l’adulte et des souris en âge de procréer (7-8 semaines) pour l’étude dédiée à une exposition maternelle pendant la gestation et la lactation.
Caractérisation du rôle d’une voie de la réponse immunitaire et de souches bactériennes du microbiote dans les troubles du comportement chez un modèle murin.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
Vingt et un gavages pour 360 souris, sept injections pour 240 autres, 1 200 prélèvements de selles, un rasage du dos et une ponction de la veine submandibulaire : 600 souris sont soumises à ces actes, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur signale un risque de traumatisme de l'œsophage lié au gavage à la canule et un risque d'infection cutanée lié au rasage. Il s'agit d'explorer le rôle de bactéries intestinales et de produits bactériens sur le comportement, chez des souris dont la réponse immunitaire a été altérée par délétion génique. Chaque souris passe une fois chaque test comportemental, pour 145 minutes cumulées d'épreuves sur trois semaines, sans que ces tests soient nommés.
Objectifs
Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte, une grande diversité de microorganismes (constituant le microbiote) et des molécules provenant de l’alimentation. Les bactéries et les produits qu’elles sécrètent y jouent un rôle crucial pour la bonne santé de l’hôte. Ainsi un déséquilibre de la diversité de microorganismes a été montré chez les patients atteints de maladies manifestées par des symptômes neuro-psychiatriques (Parkinson, dépression, sclérose en plaque). Notre travail de recherche vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales dans les manifestations comportementales de l’hôte. Des travaux suggèrent que certaines bactéries et des produits bactériens sont responsables de l’apparition de troubles du fonctionnement du système nerveux central . L’objectif de ce projet est d’explorer les mécanismes et d’identifier le rôle des bactéries et des produits bactériens dans la régulation du comportement dans un modèle de souris présentant une réponse immunitaire altérée.
Bénéfices attendus
Validation d’un modèle de souris présentant des modifications spécifiques des cellules neuronales sur des récepteurs de l’immunité innée pour l’étude de manifestations neuro-comportementales. Amélioration de la compréhension de l’influence du microbiote sur le comportement de l’hôte sur le comportement. Amélioration de la compréhension de l’impact des voies immunologiques dans les manifestations comportementales.
Procédures
Gavages : 360 souris seront soumises à 21 gavages (quelques secondes) et 240 à 7 injections (quelques secondes) ou au total, correspondant à une intervention par jour selon le protocole. La contention et le gavage sont réalisés en moins de 10 secondes par un expérimentateur qualifié. Prélèvement de selles : 2 prélèvements de selles correspondant à un placement dans un pot de récolte pendant 5 minutes maximum pour les 600 animaux, soit 1200 prélèvements. Rasage : les animaux subiront 1 rasage d’identification d’une durée de 10 secondes soit 360 actes de rasages de 10 secondes. Tests de comportement : tous les animaux subiront 1 fois chaque test comportemental dont la durée maximum est de 30 minutes. La durée cumulée d’épreuves comportementale sera de 145 min sur 3 semaines par animal. Prise de sang, durée inférieure à 15 secondes, 1 fois pour chaque animal.
Impact sur les animaux
stress léger induit par le placement dans un pot de récolte pour les prélèvements fécaux (émission naturelle de fèces par la souris en début et en fin de protocole) et la pesées des animaux (une fois par semaine). Douleur liée à la piqure et l’injection d’anesthésique et antalgique et des métabolites de l’étude.. Risque de traumatisme de l’œsophage induit par la manipulation de gavage oral à la canule souple pour administration des bactéries de l’étude. stress induit par la mise en conditions expérimentales des tests comportementaux douleurs et stress induit par la contention manuelle et la piqure effectuée par la lancette lors des prélèvements sanguins par ponction de la veine sub mandibulaire : risque de complication cutanée par infection induit par rasage à la tondeuse d’une zone du dos pour l’identification temporaire nécesaire à l’identification pendant l’enregistrement des vidéos.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre de récupérer le sang et les organes à des fins d'analyse scientifique
Remplacement
Il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico permettant d'évaluer le lien entre l'étât physiologique du microbiote et les processsus cérébraux complexes comme les comportements Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données sur les bactéries intestinales, la composition et l’abondance du microbiote intestinal, et des données phénotypiques (poids, prise alimentaire) et comportementales.
Réduction
Nous avons choisi d’utiliser des groupes de 12 animaux en se basant sur les études déjà menées au laboratoire, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres comportementaux.
Raffinement
Les souris bénéficieront d’un enrichissement avec du papier pour réaliser des nids et une maison en propylène rouge pour permettre aux souris de faire ce nid et se cacher. Elles auront également un bâton à ronger. Les animaux sont hébergés dans des cages transparentes permettant des interactions visuelles. Afin de limiter le stress lié aux tests comportementaux, les animaux seront habitués aux procédures et au matériel de manière progressive. Les animaux seront observés chaque jour (surveillance visuelle) et plus précisément une fois par semaine au moment de la pesée des animaux. Enfin des points limites adaptés sont définis pour limiter d’éventuelles souffrances.
Choix des espèces
Les animaux auront 6 à 8 semaines au début de la procédure, âge auquel le système immunitaire est mature et le microbiote intestinal stabilisé. Le modèle souris est largement étudié dans les recherches sur le comportement et l’immunologie, ce qui permet l’accès à de nombreuses données physiologiques de comparaison. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal. De plus, les délétions de gènes spécifiques dans un type de cellules donné n’existent que dans ce modèle murin.
Impact de l’inactivation d’un isoforme de PI3K sur les propriétés anti-thrombotique et anti-inflammatoire de l’endothélium.1/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Après sept jours d'acclimatation, certaines souris reçoivent la veille de l'expérience une injection intraveineuse de moins de cinq minutes dans un premier établissement. Dans un second établissement du même campus, sous anesthésie profonde, elles sont canulées à la trachée et à une veine, et leur muscle crémaster est exposé pour observer la thrombose ou l'inflammation dans les veinules et les artérioles. Au total, 116 souris, dont certaines génétiquement modifiées pour porter une forme inactive d'une isoforme de PI3K, vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ces expériences durent "respectivement 4 et 7 heures" selon la description des procédures, et "maximum 6 heures" selon celle des effets attendus. Toutes les souris sont tuées par excès d'anesthésique à la fin de l'expérience, sans reprendre conscience, le porteur indiquant qu'après ces actes invasifs elles "ne pourraient pas survivre".
Objectifs
L’inhibition d’un isoforme de la protéine d’intérêt a été identifié par nos collaborateurs comme protecteur de l’intégrité endothéliale et de la barrière vasculaire dans le contexte thrombo-inflammatoire des accidents cardiovasculaires cérébraux. Alors que les souris exprimant une forme inactive ne présentent aucun phénotype apparent, ces souris sont protégées de la perméabilité vasculaire, de l’oedème, de l’infarctus cérébral, et de la réponse inflammatoire délétère. Dans ce contexte, l’objectif de cette demande qui sera réalisé sur deux établissements utilisateurs présents sur le même campus, est d’évaluer en précliniques l’impact de son inactivation sur les propriétés inflammatoire de l’endothélium et sur la thrombose. L’impact de cette isoforme sera évalué en utilisant des molécules inhibitrices candidates générées par nos collaborateurs.
Bénéfices attendus
Ce type d’expérimentation permettra d’évaluer dans un modèle complexe vertébré ne pouvant pas être reproduit in vitro, les capacités anti-thrombotique ou/et anti-inflammatoire de la protéine d’intérêt et des molécules d’intérêts testées. Nous pourrons ainsi savoir si la protéine ciblée peut être considérée comme une cible thérapeutique capable de protéger l’intégrité du vaisseau dans un contexte thrombotique ou inflammatoire autre que les accidents cardiovasculaires cérébraux. Nous pourrons notamment évaluer le statut inflammatoire du vaisseau dépourvu de la protéine d’intérêt mais également la formation et la stabilité du thrombus ainsi que sa capacité à emboliser. Ces embolisations sont critiques car elles sont à l’origine des embolies pulmonaires et des accidents cardiovasculaires cérébraux.
Procédures
Dans l'etablissement 1: seule une injection intraveineuse la veille de l'experimentation sera realisée sur certains lots.l'intervention dure moins de 5 minutes. Dans l'etablissment 2 :Les animaux sont, sous anesthésie profonde, canulés aux niveaux trachéal et veineux, avec une exposition du muscle crémaster dans le but de visualiser les veinules et les artérioles afin d’étudier la thrombose ou l’inflammation. Les animaux sont maintenus sous anesthésie tout au long de l’expérience et sont euthanasié à la fin des experimentations qui durent respectivement 4 et 7 heures.
Impact sur les animaux
Les souris exprimant une forme inactive de l’isoforme de la protéine d'intérêt ne présentent pas de phénotype apparent (phénotype non dommageable). Les deux types d’expérimentations sont sans réveil. Les Animaux seront maintenus sous anesthésie durant la totalité de la procédure qui dure maximum 6 heures et seront mis à mort par excès d’anesthésique.
Devenir
les procédures utilisées sont invasives, il est nécessaire d'euthanasier les animaux en fin de procédures, les animaux ne pourraient pas survivre.
Remplacement
Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré non modélisable par des approches in vitro et (ii) le test d’inhibiteurs sélectifs pour la protéine d'intérêt que nous souhaitons valider in vivo.
Réduction
Dans un soucis d'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, le nombre d'animaux annoncé a été calculé au plus juste à l'aide d'outils statistiques. Dans la mesure du possible, dans les experimentations de thrombose, plusieurs types cellulaire et/ou molécules seront visualisés dans les mêmes animaux. De plus, si aucun résultat significatif n’est obtenu avec les souris exprimant une forme inactive de la molécule d'intérêt, les expérimentations avec les molécules inhibitrices de la protéine d'intérêt ne seront pas réalisées.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupes de 5, en présence de coton de nidification, avec boisson et nourriture adlibitum. Une période de 7 jours d’acclimatation sera réalisée pour tous les animaux avant expérimentation. Les animaux sont surveillés tous les jours par du personnel. Le transport entre les deux établissements sur le même campus est effectué de sorte à minimiser les bruits et les vibrations pouvant être perçu par les animaux. Les actes invasifs sont tous réalisés sous anesthésies. Les injections permettant le maintien de l’anesthésie tout au long de l’expérimentation sont minutées et dosés pour assurer un état stable sans réveil des animaux. Cependant un animal venait à avoir un réveil même léger il sera immédiatement anesthésié.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle de choix pour l’étude préclinique de la thrombose et de l'inflammation. En effet la formation d’un thrombus et le dévelopement d'une inflammation dans le modèle murin est excessivement proche de celle de l’Homme, aussi bien au niveau des molécules que des cellules impliquées. Les effets pléïotropes dans ce contexte font intervenir des fonctions cellules multiples dans l'organisme non modélisables par des approches in vitro. Le recours à l'expérimentation animale est donc l'unique approche permettant de comprendre les impacts physiopathologiques dans ce contexte. Par ailleurs, nous travaillons avec des souris génétiquement modifiées pour notre protéine d’intérêt (pas de phénotype dommageable). Nous travaillons sur des animaux adultes de 5 à 25 semaines, nous avons besoin d'un système immunitaire et d'une production de plaquettes matures
Impact de l’inactivation d’un isoforme de PI3K sur les propriétés anti-thrombotique et anti-inflammatoire de l’endothélium.2/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris de certains lots reçoivent une injection intraveineuse dans un premier établissement la veille de l'expérience, menée dans un second établissement du même campus. 116 souris, dont certaines génétiquement modifiées pour porter une forme inactive d'une isoforme de PI3K dans tout le corps ou dans les seuls vaisseaux sanguins, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Sous anesthésie profonde, pendant une procédure qui peut durer six heures, elles sont canulées à la trachée et à une veine, et leur muscle crémaster est exposé pour observer la thrombose et l'inflammation dans les veinules et les artérioles. Le porteur qualifie d'"irremplaçable" le recours à la souris, en invoquant des mécanismes "non modélisable par des approches in vitro" et des inhibiteurs qu'il souhaite "valider in vivo".
Objectifs
Ce projet a pour but d’évaluer l’impact d'une protéine d'intérêt sur les propriétés antithrombotique et anti-inflammatoire des vaisseaux sanguins autres que ceux du cerveau. L’inhibition d’une protéine d'intérêt a été identifié par nos collaborateurs comme protecteur de l’intégrité des vaisseaux dans le contexte de l'accident vasculaire cérébral. Alors que les souris exprimant une forme inactive de cette protéine ne présentent aucun phénotype apparent, ces souris sont protégées de la perméabilité vasculaire, de l’œdème, de l’infarctus cérébral, et de la réponse inflammatoire délétère. Dans ce contexte, l’objectif de cette demande qui sera réalisée sur deux établissements utilisateurs, est d’évaluer en précliniques l’impact de son inactivation sur les propriétés inflammatoire de l’endothélium et sur la thrombose Pour ce projet nous utiliserons un modèle murin qui exprime une forme inactive de la protéine d’intérêt dans tout l’organisme ou uniquement au niveau des vaisseaux sanguin. L’impact de cette protéine sera également évalué en utilisant des molécules stoppant la fonction de la molécule d'intérêt. Ces molécules seront générées par nos collaborateurs.
Bénéfices attendus
Ce type d’expérimentation permettra d’évaluer dans un modèle complexe vertébré ne pouvant pas être reproduit in vitro, les capacités anti-thrombotique ou/et anti-inflammatoire de la protéine d’intérêt et des molécules d’intérêts testées. Nous pourrons ainsi savoir si la protéine ciblée peut être considérée comme une cible thérapeutique capable de protéger l’intégrité du vaisseau dans un contexte thrombotique ou inflammatoire autre que les accidents cardiovasculaires cérébraux. Nous pourrons notamment évaluer le statut inflammatoire du vaisseau dépourvu de la protéine d’intérêt mais également la formation et la stabilité du thrombus ainsi que sa capacité à emboliser. Ces embolisations sont critiques car elles sont à l’origine des embolies pulmonaires et des accidents cardiovasculaires cérébraux.
Procédures
Dans EU 1: seule une injection intraveineuse la veille de l'experimentation sera realisée sur certains lots. Dans EU2 :Les animaux sont, sous anesthésie profonde, canulés aux niveaux trachéal et veineux, avec une exposition du muscle crémaster dans le but de visualiser les veinules et les artérioles afin d’étudier la thrombose et l’inflammation. Les animaux sont maintenus sous anesthésie tout au long de l’expérience et seront euthanasiés à la fin de l'experience .
Impact sur les animaux
Les souris exprimant une forme inactive de l’isoforme de la protéine d'interet ne présentent pas de phénotype apparent (phénotype non dommageable). Les Animaux seront maintenus sous anesthésie durant la totalité de la procédure qui dure maximum 6 heures et seront mis à mort.
Devenir
les procédures utilisées sont invasives, il est nécessaire d'euthanasier les animaux en fin de procédures, les animaux ne pourraient pas survivre.
Remplacement
Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré non modélisable par des approches in vitro et (ii) le test d’inhibiteurs sélectifs pour la protéine d'intérêt que nous souhaitons valider in vivo.
Réduction
Dans un soucis d'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, le nombre d'animaux annoncé a été calculé au plus juste à l'aide d'outils statistiques. Cependant si une différence significative est obtenue entre deux groupes expérimentaux avant la réalisation de la totalité du lot, nous ne réaliserons pas d'experimentations supplémentaires. Dans la mesure du possible, dans les experimentations de thrombose, plusieurs types cellulaire et/ou molécules seront visualisés dans les mêmes animaux. De plus, si aucun résultat significatif n’est obtenu avec les souris exprimant une forme inactive de la protéine d'intêret, les expérimentations avec les molécules inhibitrices de molécule d'intêret ne seront pas réalisées.Pour éviter toute influence de l’expérimentateur sur les résultats les expériences sont réalisées en aveugle (anonymisation des échantillons et des animaux par un autre expérimentateur).
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupes de 5, en présence de coton de nidification, avec boisson et nourriture adlibitum. Une période de 7 jours d’acclimatation sera réalisée pour tous les animaux avant expérimentation. Les animaux sont surveillés tous les jours par du personnel. Le transport entre les deux établissements sur le même campus est effectué de sorte à minimiser les bruits et les vibrations pouvant être perçu par les animaux. Les actes invasifs sont tous réalisés sous anesthésies. Les injections permettant le maintien de l’anesthésie tout au long de l’expérimentation sont minutées et dosés pour assurer un état stable sans réveil des animaux. Cependant un animal venait à avoir un réveil même léger il sera immédiatement anesthésié.
Choix des espèces
Les souris sont hébergées en groupes de 5, en présence de coton de nidification, avec boisson et nourriture adlibitum dans un portoir ventillé dans des cages de 482 cm2 de surface. Une période de 7 jours d’acclimatation sera réalisée pour tous les animaux avant expérimentation. Pour les deux types d’expérimentation (thrombose et inflammation), les souris sont anesthésiées Les expérimentations d’évaluation anti-inflammatoire pouvant se prolonger jusqu’à 6 heures, nous avons fait le choix de traiter les souris avec un analgésique supplémentaire et différents déjà inclus dans le mélange initial d'anesthesie. L'anesthesie est maintenue par un ajout minuté en intraveineux durant toute la procedure.. Nous travaillons sur des animaux adultes de 5 à 25 semaines, nous avons besoin d'un système immunitaire et d'une production de plaquettes matures
Etude du comportement alimentaire chez des souris atteintes de glycogénose de type Ia :EU1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Observer pendant trois jours comment mangent des souris rendues incapables de produire du glucose : 23 souris sont utilisées pour cela, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une biopsie de tissu sert d'abord à les génotyper, puis cinq injections sous-cutanées en cinq jours déclenchent la maladie hépatique, avant un transfert vers un second établissement et trois à quatre jours d'isolement dans des cages qui enregistrent chaque accès à la mangeoire. Le porteur indique que ces souris peuvent développer des hypoglycémies se traduisant par de la prostration, une baisse de la température corporelle et parfois la mort, décès observé chez moins de 2 % des souris de l'élevage. En cas d'hypoglycémie, la souris reçoit une injection de sucre et une partie de sa cage est posée sur une plaque chauffante, et les tumeurs hépatiques que ce modèle développe vers 12 à 15 mois ne constitueront pas un point limite puisque les procédures s'arrêtent à six mois.
Objectifs
La glycogénose de type Ia (GSDIa) est une maladie métabolique rare due à l’absence de production de sucre (glucose) par l’organisme. Cette fonction est essentielle pour maintenir les taux de sucre dans le sang (glycémie) constante en dehors des repas. Contrairement aux diabétiques, les patients atteints de GSDIa développent des hypoglycémies sévères. Une baisse du taux de sucres dans le sang conduit à un mal-être important, qui peut conduire au coma, et à la mort en quelques minutes. Ainsi, les patients doivent manger régulièrement (toutes les 3h environ), y compris la nuit. Ces perturbations du rythme biologique ont un fort impact sur l’ensemble de fonctions physiologiques. Ainsi, la prise de nourriture à un temps inapproprié par rapport au cycle biologique, par exemple durant la période de sommeil, entraine un dérèglement de certaines réactions biologiques, en particulier dans le foie. Des résultats préliminaires obtenus dans un modèle de souris atteintes de GSDIa montrent des dérégulations dans le foie des souris, qui pourraient être entrainées par une modification du rythme biologique. L’objectif de ce projet est d’étudier la prise alimentaire et la structuration des repas de souris atteintes de GSD Ia sur une période de 3 jours, avec un accès continu à la nourriture. Le projet se déroulera dans deux établissements différents, l’un produira les souris et l’autre sera chargé de l’étude du comportement alimentaire.
Bénéfices attendus
L’étude des paramètres des repas (fréquence-quantité) devrait permettre de confirmer que les souris atteintes de GSDIa mangent régulièrement, tout au long de la journée et de la nuit, afin de limiter le développement d’hypoglycémie. Ces données seront utiles pour expliquer les origines des perturbations de l’horloge biologique observées au niveau du foie.
Procédures
Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, une biopsie de tissu sera prélevée pour caractériser leurs gènes. Pour obtenir les souris atteintes de glycogénose de type 1a, les souris transgéniques sélectionnées et leur souris contrôles (souris saines) subiront une injection d’un produit chimique par voie sous-cutanée pendant 5 jours de suite à l’âge de 6-8 semaines dans l’établissement utilisateur EU1 Après transfert par un transporteur agréé dans l’EU2, ces souris seront ensuite isolées pendant 3 jours afin d’étudier leur comportement grâce à des cages détectant quand la souris accède à la mangeoire ou au biberon. L’appareillage permet aussi de déterminer la quantité de nourriture et le volume d’eau ingérés sur 24h. Afin de limiter le stress induit par l’isolement des souris, une période d’acclimatation progressive (isolement d’une demi-journée, puis d’une journée, avec remise avec leurs congénères entre chaque période) à leur nouvel environnement sera programmée sur les 3 jours précédents les enregistrements de prises alimentaires. Les animaux seront ensuite regroupés dans leur cage d’origine en fin de procédure.
Impact sur les animaux
Les souris subiront une série d’injections de 5 injections par voie sous-cutanée qui peuvent entrainer une légère douleur liée à la piqure. Ce projet concerne une pathologie caractérisée par le développement d’hypoglycémies lors de jeûnes courts (entre les repas), et par des atteintes hépatiques menant à long terme au développement de tumeurs du foie. En ciblant la pathologie dans le foie par transgenèse, le modèle de souris atteintes de GSDIa utilisé dans cette étude reproduit toute la pathologie hépatique observée chez l’homme et est viable. Cependant, ces souris peuvent développer des hypoglycémies si elles ne s’alimentent pas régulièrement, car elles ne peuvent pas utiliser leur stock de sucres accumulé dans le foie. Les hypoglycémies entrainent un mal-être, observé par la prostration des animaux, une baisse de la température corporelle, et possiblement le décès de l’animal (qui a été observé dans moins de 2% des souris de l’élevage grâce à une observation renforcée des animaux). Les souris développent aussi des tumeurs hépatiques autour de 12-15 mois ce qui ne constituera pas un point limite dans ce projet puisque les procédures seront limitées à 6 mois. Enfin, les souris seront isolées physiquement afin de mesurer leur prise alimentaire et leur rythme de prise de nourriture. Cet isolement sera limité à 4 jours. Il peut entrainer un stress chez l’animal.
Devenir
A l’issu du projet, l’avis vétérinaire désigné sera demandé pour chaque animal afin d’évaluer la gravité réelle subie au cours du projet. Ces animaux mis en procédure sévère ne pourront pas être utilisés dans un autre projet et seront mis à mort.
Remplacement
L’étude du comportement alimentaire des souris atteintes de GSDIa nécessite de travailler sur les animaux vivants. Ce modèle animal reproduit toute la pathologie hépatique de cette maladie rare, y compris les modifications de l’horloge biologique liées probablement aux adaptations des prises alimentaires des souris régulièrement nuit et jour afin d’éviter le développement d’hypoglycémies.
Réduction
Afin de pouvoir réaliser une analyse statistique, le nombre d’animaux a été limité à 11 souris par groupe (avec une souris supplémentaire pour les souris atteintes de glycogénose en cas de décès d’un congénère), soit au total 23 animaux, sur une période de 2 ans. Ce nombre a été calculé pour obtenir une puissance d’étude élevée et tenir compte de la variabilité inter-individus. Les résultats des 2 groupes de souris étudiés seront comparés par un test statistique.
Raffinement
Afin d’éviter la mort précoce des animaux atteints de GSDIa, la pathologie a été induite uniquement dans le foie et à l’âge adulte ; ceci permet d’éviter les hypoglycémies chez les souris nourries et de passer la période néonatale sans phénotype dommageable (pas de retard de croissance). Pour éviter les réactions inflammatoires liées à l’injection du produit chimique utilisé pour générer les souris transgéniques, les traitements seront réalisés par injections sous-cutanées. La connaissance de ce modèle animal a permis de définir des points limites, en contrôlant les risques d’hypoglycémie et en limitant les efforts des souris pour accéder à la mangeoire (croquettes accessibles directement dans la cage) et au biberon. L’état de bien-être sera évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (état du pelage, mouvements/posture de la souris, morsures...) et du comportement des animaux pour détecter tout mal -être occasionné par une hypoglycémie (fiche de suivi des animaux fournie aux zootechniciens). En cas d’hypoglycémie, la souris sera systématiquement injectée avec une solution de sucre et une partie de sa cage sera placée sur une plaque chauffante afin de maintenir sa température corporelle. Dans ce projet, aucune souris ne sera mise à jeun. A leur arrivée dans le deuxième établissement, les souris seront hébergées pendant une période de 15j au minimum afin de s’acclimater à leur nouvel environnement. L’enrichissement sera conservé tout au long de l’étude. Les souris seront ensuite hébergées progressivement dans les cages d’enregistrement de la prise alimentaire pour les habituer à l’isolement. Un suivi du poids sera effectué quotidiennement lors de l’isolement de l’animal. Pour réduire le stress de l’isolement, les cages sont transparentes et sans couvercle permettant aux souris un contact visuel sonore et olfactif. Des céréales (type Kellogg’s) seront proposées aux souris à la fin de chaque période d’isolement comme récompense. En cas de petites plaies, une crème à base de teintures mères et d’huiles essentielles qui apaise et cicatrise sera systématiquement appliquée par les zootechniciens en charge du suivi du bien-être animal.
Choix des espèces
Souris (Mus musculus) En ce qui concerne la production de sucre par l’organisme, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Les expériences seront donc réalisées avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme et qui reproduisent toute la pathologie hépatique observée chez les patients. Pour cela, un modèle de souris reproduisant la pathologie hépatique de la glycogénose de type Ia a été obtenu par transgenèse en ciblant uniquement la perte de production de sucre par le foie. Ce modèle murin est unique et viable. En effet, l’élevage des deux autres modèles d’animaux atteints de glycogénose de type Ia (souris et chien qui présentent une perte totale de la production de sucre par l’organisme est très complexes car la plupart des animaux meurt avant le sevrage. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 6 semaines et 6 mois.
Identification des antigènes reconnus par les Lymphocytes T gamma delta humains dans la réponse immunitaire contre le cytomégalovirus
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Reçues à six semaines et acclimatées dix jours, 27 souris subissent une injection unique de cellules cibles dans le jarret de la patte arrière, sur animal vigile, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. La seule atteinte décrite est la douleur brève de la piqûre. Trois souris suffisent, indique le porteur, à produire plus de cent millions de cellules productrices d'anticorps, et il revendique la souris comme "indispensable" faute d'alternative reproduisant la réponse immunitaire d'un "organisme entier". Deux semaines après l'injection, les 27 sont tuées pour prélever leurs tissus.
Objectifs
Lorsqu'une personne reçoit une greffe d'organe, elle doit prendre des médicaments qui affaiblissent son système immunitaire pour éviter que le corps rejette le nouvel organe. Cela la rend plus vulnérable à certaines infections graves, comme celle causée par un virus appelé cytomégalovirus. Cette infection peut sérieusement compliquer la greffe et même mettre en danger la vie du patient. Certains globules blancs, appelés lymphocytes T gamma delta, peuvent aider à combattre ce virus. Notre objectif est de trouver des antigènes que ces globules blancs reconnaissent pour voir si on pourrait développer un vaccin contre ce virus. Pour y parvenir, nous devons produire des anticorps (des protéines qui se lient aux antigènes) qui bloquent la reconnaissance des antigènes par les lymphocytes T gamma delta. Pour fabriquer ces anticorps, nous utilisons des souris. Nous les exposons à des cellules que les lymphocytes T gamma delta reconnaissent, puis nous collectons les anticorps produits par les souris au bout de deux semaines pour les tester.
Bénéfices attendus
Une fois que nous avons trouvé les antigènes du virus , nous pourrons essayer de fabriquer un vaccin pour aider le corps à mieux se défendre contre ce virus chez les personnes qui ont eu une greffe d’organe ou celles à risque, comme les femmes enceintes qui n'ont pas encore été exposées au virus.
Procédures
Les souris sont soumises à une vaccination par injection dans le jarret de la patte postérieure gauche de cellules cibles en solution saline. Les injections se font sur animal vigile à raison d'une seule injection par animal.
Impact sur les animaux
La piqure d'aiguille pour l'injection entraîne une douleur légère de courte durée.
Devenir
Les souris sont mises à mort en fin de procédure afin de réaliser des prélèvements tissulaires.
Remplacement
Nous utilisons des souris pour notre projet car elles sont des modèles très bien étudiés en recherche scientifique. Les souris ont un système immunitaire qui ressemble à celui des humains, ce qui permet de mieux comprendre comment notre propre corps pourrait réagir. Pour ce projet, les souris sont indispensables en raison de l'absence d'alternatives pratiques : bien qu'il existe des méthodes alternatives comme les cultures cellulaires ou les simulations informatiques, elles ne reproduisent pas encore la complexité de la réponse immunitaire d’un organisme entier. Elles ne peuvent pas, à ce stade, remplacer la capacité des souris à produire des anticorps complexes et diversifiés. De plus, l’utilisation de souris pour générer des anticorps est une méthode bien établie depuis de nombreuses années, avec des protocoles clairs et reproductibles. Cela nous donne des résultats fiables et comparables avec les recherches existantes. En résumé, nous employons donc des souris car elles offrent une combinaison unique de caractéristiques qui ne peut pas être reproduite par d'autres moyens disponibles actuellement.
Réduction
Le protocole que nous utilisons est très efficace et ne nécessite que trois souris pour obtenir un grand nombre de cellules immunitaires. Avec ces trois souris, nous obtenons plus de 100 millions de cellules productrices d'anticorps, ce qui nous permet de tester environ 10 000 anticorps différents. Parmi ceux-ci, il est probable que nous trouvions un anticorps spécifique qui cible les cellules que nous étudions. Même si le processus pour identifier les antigènes du virus est long et compliqué, nous n'avons besoin que de neuf souris par an au maximum pour nos expériences.
Raffinement
Les animaux sont hébergés à l'animalerie dans des conditions veillant au respect du bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. Les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise les méthodes de préhensions douces. Les expérimentateurs sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal.
Choix des espèces
Pour obtenir les anticorps monoclonaux bloquants, il faut passer par une étape d'immunisation d'animaux suffisamment éloignés de l'homme pour générer une réponse immunitaire forte. La souris est l'espèce de choix depuis la publication du protocole de production anticorps monoclonaux en 1975. Les souris sont commandées à l'age de 6 semaines d'un poids supérieur à 20g et elles sont acclimatées à l'animalerie pendant 10j avant le début du protocole. Les animaux jeunes ont une meilleure réponse immunitaire.
Rôle des macrophages dans l’homéostasie du pancréas et au cours du diabète de type 2
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Deux cent soixante-quatre souris échapperont à la mise à mort pour être replacées dans un autre projet, faute de porter la modification génétique voulue, les 576 autres seront tuées, reproductrices comprises. 840 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 324 d'entre elles et modéré pour 516. Tatouées et amputées d'un fragment de queue vers sept jours, elles reçoivent un traitement oral, et une partie subit la destruction des cellules immunitaires de ses pattes arrière suivie d'une greffe qui la laisse quinze jours avec un système immunitaire incomplet, quand d'autres passent douze semaines sous régime gras avec des tests de tolérance au glucose faits à partir d'une incision de la queue. Le porteur calcule ses effectifs sur des groupes de cinq à huit souris, sans expliquer comment il parvient à 840.
Objectifs
Ce projet vise à étudier le rôle des macrophages pancréatiques dans l’homéostasie du pancréas et durant le diabète de type 2. Les macrophages sont des cellules immunitaires innées présentes dans tous les tissus, jouant un rôle crucial dans la défense contre les infections, la résolution de l'inflammation et la régulation de la réponse immunitaire. Ces cellules peuvent être trouvées dans tous les tissus et organes, où elles remplissent des fonctions spécifiques adaptées à leur environnement local. Dans le contexte du pancréas, les macrophages pancréatiques peuvent jouer un rôle crucial dans la régulation de l'inflammation, de la réponse immunitaire et de la fonction des cellules bêta productrices d'insuline. Le diabète de type 2 est une maladie métabolique chronique caractérisée par une résistance à l'insuline et une production insuffisante d'insuline par le pancréas entrainant une hyperglycémie chronique. La survie des macrophages dans les tissus dépend de la présence de Csf1, ou facteur de stimulation des colonies 1, une protéine qui permet aux macrophages de survivre, se développer et fonctionner correctement. Le Csf1 est produit par les cellules du micro-environnement des macrophages. Des résultats préliminaires obtenus dans un projet précédent suggèrent une dépendance de certains macrophages pancréatiques à l'égard du Csf1 produit par les fibroblastes, des cellules de soutien du tissu. Comprendre la fonction des macrophages et leur interaction avec d'autres cellules pancréatiques est essentiel pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant le diabète de type 2. Notre projet a 3 objectifs principaux : 1/ Étudier l’impact de la délétion fibroblastique de Csf1 sur les macrophages pancréatiques 2/ Etudier le renouvellement des macrophages au sein du pancréas 3/ Déterminer si les macrophages pancréatiques jouent -un rôle clé au cours de l’évolution du diabète de type 2.
Bénéfices attendus
Le pancréas, un organe vital du système digestif et endocrinien, joue un rôle crucial dans la régulation du métabolisme glucidique et la production d'insuline. Son dysfonctionnement est intimement lié à des pathologies telles que le diabète de type 2, une maladie métabolique chronique en constante augmentation dans le monde. Comprendre les mécanismes sous-jacents impliqués dans le développement du diabète de type 2 est essentiel pour améliorer sa prise en charge. Ce projet présente plusieurs bénéfices potentiels. Tout d'abord, en examinant l'impact de la délétion de Csf1 dans les fibroblastes sur les macrophages pancréatiques et la physiologie du pancréas, nous pourrions identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour moduler la réponse immunitaire dans le pancréas et potentiellement prévenir ou traiter le diabète de type 2. De plus, en étudiant comment les cellules immunitaires appelées macrophages sont recrutées dans le pancréas à l’état physiologique, nous pourrions mieux comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans le maintien de l'équilibre immunitaire dans cet organe crucial. En comprenant le rôle des macrophages pancréatiques dans la tolérance au glucose et l'insulinémie à l'état physiologique, nous pourrions développer des approches plus précises pour réguler la glycémie et améliorer la sensibilité à l'insuline. Enfin, en déterminant si les macrophages pancréatiques jouent un rôle crucial dans l'évolution du diabète de type 2, nous pourrions ouvrir de nouvelles perspectives pour la prévention et le traitement de cette maladie complexe. En somme, ce projet offre un potentiel significatif pour une meilleure compréhension du diabète de type 2 et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Procédure 1 : En générant les lignées d’intérêt pour cette étude nous obtiendrons des accouplements avec une descendance que nous aurons besoin d’identifier afin d’obtenir les souris avec la modification génétique voulue. Pour ce faire les souris seront tatouées et un morceau de queue sera prélevé 7 à 10 jours après leur naissance. Procédure 2 : Les souris seront traitées avec une molécule permettant à notre modèle murin de fonctionner, par voie orale 2 fois à intervalle de 1 semaine puis mises à mort après un mois. Procédure 3 : Les souris seront traitées avec la molécule permettant au modèle de fonctionner, par voie orale 2 fois à intervalle de 1 semaine. Un mois après, pour laisser le temps aux effets d’avoir lieu, les cellules immunitaires des pattes arrière seront éliminées. Cette procédure se fera sous anesthésie afin de pouvoir toucher uniquement la zone souhaitée (pattes arrière). Par la suite, les animaux seront injectés de nouvelles cellules immunitaires d’une souris d’intérêt pour reconstituer les cellules précédemment éliminées. Enfin 2 mois après la reconstitution nous suivrons le renouvellement des macrophages provenant des cellules immunitaires nouvellement injectées. Un prélèvement sanguin sera réalisé sur ces mêmes souris par voie rétro-orbitale 1 fois avant la mise à mort. Procédure 4 : Les souris seront traitées avec la molécule permettant à notre modèle murin de fonctionner, par voie orale 2 fois à intervalle de 1 semaine. 1 mois après, les souris seront mises soit sous régime riche en graisses soit sous régime standard (contrôle) et ce pendant 12 semaines. Aux semaines 4 et 8 (deux groupes de souris différents), un test de tolérance au glucose sera réalisé, pour cela, les souris seront mises à jeun 6h puis gavées avec une solution de glucose et la concentration de glucose sera suivie par prélèvement de sang au bout de la queue pendant 2h. Avant la mise à mort, les souris seront mises à jeun sur la nuit pour déterminer la glycémie et le taux d’insuline par prélèvement de sang au bout de la queue.
Impact sur les animaux
- Une biopsie de la queue sera réalisée sur les animaux entre 7 et 10 jours après leur naissance. À cet âge, la perception de la douleur dans la queue par la souris est encore considérée comme faible, voire nulle, car le réseau neuronal de cette partie est encore sous-développé (nuisances légères). - L'administration d’une molécule permettant à notre modèle de fonctionner par voie orale peut entrainer un léger inconfort et du stress pour la souris pendant l'administration qui dure environ 10 secondes (nuisances légères). - Les animaux subiront une délétion des cellules immunitaire au niveau des pattes arrière ainsi qu'une injection intraveineuse pour réintroduire des cellules immunitaires au niveau des pattes arrière. Pendant toute la durée de la délétion ainsi que l'injection de cellules immunitaires, les animaux seront maintenus sous anesthésie (environ 15min au total) et ne ressentiront donc aucune douleur. L'anesthésie des animaux engendrera un stress à court terme des animaux, de plus, après la délétion des cellules immunitaire au niveau des pattes arrière, les animaux se retrouvent avec un système immunitaire incomplet pendant 15 jours augmentant ainsi le risque d'infection durant cette période. Les animaux seront ainsi plus vulnérables. Enfin l'injection intraveineuse, bien que faite sous anesthésie, entrainera une légère lésion pouvant entrainer un inconfort à court terme de la souris. L'ensemble de ces actes entraineront donc des nuisances considérées comme modérées. - Une petite incision de la queue sera réalisé avant le test de tolérance au glucose et le sang sera prélevé par cette unique incision tout au long du test (nuisances modérées). L’administration de glucose par voie orale peut entrainer un léger inconfort et du stress pour la souris pendant l'administration qui dure environ 10 secondes (nuisances légères). - Les souris seront soumises à un régime riche en graisses pendant 12 semaines engendrant ainsi des maladies métaboliques (nuisances modérées).
Devenir
Tous les animaux reproducteurs seront mis à mort à l’issue de la période d’accouplement. A l'issue de la procédure 1, les animaux avec la modification génétique voulue seront utilisés dans les procédures 2, 3 et 4 et mis à mort afin de prélever les organes. Les animaux avec une modification génétique non voulue pourront être replacés dans un autre projet.
Remplacement
La complexité des interactions entre les cellules stromales des organes, tel que le pancréas, et les macrophages ne peut être étudiée efficacement à l'aide de modèles in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des modèles animaux pour ce projet. En effet, comprendre comment l'absence des macrophages peut affecter la fonction du pancréas à l'état physiologique mais aussi au cours du diabète de type 2 met en jeu de nombreux types cellulaires présents dans ce microenvironnement. L'utilisation d'un modèle in vitro ne permet pas de refléter la complexité et la dynamique de cet environnement, qui joue un rôle crucial dans la fonction des macrophages pancréatiques.
Réduction
De manière générale, nous utiliserons le minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs pour nos expérimentations. Le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été calculé sur http://Biomath.info/power/ttest.htm en prenant en compte des facteurs tels que la puissance statistique (Probabilité d’obtenir un résultat significatif même avec une faible différence = 80%), le niveau de risque acceptable (probabilité de se tromper et de conclure à une différence significative alors qu'il n'y en a pas = 5%) et l'écart de moyennes attendu entre les groupes expérimentaux et contrôles (différence attendue entre les groupes = 40%). Une taille de groupe égale à 5 devrait permettre de produire des résultats statistiquement exploitables. La taille du groupe sera élevée à 8 souris dans le cas des transplantations de moelle osseuse, cette expérience entrainant des variabilités plus élevées entre les échantillons. Dans le cadre de cette étude, pour les souris génétiquement modifiées (mutants conditionnels pour le facteur Csf1 et leurs contrôles), les accouplements seront faits pour permettre que tous les animaux générés dans les élevages soient utilisés pour les expériences.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des environnements enrichis afin de satisfaire leur instinct grégaire, de favoriser les comportements naturels et limiter l’agressivité. Les conditions d'hébergement des souris respectent la directive 2010/63/UE : - Les cages utilisées permettent l'hébergement de 5 souris adultes d'un poids supérieur ou égal à 30 g (souris âgées de plus de 6 semaines). Dans chaque cage du coton pour confectionner des nids et des igloos seront introduits. Enfin, le statut EOPS de notre animalerie permet de minimaliser les variabilités dues au stress ou à des infections. Par ailleurs, la mise en place de points limites précoces, prédictifs et adaptés à chaque procédure, basés sur une observation quotidienne des animaux, de l’évolution de leur poids, de leur apparence et de leur comportement au cours de chaque procédure permettra de prendre les mesures adéquates pour limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux.
Choix des espèces
L'espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés, et leur utilisation dans ce projet est cruciale pour répondre aux questions scientifiques posées. Les souris seront utilisées à l’âge adulte à partir de 6 semaines car nous nous intéressons aux fonctions des macrophages pancréatiques à l’âge adulte.
Effet de l’irradiation sur la neurocognition chez l’enfant.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 440 d'entre elles et modéré pour 288. Le cerveau de 160 d'entre elles est irradié sous anesthésie à l'âge de 21 jours, 240 passent six tests comportementaux, 80 subissent deux heures d'imagerie par résonance magnétique, et toutes finissent par une chirurgie terminale destinée à prélever leur cerveau. La question posée est de savoir si le vieillissement prématuré des cellules cérébrales explique les séquelles cognitives des enfants irradiés pour une tumeur du cerveau. Le porteur retient la souris parce que sa neuro-anatomie lui paraît comparable à celle de l'être humain, et parce que le caractère social de l'espèce permet de mesurer un déficit d'interactions après irradiation.
Objectifs
Les tumeurs cérébrales sont les tumeurs solides les plus fréquentes chez les enfants, qui sont traitées généralement par radiothérapie, souvent précédée d'une chirurgie et d'une chimiothérapie. Le taux de survie à cinq ans varie de 70 à 99 %, selon le type de tumeur. Les effets tardifs à long terme chez les enfants traités pour des tumeurs cérébrales sont préoccupants. Ces patients souffrent de graves handicaps physiques, fonctionnels et psychosociaux, notamment de la fatigue et des altérations de certaines fonctions cognitives spécifiques telles que des troubles de l'attention, de la mémoire de travail et de la vitesse de traitement de l’information. De nombreuses études, ont montré que l'exposition aux rayonnements ionisants induit la sénescence (processus de vieillissement prématuré) des cellules du cerveau. L'impact de la sénescence cellulaire sur les lésions cérébrales et les déficits cognitifs après la radiothérapie chez les enfants ayant survécu à des tumeurs cérébrales n'a jamais été étudié. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons la sénescence cellulaire dans le cerveau de jeunes souris irradiées, les déficits cognitifs induits par l’irradiation à l’aide de tests comportementaux et les lésions cérébrales, en utilisant des méthodes d’évaluation cognitives spécifiques telles que l’histologie (analyse des tissus) des cerveaux irradiés et l’imagerie par résonance magnétique. L’utilisation d’un modèle génétique permettant de bloquer ce processus de vieillissement prématuré sera utilisé pour étudier l’implication de la sénescence cellulaire dans les séquelles cérébrales induites par radiothérapie (RT) afin de les traiter. L’utilisation de molécules qui agissent sur les cellules sénescentes constitue une voie thérapeutique prometteuse et innovante dans la prévention et le traitement des tumeurs cérébrales. Ce projet sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs différents.
Bénéfices attendus
Le projet permettra une meilleure compréhension de l'implication de la sénescence et du dysfonctionnement cellulaire dans la propagation des lésions cérébrales induites par la radiothérapie. L’équipe projet espère proposer une nouvelle approche thérapeutique pour limiter l'apparition de séquelles cérébrales hautement délétères lors de la radiothérapie chez l'enfant.
Procédures
Etablissement Ulitisateur (EU1) élevage et irradiation : Le génotypage par biopsie sera effectuée sur l’animal vigile (durée de 2 minutes, sur 360 souris). L’irradiation sera effectuée sous anesthésie (durée de 5 minutes par animal, sur 160 souris). Les injections seront réalisées sur des animaux vigiles (durée de 1 minute par animal, sur 160 souris). Chaque souris effectuera 6 tests de comportement différents (durée d’un test estimé à 5 à 15 minutes par animal, sur 240 souris) afin d’évaluer leur comportement social, leurs capacités motrices ainsi que leur mémoire. EU 2 imagerie: L’imagerie par résonance magnétique sera réalisée une seule fois par animal, sous anesthésie (durée de 120 minutes par animal, nombre de souris 80). EU1 mise à mort des souris: elle sera effectuée par chirurgie terminale sous anesthésie pour permettre le prélèvement du cerveau.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sont : - des problèmes d’anesthésie entrainant la perte d’un animal, de l’hypothermie, des douleurs liées aux injections, des douleurs et des saignements liées au prélèvement pour le génotypage ; - un déficit mental et/ou social associé à un dysfonctionnement cognitif. Il est attendu que l’anxiété soit un peu augmentée et génère de l’agressivité ; - une perte de poids liée à un problème d’alimentation.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour permettre d’effectuer des analyses histologiques (analyses de tissus) ou moléculaires.
Remplacement
L’étude de l’impact de l’irradiation sur la sénescence au cours du développement nécessite d’irradier le cerveau de souriceaux et d’étudier les conséquences sur le cerveau à l’âge adulte au niveau histologique, imagerie par résonance magnétique et tests comportementaux. Il n’existe pas d’alternative non animale permettant étudier l’effet de l’irradiation sur la sénescence sur le cerveau de souris au cours du développement (équivalent de l’adolescence chez l’homme) et d’évaluer les altérations cognitives à l’âge adulte.
Réduction
Compte tenu de la variabilité des réponses des souris au sein d’un même groupe dans les tests de comportement, nos expériences précédentes (et celles d’autres laboratoires) montrent qu’un nombre de dix animaux par lot est un minimum requis pour assurer des résultats statistiquement significatifs. Cependant, nous prévoyons d’utiliser 15 souris par groupe afin d’assurer le nombre minimum d’animaux pour les analyses de comportement et réaliser des expériences complémentaires en : imagerie par résonance magnétique, histologie 2-3D et séquençage, de façon à corréler l’ensemble des résultats obtenus. Nous utiliserons également 5 souris par groupe pour des analyses en cytométrie en flux (méthode de tri des cellules en fonction de certaines propriétés).
Raffinement
Les animaux reçoivent un dispositif de nidification périssable chaque semaine au moment du change des cages. Les souris sont irradiées sous anesthésie générale afin de limiter le stress lié au confinement de l’animal dans l’irradiateur. Pour limiter la baisse de la température corporelle sous anesthésie, les animaux seront placés sur une couverture chauffante ou dans une cage elle-même placée sur une plaque chauffante jusqu’au réveil de l’animal. Les animaux sont suivis pendant les 24h suivant l’anesthésie (irradiation, IRM). Avant les phases de tests de comportement, une phase d’adaptation des souris est effectuée pendant deux semaines. Pendant cette phase d’adaptation, les animaux sont familiarisés à la manipulation quotidiennement par l’expérimentateur dans la pièce où se dérouleront les tests. Les animaux sont transportés entre les deux EU concernés par un transporteur agrée. Afin de préserver le bien-être des souris pendant le transport, celles-ci sont placées dans des boîtes de transport jetables contenant de la litière, du coton, de l’eau gélifiée, des croquettes ainsi qu’un enrichissement de type tunnel. La taille des boîtes est adaptée au nombre d’animaux et permet de conserver leur répartition initiale par cage.
Choix des espèces
Nous avons décidé de travailler chez la souris pour deux raisons majeures : 1) La souris est une espèce couramment utilisée en recherche fondamentale, qui possède une structure neuro-anatomique comparable à celle du cerveau humain tout au moins pour notre approche, et qui permettra donc d’extrapoler les résultats. Les souris seront étudiées à l’âge de 21 jours, au moment du sevrage et de la première vague de spermatogenèse, avant la maturité sexuelle qui a lieu à 50 jours environ. Cet âge chez la souris correspond à la préadolescence chez l’homme qui marque une transition entre l’enfance et le début de la puberté. 2) La souris est une espèce sociale, qui présente notamment des niveaux élevés d’interactions sociales réciproques. Ceci permet d’utiliser des tests de comportement et de mettre en évidence un déficit social dans le modèle de souris transgénique qui permet de mettre en évidence facilement la sénescence.
Etude de la formation de la myéline et de son rôle dans la physiologie et le comportement chez un modèle murin génétiquement modifié.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un fragment de queue est prélevé sur chaque souriceau vers sept à dix jours, une partie des souris est ensuite opérée du crâne pendant trente à soixante minutes puis hébergée seule jusqu'à dix jours, certaines dès l'âge de quatorze jours avec le risque d'être rejetées par leur mère au retour dans la portée. 950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 730 d'entre elles, modéré pour 60 et sévère pour 160. Sont tuées aussi les reproductrices renouvelées et les souris nées sans la mutation recherchée. Le projet porte sur le rôle d'une protéine dans la formation de la myéline, protéine que le résumé désigne d'un bout à l'autre comme la "protéine A" sans jamais la nommer.
Objectifs
Dans le cerveau, l’information électrique est transportée le long des axones des neurones. Pour assurer sa bonne propagation, l’établissement de gaines isolantes est essentiel : ce sont les gaines de myéline qui ont une double fonction : assurer la survie et la fonction des neurones. La formation de gaines de myéline, appelée myélinisation, est effectué par des cellules appelées, les oligodendrocytes. La perte de la myéline dans le cerveau et l'échec de sa régénération contribuent à de graves troubles neurologiques, moteurs et cognitifs, qui sont les principales caractéristiques de plusieurs maladies de la myéline, dont la sclérose en plaques (SEP). La synthèse continue de la myéline au cours du développement et chez l’adulte est essentielle au maintien de plusieurs comportements dont l’apprentissage et les interactions sociales. Ainsi la compréhension des mécanismes moléculaires de sa formation est très importante. Nous avons récemment identifié une protéine A comme une protéine essentielle à la formation de cette myéline in vitro. Cette protéine est connue pour être liée à une pathologie humaine dont les patients présentent des défauts de substance blanche à l’imagerie, ainsi qu’une plus grande susceptibilité au développement de SEP que la population générale. L’objectif de ce projet est d’étudier précisément chez le modèle animal le rôle de la protéine A dans la myélinisation in vivo. La myéline étant une structure adaptative, l’identification de cibles moléculaires permettant d’actionner cette dynamique au cours du développement représente un espoir thérapeutique très important dans plusieurs pathologies de la myéline.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra d’apporter de nouveaux éléments à la compréhension des mécanismes impliqués dans la myélinisation du système nerveux central (SNC). Les résultats de ce projet pourraient contribuer à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de stimuler la formation de la myéline au cours du développement. Nous pensons que les bénéfices de cette étude pourraient permettre une meilleure compréhension des circuits neuronaux, notamment dans le cadre de pathologies impliquants la myéline. A plus long terme, une meilleure compréhension des mécanismes de la myélinisation du SNC pourrait permettre la mise en avant de nouvelles pistes thérapeutiques pour diverses maladies de la myéline.
Procédures
L’ensemble des animaux de cette étude seront prélevés d’un fragment de l’extrémité de la queue (prélèvement unique, moins d’une minute par animal) à l’âge de 7 à 10 jours afin de connaitre leur patrimoine génétique. Un groupe de souris sera étudié dans trois tests comportementaux non-invasifs pour évaluer les capacités sociales, motrices et mémorielles des soucis à raison de 1test tous les 10jours (étude sur 30jours, test sur 4-5jours maximum en prenant en compte le jour d’évaluation et les jours d’habituations et d’entrainement précédents, suivis par 6- 5jours de repos), effectués du moins au plus stressant. Les tests (test de sociabilisation, test coordination motrice, test de mémoire) seront effectués le matin, avec une habituation de l’animal à la salle d’expérimentation pendant à minima 30min. Les tests seront effectués par une personne qualifiée. La durée maximale par test n’excédera pas 1h30 (temps d’habituation à la salle et test compris) et les tests ne seront réalisés qu’une seule fois chacun. Enfin, une partie des souris seront opérées sous anesthésie locale et générale (durée opération 30 à 60min par souris), et analgésie avant et après l’opération. Les animaux devront être hébergés de façon individuelle après la chirurgie afin de ne pas abîmer le matériel implanté et permettre le bon enregistrement des données. L’hébergement individuel des souris sera réduit au temps minimal nécessaire (10 jours maximum) et leur cage sera enrichie en coton et en kraft afin de limiter le stress. L’ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure par une technique réglementaire. Les animaux vigiles seront connectés à un système d’enregistrement (connexion simple et indolore) pour enregistrer l’activité électrique du cerveau en continu pendant 72h, une seule fois.
Impact sur les animaux
Les animaux ressentiront un stress lors des manipulations et contentions nécessaires pour différentes étapes du projet. Ils pourront ressentir une légère et brève douleur lors du prélèvement du bout de la queue pour connaitre leur patrimoine génétique, et un risque de saignement. La protéine que nous étudions est un gène suppresseur de tumeur, il est donc possible mais très peu probable que ces souris développent des tumeurs. En effet très peu probable car les patients ne développent pas de tumeur dans les oligodendrocytes (or notre modèle animal possède une perte partielle de la protéine dans les oligodendrocytes) et que des études précédentes utilisant le même type de modèle animal que nous ont montré le très faible développement de tumeur dans les cellules habituellement sujettes au développement tumoral chez les patients. Le risque zéro n’existe pas, mais il est extrêmement peu probable que notre étude produise des tumeurs chez les souris. L’anesthésie réalisée pour la chirurgie impliquera pour l’animal un risque d’hypothermie, de sécheresse oculaire et un risque rare de dépression cardio-respiratoire. La chirurgie impliquera quant à elle une douleur et un inconfort post-opératoire ainsi que des risques de complications inattendues telles que saignement ou infection. Les souris étant des animaux grégaires, l’hébergement individuel nécessaire pour les enregistrements électrophysiologiques pourra être source de stress. Pour les souris qui seront opérées jeunes, un risque de rejet par sa mère lors de leur retour dans la portée en post-chirurgie est possible. Les tests comportementaux peuvent également représenter un stress pour les animaux lié au changement d’environnement et aux manipulations. Un risque d’hypothermie est également possible dans le test impliquant un placement des animaux dans l’eau.
Devenir
A l’issue de ce projet, l’ensemble des animaux sera euthanasié : - pour prélever leur cerveau en post-mortem, afin d’analyser de près la structure de la myéline et des neurones - à l’issue des tests comportementaux ou après la chirurgie puisque nous aurons d’ores et déjà obtenu le maximum de renseignements possibles sur ces animaux - les animaux reproducteurs renouvelés pour maintenir des capacités reproductives optimales - les animaux produits mais non porteurs de la mutation d’intérêt.
Remplacement
Le neurone, cellule nerveuse, comporte une partie très allongées appelée axone. Autour d’elle s’organise une structure particulière nommée myéline. Cette myéline est une structure en trois dimensions : une extension des membranes dites oligodendrocytaires qui s’enroule autour d’un axone électriquement actif. Suivant le principe de remplacement, nous étudierons en détail cette structure sur les cellules à l’origine de ces membranes, appelées oligodendrocytes, mis en culture (donc hors de l’animal) puisque même sans axone, ces cellules forment de la myéline. Or, il est essentiel dans le cadre de cette étude, de passer par une étude chez l’animal présentant une mutation jouant un rôle clé dans la formation de la myéline afin de pouvoir : (1) observer la formation de la myéline impactée par toutes les interactions cellulaires présentes dans le cerveau et surtout l'activité électrique des neurones, (2) étudier l'impact de la mutation sur le comportement de la souris.
Réduction
Afin d’appliquer le principe de réduction, nous fondons une grande partie de notre étude sur des expériences de cellules en culture. De plus, nous optimiserons l’utilisation de nos animaux. Le nombre d’animaux utilisés (950) sera limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables (taille des effectifs nécessaire établi grâce à un calcul de puissance permettant une interprétation fiable des résultats, étude faite en collaboration avec les statisticiens). Une marge de production est incluse dans ce nombre d’animaux mais nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux strictement nécessaire pour nos lots expérimentaux, nous utiliserons donc potentiellement moins d’animaux que prévu ici. Toutes les expériences mentionnées seront réalisées sur des mâles et des femelles afin d'évaluer la présence éventuelle d'un sex-ratio. Toutes les quantifications se feront en aveugle, c’est-à-dire sans connaitre au préalable le génotype de la souris analysée pour limiter le biais lié à l’observateur, donc la variabilité et ainsi le nombre de souris nécessaire.
Raffinement
L’animalerie est agréée, ainsi les conditions d’hébergement (température,hygrométrie,éclairage et espace selon les recommandations) et les conditions d’enrichissement de l’environnement (bâtonnet à ronger, neslet), d’alimentation et les soins (quand nécessaires) seront contrôlés quotidiennement. L’hébergement individuel des animaux sera automatiquement suivi d’une supplémentation d’enrichissement (kraft). Une période d’acclimatation de 7 jours pour les animaux provenant de l’extérieur sera effectuée avant toute procédure. Les animaux seront observés quotidiennement par la zootechnie et surveillés régulièrement et de manière adaptée aux différentes procédures par notre équipe. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera réalisé au calme dans une pièce dédiée, avec du matériel désinfecté et suivi d’une surveillance pour vérifier la bonne prise en charge des petits par leur mère. Sa taille sera limitée au strict minimum et il sera fait sur de jeunes animaux pour lesquels l’extrémité de la queue est peu sensible et cicatrise vite. Pour les tests comportementaux, une période d’habituation propre à chaque test sera réalisée avant chacun des tests et une période de repos sera assurée entre chaque test. Pour chaque test comportemental, un suivi adapté de la souris sera assuré pour limiter son stress et favoriser son bien- être. La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec un maintien et un suivi de la température des animaux. Un suivi renforcé sur 7 jours sera mis en place pour s’assurer de la bonne récupération des animaux. Un suivi spécifique sera mis en place pour les animaux opérés à 14 jours d’âge. Afin d’évaluer les impacts phénotypiques des mutations étudiées, nous tiendrons un registre de suivi du bien-être des animaux : observation 2 fois parsemaine par notre équipe de la naissance à la mort des animaux à l’aide d’une grille d’évaluation (en fonction des critères, l’observation et le suivi de l’animal pourra devenir quotidienne). Des points limites sont mis en place et respectés pour éviter toute souffrance, avec décision et prise en charge rapide des animaux.
Choix des espèces
La formation de myéline est propre au développement des animaux vertébrés. Ainsi son étude nécessite l’utilisation de modèles animaux vertébrés. De plus, puisque nous étudions une voie moléculaire en particulier, celle de la ‘protéine A’, l’établissement de la myélinisation avec une visée thérapeutique future, il est indispensable que le modèle que nous choisissions ait une forte homologie de séquence génétique de cette protéine A avec l’Homme. Le modèle souris présente plusieurs avantages pour notre étude : c’est un vertébré dont les gènes codant la protéine A présentent une forte homologie de séquence avec ceux de l’Homme. Nous étudierons les animaux à différents âges depuis la naissance. Nous réaliserons un prélèvement pour connaitre leur patrimoine génétique à l’âge de 7 à 10 jours. Une étude à différents âges au cours du développement post-natal permettra de suivre l’évolution de la myélinisation (à 14, 21, 30, 60, 120 et 180 jours). En parallèle, nous étudierons aux mêmes âges comment est affecté le fonctionnement du cerveau en enregistrant les ondes produites (étude dite électrophysiologique). Enfin, nous étudierons le comportement des souris chez le jeune adulte (entre 60 et 90 jours).
Production et caractérisation de souris transgéniques FMC1 KO (1/3)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
Une perte de 25 % du poids, ou un score de douleur de huit à neuf sur la grille du laboratoire, déclenche la mise à mort. 313 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements terminaux de sang et d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation qui reproduit un syndrome mitochondrial rare, elles sont suivies de la naissance jusqu'à deux ans, avec prélèvements sanguins et urinaires à un, deux, quatre et six mois, tests de force et d'endurance et séances d'IRM et d'échocardiographie sous anesthésie aux mêmes âges. Le porteur attend un déficit de poids d'environ 20 %, un défaut cardiaque et un défaut musculaire, et présente ce travail comme l'étape préalable au test de candidats médicaments déjà repérés sur des cellules de patients.
Objectifs
Le syndrome NARP (Neuropathie Ataxie Rétinite Pigmentaire) est une pathologie rare qui affecte majoritairement les fonctions cardiaques, musculaires, et neurologiques et pour laquelle il n'y a toujours pas de traitement. Au laboratoire nous avons identifié des candidats médicaments efficaces sur les cellules de patients atteints du syndrome NARP. Afin de pouvoir proposer le traitement à des patients il nous faut prouver leur efficité dans un animal entier (ici le modèle murin). Avant, il est nécessaire d'identifier des déficits clairs dans le modèle souris du syndrome de Barth. Ce projet vise donc à caractériser finement le modèle souris du Syndrome NARP d'un point de vue cardiaque, musculaire, comportementale etc.... Ceci permettra ensuite de tester si les candidats médicaments efficaces en cellules de patients sont capables de diminuer les défauts mis en évidence dans l'étape de caractérisation du modèle murin. Si tel est le cas, on aura la preuve de leur efficacité dans un animal entier. L'objectif ultime étant de proposer les candidats médicaments efficaces dans les cellules de patients et le modèle murin du syndrome NARP à des patients atteints du syndrome NARP.
Bénéfices attendus
Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome NARP, dans nos animaleries afin d'identifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. Seront analysés, le comportement, le poids, la fertilité, les portées, les avortements spontanés, la mortalité périnatale, l'acidose, la force musculaire, l'endurance, la coordination, les fonctions cardiaques, les fonctions mitochondriales sur tissus et des dosages sanguins et urinaires.
Procédures
Prélèvements sanguins et urinaires aux âges de 1 mois, 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excédera pas 10 minutes. Tests comportementaux (force musculaire, motricité, équilibre et endurance) aux âges de 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes. IRMs et echocardiographies aux âges de 2, 4 et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 30 minutes et les souris subiront des anesthésies.
Impact sur les animaux
Des nuisances liées aux souris présentant un phénotype dommageable peuvent être attendues. Comme d'autres modèles murins similaires (avec des déficits mitochondriaux) nous pouvons attendre, à l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents, un défaut cardiaque et un défaut musculaire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse par IRM et échocardographie nécesite une anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données IRM ou échocardiographiques. Le suivi des performances sur tapis de course, rotarod ou grip test teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de caractériser à différents niveaux le modèle murin.
Remplacement
Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome NARP, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également avant de procéder aux essais cliniques chez l'homme.
Réduction
Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 20-25 pourcents d’animaux en plus, soit 10 souris par groupe.
Raffinement
Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 1 fois par semaine. Si l'animal perd entre 10 et 15 pourcents par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 25 pourcents l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Nous raffinons nos expérimentations en utilisant les animaux de chaque groupe pour recueillir plusieurs types de données. Sur chaque animal, l’ensemble des organes et tissus pouvant être recueillis sont prélevés afin d’anticiper les expérimentations futures. Pour toutes les procédures, les animaux seront observés quotidiennement, et les points limites seront évalués en détail: Plaie/Traumatisme, Comportement/Mouvement, Aspect général, Evolution pondérale. Un score sera attribué, qui déterminera les traitements/observations à suivre: Score 0-2 = aucune douleur => pas de traitement. Score 3-5 = Observation plus importante et gel diet et croquettes humides au fond de la cage. Score 6-7=douleur légère à modérée=>Nettoyer d'éventuelles plaies et injection en sous cutanée d'un anti douleur et euthanasie si pas d'amélioration sous 24H. Score 8-9 = euthanasie de l'animal pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. Les animaux seront transférés dans différentes animaleries selon les analyses. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquate et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des cages de transport adaptées contenant copeaux, cotons et nourritures. Les souris contrôles seront toujours séparées des souris modèle de la maladie. Les transferts seront effectués une semaine avant les analyses pour laisser un temps d'acclimatation dans la nouvelle animalerie.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - les symptômes de la maladie retrouvés dans le modèle murin sont équivalents à ceux retrouvés chez l'homme suggérant qu'un candidat médicament efficace dans le modèle murin le sera également chez l'homme Les animaux seront suivis de leur naissance (mortalités, suivi des portées, génotypage, avortements spontanés) à l'âge de 2 ans. Les animaux seront caractérisés dès l'âge de 10 jours pour un suivi de poids hebdomadaire, aux âges de 2, 4 et 6 mois pour des tests d'endurance, de force musculaire, de coordination et de fonction cardiaque et aux âges de 1, 2 ,4 et 6 mois pour des dosages sanguins et urinaires, et des prélèvements d'organes.
Caractérisation de différents déterminants moléculaires sur la survenue de l’Insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée (ICFEP)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Cathétérisées au ventricule gauche après une échocardiographie sous anesthésie, 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les deux interventions durent quinze et trente minutes par animal, sur des souris transgéniques privées de certaines protéines dans un organe précis. Le projet cherche pourquoi la relaxation du cœur se dégrade davantage chez les femmes après la ménopause, en explorant un axe entre le foie et le cœur. Le porteur justifie la mise à mort par le "bien être à long terme de la souris", au motif que la chirurgie qu'il vient de pratiquer risque de provoquer des complications.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont responsables de 4 millions de décès par an en Europe et représentent la principale cause de décès. Cependant, l'incidence des MCV varie considérablement en fonction du sexe, du statut hormonal et du statut métabolique. En effet, avant la ménopause, les femmes semblent être protégées des MCV par rapport aux hommes du même âge, mais leur incidence et leur gravité rejoignent ensuite celles des hommes après la ménopause, suggérant ainsi un rôle protecteur des œstrogènes. Parmi les MCV, l'insuffisance cardiaque (IC) avec fraction d'éjection préservée (ICFEP), caractérisée par une dysfonction diastolique (relaxation cardiaque) et une function systolique normale ( contraction cardiaque) est désormais considérée comme la forme prédominante d’IC (>50%). L’ICFEP présente un dimorphisme cardiaque puisque les femmes âgées sont davantage touchées par rapport aux hommes. Aujourd’hui, le diagnostic précoce de la maladie est difficile et, contrairement à l’ICFER (IC à fraction d’éjection réduite), il n’existe que peu de médicaments efficaces. Ce constat provient du fait que l‘on connait très mal le fonctionnement de la relaxation cardiaque et ses régulateurs, d’où la nécessité urgente d’étudier ces mécanismes. Dans ce contexte, dans l’équipe, nous avons identifié récemment Ephrine-B1 comme un déterminant moléculaire de la diastole. Plus récemment, des données de microscopie électronique du tissu cardiaque ont révélé des régulateurs potentiels d’Ephrine-B1 avec notamment le rôle des œstrogènes et le rôle du métabolisme hépatique . Aussi, l’OBJECTIF DU PROJET consistera maintenant à explorer, dans différents modèles de souris le rôle de ces différentes pistes moléculaires dans la régulation spécifique de la fonction diastolique cardiaque, mais également de la fonction systolique. Les différences mâles/femelles chez ces animaux nous permettront également d’explorer la dimension dimorphique sexuelle de l’ICFEP.
Bénéfices attendus
Les mesures de pressions intra-cavitaires et les échocardiographies permettront de connaitre avec précision les fonctions de relaxation et de contraction du cœur et nous permettront ainsi de définir la présence ou non d’une ICFEP chez nos animaux. Ce projet nous permettra pour la 1ère fois, au travers la régulation de la protéine Ephrine-B1, d’apprécier le rôle des œstrogènes et du métabolisme hépatique dans la relaxation cardiaque et donc de présenter l’axe foie/cœur comme un nouvel axe thérapeutique potentiel dans l’ICFEP. En effet, les dysfonctions métaboliques du foie pourraient donc entrainer des dysfonctions de la relaxation cardiaque. En accord avec cette hypothèse, les maladies métaboliques du foie touchent les mêmes catégories de patients que l’ICFEP avec, de la même façon, une incidence plus élevée chez les femmes. A terme, ce projet devrait permettre de mieux appréhender l’ICFEP touchant différemment les hommes et les femmes et une meilleure prise en charge thérapeutique personnalisée.
Procédures
IL y a 2 intervention : l'échocardiographie, non invasive sous anesthésie légère - Durée: 15 min / souris et l'intervention 2: cathétérisme ventricule gauche cardiaque, procédure chirurgicale Durée : 30 min / souris
Impact sur les animaux
Une mauvaise gestion de l'anesthésie pourrait entrainer soit la mort prématurée de la souris ou, au contraire, un réveil de cette dernière en cours de chirurgie. Cependant, le manipulateur peut ajuster en temps réel le % d'anesthésique. De plus, le système du cathéter est doté de sonde permettant de mesurer le rythme cardiaque qui est un excellent indicateur de la qualité de l'anesthésie.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure. En effet, l'acte chirurgical présente un risque de développer des complications post opératoires. Pour le bien être à long terme de la souris, il est nécessaire d'euthanasier les animaux à la fin de cette intervention.
Remplacement
Pour diagnostiquer l’ICFEP, il est nécessaire d’évaluer la fonction cardiaque diastolique (mesures des flux et vitesses de relaxation en Echocardiographie Doppler-Intervention 1 + mesures de pression intra-cavitaires par cathétérisme ventricule gauche-Intervention 2) mais aussi la fonction systolique (Echocardiographie-Intervention 1) sur animal entier vivant. Aujourd’hui, il n’existe pas de méthodes alternatives permettant d’obtenir l’ensemble de ces données fonctionnelles cardiaques nécessaires pour étudier l’ICFEP, à part ces 2 interventions fonctionnelles sur l’animal.
Réduction
Les souris utilisées pour l'échocardiographie sont les mêmes que celles utilisées pour le cathétérisme ventriculaire. Par ailleurs, des études antérieures de notre équipe mais également d’autres équipes ont démontré que 20 souris par groupe est le minimum pour faire une analyse statistiquement correcte pour les mesures de pressions cardiaques intra-cavitaires en tenant compte de la variabilité de mesure dans les cas pathologique d’ICFEP mais également en tenant compte des animaux pour lesquels il est quelquefois impossible d’introduire le cathéter au niveau ventriculaire.
Raffinement
Les mesures de raffinement mises en place pour minimiser le stress et améliorer la qualité de vie au quotidien de nos animaux est une alimentation et une source d'eau ad libitum. Un enrichissement du mileu est fait grâce à l'utilisation de morceaux de papier et de cartons permettant au souris de fabriquer un nid. De plus, des tunnel en cartons sont également utilisés pour occuper au quotidien nos souris. Concernant l’intervention 1 (imagerie cardiaque), nous utilisons une anesthésie légère par inhalation car c’est une intervention non invasive. Nous utilisons également une table thermorégulée pour le bon maintien de la température de la souris. Le point limite de cette intervention est une mauvaise adaptation de l'animal à l'anesthésie (respiration haletante ou trop diminuée), qui est compensée par une régulation immédiate de la concentration de produit délivré. Pour l’intervention 2 (chirurgie), l’anesthésie se fait comme pour l’intervention 1 (imagerie cardiaque) mais nous utilisons en plus à la fois une analgésie globale et une analgésie locale. Ceci nous permet d’avoir une couverture maximale de la douleur lors de la procédure chirurgicale. Cette intervention 2 est une chirurgie donc elle peut entrainer une diminution de la température corporelle de la souris, et pour palier à cela nous utilisons un tapis chauffant. Pour éviter un dessèchement des yeux, un gel occuloprotecteur est également utilisé. Les points limites concernant cette intervention 2 sont l’hémorragie, une mauvaise réaction aux analgésiques et ou anesthésiques. L'expertise chirurgicale de l'expérimentateur permet de gérer toute complication et le cathéter, capable de détecter la fréquence cardiaque de l’animal, permet de réagir au plus vite si l’un de ces points limites est atteint. Cela est couplé à une surveillance visuelle constante de l’animal et de la zone chirurgicale.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris car nous avons pu générer grâce à cette espèce différents modèles transgéniques présentant une délétion (= absence d'expression) de différentes protéines d’intérêt dans un organe spécifique pour étudier la régulation de la fonction diastolique cardiaque à l’âge adulte chez le mâle et la femelle. Les animaux sont tous utilisés au stade postnatal 60 jours (P60) quand le coeur a fini définitivement sa maturation.
Microstructure du cycle veille-sommeil au cours du vieillissement chez les souris TgM83, un modèle préclinique de la maladie de Parkinson
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris de la lignée TgM83 portent une protéine humaine mutée qui déclenche chez elles, vers huit à dix mois, des troubles moteurs de type parkinsonien. 24 d'entre elles vont être utilisées, douze dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, douze dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil. La moitié subit une chirurgie crânienne pouvant durer une heure, puis vit isolée une semaine sur deux pendant dix-huit semaines, le temps d'enregistrer leur sommeil de trois à dix mois d'âge. Toutes sont tuées par perfusion transcardiaque sous anesthésie terminale, pour que leur cerveau soit examiné avant l'apparition des signes moteurs de la maladie.
Objectifs
Le trouble comportemental en sommeil paradoxal anticipe d’une décennie la maladie de Parkinson dont il est considéré comme le meilleur marqueur précoce. Pendant le sommeil paradoxal, nous sommes naturellement paralysés. Cette paralysie est absente chez les patients atteints du trouble comportemental en sommeil paradoxal. Nous faisons l’hypothèse que la zone cérébrale contrôlant cette paralysie serait une cible précoce des mêmes processus pathologiques que ceux responsables de la maladie de Parkinson et qui envahiraient au cours du veillissement l’ensemble du cerveau.Notre objectif est de tester cette hypothèse sur une souche de souris de type transgénique (TgM83), fréquemment utilisée pour la recherche sur la maladie de Parkinson, qui expriment une protéine humaine mutée responsable d’une forme génétique de cette maladie neurodégénérative. Différentes études comportementales indiquent que les souris TgM83 présentent des altérations motrices sévères de type parkinsonien dès l’âge de 8-10 mois. En revanche, on ne sait pas si leur sommeil est perturbé en amont de ces signes cliniques, comme chez les patients parkinsoniens.Ce projet nous permettra de caractériser le sommeil des souris TgM83 porteuses de la pathologie, de prévoir l’émergence de la maladie de Parkinson à la détection de symptômes précoces durant le sommeil et enfin d’étudier la propagation cérébrale de la pathologie au cours du veillissement.
Bénéfices attendus
Le trouble comportemental en sommeil paradoxal est pour les médecins un symptôme neurologique précoce et fiable de la Maladie de Parkinson. En effet, il serait l’un des premiers signes visible et facilement identifiable à l’hôpital qui survient une dizaine d’années avant les symptômes moteurs invalidants bien connus. Par ailleurs, ceci suggère que ces deux pathologies sont chronologiquement liées et partageraient des mécanismes pathologiques communs qui envahiraient de façon lente, insidieuse et presqu’invisible, le cerveau au cours du vieillissement chez les patients. Notre objectif est de tester cette hypothèse en profitant de l’opportunité expérimentale que nous offre une souche de souris exprimant la protéine mutée qui est responsable de la maladie de Parkinson. Différentes études comportementales antérieures ont déjà établi que ces souris présentent des altérations motrices de type parkinsonien dès l’âge de 9-10 mois. En revanche, on ne sait pas si leur sommeil est sévèrement perturbé en amont comme il est maintenant bien décrit chez les patients parkinsoniens. Plusieurs bénéfices importants sont attendus de ce projet de recherche qui visera d’abord à caractériser finement le sommeil de ces souris, de déterminer si elles développent, comme nous le prévoyons, un trouble comportemental en sommeil paradoxal précoce, voire d’autres biomarqueurs potentiels prédictifs de la Maladie de Parkinson, et d’étudier comment la pathologie se propage dans le cerveau au cours du vieillissement. Selon les résultats obtenus, cette souche de souris pourrait alors constituer un modèle préclinique pertinent de la maladie de Parkinson, mimant précisément et chronologiquement son développement au cours du temps. Ceci ouvrirait alors de nombreuses voies de recherche pour la mise au point à moyen terme de traitements préventifs pour ralentir la maladie, voire curatifs en la stoppant complètement dès la pose de son diagnostic.
Procédures
La moitié des souris (n=12) prévues pour ce projet de recherche subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale d'une durée maximum de 60 minutes. Elles seront ensuite mises en isolement lors des phases expérimentales pendant 1 semaine toutes les 2 semaines, soit pour une durée maximale de 18 semaines. Pour le prélèvement des cerveaux en fin d’expérimentation, l’ensemble des souris (n=24) recevront successivement un traitement médicamenteux analgésique puis sédatif avant l’induction par voie intrapéritonéale d'une anesthésie chirurgicale terminale requise pour la perfusion transcardiaque de l’animal.
Impact sur les animaux
Pour l’ensemble des souris (n=24) prévues pour ce projet de recherche, de potentiels effets indésirables liés à l’aspect neurodégénératif du modèle animal sont à considérer et sont de fait attendus (objet du présent projet). Bien que les animaux soient mis à mort avant l’apparition de signes moteurs avant-coureurs de la maladie de Parkinson, il n’est pas à exclure une apparition précoce d’un trouble du comportement en sommeil paradoxal (objectif de ce projet), une perte légère de poids et quelques difficultés locomotrices à l’éveil sur certains individus. Pour la moitié de ces souris qui seront soumises à une intervention chirurgicale (n=12), les effets indésirables afférents sont très peu probables mais seront anticipés comme une hypothermie, une hémorragie locale, un arrêt respiratoire ou une infection post-opératoire entraînant une dégradation de l’état de santé. L’isolement des souris durant les phases d’enregistrement pourrait entraîner un léger stress et anxiété transitoire, sans impact sur nos paramètres d’intérêt.
Devenir
Toutes les souris prévues pour ce projet de recherche (n = 24) seront mises à mort en fin de procédure afin de prélever les cerveaux pour leur étude anatomo-pathologique et comparative.
Remplacement
L’intérêt d’étudier les mécanismes physiopathologiques responsables troubles du sommeil réside dans leur caractère prédictif et évolutif vers la Maladie de Parkinson. Or, il est encore aujourd’hui impossible d’aborder ces questions chez l’homme sain ou malade, d’autant qu’aucun marqueur spécifique des mécanismes impliqués n’est encore validé en neuroimagerie. Des contrôles anatomo-pathologiques sont souvent réalisés sur des biopsies issues de patients mais décédés des décennies après le déclenchement des processus pathologiques. Aussi, des modèles animaux demeurent essentiels pour reproduire les observations cliniques, les comprendre et les modéliser. La souris est un animal adapté aux études longitudinales (faible prise de poids et de volume corporel avec l’âge). Par ailleurs, les réseaux neuronaux responsables du sommeil sont communs aux mammifères, incluant les rongeurs et l’homme, et sont bien identifiés. Enfin, des animaux de niveau phylogénétique inférieur (drosophile, poisson rouge, vers C. elegans) sont parfois utilisés pour l’étude du sommeil (activité́/inactivité́) mais ils ne possèdent pas de sommeil paradoxal qui est spécifique aux mammifères et aux oiseaux (peut-être aux reptiles) et dont la complexité́ du système nerveux n’est en rien comparable avec celle des mammifères. D’autres méthodes prometteuses se développent régulièrement comme la modélisation in-silico, l’intelligence artificielle, les cultures cellulaires sur puces et depuis peu les organoïdes cérébraux mais elles ne constituent pas encore d’alternatives crédibles pour aborder des processus neurobiologiques complexes, mimer leurs dysfonctionnements, reproduire et modéliser des observations cliniques sous-jacentes de pathologies évolutives et neurodégénératives comme la Maladie de Parkinson.
Réduction
Le nombre d'animaux est légitimé par l’organisation de l’étude autours de deux procédures expérimentales indépendantes mais conduites en parallèle. La taille de chaque lot expérimental a été calculée et optimisée sur la base de nos nombreuses études conduites chez la souris et publiées au cours de la dernière décennie par l’équipe, incluant nos travaux déjà réalisés dans le cadre de la demande d’autorisation de projet précédente sur le même sujet. Ces calculs prennent en compte les « erreurs et échecs » aux différentes étapes des deux procédures expérimentales (chirurgie sous anesthésie générale, récupération post-opératoire, survie post-traitement, comportements anormaux, état de santé général), la variabilité́ interindividuelle des paramètres physiologiques considérés, la dégradation des signaux polysomnographiques au cours du temps (procédures de plusieurs mois) pouvant dès lors rendre leur interprétation aléatoire, en enfin la nécessité de ne pas compromettre la reproductibilité et la significativité des données obtenues (utilisation systématique de tests statistiques paramétriques ou non paramétrique adaptés aux petits échantillons). Chaque animal ne sera soumis qu’à une seule procédure expérimentale avec mise à mort pour les analyses des cerveaux, éliminant toute possibilité de réutilisation.
Raffinement
Dès leur arrivée à l’animalerie de notre centre de recherche, toutes les souris (n=24) seront classiquement hébergées en respectant des conditions optimales à 4 par cage favorisant des interactions sociales normales jusqu’à ce qu’elles atteignent l’âge requis pour les expérimentations. Des enrichissements environnementaux systématiques seront mis en place pour améliorer leur bien-être, tels que des carrés de coton à déchirer pour faire le nid ou encore des batônnets de bois à ronger. Pour évaluer le bien-être, le poids et l’état du pelage seront mesurés quotidiennement. Si un animal dépasse un des points limites détaillés dans les procédures expérimentales, il sera retiré́ et euthanasié sans délai. Pour les souris qui seront soumises à une intervention chirurgicale (n=12), une attention quotidienne leur sera portée lors de la phase post-opératoire pour optimiser la récupération (ajout d’anti-inflamatoires non-stéroidiens si nécessaire, suivi pondéral, mobilité et comportements) grâce à l’utilisation d’une grille de score post-opératoire. Pendant les périodes expérimentales (1 semaine sur 2 pendant 18 semaines), notre préoccupation sera d’analyser régulièrement grâce à des fiches de scorage l’évolution des paramètres physiologiques et le comportement locomoteur pour détecter au plus tôt les perturbations caractéristiques du trouble comportemental en sommeil paradoxal. Celles-ci constitueront de-facto le point limite des expérimentations, tout en établissant la preuve de concept recherchée. Dans les cas où aucun trouble comportemental en sommeil paradoxal ne se déclencherait avant l’apparition spontanée des signes cliniques moteurs de type parkinsonien (9-10 mois d’âge), la mise à mort sera programmée pour prévenir toute souffrance.
Choix des espèces
Nous souhaitons valider un modèle préclinique d’une pathologie neurologique prédictive de la Maladie de Parkinson, en reproduisant chez la souris les mécanismes évolutifs sous-jacents se déroulant sur plusieurs décennies chez les patients, bien avant leur décès. Aussi, les analyses anatomo-pathologiques des cerveaux de patients décédés ne permettent pas d’aborder ces mécanismes qui débutent de façon précoce, bien avant l’apparition des problèmes moteurs bien connus de la Maladie de Parkinson. Il n'existe pas de marqueurs qui permettraient l’exploration fonctionnelle par neuroimagerie. La compréhension de mécanismes à l’échelle cellulaire et moléculaire passe par la mise en œuvre de techniques inapplicables chez l’homme mais possible chez la souris présentant de grandes similitudes d’organisation de leur cerveau. Par ailleurs, le sommeil paradoxal est propre aux mammifères. Des modèles d’animaux moins évolués sont parfois utilisés pour l’étude de la vigilance mais ils ne sont pas pertinents pour ce projet. Nos travaux ont permis d’identifier chez le rongeur les structures cérébrales potentiellement ciblées par la pathologie. Ceci rend évident le choix de la souris, particulièrement la souris TgM83 pour induire l’expression de la protéine mutée impliquée dans la pathologie qui nous intéresse. Cette étude longitudinale de la période présymptomatique chez ce modèle murin durera 7 mois environ, débutant chez des souris jeunes adultes asymptomatiques âgées de 3 mois pour s’achever dès qu’apparaitront les premiers signes prédictifs de la maladie de Parkinson (mais avant la mise en place de la pathologie), à l’âge de 9-10 mois. Pour ce type d’étude physiologique et comportementale de longue durée, la souris s’avère à nouveau plus adaptée que le rat (pas de prise de poids et de volume corporel significatif avec le vieillissement, cerveau de plus petite taille avec des processus évolutifs plus rapides) augmentant la faisabilité du projet.