Souris

1 500 souris porteuses d'une mutation du gène de la dystrophine vont être utilisées, 1 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse moléculaire. Elles sont gavées chaque jour pendant trente jours au maximum, opérées sous anesthésie générale pour la pose d'une pompe osmotique sous la peau du dos, ou piquées dans le muscle, puis évaluées sur leur force en courant dans une roue d'effort et en résistant à l'agrippement. L'objectif déclaré est de valider des molécules corrigeant les mutations non-sens, étape préclinique avant un éventuel essai chez l'humain dans la myopathie de Duchenne. Le porteur écrit veiller à ne pas porter atteinte aux "libertés individuelles" des souris, et décrit le gavage comme "a priori indolore puisque très souvent la souris positionne elle-même la sonde dans sa gorge".

Objectifs

Le projet vise à valider l'utilisation de petites molécules pour corriger des mutations non-sens dans différents modèles de maladies génétiques dont la myopathie de Duchenne. Une validation in vivo sur le petit animal de molécules avec un intérêt thérapeutique potentiel est nécessaire dans une étude préclinique avant de pouvoir envisager une étape d’essai clinique éventuelle.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier des molécules correctrices de mutations non-sens capables d'agir dans un organisme complexe comme la souris. Ce projet fait donc partie d'un développement pré-clinique d'éventuels futurs médicaments pour des personnes atteintes d'une maladie génétique comme la myopathie de Duchenne. L'étude préclinique de ce type de molécule et en particulier l'analyse chez le petit animal est une étape obligatoire avant de pouvoir éventuellement tester ces molécules chez l'Homme.

Procédures

Les animaux seront exposés à des molécules candidats médicament par trois voies qui seront testées successivement si la précédente ne conduit pas à la restauration de l'expression et de la fonction du gène DMD. Ces voies seront le gavage qui sera effectué quotidiennement pendant maximum 30 jours, l'exposition sous cutanée suite à une procédure chirurgicale conduisant à la pose d'une pompe osmotique qui se déroule sous anesthésie générale et qui n'est réalisé qu'une seule fois pour un animal donné. La troisème voie d'exposition qui sera explorée est l'injection intra-musculaire qui sera réalisée sous anesthésie. Toutes ces voies d'exposition s'accompagneront d'une mesure de la force musculaire (course dans une roue d'effort et résistance à l'aggripement).

Impact sur les animaux

Ce projet a pour but de valider l’utilisation de nouvelles molécules comme éventuel candidat médicament. Bien que des tests de toxicité auront été effectués au préalable sur culture cellulaire, l’effet de ces molécules sur un organisme entier doit être évalué. Pour cela, nous veillerons à ce que ces molécules ne portent pas atteinte aux libertés individuelles de l’animal définies comme étant l’absence de faim, de soif et de malnutrition, l’absence de peur et de détresse, l’absence de stress physique et/ou thermique, l’absence de douleur, de lésions et de maladie ainsi que la liberté d'expression d'un comportement normal de son espèce. Cette observation servira à détecter une nuisance sur du long terme d'exposition à la molécule étudiée. Concernant les procédures qui seront utilisées : 1) le gavage : il s'agit d'un geste rapide a priori indolore puisque très souvent la souris positionne elle-même la sonde dans sa gorge, et qui n'entraine aucune atteinte aux libertés individuelles de l'animal. Il s'agit d'une procédure légère 2) la pompe osmotique : la pose de la pompe se fait sous anesthésie générale puis la gestion de la douleur post-opératoire par l'utilisation d'analgésique. Les autres libertés individuelles ne seront pas affectées par la procédure car la pompe est placée sous la peau dans le dos n'impactant pas le déplacement de l'animal et donc son alimentation par exemple. Cette procédure est classée modérée 3) l'injection intra-musculaire se fera sur animal endormi à l'isoflurane supprimant ainsi tout stress lié à cette procédure qui est rapide et dont la douleur correspond à une piqure d'aiguille. Il s'agit d'une procédure modérée.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de procéder à une analyse moléculaire de l'expression du gène DMD codant pour la dystrophine.

Remplacement

Ce projet est en conformité avec les exigences de remplacement puisque l'étude in vivo sur des modèles animaux est indispensable avant le passage éventuel de molécules à visée thérapeutique vers des essais cliniques.

Réduction

Le projet est conforme aux exigences de réduction puisqu'une phase exploratoire avec un nombre réduit d'animaux par lot (lot de 5) sera effectuée afin d'identifier la voie d'exposition, la concentration et la cinétique d'action de la molécule étudiée et ce afin d'abaisser au minimum le nombre d'animaux qui seront ensuite utilisés pour la démonstration de l'efficacité d'action de la molécule in vivo. Ce nombre sera de 40 ce qui correspondra à deux séries d'expériences avec 10 animaux par condition (avec et sans la molécule). La répétition de l'expérience est nécessaire pour s'affranchir d'un éventuel effet biaisé lié à la préparation de la molécule, au lot d'animaux ou à un stress survenu pendant l'expérience. Le nombre de 10 animaux par condition et par série afin de pouvoir réaliser ensuite un test statistique utilisé dans les expériences permettant d'évaluer l'efficacité d'un traitement.

Raffinement

Enfin, concernant le raffinement, l'expérience sera toujours menée de façon à prévenir ou à réduire au maximum toute souffrance. Ainsi, la voie d'exposition efficace la moins invasive sera privilégiée (le gavage par rapport à la pose d'une pompe osmotique par exemple) et une anesthésie sera effectuée lorsque cela est compatible avec l'expérience.

Choix des espèces

La souris présente l'avantage d'avoir un mécanisme de reconnaissance des codons stop prématurés semblables à celui de l'Homme (mécanisme de nonsense-mediated mRNA decay (NMD). La souris à un cycle de vie compatible avec le test in vivo sur plusieurs semaines de molécules à visées thérapeutiques. Les animaux seront utilisés à partir du sevrage et jusqu'à 5 mois après la naissance car c'est pendant cette fenêtre de temps que nous pouvons observer le mieux l'expression de la dystrophine.

Injections dans le vitré, implants cousus dans la conjonctive, la sclère ou la cornée, collyres administrés jusqu'à huit fois par jour : 1 500 souris, 1 500 rats et 1 950 lapins vont être utilisés pour provoquer chimiquement une dégénérescence de la rétine, puis tester des substances censées la freiner. 4 500 relèvent d'un niveau de souffrance léger, 450 d'un niveau modéré, et le porteur reconnaît que l'œil injecté subira une altération permanente de la vision. Il affirme par ailleurs que les maladies neurodégénératives ne sont pas douloureuses chez l'humain et transpose ce constat aux autres animaux. Tous seront tués pour analyse des tissus et dosage des produits, le projet servant aussi à la formation professionnelle et à des tests réglementaires d'efficacité.

Objectifs

La rétine est un tissu hautement spécialisé qui tapisse le fond de l'œil. Elle est composée de différents types cellulaires, elle repose sur l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) qui assure la survie et le bon fonctionnement des photorécepteurs: les cellules qui reçoivent le signal lumineux et le transforment en influx nerveux. Le signal est transmis et modulé par les autres cellules de la rétine, les cellules horizontales, bipolaires, amacrines et les cellules gliales, jusqu'aux cellules ganglionnaires dont les axones forment le nerf optique. Le nerf optique conduit le signal jusqu'au cerveau qui construit les images. Les maladies dégénératives de la rétine affectent un ou plusieurs types cellulaires. Ces maladies sont variées, liées au vieillissement comme la DMLA, héréditaires comme les rétinites pigmentaires, associées aux complications du diabète, ou encore à des traumatismes (décollement de rétine), elles entrainent soit directement l'atteinte des photorécepteurs, soit d'abord la détérioration de la RPE puis des lésions de photorécepteurs consécutives, il en résulte une baisse voire une perte de la vision pour l'œil atteint. Des auteurs ont utilisé les propriétés toxiques de certaines molécules envers des types cellulaires de la rétine afin de créer des modèles expérimentaux de dégénérescence rétinienne. Ces modèles expérimentaux permettent d'étudier les mécanismes des maladies mais aussi de tester des traitements potentiellement neuroprotecteurs. Le but de ce projet est de mettre place, en se basant sur les données bibliographiques, des modèles expérimentaux de dégénérescence rétinienne chez la souris, le rat et le lapin afin de tester l'efficacité de substances neuroprotectrices.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de participer à la recherche de nouveaux traitements neuroprotecteurs de la rétine.

Procédures

Le déclenchement du modèle expérimental est dû à une injection intrapéritonéale, intraveineuse ou intra vitréenne. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations au biomicroscope, electrorétinogramme), réalisées chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes et se produit une fois par semaine. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois par jour (dans la majorité des cas 6 à 8 administrations maximum par jour). Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leur fréquence est limitée, une à deux fois par semaine. Les administrations de produit par pose d’implant nécessitent une anesthésie et éventuellement des points de sutures au niveau des conjonctives, de la sclère ou de la cornée. Cet acte chirurgical dure cinq minutes tout au plus et sera réalisé généralement une seule fois, puisque l’implant à vocation à délivrer son contenu sur une longue période. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les maladies neurodégénératives ne sont pas douloureuses chez l'homme, et par transposition chez l’animal. Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, la pathologie devrait entrainer une altération permanente de la vision sur l'oeil ayant reçu l'injection. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant, de lampe chauffante ou d’armoire de réveil chauffée en fonction des espèces.

Devenir

Le animaux seront mis à mort pour des analyse de tissus ou dosages de produits.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse ...) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques avec possibilité d'effectuer des comparaisons multiples; chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. La possibilité d'induire les deux yeux sera étudiée pour limiter le nombre d'animaux en étude si cela est compatible avec le mode de traitement. L'induction de la pathologie dans l'œil entraine une altération partielle et permanente de la vision, nous avons déjà expérimenté ce modèle dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés par deux au minimum en première intention, avec différents enrichissements adaptés à l'espèce. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction de la quantité et des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux sont de jeunes adultes, les lapins inclus auront minimum 8 à 12 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux

Implantation d'un casque sur le crâne sous anesthésie, port prolongé d'un cache ou d'une lentille, treize anesthésies gazeuses en trois semaines, une heure d'anesthésie par injection pour l'électrorétinographie : 330 souris vont être utilisées, dont 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées, le porteur indiquant qu'étant génétiquement modifiées elles ne peuvent être ni réutilisées ni mises à la reproduction, et leurs yeux sont prélevés. Le projet cherche à comprendre le rôle d'un gène dans la cécité nocturne congénitale stationnaire, maladie qui s'accompagne souvent d'une forte myopie. Un test comportemental est annoncé, décrit seulement comme un "changement de milieu sur une courte durée", sans que sa nature soit précisée.

Objectifs

La cécité nocturne congénitale stationnaire (CNCS) est un groupe de pathologies rétiniennes cliniquement et génétiquement hétérogène. La plupart des personnes atteintes ont une acuité visuelle basse, associée à des difficultés d’orientation en condition de faible luminosité. De nombreux patients présentent également d’autres anomalies oculaires telles qu’une forte myopie (inférieure à moins 6 dioptries), un strabisme ou un nystagmus. Parmi les différentes formes de CNCS, la forme complète, CNCSc, se caractérise par un dysfonctionnement de la transmission du signal entre les photorécepteurs et une classe de cellules bipolaires. Ce mécanisme n’est actuellement toujours pas bien compris. Dans ses études précédentes, notre équipe a identifié que des mutations dans différents gènes étaient associés à la CNCSc. Nous avons aussi pu mettre en évidence que les modèles murins de CNCSc présentent des déficiences génétiques communes dans certains gènes. Le rôle précis de ces gènes dans la rétine et leur impact sur la CNCSc et la myopie sont encore mal connus. Dans ce projet, nous proposons d’élucider le rôle de l'un de ces gènes par une analyse fonctionnelle in vivo et ex vivo d’un modèle de souris privée dudit gène

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet incluront une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires menant à la myopie. La myopie étant l’affection oculaire handicapante la plus courante actuellement et avec une incidence en constante augmentation (les prédictions nous disent que la moitié de la population mondiale sera myope d’ici 2050, et 10 pourcent sera atteint d’une forte myopie). La Cécité Nocturne Congénitale Stationnaire est une maladie visuelle handicapante provoquant des symptômes variés pour laquelle aucun traitement n’existe à ce jour. Une meilleure compréhension des mécanismes induisant ces pathologies permettrait de proposer des traitements plus précoces, plus efficaces et moins invasifs que ceux déjà existant.

Procédures

Pour induire et étudier la myopie, une technique chirurgicale, effectuée sous anesthésie et analgésie, se résumant par l’implantation d’un casque sur le crâne de certains animaux est nécessaire. Pour mesurer la myopie : contention manuelle régulière et répétée de certains animaux: une fois par animal et par semaine pendant 6 semaines au total, 10 minutes par animal maximum à chaque fois. Anesthésies gazeuses répétées: Une anesthésie le jour de la chirurgie (durant 45 minutes maximum) plus 3 anesthésies maximum par semaine pour le nettoyage des lentilles et des yeux des animaux (10 minutes maximum/animal) plus Anesthésies le jour des scanners (3 fois, 15 minutes par animal maximum) soit 13 anesthésies maximum sur 3 semaines. Certains animaux seront soumis à un test comportemental impliquant un changement de milieu sur une courte durée. Anesthésie par injection le jour de l’électrorétinographie (une fois/animal, pendant une heure). Modification de l’environnement lumineux de certains animaux : abaissement de la luminosité pendant 4h à un niveau dit « de lumière basse). Les animaux seront répartis en 3 groupes distincts : le premier groupe se verra induire et mesurée la myopie, le deuxième groupe se verra analysé par électrorétinographie, le troisième groupe verra son environnement lumineux changé.

Impact sur les animaux

Certains animaux seront soumis à des contentions manuelles répétées et relativement longues, entrainant un stress. Certains des animaux seront soumis à des chirurgies : Les techniques chirurgicales peuvent mener à des pertes de poids, des infections, douleurs post-opératoire, perte de sang. Ces mêmes animaux subiront des anesthésies gazeuses répétées pouvant causer un risque léger d’hypothermie, d’insuffisance respiratoire et arrêt cardiaque. Port du cadre à lunette: qu’il s’agisse du cache-œil ou d’une lentille, le port prolongé de l’appareil peut induire une gêne et un assèchement oculaire. Certains animaux seront placés en hébergement individuel, ce qui peut entraîner des détresses sociales. Durant les tests comportementaux, certains animaux seront placés sur une plateforme durant une heure. L’arrivée dans un milieu inconnu peut stresser l’animal. Une partie des animaux seront utilisés dans le cadre de différents tests fonctionnels afin de caractériser le modèle qui implique soit une immobilisation manuelle pouvant induire un stress soit une anesthésie par injection d’anesthésiques pouvant induire un stress thermique ou des risques cardio-respiratoires. L’un de ces tests peut entrainer une cataracte temporaire. Enfin, certains animaux seront placés en illumination contrôlée sont dans une ambiance lumineuse différente de celle de leur hébergement. L’enrichissement sera réduit pendant cette procédure, ce qui peut induire un stress.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés selon la procédure réglementaire car il s'agit d'animaux OGM ne pouvant être réutilisés pour d'autres projets ou pour l'accouplement. De plus les yeux des animaux seront récupérés pour analyses post-mortem.

Remplacement

L’induction et l’étude de la myopie ainsi que la caractérisation phénotypique nécessite un œil complet, en 3D, avec sa rétine et ses tissus environnant (Choroïde, Sclère) ainsi qu’un trajet optique complet (cornée, lentille, crystallin, iris, humeur aqueuse). Aucune méthode alternative ex vivo ne permet d’obtenir des yeux en 3D.

Réduction

Afin de générer le moins d’animaux possible, nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux nécessaires pour le projet en nous basant sur les données de la littérature scientifique. Aucune étude n’a montré d’influence claire du sexe sur la Cécité Nocturne Congénitale Stationnaire et la myopie. Nous allons utiliser les animaux mâles et femelles indistinctement. Nous utiliserons comme témoins des animaux contrôles non modifiés, possédant donc le gène testé sur leurs 2 chromosomes. Nous comparerons aussi les résultats avec des animaux contrôles hétérozygotes afin de renseigner le potentiel impact de la perte du gène sur un chromosome. Le nombre d’animaux indiqué dans chaque procédure a été estimé sur la base d’expériences similaires effectuées dans notre équipe et en tenant compte des contraintes statistiques (nombre d’échantillon par groupe), des contraintes techniques (taux de réussite des expériences), des contraintes de contrôles. Nombre total d’animaux nécessaires : 330 animaux.

Raffinement

Les animaux utilisés naîtront et seront hébergés en animalerie extérieure jusqu’à expérimentation. Ils seront alors hébergés dans notre animalerie où ils observeront une période d’acclimatation de 5 jours avant toute manipulation. Pour les accouplements, les parents seront placé un mâle avec deux femelles. Les nouveaux-nés seront sevré à 21 jours après la naissance. Les animaux adultes seront placés à 5 au maximum par cage (hors accouplement), possèderont une maison et des morceaux de cellulose ainsi que des morceaux de bois. Ils auront accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les paramètres environnementaux contrôlés des animaleries seront conformes aux normes réglementaires. De l’hydrogel nutritif sera mis à disposition si nécessaire. Seul le personnel qualifié en zootechnie sera habilité à gérer l’hébergement des animaux. Seul le personnel compétent dans la manipulation des animaux sera autorisé à manipuler les animaux. Seul du personnel formé aux techniques chirurgicales du petit animal sera autorisé à procéder aux techniques chirurgicales. Le personnel de zootechnie change les cages chaque semaine et sera en charge de la surveillance de la santé des animaux. Une communication rapide entre les chercheurs et les membres de la zootechnie est assurée par la proximité géographique entre l’animalerie et le laboratoire et permettra une prise de décision rapide en cas de problème de santé des animaux. Les procédures nécessitant une anesthésie et/ou l’application d’analgésiques seront effectuées par du personnel habilité. Un système d’étiquettes et de pastilles assurera le suivi du bien être des animaux. Les informations concernant les animaux seront mutualisées sur un site web commun. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs permettant de limiter toute douleur inutile aux animaux ont été mis en place.

Choix des espèces

Nous utilisons le modèle souris car nous avons besoin d’un modèle génétique particulier qui n’existe que dans cette espèce. Certaines expériences visent à étudier le développement naturel de l'oeil. Le développement de l'oeil se mesure par réfractométrie. Les mesures de réfractométrie ne commencent à être fiables qu’à partir de 3 semaines d’âge, lorsque l’animal est sevré. Avant cela, l’œil est trop petit. En général, le développement de l'oeil des souris se termine autour de 6 semaines d’âge. Pour nous assurer d’avoir dépassé la période critique du développement, nous poursuivrons la mesure du développement jusqu’à 9 semaines d’âge. Certaines expériences nécessitent d'induire la myopie. L’induction de la myopie est plus efficace si elle débute entre 3 et 4 semaines d'âge car l’œil y est encore en phase de croissance critique. Certaines expériences consistent en la mesure post-mortem des taux de dopamine rétiniens. Pour éviter tout impact de la croissance de l'animal sur la mesure de Dopamine, nous effectuerons l’expérience à l’âge adulte. Dans un souci de cohérence, nous nous fixons sur 80 jours après la naissance car il s’agit de l’âge auquel nous avons fait des analyses similaires lors de projets précédents. Certaines expériences consistent en la caractérisation phenotypique (ie les symptômes)des animaux, nous travaillerons sur des animaux sur 2 stades adultes différents (6 semaines, 6 mois) pour documenter un possible phénotype progressif.

77 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à 56 mesures de sa tumeur au pied à coulisse, neuf administrations de composés et jusqu'à sept pesées par semaine. 65 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées, une partie après un prélèvement de sang terminal par ponction intracardiaque. Des cellules d'adénocarcinome de l'endomètre leur sont greffées sous la peau de l'omoplate, puis un radiopharmaceutique au lutétium-177 est testé en association avec le niraparib, une molécule anticancéreuse déjà utilisée chez l'humain. Le nombre d'animaux par groupe est fixé par le client qui commande l'étude, sur la base de ses résultats antérieurs.

Objectifs

Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la 2ème cause de décès dans le monde. Les modèles murins sont encore aujourd’hui indispensables en cancérologie notamment pour comprendre la physiopathologie de ces maladies, trouver des thérapies innovantes et évaluer leur efficacité. L’utilisation de radiopharmaceutiques (médicaments ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses conduisant ainsi à leur destruction grâce à l’émission de leurs rayonnements ionisants) est une nouvelle approche thérapeutique prometteuse. Notre projet vise à quantifier l’efficacité thérapeutique d’un médicament fourni par notre client couplé au radioéléments Lutetium-177 pour le traitement d’un modèle tumoral greffé chez la souris par voie sous-cutanée avec des cellules KB (cellules de cancer de l’endomètre utérin) associé à l’utilisation d'une molécule anti-cancéreuse déjà utilisée en clinique humaine. Le but est d’évaluer le retard de croissance tumorale ou sa régression, ainsi que la toxicité éventuelle de l’association proposée. La molécule testée doit viser spécifiquement les cellules tumorales pour permettre au radioélément d’y accéder et in fine de les détruire, la molécule anti-cancéreuse permet d’inhiber le système de réparation des cellules cancéreuses et potentialise donc l’action de la molécule de notre client.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de tester l’efficacité de la molécule thérapeutique de notre client couplée à un radioélément et à un traitement avec une molécule anti-cancéreuse afin de trouver une nouvelle piste thérapeutique ciblée et spécifiques de la lignée cellulaire tumorale KB (adénocarcinome de l’endomètre utérin) afin de la transférer en clinique en fonction de son efficacité et de sa toxicité éventuelle.

Procédures

Sur animal vigile : Pesée (de 2 à 7 fois/semaine, 20 s) ; Administration de composés thérapeutiques (9 fois et 2 fois max par jour, 15 s) ; Mesures de tumeurs (56 fois max et 1 fois max par jour, 15s) Sur animal anesthésié : Greffe de cellules tumorales par voie sous-cutanée (omoplate) (1 injection, 15 s) ; Prélèvement de sang terminal en intracardiaque sous analgésie (1 fois, 5 min)

Impact sur les animaux

Stress lié à l’anesthésie à l’isoflurane ; stress et douleur légère liés à l’administration des molécules en intraveineuse et par gavage oral ; stress lié à la manipulation vigile pour les pesées ou les mesures de tumeurs au pied à coulisse ; inconfort lié aux modifications des paramètres hématologiques dues à l'administration de la molécule anti-cancéreuse.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux de chaque procédure lorsque l’une des conditions ci après est remplie : prélèvement de sang ou de tumeur en cours de l’étude , atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort de l’animale et fin de l’étude

Remplacement

Evaluer l’efficacité de molécules couplées à des radioéléments nécessite d’être en présence d’un système biologique complexe. En effet, il est nécessaire dans le cadre de notre projet de vérifier que le candidat cible les cellules tumorales et de suivre son évolution dans d’autres tissus où il n’est pas souhaitable qu’il soit en trop grande quantité. l n’est pas possible aujourd’hui de faire ce suivi in vitro et l’animal reste donc le modèle le plus pertinent pour ce type de traitement.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé par groupe est déterminé par le client par des méthodes classiques statistiques en fonction des résultats préalables qu'il a obtenu avec sa molécule d'intérêt et du modèle tumoral sélectionné (homogénéité de la croissance des tumeurs SC). Ce nombre est réduit au minimum utilisable afin d'obtenir des données statistiquement relevantes.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse au maximum, les animaux sont surveillés quotidiennement et des points limites les plus précoces possibles sont mis en place. Les animaux sont également hébergés en groupes sociaux harmonieux dans un environnement enrichi comme la réglementation l'exige. Les injections et les prélèvements de sang effectués sur l’animal vivant le seront selon les bonnes pratiques de bien-être animal en termes de volumes, de matériel utilisé, d’anesthésie éventuelle et de préhension des animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies anti-cancéreuses. Les souris seront utilisées à un âge compris entre 5 et 6 semaines lors de leur entrée en étude, âge auquel le système immunitaire de ces animaux est décrit comme mature pour les souches immunocompétentes.

700 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à dix anesthésies gazeuses en trois semaines, trois contentions manuelles de dix minutes et trois semaines d'isolement en cage individuelle. 540 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées pour prélèvement des rétines. Trois ou quatre jours après leur naissance, une partie reçoit une injection de virus dans le sang, éveillée, puis un dispositif à lunette est implanté par une chirurgie de 45 minutes pour provoquer la myopie. Le porteur annonce des douleurs aiguës aux injections, des pertes de sang et des infections possibles après chirurgie, et de l'agressivité liée à l'isolement, en regard d'un bénéfice formulé comme une meilleure compréhension des mécanismes de la myopie.

Objectifs

La myopie implique des questions optiques, génétiques, mais aussi neuronales. La rétine, tapissant le fond de l’œil, est un réseau de neurones connectés de manière complexe et dont la fonction est impactée par la lumière environnante. La rétine est donc l’acteur responsable de la réception et transformation du signal lumineux en signal nerveux. Les études précédentes montrent que la rétine est impliquée dans la croissance de l’œil et l’apparition de la myopie, notamment en repérant le manque de contraste. La rétine peut donc capter le flou lumineux et envoyer aux tissus voisins les messagers chimiques nécessaires à l’accélération ou l’arrêt de la croissance de l’œil. Les mécanismes précis par lesquels la rétine y parvient sont encore sujets à débat. Durant ce projet, nous étudierons les mécanismes rétiniens intervenant dans le développement de la myopie. Ce projet a pour objectif de vérifier l’hypothèse selon laquelle une modification de l’activité neuronale de certains neurones rétiniens spécifiques a un impact sur l’apparition de la myopie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet incluront une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires menant à la myopie, qu’elle soit syndromique ou non. La myopie étant l’affection oculaire handicapante la plus courante actuellement et avec une incidence en constante augmentation (les prédictions nous disent que la moitié de la population mondiale sera myope d’ici 2050, et 10 pourcents sera atteint d’une forte myopie). Une myopie forte peut entrainer des complications telles que des glaucomes et détachements rétiniens pouvant mener à la cécité. Une meilleure compréhension des mécanismes induisant la myopie permettrait de proposer des traitements plus précoces, moins invasifs que l’opération chirurgicale.

Procédures

Certains animaux se verront administrer un virus non pathogène à un âge très précoce via une injection dans la circulation sanguine (une fois par animal), ce geste dure 5 minutes et est effectué sur animal vigile Certains animaux seront soumis à une technique chirurgicale consistant en l’implantation d’un dispositif à lunette par chirurgie effectuée sous anesthésie générale et locale avec prise en charge de la douleur avant/pendant/après la chirurgie (une fois par animal), ce geste dure 45 minutes. Les animaux seront soumis à des anesthésies gazeuse répétées (10 fois maximum par animal, étalées sur 3 semaines, chacune durant 10 minutes maximum). Certains animaux seront placés en hébergement individuel pendant 3 semaines. La myopie sera mesurée par des techniques d'imagerie et de réfractométrie non invasive mais pouvant nécessiter l'anesthésie de l'animal. Certains animaux verront leur condition d’hébergement modifiées : des flashs lumineux réguliers leur seront soumis. Contention manuelle prolongée et répétée : 3 fois/animal pendant 10 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Les injections peuvent entrainer des douleurs aigues. Les techniques chirurgicales peuvent mener à des pertes de poids, des infections, douleurs post-opératoire, perte de sang. Les anesthésies répétées peuvent causer un risque léger d’hypothermie, d’insuffisance respiratoire et arrêt cardiaque. Le port prolongé du dispositif implanté peut induire une gêne et un assèchement oculaire. De nombreux animaux seront isolés, avec un enrichissement réduit, ce qui peut induire un stress caractérisé par de l’agressivité. Enfin, les animaux seront placés en cage à illumination contrôlée, dans lesquelles une ambiance lumineuse différente de celle de leur hébergement sera imposée.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés selon la méthode réglementaire et les rétines seront récupérées pour analyses post-mortem.

Remplacement

L’induction de la myopie nécessite un œil complet, en 3D, avec sa rétine et ses tissus environnant (Choroïde, Sclère) ainsi qu’un trajet optique complet (cornée, lentille, cristallin, iris, humeur aqueuse). Aucune méthode alternative ex vivo ne permet d’obtenir un oeil en 3D.

Réduction

Afin de générer le moins d’animaux possible, nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux nécessaires pour le projet en nous basant sur les données de la littérature scientifique et nos expériences passées. De plus, nous utiliserons uniquement des animaux issus d’accouplements homozygotes. Ainsi, nous éviterons les faux/mauvais génotypes et pourrons contrôler exactement le nombre d’animaux à naître et à faire passer dans les procédures. Les accouplements seront contrôlés pour éviter les naissances d'animaux en trop. Les résultats seront soumis aux tests statistiques adéquates. Le nombre d’animaux nécessaire est obtenu en tenant compte des contraintes statistiques (nombre d’échantillon par groupe), des contraintes techniques et des contraintes de contrôles. De plus, nous nous sommes basés sur la littérature scientifique préexistante et nos expériences passées. Nombre total d’animaux nécessaires : 700

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet naîtront et seront hébergés dans notre animalerie. Des couples seront achetés puis seront hébergés dans notre animalerie. Les animaux en provenance de l'extérieur observeront une période d'acclimatation de 5 jours avant toute manipulation. Les accouplements seront constitués d’un mâle avec deux femelles. Les nouveaux-nés seront sevrés à 21 jours après la naissance. Les paramètres environnementaux contrôlés de l’animalerie sont : cycle 12h jour – 12h nuit, hygrométrie 55 pourcent plus ou moins 10 pourcent et une température 22 degrés celsius plus ou moins 2 degrés celsius. De l’hydrogel nutritif sera mis à disposition si nécessaire. Les animaux adultes seront placés à 5 maximum par cage (hors accouplement), possèderont une maison et des morceaux de cellulose ainsi que des morceaux de bois. Seul le personnel qualifié en zootechnie sera habilité à gérer l’hébergement des animaux. Seul du personnel formé aux techniques chirurgicales du petit animal sera autorisé à manipuler les animaux. Le personnel de zootechnie change les cages chaque semaine et sera en charge de la surveillance de la santé des animaux. Une communication rapide entre les chercheurs et les membres de la zootechnie est assurée par la proximité géographique entre l’animalerie et le laboratoire et permettra une prise de décision rapide en cas de problème de santé des animaux. Un système d’étiquettes et de pastilles assurera le suivi du bien être des animaux. Les informations concernant les animaux seront mutualisées sur un site internet commun. Des points limites précoces et suffisament prédictifs ont été mis en place pour épargner aux animaux toute douleur ou détresse évitable.

Choix des espèces

Nous utilisons le modèle souris car nous avons besoin de modèles génétiques particuliers présent uniquement dans cette espèce. De plus, les méthodes d’induction de myopie sur ce modèle sont bien renseignées et validées par la communauté scientifique. L’induction de la myopie est bien plus efficace si elle commence lorsque l’œil est encore en phase de croissance critique, au cours du développement de l'animal. Nous devons stimuler les neurones étudiés en parallèle de l’induction de myopie. Il est donc nécessaire que la construction virale ait eu le temps de s’intégrer au génome de l’animal avant l’induction de myopie. Les virus peuvent mettre 3 semaines à s’intégrer au génome, raison pour laquelle nous devons procéder à l'infection par la construction virale 3 ou 4 jours après la naissance afin de laisser le temps au virus de s'exprimer avant d'induire la myopie.