Souris

Les souris qui perdent 15 % de leur poids ou présentent des difficultés respiratoires après l'infection par le SARS-CoV-2 sont mises à mort sans délai, l'infection pouvant les tuer en huit jours. 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs poumons, de leur cerveau et de leur tête. Chacune reçoit une puce sous la peau du dos, subit huit prises de sang à raison d'une par semaine, trois ou quatre vaccinations par le nez sous anesthésie générale et une inoculation du virus par la même voie. Toute médication susceptible d'interférer avec la réponse immunitaire est exclue. Les résultats doivent alimenter une publication et une éventuelle demande d'essai clinique pour le candidat vaccin LVT-001, contre les symptômes du covid long.

Objectifs

Le COVID-19, causé par le virus SARS-CoV-2, a affecté des millions de personnes dans le monde, entraînant non seulement des problèmes respiratoires mais aussi des symptômes neurologiques graves, y compris des atteintes cérébrales. Des recherches récentes ont montré que ces complications persistent chez certains patients, formant ce qu'on appelle le 'covid-long'. La vaccination a démontré son efficacité à la fois dans la prévention et le traitement du covid-long. Nous proposons d'évaluer le potentiel thérapeutique de notre vaccin dans un modèle murin, qui reproduisent les symptômes du covid-long, y compris les atteintes cérébrales. Ce modèle animal nous permettra d'étudier comment notre vaccin peut moduler les symptômes persistants du COVID-19, en particulier ceux affectant le système nerveux central. Ce vaccin, conçu pour cibler plusieurs variants du virus, pourrait offrir des perspectives prometteuses pour le traitement de ces formes graves de la maladie.

Bénéfices attendus

Les resultats de ce projet feraient l’objet d’une publication scientifique mais pourraient également servir de données preclinique à une demande d’essais clinique thérapeutique chez l’homme pour le traitement des symptomes liés au covid-long avec le candidat vaccin LVT-001 qui sera déjà évalué en clinque fin 2024 en prophylactique.

Procédures

Tous les animaux, soit 96 souris. Des puces d’identification dorsales en voie sous-cutanée (12 minutes par animal, 1 fois). Des prises de sang à la veine submandibulaire (5 minutes par animal, 8 fois soit une fois par semaine). Inoculation du vaccin par voie nasale sous anesthésie générale. (10 minutes par animal, entre 3 et 4 fois selon les lots). Challenge infectieux par voie nasale sous anesthésie générale (10 min par animal, 1 fois). Prélèvement d'urine (20 seconde maximum par animal, 1 fois).

Impact sur les animaux

Pour le challenge viral par voie nasale, une perte de poids moyen de 15% est observée en premier lieu entre 3 et 5 jours post infection et suivie très rapidement par une léthargie, des difficultés respiratoires pouvant entrainer la mort 8 jours post infection. Pour éviter toute souffrance aux animaux, une perte de poids moyen de 15% et/ou l’apparition de difficultés respiratoires entrainera la mise à mort sans délai. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon nos observations bi/quotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. Les administrations en voie intra-péritonéale pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantations de la puce télémétrique. Les prises de sang peuvent également entrainer une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (poumons, cerveau, tête, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pur le recrutement cellulaire et sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution qui pourrait restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique, déjà éprouvé notamment pour l’étude de la réponse immunitaire humorale et cellulaire. Ce nombre d’animaux repose également sur notre experience precedente d’utilisation du même modèle animal dans le cadre d’essais de protection prophylactique avec le même candidat vaccin.

Raffinement

Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes et bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger) dans la zone d'hébergement défini par la structure chargée du bien-être animal de l’établissement. Les souris sont hébergées, avant infection, en animalerie sur des portoirs ventilés puis en isolateur après infection expérimentale (environnement confiné). Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Tout type de médication pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Des critères d’arrêt sont prévus dans le projet afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire.

Choix des espèces

Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par la vaccination post-infection dans l’étude du covid long. Le modèle murin est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux Covid. Il a été récemment étendu à l’étude des symptômes et pathologies liées au Covid long avec notamment sa propension à reproduire l’infection du SNC par le virus. Ainsi ce modèle est le plus relevant pour l’étude de thérapie contre le covid long. Adulte et immunocompétent : afin d’être représentatif en préclinique de la cible clinique du protocole, le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents.

Vaccinées par le nez sous anesthésie générale, une ou deux fois à deux semaines d'intervalle, 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur réponse immunitaire. Elles peuvent aussi recevoir entre 13 et 30 injections quotidiennes dans l'abdomen sans anesthésie, trois prises de sang et une injection dans la veine, et subir sous anesthésie un lavage des poumons et une perfusion par le cœur avant le prélèvement du poumon. L'équipe cherche les mécanismes qui font apparaître, après une vaccination par le nez, des cellules immunitaires cytotoxiques résidant dans le poumon, en vue de vaccins contre le cancer du poumon. Une chirurgie de 20 minutes figure parmi les actes, sans que sa nature soit précisée, et ni le traitement injecté chaque jour ni le produit injecté dans la veine ne sont nommés.

Objectifs

Le but des vaccins anti-tumoraux est d’induire des cellules immunitaires capables d’éliminer les cellules tumorales. Des travaux ont montré que dans le cancer du poumon, il est important d’induire localement des cellules immunitaires cytotoxiques résidentes dans cet organe, car ces cellules résidentes sont connues pour avoir une protection plus rapide et plus efficace du fait de leur localisation. Ces cellules ne peuvent être générées que par une voie de vaccination intranasale et non systémique ( sous-cutanée ou intramusculaire). L’objectif de ce projet est d’identifier les mécanismes qui favorisent la génération de ces cellules immunitaires cytotoxiques résidentes, après vaccination intra-nasale.

Bénéfices attendus

Une meilleure connaissance dans la génération de ces cellules immunitaires cytotoxiques résidentes dans les poumons, permettra de développer et d’optimiser des vaccins anti-tumoraux pour traiter les cancers du poumons.

Procédures

Injection par voie intra-nasale : 1 ou 2 fois à 2 semaines d'intervalles, sur animaux sous anesthésie générale, durée: 30min. Injection par voie intra-péritonéale d’anesthésique sur souris vigiles: 1 ou 2 injections à 2 semaines d'intervalles,durée: 10secondes/injection. Injection par voie intrapéritonéale de traitement sur souris vigiles : entre 13 et 30 injections ( 1 injection/ jour sur une période de 13 à 30 jours),durée 10 secondes/ injection. Prélèvement de sang: x3 sur souris anesthésiées,durée 1-2 min. Injection intraveineuse de produit : 1 fois sur animaux sous anesthésie générale,durée: 30 secondes. Injection d'analgésique par voie sous-cutanée sur souris vigiles : x1 fois, durée 10 secondes/injection. Prélèvement du lavage broncho alvéolaire (x1fois), perfusion intracardiaque et prélévement du poumon (x1fois) sur animaux sous anesthésie générale,durée totale environ 30 min. Chirurgie sur animaux sous anesthésie,durée 20 min.

Impact sur les animaux

La vaccination par voie intranasale peut induire une gêne respiratoire transitoire de courte durée pendant la durée de l’administration. Les injections répétées par voie intrapéritonéale peuvent induire une douleur légère et transitoire ou une irritation au niveau du site d’injection. La chirurgie peut induire des douleurs post-opératoire (traitée par un analgésique) et risque d’infection et problème de cicatrisation ( traitée avec un antiseptique locale).

Devenir

mise à mort pour récupérer les organes en vue d’analyse de la réponse immunitaires

Remplacement

L’analyse des réponses immunitaires après vaccination, dans différents organes au cours du temps, ne peut être évaluée que dans des organismes entiers. Les modèles in vitro ne permettent pas de mimer fidèlement les réponses immunitaires ni le microenvironnement muqueux pulmonaire. L’expérimentation animale est indispensable afin de se rapprocher de conditions observées chez l’homme. Aucune méthode alternative n'existe.

Réduction

Les paramètres expérimentaux (doses, cinétiques) ont été déterminés selon des données déjà publiées. Basé sur des études déjà publiées et avec l’aide d’un logiciel de calcul d’effectifs, nous avons déterminé un nombre d’animaux minimum pour avoir assez de matériel et garantir une analyse statistique fiable. Pour chacune des expériences nous avons maximisé les prélèvements et analyses biologiques.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les injections intranasales, les prélèvements de sang, les injections intraveineuses, et la chirurgie sont réalisés sous anesthésie pour le confort de l’animal. La profondeur de l’anesthésie est surveillée tout le long de la procédure, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil. Des analgésies pre et post-opératoires sont prévues ainsi que des solutions antiseptiques pour la cicatrisation. Tous les vaccins et traitements sont préparés dans des formulations validées pour des administrations chez l’animal et ne sont pas décrits comme toxiques aux doses utilisées. Les animaux sont surveillés tout au long du projet. Une grille de score et des points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L’atteint d’un point limite qui ne peut être soulagé induira une mise à mort anticipée de l’animal par le responsable du projet.

Choix des espèces

Cette étude sera réalisée avec des souris, car nous avons des vaccins déjà utilisés et validés dans cette espèce pour induire une bonne réponse immunitaire dans les poumons ainsi que tous les outils et techniques d’analyse adéquats. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, car le système immunitaire est développé et mature.

Pour chercher un moyen de prévenir les douleurs neuropathiques provoquées par trois chimiothérapies anticancéreuses, 102 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour l'analyse de leurs tissus. Pendant huit jours, elles reçoivent des injections intrapéritonéales de vincristine, de paclitaxel ou d'oxaliplatine, seules ou associées à un bloqueur. Trois tests d'évitement mesurent tous les trois jours leur sensibilité au toucher et à la chaleur, chaque animal restant jusqu'à quarante minutes isolé de ses congénères. Le porteur affirme qu'en dehors des tests ces souris se comportent comme les témoins, et précise qu'une valeur limite retire l'animal du stimulus même lorsqu'il ne montre aucun signe d'évitement.

Objectifs

Les neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie sont le second effet indésirable le plus fréquent induits par les agents anticancéreux. Ces dernières sont principalement source de douleurs (à type de brûlure, piqure, fourmillements) altérant fortement la qualité de vie des patients en cours de traitement et/ou survivant à un cancer. Ces douleurs intenses peuvent être à l’origine d’une diminution des doses, d’un espacement des cycles voire d’un arrêt du traitement anticancéreux, et mettre ainsi en péril les chances de survie du patient. Pour autant, il n’existe à ce jour aucune stratégie pharmacologique préventive efficace. Avec une incidence croissante de 25 millions de cancers par an à travers le monde, le développement de stratégies neuroprotectrices contre ces NPIC constitue un enjeu de santé publique. Une analyse transcriptomique réalisée sur les ganglions spinaux de souris exposées à des agents anticancéreux neurotoxiques mettaient en évidence une très forte surexpression de l’urocortine. L’urocortine est une neurohormone qui agit sur deux types de récepteurs. Il a été montré que les activateurs naturels de ses récepteurs jouaient un rôle dans l’éxagération de la douleur en particulier viscérale et que le blocage de ces récepteurs pouvaient abolir cette hyperalgésie. Ces récepteurs pourraient constituer une cible thérapeutique potentielle intéressante pour prévenir et/ou traiter les neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie. Notre objectif principal est d’étudier l’implication de l’urocortine 1 et de ses récepteurs, dans le développement de la neuropathie induite par la vincristine, par le paclitaxel et par l’oxaliplatine dans nos modèles murins. Pour cela, une étude pharmacologique évaluant les effets de bloqueurs sur le développement des neuropathies induites par la vincristine, le paclitaxel ou l’oxaliplatine sera réalisée.

Bénéfices attendus

Les récepteurs de l’urocortine sont présents à la fois au niveau du système nerveux central (cortex et moelle spinale) et au niveau du système nerveux périphérique (terminaisons nerveuses cutanées, ganglions spinaux). Il a été démontré que l’urocortine injecté dans la moelle spinale chez la souris induisait une éxagération de la douleur en réponse à un stimulus tactile, ce qui confirme le rôle important de l’urocortine et de ses récepteurs dans la modulation de la douleur neuropathique. De plus, un lien étroit existe entre l’exacerbation de la douleur et le stress. Le système urocortine/récepteurs participe à ce phénomène et se présente comme une cible intéressante pour la modulation de la douleur. Cette étude pharmacologique évaluant les effets de bloqueurs des récepteurs à l'urocortine sur le dévellopement des neuropathies induites par la vincristine, le paclitaxel ou l’oxaliplatine pourrait permettre de mettre en évidence une nouvelle cible d’intérêt pour la prise en charge d’un effet secondaire des chimiothérapies, lourd de conséquences sur la qualité de vie des patients et contre lequel il n’existe à ce jour aucun traitement préventif efficace.

Procédures

Au cours des procédures, les animaux recevront leurs traitements (véhicule, bloqueurs et /ou chimiothérapie) par des injections intrapéritonéales répétées tous les jours, tous les deux jours ou tous les jours selon l'agent anticancéreux et sur une période de 8 jours. L'ensemble des animaux sera soumis à trois test comportementaux; l'un évaluant la sensibilité tactile et deux autres évaluant la sensibilité thermique, tous les 3 jours pendant 14 jours.

Impact sur les animaux

L'administration des agents anticancéreux et des traitements par voie intrapéritonéale induira une douleur légère à modérée de courte durée (30 minutes max), pouvant générer un stress. L'administration des agents anticancéreux induira une hypersensibilité caractérisée par une gène observable au cours des tests comportementaux, et en réponse à un stimulus. Au cours des tests comportementaux, les animaux se retrouveront isolés de leurs congénères pendant une courte période (40 minutes max.) pouvant générer un stress. En dehors de la phase de test, les animaux ayant reçu de la vincristine, du paclitaxel ou de l’oxaliplatine ont un comportement similaire aux animaux témoins et ne présentent aucun signe de souffrance ou de perte de poids.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les éventuelles altérations associées à la vincristine, au paclitaxel ou à l'oxaliplatine seront mises en évidence par une analyse histologique et immunohistologique. L'ensemble des animaux seront mis à mort, puis les tissus d'intérêt seront prélevés sur chaque animal.

Remplacement

Il n'y a actuellement aucune méthode de remplacement pour l'expérimentation animale qui reproduit tous les mécanismes impliqués dans la génération de la douleur causée par les cytotoxiques anticancéreux. Nous avons choisi trois modèles qui suivent les protocoles d'injection des agents anticancéreux utilisé chez l'Homme. Une étude in vitro est en cours pour évaluer l'effet des bloqueurs des récepteurs de l'urocortine sur des neurones sensitifs humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Ce modèle cellulaire permet de déterminer les mécanismes physiopathologiques (neurotoxicité, hyperexcitabilité, dérégulation du transport axonal, etc.) impliqués au niveau des neurones sensitifs, mais exclut les phénomènes de neuroinflammation liés aux neuropathies induites par la chimiothérapie ainsi que la complexité des phénomènes qui aboutissent à la sensation douloureuse.

Réduction

Le nombre de 6 animaux par groupe pour l’étude principale a été déterminé à l'aide d'un logiciel de calcul qui estime un nombre total de 78 animaux (avec 6 mesures de la sensibilité), distribués en 13 groupes. Pour réduire le nombre d'animaux, chacun subira toutes les expérimentations les unes après les autres dans l'ordre chronologique : les injections, les tests de comportements puis la mise à mort pour prélèvements en fin d'expérimentation. Les résultats générés par les animaux de l'étude pilote pourront être utilisés pour renforcer l'analyse statistique de l'étude principale et ainsi permettre d’augmenter le nombre d'animaux de l'étude principale.

Raffinement

Une étude pilote permettra d'évaluer l'effet des bloqueurs des récepteurs de l'urocortine sur l’état général des animaux et le développement d'une neuropathie sensitive sans troubles moteurs dans nos conditions d"hébergement : l’apparition de signes de souffrance ou de toxicité sera évaluée à l’aide d’une grille de suivi biquotidien et l'apparition de la neuropathie sensitive sera évaluée à l'aide de tests comportementaux. Si le score pour au moins 1 souris est supérieur à 10 alors l’étude principale ne sera pas poursuivie. Si aucun signe de souffrance ou de toxicité n’est observé au cours de l’étude pilote, et que le blocage des récepteurs présente un effet analgésique et/ou neuroprotecteur sur la neuropathie alors nous procèderons à l’étude principale. Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un temps d'habituation et/ou d’entrainement sera respecté pour chaque test comportemental afin de limiter le stress de l’animal et de réduire la variabilité des résultats. Seul des tests d'évitement seront utilisés pour l'évaluation de la sensibilité tactile et thermique, et une valeur limite est établie à partir de laquelle l’animal est soustrait au stimulus même s’il ne présente aucun signe d'évitement. Les animaux exposés aux traitements doivent présenter un comportement naturel similaire aux animaux contrôles pour pouvoir participer à l'analyse comportementale. Les animaux présentant des signes de fatigue, troubles moteurs ou souffrance qui pourraient générer un biais dans les réponses aux tests comportementaux seront retirés du protocole. L’équipe de recherche maitrise les modèles de neuropathie chimio-induite et les tests de sensibilité associés qui requiert un savoir-faire et un suivi précis des réactions de l'animal.

Choix des espèces

Des modèles murins de neuropathies induites par la chimiothérapie chez la souris ont déjà été validés, publiés et ont montré leur intérêt pour tester l'effet neuroprotecteur de molécules. Leur physiopathologie est très proche de celle de l'Homme. Nous utilisons un équipement adapté à la souris. Ce matériel est maitrisé par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point et d’éviter une source de stress supplémentaire pour l’animal. Pour obtenir des résultats statistiquement fiables, malgré les faibles effectifs par lot, nous utiliserons des souris présentant le moins de variabilité : même fond génétique, même âge, poids identique.

Anesthésiées pour une chirurgie de quarante minutes qui interrompt la circulation dans l'artère fémorale d'une patte, 1 380 souris passent ensuite par cinq à six imageries laser doppler et cinq imageries isotopiques pouvant durer deux heures, étalées sur 21 jours. Une partie reçoit en plus des injections abdominales ou des gavages, jusqu'à deux fois par jour pendant trois semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur énumère les atteintes possibles : douleur, œdème douloureux du membre, infections, incapacité à se servir de la patte, irritations de l'œsophage liées au gavage. Celles qui vont au bout sont tuées pour prélever leurs tissus, et 88 souris qui n'auront pas perdu la vascularisation de leur patte pourront être réutilisées dans un autre projet.

Objectifs

La maladie artérielle périphérique (MAP) se définit comme un blocage partiel ou total d’une artère causé par une accumulation de lipides dans la paroi des vaisseaux artériels se situant en périphérie de l’aorte. Elle est généralement provoquée par un durcissement des artères (athérosclérose). La MAP représente un problème majeur de santé publique dans les pays développés. Malgré les progrès réalisés dans la prévention des facteurs de risque (tabac, diabète, obésité…) et dans les techniques interventionnelles et chirurgicales (pontage, stents…) pour améliorer la perfusion des membres inférieurs, une partie importante des patients atteints sont considérés comme « non répondeurs » pour la revascularisation et ont un pronostic particulièrement défavorable avec des taux élevés de mortalité et d’amputation des membres. En conséquence, l’identification de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter cette complication invalidante est d’un intérêt critique. Le but de ce projet est d’évaluer soit de nouveaux radiotraceurs qui permettraient un meilleur suivi ou détection des processus de réperfusion (recrutement des petits vaisceaux autour ou créations de nouveaux vaisseaux permettant la revascularisation du membre inférieur), soit d’évaluer l’efficacité de nouveaux candidats-médicaments sur un modèle murin d’ischémie de la patte par arrêt de la circulation dans l'artère fémorale de la patte.

Bénéfices attendus

Le diagnostic et le traitement précoces, ainsi qu’un suivi rigoureux, contribuent à améliorer la qualité de vie des patients en réduisant les symptômes associés et en augmentant l’efficacité des traitements. L’utilisation de nouveaux traceurs permet de détecter le site d’ischémie et facilite la prise en charge rapide des traitements, en augmentant les chances de bon pronostic des patients. Les traceurs développés grâce à la recherche en imagerie médicale offrent une précision supérieure dans la détection du site ischémique. Cela permet aux médecins de cibler plus précisément les zones affectées, réduisant ainsi les dommages aux tissus sains environnants.

Procédures

Les animaux auront : une chirurgie (1 fois, durée 40 minutes max, sous anesthésie générale), des imageries laser doppler (5 à 6 fois sur 21 jours, durée :5 min ; sous anesthésie général), des imageries isotopiques (5 fois sur 21 jours, durée maximum 2h ; sous anesthésie). Une partie des animaux auront également des injections de médicaments soit par injections abdominal soit par gavage (maximum 2 fois pas jours pendant 21 jours , durée en moyenne 1 à 2 minutes, sur animal vigile en contention) et certain auront des prélèvements sanguins au niveau de la queue (2 fois maximum, sous anesthésie, 2min).

Impact sur les animaux

Pendant les procédures décrites dans cette saisine, les animaux sont passibles d’expérimenter ce qui suit : • Douleur et inconfort : la chirurgie pourra provoquer une douleur due au manque d'oxygène et de nutriments dans les tissus affectés. Cela peut aussi entraîner une diminution de l'appétit chez l'animal, conduisant à une perte de poids et à une augmentation du stress. Les traitements réalisés sur les animaux vigiles peuvent entrainer un stress dû aux contentions répétées de l’animal ainsi que des irritations de l’œsophage et des problèmes de déglutition dans les cas des gavages. Les traitements répétés par injections peuvent entrainer des petites plaies cutanées. • Problèmes circulatoires et œdème : le manque de circulation peut entraîner une accumulation de liquide dans les tissus, provoquant un gonflement douloureux et une altération de la fonction des membres affectés. • Infections : en raison de la chirurgie, les tissus ischémiques sont plus sujets aux infections en raison de la réduction de l'apport sanguin et de la réponse immunitaire locale ; ça peut entrainer aussi une dégradation de la peau et du pelage dans le cas des infections cutanées. • Difficulté de locomotion : les animaux dont la patte n'est plus correctement vascularisé peuvent présenter une difficulté ou une incapacité à utiliser leur patte. Cela peut réduire leur capacité à se déplacer librement ou à chercher de la nourriture. • Les anesthésies gazeuses répétées peuvent entrainer des difficultés respiratoires lors de l’anesthésie, ainsi que des difficultés d’endormissement et de réveille au cours du temps.

Devenir

Tous les animaux qui iront au bout des procédures seront mis à mort de afin de récupérer les tissus d'intérêts et de pouvoir compléter l’études avec des expérimentations ex vivo et in vitro. Les animaux qui n'auront pas développé de perte de la vascularisation de la patte et qui seront sortis du projet en bonne santé pourront être réutilisé dans un autre projet.

Remplacement

Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent l’utilisation de modèle complexe. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative in vitro ou in sillico qui permet d'avoir une vision complète des grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’Homme. L’ensemble des candidats radiotraceur et des candidats médicament, qui seront testés dans ce projet, auront été préalablement évalués pas des études in vitro pour leur ciblage spécifique et leur efficacité.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisé aux maximums tout en assurant des résultats statistiquement exploitables, nous avons calculé les effectifs à l’aide d'un logiciel de statistique G*Power. Pour l’évaluation de nouveaux traceur radioactif, le marquage spécifique dans la patte avec le blocage artériel sera comparé avec la patte en controlatérale (saine), chaque animal sera donc son propre contrôle. Pour la partie sur le développement de nouveaux candidat médicament, nous réaliseront sur 5 groupes distincts une série de 5 mesures répétées sur les mêmes animaux grâce aux imageries in vivo permettant de visualiser les traceur radioactif et permettant de faire des études longitudinales. Nous analyserons les données à l'aide de tests statistiques multiparamétriques.

Raffinement

Les chirurgies, les injections par voie veineuse et les séances d’imagerie se feront sous anesthésie générale gazeuse, ce qui permettra de minimiser le stress de l’animal et un réveil rapide. Les souris anesthésiées seront toujours placées sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter tout risque d’hypothermie. Les expérimentations douloureuses seront toujours accompagnées, en plus de l’anesthésie générale, d’une analgésie locale et générale par injection sous cutanée de morphinique . Pendant une heure après la chirurgie, une surveillance accrue des animaux sera mise en place, pour éviter toutes complications post- opératoires. L’accès à la nourriture et à l’eau ne sera permis qu’une fois que l’animal sera parfaitement réveillé pour éviter les problèmes de fausse route. Les périodes de traitements sur animaux vigiles seront précédées d’une semaine d’habituation à la contention pour diminuer le stress lors des expérimentations. Les gavages se feront avec sonde de nutrition vétérinaire adaptée aux souris. L’embout est arrondi pour ne pas endommager les parois de l’œsophage et de l’estomac et l’on attend que la souris avale le bout de la sonde (sans forcer) pour éviter les fausses routes. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour les prendre en charge. Tout signe et/ou comportement anormal : difficultés à respirer, souris prostrée, en retrait, ou une perte de poids, sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent pas ou que la perte de poids est supérieure à 20 % du poids initial, l’animal sera sorti du protocole et mis à mort sans délai pour éviter toute souffrance inutile. Les conditions d’hébergement classiques ; animaux hébergés en groupe (maximum 5 par cage), avec accès à la nourriture et à l’eau sans restriction et avec un cycle jour/nuit de 12/12 h ; seront enrichies en alternance par l’ajout de dôme, de tube, de bâtons ou boules en bois pour faire les dents, de matériel (fibre de coton) pour la nidification, afin d’enrichir l’environnement et d’éviter les comportements de stéréotypie.

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. Le modèle d'ischémie des membres inférieurs chez la souris est bien documenté et a fait l'objet de plusieurs publications dans notre équipe. Notre modèle d’ischémie des membres inférieurs se fait chez le jeune adulte. Les animaux arriveront dans l’animalerie à 6 semaines (poids compris entre 25 et 35 g en fonction du sexe) et la chirurgie sera faite dans leur 8e semaine (poids compris entre 27 et 40 g). À la fin du protocole, les souris devraient peser entre 28 et 45 g.

Rendues malades par des injections intraveineuses répétées sous anesthésie, les souris développent en dix jours une altération de leur fonction rénale. 1 360 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin de l'étude pour évaluer l'évolution de la maladie. Il s'agit d'induire deux modèles de vascularite auto-immune, puis de tester des molécules censées remplacer des immunosuppresseurs que le porteur qualifie lui-même de lourds. Celui-ci affirme qu'aucun effet significatif sur le bien-être des animaux non-humains n'a été rapporté pour ces modèles, sans nommer les molécules testées ni le seuil de la grille de score au-delà duquel les souris sont tuées.

Objectifs

Les vascularites sont un groupe de maladies auto-immunes touchant les petits vaisseaux sanguins. Parmi elles, un sous-groupe se distingue par la présence d’auto-anticorps dirigés contre certaines cellules du système immunitaire. La prise en charge thérapeutique de ces vascularites est complexe. Elle repose sur l’instauration de traitements immunosuppresseurs « lourds » (phase d’induction), qui doivent être administrés le plus rapidement possible pour éviter les séquelles, mais il est essentiel d’être certain du diagnostic. En effet, les traitements actuellement disponibles entraînent de lourds effets indésirables, et un retard thérapeutique peut grandement impacter les chances de survie des patients. Il est donc nécessaire de développer de nouveaux outils thérapeutiques pour enrichir l’arsenal thérapeutique disponible et permettre une meilleure prise en charge des patients, tout en diminuant les effets indésirables à long terme.

Bénéfices attendus

Les vascularites sont des pathologies complexes à traiter. Cette étude pourrait enrichir notre compréhension de la maladie et améliorer les options thérapeutiques en offrant un traitement moins invasif, pouvant être débuté plus rapidement pour réduire les séquelles. Un traitement plus spécifique pourrait également améliorer la qualité de vie des patients, diminuer le risque d’effets secondaires et, par conséquent, augmenter les chances de survie.

Procédures

Les souris seront prélevées pour des analyses sanguines une semaine avant le début de la procédure, puis deux fois au cours des deux semaines suivantes pendant l'induction de la pathologie. Afin de minimiser le stress lié à ces prélèvements, les souris seront sous anesthésie générale pendant le prélèvement sanguin. Les échantillons d'urine seront également collectés au même moment, en utilisant des souris vigiles et en les laissant uriner à leur convenance. L'induction de la pathologie sera réalisée selon deux modèles : Modèle 1 : L'induction se fera par une injection intrapéritonéale suivie d'injections intraveineuses sous anesthésie générale quotidiennes pendant trois jours. Modèle 2 : Ce modèle sera induit par une injection intraveineuse sous anesthésie générale, suivie, cinq jours plus tard, d'une autre injection intraveineuse sous anesthésie générale, puis d'une injection intrapéritonéale.

Impact sur les animaux

Les souris développeront progressivement une altération de la fonction rénale au cours des 10 jours d'induction de la maladie. Aucun effet significatif sur le bien-être ou le stress induit par ce modèle n'a été rapporté jusqu'à présent. Les injections intraveineuses répétées peuvent entraîner de la douleur ; ces injections seront donc réalisées sous anesthésie générale induite par isofluorane. Les souris seront ensuite soigneusement surveillées pendant leur réveil pour détecter toute réaction indésirable ou inconfort.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l'étude afin d'évaluer l'évolution de la maladie et d'analyser l'impact des molécules testées sur cette dernière.

Remplacement

Les études réalisées dans des systèmes simplifiés ont démontré l’efficacité de ces molécules. Cependant, ces systèmes ne parviennent pas à reproduire la complexité des interactions cellulaires dans un organisme entier et ne permettent pas d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nos molécules dans un contexte aussi complexe que celui de la vascularite.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire a été déterminé en fonction du nombre minimum requis pour atteindre une puissance statistique suffisante. Ce calcul prend en compte l’hétérogénéité intrinsèque des modèles de maladies induites et la nécessité de répéter chaque cohorte au moins trois fois pour minimiser les biais expérimentaux. Pour éviter tout biais lié aux cages, les animaux seront aléatoirement répartis entre les différentes cages. De plus, des études pilotes seront réalisées pour les souris génétiquement modifiées afin d’évaluer leur pertinence dans les expérimentations et, le cas échéant, réduire leur nombre en cas de résultats négatifs.

Raffinement

Chaque cage sera équipée d'enrichissements, tels que des igloos en plastique, pour permettre aux souris de se cacher et d'améliorer leur bien-être. Les gestes techniques effectués sur les animaux seront réalisés par du personnel qualifié et expérimenté afin de minimiser la douleur et la souffrance. Par ailleurs, le bien-être des animaux sera régulièrement évalué par le personnel de l'animalerie à l'aide d'une grille de score spécifique. Cette grille permet d'évaluer la souffrance animale et, si un seuil critique est atteint, des soins particuliers seront fournis aux animaux. Si les niveaux de souffrance dépassent un seuil prédéfini, les animaux seront euthanasiés conformément à cette grille.

Choix des espèces

Les modèles de vascularites disponibles incluent les modèles chez les rats et les modèles murins. Nous avons choisi d'utiliser des modèles murins en raison de l'expertise de notre équipe et du personnel de l'animalerie dans ce type de modèle. De plus, l'un des deux modèles est déjà familier à notre équipe, ce qui facilite sa mise en place. Les souris seront utilisées après leur sevrage, entre 8 et 12 semaines après leur naissance, car les modèles d'induction de vascularite ont été validés pour ces animaux à cet âge.

Injectées à trois à six reprises avec de la doxorubicine ou son véhicule, puis anesthésiées pour deux échographies cardiaques de vingt minutes, 1 440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes. 1 080 d'entre elles reçoivent en plus une greffe de cellules tumorales sous la peau, avec un suivi de la tumeur au pied à coulisse trois fois par semaine. Le projet cherche à savoir si des gènes de la réponse immunitaire protègent le cœur des effets de cette chimiothérapie, dont la cardiomyopathie touche 29 % des patients dans les cinq premières années. Le porteur qualifie la cardiotoxicité induite d'asymptomatique, avec des altérations transitoires, tout en décrivant des tumeurs pouvant se nécroser, s'ulcérer ou saigner et, plus rarement, une tachycardie, une fibrillation ventriculaire et une insuffisance cardiaque aiguë.

Objectifs

La doxorubicine est un médicament anti-cancer puissant et largement utilisé pour le traitement de différents types de carcinome chez l’homme. Toutefois, il est connu qu'il peut provoquer des effets secondaires graves, parmi lesquels le développement d’une cardiomyopathie. Bien que plusieurs modèles aient été proposés pour expliquer ce phénomène singulier de toxicité cardiaque, il n'a pas encore été possible d'identifier un mécanisme moléculaire spécifique afin de développer une stratégie pharmacologique cardio-protectrice. L'objectif de ce projet est d'évaluer si nos gènes d’intêret, impliqués dans la réponse immunitaire, jouent un rôle protectif au niveau cardiaque lors d’un traitement à la doxorubicine. L’étude de ces gènes dans ce contexte permettra la mise en place d’une stratégie cardio-protectrice.

Bénéfices attendus

La doxorubicine peut provoquer des effets secondaires graves. Parmi ceux-ci, le développement de la cardiomyopathie est parmi les plus courants, affectant 29 pour cent des patients au cours des cinq premières années de traitement. Ce projet vise à identifier les mécanismes impliqués dans le développement des effets cardiotoxiques observés, afin d’améliorer la prise en charge des patients traités avec la doxorubicine. Nous préconisions que l’accomplissement de ce projet fournira des bases pour le développement de stratégies cardioprotectrices ciblées pour les patients atteints de cancer et traités avec doxorubicine.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à: (i) l'injection de traitements intrapéritonéaux par contention de l'animal vigile (un minimum de 3 fois à un maximum de 6 fois au total/animal, 2 min/animal); (ii) 2 échographies cardiaques (20 min/animal) sur l'animal anesthésié par anesthésie gazeuse. 1080 animaux seront soumis à : (i) l’injection de cellules tumorales en sous cutané (1 fois, 5 min/animal) sur l’animal anesthésié par anesthésie gazeuse ; (ii) un suivi de la croissance tumorale par contention de l’animal vigile à l'aide d'un pied à coulisse 3 fois par semaine (5 min/animal). 360 animaux vigiles seront soumis à 2 prélèvements sanguins (4min/animal)

Impact sur les animaux

Les différentes manipulations peuvent entrainer du stress chez l’animal. La chimiothérapie et la croissance tumorale peuvent induire une perte de poids et de la diarrhée. Les tumeurs peuvent se nécroser et/ou ulcérer et/ou saigner. Les sites d’injections ainsi que les sites des prélèvements sanguins peuvent s’infecter. La cardiotoxicité qui est induite dans ce protocole est asymptomatique avec des altérations transitoires de la fonction systolique et des arythmies. Des manifestations symptomatiques graves mais rares (moins d’un pour cent) peuvent apparaître sous la forme d'une tachycardie et fibrillation ventriculaire, et d'une insuffisance cardiaque aigüe. Les risques liés à l’anesthésie peuvent être : l’hypothermie, difficultés de réveil et respiratoires.

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin de prélever des organes et faire des analyses de biologie moléculaire et cellulaires pour répondre aux enjeux scientifiques du projet.

Remplacement

Nous développons un maximum d’approches in vitro (développement de tumoroides et expériences in vitro avec coltures cellulaires humaines et murines ; mesures de paramètres biochimiques sur du sang de patients, extraction de cellules mononuclées du sang périphérique pour mise en culture puis stimulation/inhibition) dans le but de répondre à l’ensemble des questions posées dans notre projet de recherche. De plus, des études retrospectives sur coohortes de patients sont en cours. Toutefois, l’étude de la cardiotoxicité induite par la chimiothérapie rend l’étude in vivo indispensable, car il n’est pas possible d’étudier la cardiotoxicité induite par la chimiothérapie seulement dans des systèmes in vitro ou ex vivo à cause de sa complexité.

Réduction

Nous souhaiterons effectuer cette étude sur un total de 1440 souris transgéniques ou normales pour permettre d’étudier le rôle de nos gènes d’interet dans le cadre de la cardiotoxicité en réponse à la chimiothérapie et ce dans le respect du bien-être animal. Les modèles choisis sont très bien documentés dans la littérature et les protocoles solidement établis au sein de notre laboratoire, permettant ainsi de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Notamment, les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Des tests statistiques appropriés seront utilisés pour comparer les divers groupes de traitements. Une veille bibliographique attentive et constante sera effectuée pour s’assurer que les expériences planifiées n’ont pas été déjà rapportées dans la littérature scientifique.

Raffinement

Nous utiliserons des souris transgéniques viables, fertiles, de taille normale et ne présentent pas d'anomalies physiques ou comportementales. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et tunnels en cartons). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur comportement et leur bien-être. Pour l’injection de cellules tumorales par voie sous-cutanée et lors des échographies, les souris seront anesthésiées (anesthésie gazeuse). La mise en place d’un suivi des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par differentes raisons : - Les souris âgées à partir de 6 semaines seront utilisées dans cette étude afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Au sein de notre laboratoire, les protocoles expérimentaux d’induction tumorale sont bien établis.

Jusqu'à 25 injections intrapéritonéales par animal, et une prise de sang tous les quinze jours pendant huit semaines : 612 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour que leurs organes soient prélevés. Elles reçoivent du busulfan pour préparer leur moelle osseuse, une greffe de cellules de leucémie aiguë myéloïde issues de patients, puis des chimiothérapies. L'objectif déclaré est de vérifier chez la souris qu'un test de séquençage de l'ADN mitochondrial, le mitoscore, permet d'ajuster les combinaisons de médicaments patient par patient. Le choix s'est porté sur des souris NOD-SCID, immunodéprimées par construction pour que la greffe humaine prenne, et dont le porteur reconnaît le phénotype dommageable.

Objectifs

La leucémie aigüe myéloïde est une maladie du sang dont l'incidence augmente avec l'âge. Son pronostic est mauvais (environ 35 % de survie à 5 ans). Au diagnostic, une classification du pronostic est effectuée (classification ENL 2017). Cette classification permet de catégoriser le pronostic en 3 groupes (favorable, intermédiaire ou défavorable). Cette classification est complexe, coûteuse et également imparfaite. Une nouvelle classification a récemment été inventée : le mitoscore qui se base sur le séquençage de l'ADN mitochondrial. Ce test est moins couteux, plus rapide à mettre en œuvre et permet une meilleure stratification des groupes (notamment pour le groupe favorable). L'objectif du projet et de faire du mitoscore un compagnon pour la médecine de précision. Le test va mettre en avant des gènes mutés ce qui va permettre d'ajuster les combinaisons de drogues à utiliser en fonction de chaque patient. Dans un premier temps, plusieurs drogues seront testées in vitro sur des lignées cellulaires leucémiques de manière à déterminer une matrice de sensibilité en fonction du mitoscore. Dans un second temps, la matrice de sensibilité sera confirmée sur des cellules de patients atteints de LAM. C'est dans un troisième temps que nous confirmerons la stratégie sur un modèle in vivo. A la suite de ça, nous metterons au point une procédure d'imagerie non invasive pour le suivi de l'effet thérapeutique.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de cette étude est de confirmer sur modèle animal que la classification mitoscore nous permet d'ajuster la combinaison de différentes chimiothérapies à chaque cas et ainsi augmenter la réponse au traitement.

Procédures

injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse (2 fois 5minutes) prélèvements de sang sur animaux vigiles (touts les 15 jours pendant 8 semaines, 5 minutes) injection intra péritionéale sur animaux vigiles (maximum 25 fois 1 minutes)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux dans cette étude sont le phénotype dommageable des souris, les effets secondaires de l'injection de Busuflan (conditionement de la moelle osseuse pour la prise de greffe), les effets de la leucémie aigue myéloïde, les effets secondaires de la chimiothérapie de référence et les prises de sang pour le suivie de la maladie.

Devenir

Les animaux issus des procédures seront mis à mort, afin de prélever leurs organes pour des analyses anatomopathologiques.

Remplacement

À partir des gènes identifiés pour le mitoscore, 6 molécules d'intérêt ont été identifiées. Par la suite, une matrice de sensibilité sur lignée cellulaire de cellules leucémiques sera établie in vitro pour toutes les molécules candidates. Cette matrice de sensibilité sera ensuite testée ex vivo sur cellules de patients atteints de leucémie aigüe myéloïdes. Grace à cela, seulement les 3 molécules les plus prometteuses seront sélectionnées pour l'étude in vivo. Les paramètres de toxicité et d'efficacité thérapeutique sont obtenus uniquement par l'emploi d'animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l'homme. Il n'existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d'information scientifique.

Réduction

Des tests in vitro permettront de réduire le nombre de molécules et ne seront testés sur animal que les molécules ayant montré une efficacité au préalable. Concernant les tests sur animaux, nous nous efforcerons de faire en sorte que l’effectif utilisé soit minimal. Cela permettra ainsi de réduire le nombre d’animaux employés autant que possible tout en obtenant des informations scientifiques avec une validité statistique suffisante. Nous avons prévu un minimum de 30% de prise de greffe mais si ce chiffre est meilleur, nous diminuerons d'autant le nombre de souris dans ce projet. Par ailleurs, s'il s'avère que le taux de prise de greffe est inférieur à 30% le projet sera stoppé et nous réévaluerons notre étude. Dans la procédure expérimentale 2, si le véhicule des molécule candidate est le même pour toutes, nous ne ferons qu'une seule fois le groupe "chimio de référence + véhicule molécule candidate". Ce qui nous permettrai de diminué au maximum de 72 le nombre de souris. Les groupes expérimentaux sont constitués de n = 12 individus afin de disposer d’une puissance statistique suffisante pour l’évaluation de l’effet du traitement.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales seront réalisées dans un établissement autorisé et en stricte conformité avec le comité local de protection des animaux, les lignes directrices de l'UE (directive 2010/63/UE) et le Comité national français (2010/63). Les animaux seront hébergés et surveillés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément. La conception et l’application des procédures expérimentales, le soin et l’hébergement des animaux seront effectuées par du personnel compétent et formé. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, dans un environnement contrôlé dépourvu de pathogènes, enrichi avec des tunnels en carton et morceaux de papier pour y faire un nid. La nourriture et l’eau de boisson stérile sont fournies ad libitum. Les souris utilisées dans ce projet ont un phénotype dommageable, des mesures de compensatoires de raffinement ont donc été prises pour leur hébergement : les circuits sale/propres sont séparés, le box est en surpression, les cages sont stériles et jetables, la litière, les croquettes et l'enrichissent sont également stérilisés. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux garantiront leur bienêtre, et nous permettront d’intervenir immédiatement de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (administration d'un analgésique si besoin). Toutes les injection IV et les imageries seront faites sous anesthésie gazeuse. Toute forme de nuisance ou effets indésirables des procédures expérimentales seront attentivement surveillées lors de l'observation des animaux. Ces effets indésirables sont listés parmi les points limites de chaque procédure. Nous utiliserons des souris immunodéprimées qui permettent l'étude de lignées cancéreuses humaines sans phénomène de rejet.

Choix des espèces

Les souris immunodéprimées (NOD-SCID) permettrent la prise de la greffe et le développement de la leucémie aïgue myéloïde issue de patient. Souris NOD-SCID de 5 semaines. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes, de taille et de poids suffisants pour être facilement manipulables.

Mesurer le devenir d'un candidat médicament dans l'organisme, au service du développement préclinique de molécules, conduit à utiliser 2 500 souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart sont tuées pour des prélèvements terminaux de tissus, 250 étant réutilisées dans d'autres projets, dont des formations. Chaque animal peut recevoir jusqu'à deux administrations par jour pendant quinze jours, subir une chirurgie de dix à quarante-cinq minutes pour l'administration du produit, puis jusqu'à cinq prélèvements sanguins en vingt-quatre heures. Le porteur écrit que l'animal constitue un passage obligatoire avant toute administration à l'homme, et que les méthodes de substitution, quand elles existent, ne suffisent pas.

Objectifs

Chaque étude de ce projet a pour objectif d’étudier le devenir d’une molécule, candidat-médicament, chez la souris, lorsque cette espèce est utilisée au cours du développement préclinique de cette molécule. Pour cela, au cours de chaque étude, le candidat-médicament est administré par differentes voies d'administration possible. Des prélèvements sanguins répétés sont ensuite effectués pour mesurer dans le temps la concentration plasmatique du candidat médicament administré et éventuellement la concentration de différents marqueurs biologiques pertinents. En fin d'étude, différents prélèvements terminaux de tissus et/ou organes peuvent également être effectués afin dans ce cas également de mesurer la concentration de la molécule d'intérêt.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Les souris seront généralement soumises à une ou des administrations du candidat-médicament en vigile (quelques secondes à 1-2 min), sous anesthésie (1 à 5 min) ou au cours d’une chirurgie (10 à 45 min). L’administration du candidat-médicament nécessitant une chirurgie ne sera réalisée qu’une seule fois. Les autres voies pourront être utilisées plusieurs fois en suivant les recommandations éthiques et n'exèderont pas 2 administrations par jour pendant 15 jours. Puis, les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins répétés (maximum 5 prélèvements sur 24h en suivant les temps de récupération indiqués dans les recommandations éthiques). Les volumes prélevés, la fréquence de prélèvement et les temps de récupération suivent les recommandations éthiques. En général, la durée du prélèvement sanguin (contention et prélèvement) n’excède pas 2 min. Des prélèvements de tissus pourront également être réalisés en terminal sous anesthésie profonde et analgésie.

Impact sur les animaux

Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l'initiation du projet. Ils font donc l'objet d'échange avec les responsables Bien-Être Animal pour adapter les outils d'observation des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques. Les contentions des animaux vigiles pour induire l'anesthésie et administrer le produit peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. Les chirurgies peuvent induire des douleurs post-chirurgicales qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie, analgésie et un protocole de soins post-opératoire. Les souris de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture. Ils pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille lors des administrations intramusculaires, sous-cutanés, intrapéritonéales, intradermique, intramusculaire et intraveineuse ou une contrainte légère liée à l'administration per os lors de l'administration du produit ainsi qu'une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins.

Devenir

Les animaux seront mis à mort si réalisation de prélèvements terminaux, suite à des effets marqués des produits testés, si non utilisés pour d’autres projets ou si implantés avec les dispositifs médicaux. Certains animaux (ex: témoins, animaux ne présentant pas d'effets marqués après traitement) pourront être réutilisés pour d'autres projets (ex: formation) si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée et si les volumes sanguins prélevés et la période de récupération sont respectés.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour étudier la pharmacocinétique ou la biodistribution d'un candidat médicament. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : en moyenne 5 animaux par groupe. L’analyse statistique sera adaptée au modèle.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuels signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adapté afin de permettre une bonne récupération des animaux,• La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

La souris fait partie des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour les modèles animaux de la recherche biomédicale. En effet, les rongeurs et l'Homme partagent de nombreuses similarités anatomiques, physiologiques et génétiques (plus de 90% de gènes en communs). De plus, les souris sont des animaux de petite taille, facile d'entretien, avec des cycles reproductifs et de vie courts. Par conséquent, la souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour la réalisation d’études de pharmacocinétique et de biodistribution qui permettent d’analyser le devenir du produit testé dans l'organisme. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.