Souris
Compréhension des mécanismes immunitaires associés aux anticorps thérapeutiques dans un modèle d’infection respiratoire à Pseudomonas aeruginosa et évaluation d’une protection à long terme chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Infectées puis réinfectées par la bactérie Pseudomonas aeruginosa au moyen d'un cathéter introduit dans la trachée, 3 390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. 1 680 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les 1 710 autres un niveau léger. Le porteur écrit qu'aucun traitement antidouleur ni anti-inflammatoire ne peut être administré pendant l'évolution de la maladie, faute de quoi l'évaluation des traitements testés serait faussée, et décrit une inflammation et une gêne respiratoire douloureuses selon leur intensité. L'alternative aux antibiotiques que le projet dit vouloir ouvrir, des anticorps inhalés combinés à des immunomodulateurs, en reste au stade des données précliniques.
Objectifs
Les infections respiratoires provoquent le décès de plus de 3 millions de personnes chaque année dans le monde. Ces pneumonies bactériennes ou virales sont particulièrement problématiques du fait de l’augmentation importante des phénomènes de résistances aux chimiothérapies antimicrobiennes. Aujourd’hui, les anticorps sont administrés exclusivement par voie intraveineuse. Or, cette voie n’est pas appropriée pour le traitement des maladies pulmonaires. En effet, les anticorps ne diffusent pas passivement dans les différents compartiments de l’organisme. Après administration intraveineuse, seule une fraction négligeable de l’anticorps accède au territoire pulmonaire. Depuis plusieurs années, des données précliniques soutiennent l’intérêt de l’inhalation pour améliorer l’efficacité des anticorps. Cette voie d’administration est d’ores-et-déjà une référence pour l’utilisation de bronchodilatateurs ou de corticoïdes chez les patients atteints d’asthme ou de bronchopneumopathies obstructives. L’inhalation permet d’administrer d’a,nticorps directement dans le poumon, sous la forme d’un aérosol. Lors d’infections respiratoires, ceci permettrait une plus grande rapidité d’action des anticorps, une forte concentration à proximité de l’agent pathogène, tout en limitant le passage systémique et les potentiels effets secondaires des anticorps. Nous avons démontré que le processus d’aérosolisation permettait d’administrer des anticorps ayant conservé leurs propriétés physiques et immunologiques, grâce à l’utilisation de dispositifs médicaux adéquats et au développement de formulations spécifiques. Nous avons également démontré qu’un anticorps dirigé contre la bactérie Pseudomonas aeruginosa, responsable de pneumonies, administré par inhalation, atteignait les poumons en plus grande quantité comparativement à une administration par voie intraveineuse. Ceci est associé à une meilleur efficacité. Des études préliminaires ont montré qu'une administration pulmonaire unique d'un anticorps anti-microbien avec certains agents immunomodulateurs permet de protéger les individus face à une seconde infection. Ce projet vise donc à décrire et comprendre les réponses immunitaires anti-infectieuses à long terme induites par des anticorps administrés par voie pulmonaire en combinaison avec des agents immunomodulateurs afin de favoriser leur transfert vers la clinique.
Bénéfices attendus
Ce projet, basé sur des données préliminaires solides, vise à développer des stratégies thérapeutiques innovantes basées sur des combinaisons d’anticorps et d’immunomodulateurs inhalés pour induire une réponse à long terme contre des pathogènes respiratoires. Cette approche anticorps/immunomodulateurs offrirait une alternative thérapeutique aux antibiotiques/antiviraux, contre des pathogènes résistants, avec un effet durable permettant de prévenir les infections secondaires. Elles permettraient notamment de traiter les infections respiratoires à P. aeruginosa dans un contexte de bronchopneumopathies obstructives, de mucoviscidose et d’infections nosocomiales ou communautaires. Ces pathologies représentent un lourd tribut en termes de morbi/mortalité, perte de productivité et coût pour le système de santé. L’inhalation d’anticorps en combinaison avec des immunomodulateurs, pourrait offrir les avantages d’une nouvelle option thérapeutique face à l’antibiorésistance et d’un effet à long terme pour prévenir de nouvelles infections (chez un même individu) par ce pathogène, qui est rencontré à la fois lors d’infections respiratoires aigües mais aussi chroniques. Plus largement, l’inhalation d’anticorps en combinaison avec des immunomodulateurs pourraient être exploitée dans d’autres pathologies infectieuses respiratoires (infections à d’autres bactéries résistantes aux antibiotiques comme Klebsellia pneumoniae, Acinetobacter baumani ou d’autres infections virales comme le virus respiratoire syncitial, le SARS-CoV-2 ou le virus de la grippe). Les effets à court terme et à long terme des anticorps sont déjà documentés et utilisés pour le traitement de diverses pathologies. Il s’agit ici d’utiliser une voie optimale pour l’administration des anticorps à visée respiratoire (voie inhalée) et de potentialiser leurs effets en combinant les anticorps avec des immunomodulateurs pour en faire des médicaments plus efficaces contre la réapparition d’infections secondaires. La voie inhalée propose une administration non-invasive directement dans le territoire malade (poumon) pour une action rapide dans le tissu malade.
Procédures
_Infection et ré-infection par voie oro-trachéale : sous anesthésie générale, 1 fois, 1min _Administration des agents immunomodulateurs par voie intranasale : sous anesthésie générale, 1 fois, 20secondes _Administration de l’anticorps ou des agents immunomodulateurs par voie oro-trachéale : sous anesthésie générale, 1 fois, 1min _Administration des agents immunomodulateurs par voie intraveineuse : en tube à contention, 1 fois, 1min 30secondes _Administration des agents immunomodulateurs par voie orogastrique : en contention, 1 fois, 30secondes _Prélèvement de sang : sous anesthésie générale, 1 fois/semaine, 1min
Impact sur les animaux
Les infections peuvent générer une inflammation et une gêne respiratoire qui peuvent être douloureuses selon leurs intensités. Les animaux peuvent également présenter des douleurs associées à un stade avancé de la maladie. Aucun traitement antidouleur ou anti-inflammatoire ne peut malheureusement être envisagé pendant l’évolution de la maladie car ceci entrainerait un facteur confondant avec l’évaluation de l’efficacité des stratégies thérapeutiques et la compréhension des mécanismes inflammatoires/immunitaires associés. Les nuisances associées aux administrations des agents thérapeutiques/agent pathogène comprendront: le stress généré par l'anesthésie à l'isofluorane et la douleur associée à l'introduction d'un cathéter dans la trachée pour la voie orotrachéale; le stress généré par l'anesthésie à l'isofluorane et l'administration d'un bolus de 40µL pour la voie intranasale; le stress généré par la contention et la douleur associée à l'introduction d'une sonde de gavage dans l'œsophage pour la voie intragastrique; le stress généré par le maintien dans un tube à contention pour la voie intraveineuse.
Devenir
L’objectif de ce projet est d’améliorer nos connaissances dans les réponses immunitaires associées aux anticorps thérapeutiques/immunomodulateurs anti-infectieux inhalés. Ceci, afin d’améliorer leur transposabilité vers une utilisation clinique. Ainsi, à l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et des prélèvements (lavages nasaux, broncho-alvéolaires / prélèvements des poumons, rate, ganglions drainant) seront réalisés afin d’analyser les dynamiques des populations immunitaires.
Remplacement
Jusqu’à présent, aucun système in vitro ne permet de reproduire les caractéristiques/processus associés aux infections respiratoires et le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent et nécessaire pour envisager des essais cliniques chez l’Homme. Les modèles murins d’infection à P. aeruginosa sont très bien décris dans la littérature et permettent de mimer les phénomènes observés chez l’Homme. Les outils moléculaires, permettant une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires mis en jeu dans la protection à long terme induit par les Ac/immunomodulateurs, sont disponibles chez la souris.
Réduction
Le nombre d’animaux est optimisé en réalisant un maximum d’analyses sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène, …). Les modèles murins d’infection à P. aeruginosa sont maitrisés par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point. De plus, les expériences sont organisées avec des témoins choisis de sorte à limiter la répétition d’expériences. Un grand nombre de données ont déjà été générées permettant de réduire le choix des doses (bactérie et traitements) et des temps d’analyses. Nous utiliserons des outils statistiques adéquats. La souris est le modèle le plus adapté pour ces études précliniques car nous pouvons étudier la mécanistique de l’effet à long terme induit par les Ac/immunomodulateurs délivrés par voie pulmonaire avec des outils appropriés (cytométrie en flux, microscopie confocale, Luminex,….).
Raffinement
Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de l’état clinique (selon notre score) des animaux sera réalisée de façon pluriquotidienne par les expérimentateurs afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale et l’atteinte des points limites décrits. Ceci inclura une attention particulière à l’observation du poids de l'animal et d'un certains nombres de symptômes qui seront utilisés pour établir un score clinique. Si l’un des points limites est atteint, les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale après anesthésie à l’isoflurane 2,5%. Un soin particulier sera apporté les 7 jours suivants une infection avec des visites biquotidiennes à l’animalerie. De la nourriture en gel sera déposée de manière préventive dans les cages pendant cette période afin de faciliter l’accès à l’eau et à la nourriture pour les animaux impactés par l’infection.
Choix des espèces
L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable, car les réponses vaccinales font (1) intervenir un certain nombre de cellules immunitaires différentes, (2) sont directement liées au contexte inflammatoire de l’hôte et (3) dépendent de l’organe considéré et donc de la voie d’administration. Le modèle infectieux à Pseudomonas aeruginosa se caractérise par une réponse inflammatoire exacerbée rapide (1 à 3 jours). L’utilisation de la souris se justifie également d’un point de vue technique avec la disponibilité au sein du laboratoire de l’ensemble des réactifs/kits/consommables spécifiques de cette espèce permettant de caractériser les réponses immunitaires à long terme associée aux anticorps. Des animaux âgés de 6-8 semaines seront utilisés. Des individus plus jeunes (âges inférieurs à 6 semaines) sont à proscrire du fait du développement incomplet de leur système immunitaire, ce qui pourrait perturber l’évaluation des traitements. Des individus plus vieux (âges supérieurs à 12 semaines) sont également à proscrire du fait d’un poids souvent élevé incompatible avec certaines procédures. Ce facteur poids rend les animaux plus résistants à l’infection et là encore pourrait gêner la correcte évaluation de l’efficacité de la réponse immunitaire au traitement.
Le role des macrophages périvasculaires dans le drainage cérébral : effets sur les maladies neurodégénératives.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
1 036 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une seule injection dans le cou, de dix minutes, et le porteur qualifie les nuisances attendues de "très minimes" tout en signalant que les souris de la lignée APP/PS1 peuvent mourir prématurément du fait de leur phénotype dommageable. Certaines sont suivies jusqu'à 700 ou 800 jours d'âge pour observer les macrophages périvasculaires aux stades avancés, l'objectif déclaré étant de comprendre comment ces cellules participent à l'accumulation des plaques amyloïdes de la maladie d'Alzheimer. Le porteur justifie l'usage de la souris par le fait que ces macrophages n'ont été décrits que chez les rongeurs, ce qui exclut selon lui les espèces non couvertes par la réglementation comme le nématode ou la drosophile.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer, c'est quand le cerveau accumule une sorte de déchet appelé "plaque amyloïde". Cela se produit car le cerveau a des problèmes pour se débarrasser de ces déchets, ce qui fait qu'ils s'agglutinent et se déposent. On a découvert que des cellules spéciales appelées macrophages, qui normalement aident à nettoyer ces déchets, peuvent être en partie responsables de ce problème. Ils sont comme des éboueurs, mais dans ce cas, ils semblent avoir du mal à faire leur travail correctement. Notre idée, c'est de comprendre exactement comment ces cellules contribuent à la maladie d'Alzheimer, depuis le tout début jusqu'aux stades avancés. On pense qu'en comprenant mieux leur rôle, on pourrait trouver des moyens de les aider à mieux faire leur travail et ainsi empêcher l'accumulation de ces déchets. Pour cela, on va : 1. Regarder de près comment ces cellules et les plaques se développent ensemble dans le cerveau au fil du temps. On veut aussi voir quand ces cellules commencent à mal fonctionner. 2. Essayer de comprendre comment ces cellules fonctionnent au niveau moléculaire. Cela pourrait nous donner des indices sur ce qui déclenche et aggrave la maladie. On espère aussi trouver des signes qui pourraient nous aider à détecter la maladie plus tôt. 3. En comprenant mieux le rôle de ces cellules dans le nettoyage du cerveau, on espère pouvoir restaurer cette fonction chez les personnes atteintes de la maladie d'Alzheimer. Pour nos recherches, on dispose de modèles de souris qui reproduisent certains aspects de la maladie d'Alzheimer. Cela nous permettra d'étudier ces cellules et de tester des idées pour voir si elles pourraient aider à ralentir la progression de la maladie. Si nos découvertes sont fructueuses, cela pourrait ouvrir la porte à de nouveaux traitements pour la maladie d'Alzheimer et d'autres maladies du cerveau, ce qui pourrait aider à retarder leur évolution.
Bénéfices attendus
La maladie d'Alzheimer est causée par un problème de nettoyage du cerveau, mais on ne comprend pas encore très bien comment cela se produit. Avec notre recherche, nous espérons : 1. Mieux comprendre comment les macrophages périvasculaires agissent dans le cerveau. 2. Découvrir le rôle spécifique des macrophages périvasculaires dans le nettoyage des plaques amyloïdes dans le cerveau. 3. Trouver de nouvelles idées pour traiter la maladie d'Alzheimer, en plus des traitements actuels.
Procédures
Les animaux auront des injections au niveau du cou. Chaque souris subira une seule injection de 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues seront très minimes. Cependant, il est possible que les animaux soient stressés suite à leur contention et aux injections. Ils pourront donc être sujets à des fluctuations de poids et présenter une douleur locale au niveau du site d’injection, ceci pouvant se traduire par une activité/mobilité réduite. De plus, les souris de la lignée APP/PS1 peuvent être sujette à une mort prématurée, entrainant leur phénotype dommageable.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chacune des procédures dans le but de prélever les organes (cerveaux, méninges et moelle épinière) pour des études post-mortem.
Remplacement
Ce projet nécessite l’étude de macrophages dans leur contexte environnemental et dans leur tissue natif. L’étude in-vitro ne présente pas le contexte tridimensionnel et physiologique nécessaire à la caractérisation de leurs rôles, alors il n’est pas possible de s’affranchir de l’expérimentation animale. Etant donné que ces macrophages sont décrits seulement chez les rongeurs, l’utilisation des modèles animaux qui ne sont pas soumis à une règlementation comme c elegans, drosophila melanogaster, etc ; n’est pas possible.
Réduction
Sur la base de notre expérience, le nombre est calculé au plus juste pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les procédures ont été optimisées afin de minimiser le nombre d’animaux à utiliser, grâce notamment à une réalisation séquentielle de nos expériences évitant l’initiation de travaux avant la caractérisation complète des outils et méthodes utilisés. Nous utiliserons mâles et femelles ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à générer dans le cadre de l’élevage maintenu au sein de notre animalerie.
Raffinement
Toutes les expériences sont réalisées sous anesthésie générale, combinée à un traitement analgésique. De plus, les animaux seront suivis à l’aide d’une grille de score, des relevés de poids seront réalisés et des points limites précoces seront établis pour prendre en charge rapidement toute douleur ou mal être observé. Si les animaux montrent de tels signes, ils recevront un traitement adapté.
Choix des espèces
Ce projet vise à étudier les macrophages périvasculaires avant et après le déclenchement de la maladie d’Alzheimer. Ceci nécessite l’utilisation de souris du stage jeune (âge 22 jours), jeune adulte (âge 60 jours) jusqu’au stade adulte très avancé (âge 700-800 jours). Nos données suggèrent que le pic de présence des macrophages périvasculaires est aux alentours de 22 jours et que les macrophages périvasculaires sont altérés chez les souris APP/PS1 très agées. Nos données suggèrent également que le défaut de drainage observé chez nos souris est maximal à 4 mois.
Formation de personnels au prélèvement de liquide céphalorachidien sur des rats et des souris
- Formation professionnelle
Rats : 21
Pour entraîner des personnels à prélever du liquide céphalorachidien, 21 souris et 21 rats sont opérés sous anesthésie générale profonde et tués sans phase de réveil. La procédure dure quinze minutes chez les rats et vingt-cinq chez les souris, temps d'anesthésie compris, et aucune connaissance n'en sortira. Le porteur décrit un déroulé en trois temps, exposé théorique, démonstration, puis mise en pratique par les apprenants sous la surveillance d'un vétérinaire formateur. Il affirme que cette mise en pratique "ne peut être évitée" et que l'apprentissage est impossible sur des cadavres, le prélèvement n'y étant pas réalisable.
Objectifs
La bonne formation des expérimentateurs est un point clé de la réalisation d’une recherche reproductible et conclusive. Elle permet également de garantir le bien-être des animaux et de réduire le nombre d’animaux à utiliser dans les procédures. Dans ce projet, un vétérinaire va venir dans nos locaux afin de former des personnes à ce prélèvement. La partie pratique sera précédée d’un exposé théorique permettant de souligner les précautions à prendre et les raffinements à mettre en place
Bénéfices attendus
Avec ce projet nous participons à la formation aux gestes techniques des personnels impliqués dans les expériences ce qui va améliorer le bien -être des animaux et la qualité de nos recherches.
Procédures
Les animaux de ce projet seront tous amenés à subir un prélèvement de LCR sous anesthésie générale profonde. La durée de la procédure est de 15 min chez le rat et de 25min chez la souris en tenant compte du temps d’anesthésie.
Impact sur les animaux
Un inconfort et un stress transitoire lier aux injections des anesthésiques.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience sans phase de réveil.
Remplacement
Bien qu’il soit possible de se préparer à la réalisation de gestes techniques sur animal vivant par le visionnage de vidéo de démonstration, la discussion avec des experts et la lecture de référence bibliographique, la mise en pratique après une démonstration ne peut être évitée. De plus l’apprentissage ne peut pas se faire sur des animaux morts car le prélèvement n’est pas possible sur des cadavres.
Réduction
L’apprentissage sera réalisé avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux. Ainsi le vétérinaire formateur choisi est un expert en la matière. La formation sera faite en trois temps : un exposé théorique, une démonstration puis seulement après une mise en œuvre sous la surveillance du formateur par les apprenants.
Raffinement
L’apprentissage sera réalisé avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux. Ainsi le vétérinaire formateur choisi est un expert en la matière. La formation sera faite en trois temps : un exposé théorique, une démonstration puis seulement après une mise en œuvre sous la surveillance du formateur par les apprenants.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris et des rats non transgéniques. Il est important que la formation se fasse sur les espèces qui seront ensuite utilisées dans nos expérimentations. Nous utiliserons des souris de 8 semaines (35g environ) et des rats de 6 semaines (200-250g environ) afin d’être dans les conditions réelles de mise en œuvre des prélèvements de LCR.
Caractérisation du mécanisme pathologique des synucléinopathies par microscopie à fluorescence
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
968 souris vont être utilisées dans ce projet, dont 744 tuées sous anesthésie sans jamais se réveiller pour prélever des tissus destinés aux cultures de neurones et aux coupes de cerveau, et 224 soumises à un génotypage et à un tatouage à l'âge de sept jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les cultures sont préparées à partir d'embryons et de nouveau-nés jusqu'à dix jours, pour suivre au microscope l'agrégation d'une protéine rendue fluorescente. Une vingtaine de souris seront replacées en élevage pour préserver la lignée dans un projet suivant, le reste étant tué à la fin du projet. Le porteur présente la culture de cellules neuronales comme un modèle qui "remplace les expériences sur des animaux vivants", tout en précisant que cette culture exige le maintien d'une colonie de souris et le prélèvement de tissus après leur mise à mort.
Objectifs
Dans plusieurs maladies dégénératives telles que la maladie de Parkinson ou la démence à corps de Lewy, des agrégats d’une protéine appelée synucléine entrainent la mort des cellules neuronales du cerveau. La perte de ces cellules est responsable des symptômes que l’on observe chez les patients aux stades avancés de la maladie. Pour trouver un éventuel traitement il est essentiel de comprendre les premières étapes de ces maladies qui se produisent souvent plusieurs années avant les symptômes cliniques. Par contre, la plupart des recherches précédentes sur la maladie de Parkinson a étudié la formation d’agrégats dans des tubes à essai ou en utilisant des modèles expérimentaux très simples tels que les cellules de levure. Pour arriver à comprendre la maladie dans l’homme, il est pourtant nécessaire d’utiliser un modèle expérimental adapté, tel que le cerveaux de souris. L'objectif de ce projet est donc d'étudier la formation des agrégats des protéines dans des cultures de cellules neuronales de souris. Le projet devrait ainsi permettre de mieux comprendre la mort des cellules du cerveau dans la maladie de Parkinson et d'autres maladies dégénératives, et d'apporter des nouvelles pistes pour un traitement.
Bénéfices attendus
Pour ce projet, nous avons développé un nouveau modèle de souris dans lequel la protéine synucléine est fluorescente. Ceci permet de suivre son agrégation dans les cellules et tissus neuronaux à l'aide de la microscopie à fluorescence de pointe. Deux séries d’expériences sont prévues. Premièrement, nous allons cultiver des cellules neuronales prélevées des embryons, ce qui nous permet de regarder les cellules sous un microscope et de tester différents traitements pharmacologiques. Deuxièmement, nous allons étudier la présence de la synucléine dans des coupes de cerveau, pour identifier les régions du cerveau les plus affectés par la maladie. Ainsi, le projet ouvre des nouvelles pistes pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la maladie de Parkinson et d'autres maladies similaires. De plus, le modèle développé dans le cadre de ce projet représente un système expérimental puissant dans lesquels des approches thérapeutiques peuvent être testées, par exemple en utilisant des substances qui empêchent l'agrégation des protéines.
Procédures
En total 224 souris seront génotypés pour le maintien de la lignée et la sélection des animaux pour l’expérimentation. Cette procédure consiste à prélever un échantillon de tissu pour l’analyse de l’ADN des souris âgées de sept jours qui sont identifiées par tatouage réalisé en même temps. Pour les deux gestes, les souris sont tenues pendant environ 20 secondes, au cours desquelles un échantillon est prélevé (1 seconde) et le doigt tatoué (3 secondes), avant d'être replacées dans la cage.
Impact sur les animaux
Le prélèvement et le tatouage pour le génotypage sont des gestes rapides (dégrée de sévérité légère), réalisés uniquement sur certains animaux. Une légère contusion et stress associé peuvent se produire lorsque l’animal est tenu pendant cette procédure.
Devenir
Les animaux génotypés sont principalement utilisés pour des prélèvements de tissu pour l’expérimentation (cultures neuronales, immunohistochimie). Ils seront euthanasiés par une technique légale selon leur âge avant le prélèvement. Les souris génotypés qui ne sont pas utilisés dans des expériences seront euthanasiés à la fin du projet, sauf une vingtaine de souris qui pourront être replacés en élevage pour la préservation de la lignée dans le cadre d’un nouveau projet.
Remplacement
La majorité des expériences seront réalisées dans des cellules neuronales en culture ou des prélèvements de tissu. Ce modèle remplace les expériences sur des animaux vivants. Étant donné que la synucléine est fortement exprimée dans des cellules neuronales, d'autres modèles expérimentaux ne peuvent pas substituer l'utilisation du modèle animal. Cependant, la mise en culture des neurones implique le maintien d’une colonie de souris ainsi que le prélèvement de tissu après l’euthanasie des animaux.
Réduction
La lignée de souris qui contient la protéine synucléine fluorescente sera maintenue dans une forme pure (dite homozygote) dans la mesure du possible, permettant de réduire de plus de la moitié le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux est réduit au minimum nécessaire à l'obtention d'un nombre statistiquement suffisant de données expérimentales. Les expériences préliminaires pour la mise au point des techniques d'imagerie seront réalisées sur d'autres modèles cellulaires établis afin de réduire l'utilisation d'animaux le plus possible.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans une animalerie agrée, en groupe sociaux, dans des conditions de température et humidité contrôlées. Elles ont accès libre à la nourriture et l'eau. Au sevrage, des croquettes humides sont placées au fond de la cage pendant la première semaine et leur consommation est vérifiée. Les cages présentent un enrichissement du milieu dont la présence d'un "nid" sera le signe de souris calmes, regroupées et sociables. Les animaux sont régulièrement surveillés, en tenant compte de leur comportement (pas de difficulté de déplacement, isolation, signes de stress) et de l'absence de blessures.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour étudier les pathologies du cerveau, et largement utilisé dans la recherche biomédicale. Un marquage par fluorescence permet la visualisation de ces processus sous le microscope, ce qui demande la préparation des cultures neuronales à partir de tissu prélevé d'embryons et de nouveau-nés jusqu'à un âge de 10 jours. A ce stade de développement les cellules neuronales prélevés peuvent être mis en culture, ce qui permet de faire des expériences dans des cellules vivantes. L'analyse microscopique de la synucléine dans des coupes de cerveau fixé s'effectuera avec du tissu prélevé d’animaux adultes.
Combinaison de deux inhibiteurs dans un modèle de xénogreffe chez des souris immunodéficientes et des modèles d’hypercroissance 1/5
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Trente semaines de gavages quotidiens et d'injections dans l'abdomen deux fois par semaine, huit prélèvements sanguins par animal : 12 812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réparties sur cinq établissements. S'y ajoutent la pose chirurgicale d'implants d'œstrogène, une injection de cellules tumorales humaines, une ligature vasculaire et une biopsie de la queue au sixième jour de vie. Le porteur indique que le gavage comporte un risque de perforation de l'œsophage et de passage du liquide dans les poumons, et que les tumeurs devenues volumineuses provoquent des douleurs et des difficultés à s'alimenter. Les souris des procédures d'expérimentation sont tuées pour exploration anatomique, celles de l'élevage restent en vie pour l'accouplement, à l'exception des mâles immunodéficients.
Objectifs
Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.
Bénéfices attendus
Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements
Procédures
Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)
Impact sur les animaux
Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.
Devenir
Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.
Remplacement
Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.
Réduction
Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.
Raffinement
Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.
L’altération de l’activité dopaminergique dans le système olfactif comme biomarqueur de vulnérabilité aux propriétés addictives de la e-cigarette et des e-liquides aromatisés ?
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Injectées dans le cerveau et parfois équipées de fibres optiques lors d'une chirurgie d'une heure, 768 souris enchaînent jusqu'à vingt et une sessions de tests de trente minutes : vapotage et préférence de place, test de choix, labyrinthe en Y, conditionnement de préférence d'odeur. 192 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les 576 autres un niveau modéré, et des séances de restriction hydrique complètent le dispositif. Le porteur affirme que la vaporisation de e-liquide "n'a pas d'effets nuisibles", alors que le projet vise précisément à mesurer l'imprégnation en nicotine et la vulnérabilité aux propriétés addictives des arômes. Toutes les souris sont tuées à l'issue de leur procédure, une partie après un transport vers un second établissement pour une dernière mesure électrophysiologique.
Objectifs
La nicotine possède la caractéristique étonnante de n’avoir que peu d’effets euphorisants comparée à la cocaïne ou le cannabis. Pourtant, elle induit très vite une consommation soutenue et abusive malgré les conséquences négatives. La spécificité des fumeurs est d’être hypersensibles aux stimuli sensoriels associés au tabac (l’odeur ou encore le goût de la fumée, le contexte environnemental) car ceux-ci acquièrent une forte valeur attractive à force d’associations. Les fumeurs sont attachés à « leur » marque de cigarette. L’importance des stimuli olfactifs dans les effets addictifs des produits du tabac est particulièrement soulignée dans le contexte récent avec l’explosion du vapotage, utilisant des e-cigarettes (e-cig) et e-liquides avec de multiples arômes développés pour rendre le produit attrayant et spécifique. Dans ce contexte, est faite la proposition de développer un projet de recherche préclinique ambitieux qui repose sur une combinaison d'interventions cérébrales dans un modèle comportemental in vivo innovant d'addiction au vapotage avec des investigations anatomiques et fonctionnelles du système olfactif mis en jeu lors du vapotage. Ce projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
D’un point de vue santé publique, les objectifs de ce projet apporteront de nouveaux éléments essentiels pour la réflexion sur l’innocuité supposée de l’usage de la e-cigarette et des e-liquides aromatisés. Ces informations sont cruciales dans le contexte où, spontanément, la e-cigarette est conseillée dans l’optique d’une réduction des risques et les usagers la considèrent comme moins nocive que la cigarette conventionnelle sans connaitre le risque addictif lié à l’usage chronique (Déclaration haut conseil scientifique).
Procédures
Selon les procédures, les animaux seront soumis à des interventions chirurgicales (injection intracérébrale +/- implantation de fibres, 1h), et à divers tests comportementaux (maximum 21 sessions de 30 minutes environ selon les groupes) : test de vapotage et préférence de place, test de choix, labyrinthe en Y, conditionnement de préférence d'odeur. Pour une partie des animaux une procédure chirurgicale et des mesures électrophysiologiques seront réalisées dans un autre Etablissement Utilisateur.
Impact sur les animaux
Les procédures chirurgicales peuvent être source de douleurs post-opératoires pour lesquelles des traitements anatalgiques et un suivi post-opératoire sont mis en place. Les animaux sont également soumis à la vaporisation de e-liquide qui permet une imprégnation en nicotine, mais cela n'a pas d'effets nuisibles et les chambres de conditionnement sont ventilées en temps réel pour permettre l'évacuation de la vaporisation en quelques secondes. Certains animaux seront soumis à des injections de façon quotidienne durant la durée des tests comportementaux. Le transport des animaux d’un établissement à un autre peut être source de stress. La contention des animaux lors de la connection/déconnection des fibres peut être source de stress, même si les animaux sont au préalable habitués au geste. Les séances de restriction hydriques peuvent également engendrer un stress.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés. Une partie des animaux sera transportée dans un autre établissement afin de réaliser une dernière procédure avant euthanasie.
Remplacement
Nous utilisons le modèle animal pour modéliser la pathologie humaine de l'addiction au vapotage. Notre projet repose ainsi sur une approche intégrée nécessitant les capacités cognitives de l’animal et impliquant le fonctionnement du système nerveux dans son intégrité. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro ou in silico.
Réduction
Nous prévoyons d'utiliser le nombre minimal de souris nécessaires pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes. Pour les études comportementales, afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, nous effectuerons lorsque cela est possible sans biaiser les résultats de l'expérience, plusieurs tests sur les mêmes souris.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cage collectives (10/cage maximum) dans un milieu enrichi (litière de cellulose, carrés de cellulose et papier ouaté). La surveillance des animaux est réalisée quotidiennement par le zootechnicien. Toute anomalie ou souffrance évidente est signalée à l'expérimentateur et au responsable du projet qui décident de la conduite à tenir en fonction des points limites fixés. Avant toute procédure, les animaux connaissent une période d’acclimatation de minimum 7 jours, durant laquelle ils sont délicatement manipulés (handling) de façon quotidienne. Cette approche permet de limiter le stress des animaux lors du démarrage des procédures en les habituant à la préhension et à la contention. Le transport des animaux entre les deux établissements sera réalisé conformément à la charte de transport établit par l’Université de Bordeaux (distance de 50m, cages de transport adaptées et opaques, mesures d’hygiène respectées).
Choix des espèces
Les similitudes entre homme et rongeurs en terme de développement, de symptomatologie comportementale ainsi que de caractéristiques neuronales justifient l’utilisation de la souris dans nos études. Nos travaux considèrent la souris in vivo, et mettent à profit différents protocoles comportementaux irréalisables matériellement et/ou scientifiquement sur d'autres espèces. L'organisation du cerveau de souris est proche de celle du cerveau humain, ce qui permet de proposer des hypothèses de fonctionnement du cerveau humain dans le cadre des comportements spécifiques liés à la toxicomanie. Les animaux débuteront les expérimentations à l'âge de 56 jours, soit l’âge adulte. Nous choississons ce stade dévelopemental qui correspond à une maturation complète du cerveau.
Etude comparative de l’efficacité régénérative de différentes catégories de progéniteurs myogéniques utilisés en thérapie cellulaire dans deux modèles murins de dystrophie musculaire de Duchenne
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Les souris de ce projet portent une mutation qui les prive de dystrophine et ont été croisées avec des lignées immunodéficientes pour qu'elles acceptent des cellules humaines sans les rejeter. 665 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une irradiation locale sous anesthésie de vingt et une minutes au maximum, une injection d'agent de régénération dans le muscle tibial antérieur, puis une injection de cellules humaines au même endroit, une partie passant en plus quarante-cinq minutes en imagerie. Le porteur indique que l'irradiation peut provoquer un œdème, une pelade ou des ulcérations gênant les mouvements, et justifie la mise à mort de toutes les souris un mois après la greffe par la "nécessité" de retirer entièrement les muscles injectés.
Objectifs
L’objectif du projet est de comparer l’efficacité de la greffe de différents types de cellules dans la régénération musculaire, ce qui permettra ultérieurement de choisir le meilleur candidat pour de futurs essais cliniques dans le domaine des myopathies. Ce projet répondra à des questions scientifiques et représente en même temps une recherche pré-clinique. La thérapie cellulaire est une approche thérapeutique possible de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Le projet comporte deux étapes : la première consiste à mettre au point et standardiser la meilleure procédure expérimentale adaptée à nos modèles à l’aide d’études pilotes basées sur l’expérience antérieure et la bibliographie, et la seconde consiste à tester l’efficacité de différents types cellulaires. Pour faciliter le transfert à la clinique humaine, seules des cellules humaines seront utilisées, ce qui nécessitera l’utilisation d’animaux immunodéficients capables de tolérer ces greffes sans rejet immunologique. Ces animaux sont des souris modèles de la Dystrophie musculaire de Duchenne. Les explorations seront concentrées sur les muscles traités afin de classer l’efficacité des traitements étudiés. Les résultats permettront d’évaluer la faisabilité, d’affiner la logistique et d’orienter vers un projet clinique de plus grande ampleur.
Bénéfices attendus
La thérapie cellulaire est une approche thérapeutique possible des dystrophies musculaires. Sur le plan technique, une fois établi le "meilleur" candidat cellulaire il sera possible d’améliorer les paramètres de la greffe. Ces données permettront de mettre en place une nouvelle génération d’essais de thérapie cellulaire dans l’indication de la dystrophie musculaire de Duchenne, pour améliorer ou stabiliser la qualité de vie des patients. Les bénéfices de ce projet sont donc attendus dans le domaine scientifique fondamental et dans le domaine clinique. De plus, basé sur la mise en place d‘une plateforme collaborative, il bénéficiera à la communauté scientifique impliquée dans la thérapie cellulaire musculaire.
Procédures
L’ensemble des actes seront effectués sur des animaux modèles de dystrophies musculaires et immunodéficients. Une première partie des animaux servira à la mise au point de la dose d'irradiation optimale (étude pilote). Les animaux seront pesés et anesthésie afin de réaliser une irradiation à différentes doses (21 minutes maximum) suivi d’un maintien de deux semaines maximum. Une seconde partie des animaux sera utilisé pour la mise au point de la régénération musculaire (étude pilote). Les animaux seront anesthésiés et analgésiés afin de comparer l'efficacité de deux agents de régénération et de déterminer la dose minimale efficace, par injection localisée dans un muscle des pattes postérieures (Tibial antérieur). Cet acte est d’une durée de 5 minutes. Un traitement antalgique sera maintenu durant les 3 jours suivants l’injection correspondant à la période de maintien des animaux. Enfin, une dernière partie des animaux sera impliqués dans des actes successifs après les étapes de mises au point préalable. Les animaux seront irradiés localement sous anesthésie générale (21 minutes maximum), après 24h ils recevront une injection unique d’agent de régénération musculaire sous anesthésie et analgésie dans un muscle des pattes postérieures (Tibial antérieur) (5 minutes maximum), après 24h ils recevront une injection de cellules humaines sous anesthésie et analgésie au même site (5 minutes maximum). Si l’agent de régénération musculaire n’est pas toxique pour les cellules in vitro, une seule intervention d’injection sera réalisée le même jour. Un traitement antalgique sera maintenu durant les 3 jours suivants l’injection correspondant à la période de maintien des animaux. Une surveillance sera assurée quotidiennement. Après un mois d’observation, une partie des animaux de ce groupe seront analysés par imagerie (bioluminométrie) sous anesthésie après injection d’un agent produisant à l'émission des photons qui peuvent être quantifiés, et cet acte sera d’une durée de 45 minutes. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire après le temps de maintien défini (1 mois) en fonction des besoins pour prélèvements des muscles et leurs analyses.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés sont immunodéficients, ils peuvent donc être plus sensibles aux infections. Les animaux subiront une irradiation ce qui pourra induire une brûlure dans de rares car puis une perte progressive de masse musculaire vers 6-8mois (ce délai n'est pas atteint dans la procédure expérimentale). Certaines souches d'animaux immunodéficient sont plus sensibles à l'irradiation et pourront avoir un gonflement et un oedème de la peau, une pelade, ou des ulcérations, gênant les mouvements et pouvant générer de la douleur. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire. Des injections intramusculaires seront réalisées ce qui peut engendrer une douleur de courte durée au point d'injection. La solution injectée pourra générer une inflammation dans les premiers jours et dans de rares cas une gêne de la mobilité.
Devenir
La décision d’euthanasier tous les animaux à l’issue de la procédure a été prise lors de la rédaction du projet par les concepteurs, car il est nécessaire de prélever les muscles injectés, et ceci ne peut être fait sans l'euthanasie des animaux. Les animaux ne peuvent être ré-utilisés, la procédure nécessite l’exérèse totale des muscles injectés, notamment afin d’étudier les capacités de migration des cellules injectées.
Remplacement
Le but du projet est d’évaluer la capacité régénérative musculaire de différents types de cellules pour développer une thérapie cellulaire dans l’espoir de soigner la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Au stade où les différents candidats cellulaires sont utilisés, ils ont déjà fait la preuve in vitro de leur capacité à fusionner et à former des petites fibres musculaires. Les modèles de cultures en deux dimensions ne représentent pas l’architecture musculaire ni les capacités contractiles et ne permettent pas de renseigner les déplacements des cellules injectées. Les modèles in-vitro de mini-muscle en trois dimensions qui existent ne renferment qu’un ou deux types cellulaires et aucun modèle pathologique complexe n’est encore développé. C’est pourquoi l’utilisation d’un modèle animal est indispensable, car l’étude de la régénération doit prendre en compte l’environnement physiologique, les différents types cellulaires, les signaux et le micro-environnement d’un muscle qui influencent cette capacité régénérative, particulièrement dans un organisme malade. Les lignées de souris utilisées dans ce projet sont immunodéficientes et permettent la prise de greffe xénogénique (d’une espèce animale à une autre). Ainsi, le modèle peut être similaire à la DMD humaine.
Réduction
665 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les études pilotes permettront d'optimiser les conditions et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Les animaux immunodéficients sont hébergés dans une pièce dédiée de statut sanitaire contrôlé, la nourriture et la litière sont irradiées et l’eau est osmosée. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés (anesthésie, analgésie...) ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
La souris utilisée ici est un modèle classique de la dystrophie musculaire de Duchenne. Une mutation spontanée empêche l’expression de la dystrophine. Cet animal ne présente pas de signes cliniques avant un âge avancé (15-18 mois), ni de phénotype myopathique dommageable. Pour accepter les greffes de cellules humaines sans rejet immunologique, les souris ont été croisées avec des modèles immunodéficients. Ces modèles sont stabilisés et déjà existants. L’utilisation des modèles se justifie par leur différence de réactivité immunologique, et par des différences de susceptibilté à certains traitements musculaires. Les souris seront utilisées pour les greffes de cellules à l’âge de 3 à 5 mois. Dans ces modèles, un pic spontané de dégénérescence et régénération musculaire survient à l’âge de 3 à 10 semaines. Bien que la cause exacte de ce pic ne soit pas totalement élucidée, il s’agit probablement d’une mobilisation musculaire importante et nouvelle, qui coïncide avec la période du sevrage, le changement d’alimentation, l’acquisition d’une mobilité de plus en plus importante, la croissance des membres. Pour éviter les variabilités inter-animales liées à ce pic de remaniement musculaire, nous utiliserons des animaux ayant franchi ce cap, donc après l’âge de 3 mois. Par ailleurs, au-delà de 6 mois, certains animaux peuvent commencer à développer des anticorps susceptibles de permettre un rejet chronique des greffes, et c'est encore une variabilité que nous devons éviter. Les souris étant euthanasiées 1 mois après la transplantation cellulaire, soit au plus tard vers l’âge de 6 mois, nous pouvons réaliser les greffes dans une fenêtre d'âge de 3 à 5 mois.
Effet de l’alimentation cétogène sur la progression tumorale dans un modèle murin de cancer prostatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Cinq injections en cinq jours, une castration chirurgicale trois mois plus tard, puis des prises de sang répétées de mois en mois : 300 souris mâles suivent ce protocole dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées deux mois après le début des expériences pour prélever leurs organes. Des lésions prostatiques leur sont d'abord provoquées par inactivation génique, avant de comparer trois régimes alimentaires dont une alimentation cétogène. Le porteur indique que les mesures de glycémie créent un inconfort et que la présence de sang dans la cage peut déclencher des comportements agressifs entre congénères, tout en affirmant n'avoir observé aucun inconfort majeur lors du suivi des lésions. L'allongement de la durée de vie des patients atteints d'un cancer de la prostate résistant à la castration reste annoncé au conditionnel.
Objectifs
L’objectif du projet de recherche translationnelle est d'explorer le rôle spécifique de l'alimentation, en particulier la restriction en glucides, dans la croissance des tumeurs des cancers résistants à l'hormonothérapie. En mettant l'accent sur la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents, nous aspirons à identifier des cibles thérapeutiques potentielles pour surmonter la résistance à l'hormonothérapie, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives pour le traitement du cancer de la prostate.
Bénéfices attendus
Ce projet explore l'impact positif attendu de l'alimentation cétogène sur la progression tumorale et la résistance à la castration dans un modèle murin de cancer de la prostate. En s'appuyant sur les observations antérieures qui ont démontré les avantages de l'alimentation cétogène dans le cancer mammaire, et en dévoilant les mécanismes sousjacents, cette étude pourrait potentiellement ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques pour le traitement de cette forme agressive de cancer de la prostate, et allonger la durée de vie des patients.
Procédures
Les souris subiront 5 injections sur 5 jours sur animal vigile sous contention (20 secondes de contention par injection), puis une intervention chirurgicale, sous anesthésie,3 mois plus tard durant environ 30 minutes. 6 prises de sang par test seront effectuées sur l'animal vigile pour quelques gouttes de sang (1 minutes maximum par prélèvement) à un intervalle de 1mois (3 tests sont prévus au total). 2 prélèvements sanguins de 5µL/g de souris vigile seront effectués, durant 1 minute au maximum.
Impact sur les animaux
Les injections et les prélèvements sanguins seront réalisés par des personnes agréées et compétentes, mais dans de rares cas peuvent conduite à une infection de la zone d'administration. L'orchidectomie (anesthésie et geste chirurgical) est une opération rapide qui est bien maitrisée au laboratoire. Après l'inactivation des gènes, l'évolution des lésions prostatiques sera monitorée mais d'après nos expériences, aucun inconfort majeur n'a été observé. Les mesures de glycémie peuvent entrainer un inconfort chez l'animal. La présence de sang dans la cage peut générer un comportement agressif.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter les organes et de les analyser.
Remplacement
Aucun modèle cellulaire ne reproduit la cinétique et la complexité cellulaires associées à la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité souligne l'importance d'expérimentations in vivo pour élucider ce phénomène et identifier des cibles thérapeutiques potentielles. Les avancées notables en oncologie ont mis en lumière l'importance cruciale du microenvironnement tumoral dans le développement du cancer, avec ses interactions complexes impliquant le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. Ces mécanismes régulateurs et interactions cellulaires ne peuvent être pleinement compris qu'au sein d'un organisme vivant. Actuellement, l'évaluation des avantages potentiels d'une stratégie alimentaire in vitro demeure impossible, et il est impraticable pour les patients d'évaluer les bienfaits des régimes alimentaires en dehors de tout traitement conventionnel. Les progrès significatifs en oncologie ont largement découlé de l'utilisation de modèles animaux, soulignant leur importance. Les souris, partageant les mêmes protéines que l'homme, simplifient la génération des mutations couramment observées dans le cancer de la prostate humain. Ces similitudes permettront une étude approfondie de l'évolution des lésions prostatiques, favorisant ainsi le développement de traitement précoce. Un suivi bibliographique attentif évitera la redondance avec des travaux existants.
Réduction
Afin de différencier les rôles de différentes alimentations pouvant favoriser ou retarder le développement du cancer de la prostate, l’ensemble du projet va nécessiter l'utilisation de 300 animaux. Ce nombre d'animaux nous permettra d'obtenir des conclusions. Afin d'obtenir des résultats significatifs, de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués et en raison de l'hétérogénéité des souris, nous étudierons 2 lignées de souris, une qui développe un cancer, souris dites « d’étude » et une qui n’en développe pas, souris dites « contrôles », il nous faut utiliser 40 souris par groupe pour les souris d’études (20 pour les analyses histologiques et 20 pour l'analyse moléculaire) ainsi que 10 souris par groupe pour les souris contrôle (5 pour les analyses histologiques et 5 pour l'analyse moléculaire). Nous avons 3 types d'alimentations, 2 procédures chirurgicales. En conclusion, il nous faudra 50*3*2 souris soit 300 souris afin de confirmer le ralentissement de la croissance tumorale avec l’alimentation cétogène. Nous comparerons l’effet de la castration par rapport au groupe contrôle ainsi que le changement alimentaire par rapport à l’alimentation standard. Nous utiliserons, dans une première analyse, des paramètres quantitatifs (expression de gènes, nombre de cellules positives pour certains marqueurs histologiques, poids des tumeurs, poids des animaux) et également qualitatifs (expression ou non d'un marqueur au niveau histologique). Si la normalité le permet, nous analyserons les données plus finement en utilisant un test statistique.
Raffinement
L'expertise du laboratoire dans l'étude de l'évolution des lésions précancéreuses prostatiques permettra la mise en place d’expérimentations de qualité et avec des points critiques étroitement surveillés. Durant la durée de l'étude, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement. Les souris seront soumises à une anesthésie générale. En post-opératoire, une analgésie systématique sera administrée. Un suivi attentif de la zone d'incision sera effectué, comprenant la surveillance des points de suture, la palpation abdominale et l'inspection à la recherche de signes d'infection locale. En cas de manifestations douloureuses, l'administration d'analgésique pourra être répétée jusqu'à trois fois par jour. Si un point limite est atteint, la mise à mort de l'animal sera réalisée. Pour préserver le bien-être social des animaux, des groupes de deux ou trois seront maintenus et les souris seront réintroduites dans leur cage respective avec leurs partenaires préalables, évitant ainsi toute situation d'isolement. De plus, une séparation entre les animaux castrés et ceux soumis à la procédure contrôle sera mise en place, afin de minimiser les risques de comportements dominants.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin récapitule de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. Ces souris nous permettront d’étudier l’évolution des lésions de cancer de la prostate (CaP) afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris auront le même fond génétique enrichi. Les souris mâles (étude du cancer de la prostate) utilisés seront adultes. A l'âge de 8 à 12 semaines (jeunes mâles pubères), nous induirons le développement de tumeurs. Puis, 3 mois plus tard (soit vers les 5 mois de la souris correspondant à un adulte), nous débutons les expériences (castration et changement alimentaire) avec les différents groupes expérimentaux. Nous mettrons à mort 2 mois après le début des expériences.
Prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique de modèles murins permettant l’étude des mécanismes gouvernant le développement des cellules germinales
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
13 000 souris vont être utilisées pour un unique geste de quelques secondes chacune, une biopsie de la queue pratiquée sur animal vigile dès l'âge de dix jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ce prélèvement sert à trier les descendants de croisements destinés à invalider seize gènes de la reproduction. Le porteur reconnaît que la contention et le geste provoquent une douleur légère et un stress. Les souris dont le génotype ne convient pas sont tuées et leurs tissus récupérés, les autres restent en vie pour intégrer d'autres projets de recherche que le RNT ne décrit pas.
Objectifs
L’objectif principal du projet est d’acquérir de nouvelles connaissances fondamentales dans le domaine de la biologie de la reproduction. Plus précisément, ce projet vise à comprendre les mécanismes qui gouvernent la gamétogenèse, le processus biologique qui permet la formation des gamètes, les cellules sexuelles impliquées dans la reproduction. Pour cela seize gènes clefs vont être étudiés. Afin de mieux comprendre leur fonction nous étudierons l’effet de leur invalidation au cours de la gamétogenèse. Le second objectif de ce projet est d’identifier de potentielles causes génétiques d’infertilité. L’infertilité est une pathologie qui touche environ un couple sur six et dans de nombreux cas les causes en demeurent inconnues. Mieux comprendre les acteurs impliqués dans le processus de gamétogenèse et les mécanismes associés permettra de mieux diagnostiquer l’infertilité.
Bénéfices attendus
La fonction de reproduction est très particulière. C’est en effet une des premières à se mettre en place au cours du développement et une des dernières à devenir fonctionnelle à l’âge adulte (c.a.d. lorsqu’un individu souhaitera procréer). Il existe de ce fait une ‘boite noire’ entre le moment où cette fonction peut être altérée et le moment de la découverte de l’infertilité. Il est donc capital de prévenir autant que de ‘guérir’ toute atteinte à la fonction de reproduction et ceci implique une connaissance poussée des mécanismes biologiques impliqués. La compréhension du rôle des gènes est essentielle pour comprendre globalement la gamétogenèse, et donc ce qui assure la fertilité. Connaitre les gènes et comprendre les processus permettra d’identifier les causes génétiques et améliorera la prise en charge et le conseil apporté aux patients. Plus spécifiquement, notre projet améliorera cet aspect en apportant des connaissances fondamentales sur les étapes dérégulées lorsque des gènes impliqués en méiose sont invalidés. La méiose est le processus qui permet la formation des gamètes haploïdes (ovules et spermatozoïdes).
Procédures
Un biopsie de queue sera réalisé sur animal vigile afin de déterminer son statut génétique. La durée de cette procédure est de quelques secondes. Un prélèvement unique sera réalisé par animal. Celui-ci servira à déterminer le statut génétique de l’animal. En effet, afin d’étudier le rôle d’un gène dans la fonction de reproduction, nous produirons des animaux déficients pour ce gène à partir de croisements d’individus hétérozygotes (ne possédant qu’une copie sur deux du gène invalidés). Les descendants de ces animaux seront alors soit sauvages génétiquement (avec les deux copies du gène non mutées) soit hétérozygotes, soit homozygotes mutants (avec les deux copies du gène mutées). Nous allons comparer les tissus reproducteurs des animaux homozygotes à ceux des animaux sauvages pour comprendre l’effet de l’invalidation du gène candidat. Les animaux hétérozygotes serviront à maintenir la lignée. Exceptionnellement si le résultat de l’analyse génétique, n’est pas concluant, un second prélèvement peut être envisagé.
Impact sur les animaux
La biopsie de queue est un geste qui provoque une douleur légère. L’animal est maintenu en contention (pour éviter qu’il bouge) lors du prélèvement ce qui représente une source de stress.
Devenir
A l’issue de la procédure (prélèvement d’un morceau de queue) tous les animaux sont maintenus en vie. au-delà, les animaux dont le génotype ne convient pas seront euthanasiés et leurs tissus pourront être récupérés post-mortem. Les autres animaux seront maintenus en vie pour intégrer des projets de recherche nécessitant ce type d’animaux.
Remplacement
La fonction de reproduction ne peut être efficacement modélisée in vitro car elle implique plusieurs tissus et types cellulaires en interaction. De plus, l’étape centrale de la gamétogenèse, la méiose, est absolument impossible à mimer avec une lignée cellulaire. En effet, la méiose est une division cellulaire différente de la mitose qui ne permet pas la multiplication cellulaire et donc exclut l’usage d’une lignée cellulaire par définition. La souris est un modèle de choix pour l’étude de la fonction de reproduction du fait de son cycle rapide de reproduction et de l’existence de nombreux modèles mutants avec des phénotypes finement décrits dans la littérature facilitant la comparaison des données. A ce jour cette méthode, la biopsie de queue, est la seule parfaitement maitrisée au sein de notre laboratoire pour le génotypage des souris portant des constructions génétiques spécifiques. Ce processus est nécessaire pour valider les études utilisant des lignées d’animaux génétiquement modifiés, et permettre l’entretien de ces lignées.
Réduction
Sur la base de notre expérience, nous avons estimé le nombre d’animaux requis pour l’étude de ces différents gènes en fonction des étapes supposées être atteintes. Le croisement d’animaux hétérozygotes permettra de générer à la fois des animaux homozygotes et sauvages dont les phénotypes seront comparés. L’étude du processus de reproduction dans les deux sexes simultanément devrait limiter la génération d’animaux non exploités. Les animaux hétérozygotes issus des mêmes croisements serviront à maintenir les lignées.
Raffinement
Les biopsies sont réalisées par un personnel expérimenté. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Elles sont réalisées avec du matériel adapté permettant un geste rapide et précis. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les souriceaux âgés de 10 à 21 jours sont remis en présence de leur mère. Un suivi des animaux est réalisé suite à cette procédure et des points limites adaptés ont été mis en place. Dans les cas exceptionnels ou une seconde biopsie serait requise au-delà de 21 jours, un protocole d’anesthésie/analgésie sera mis en place.
Choix des espèces
Les souris sont de petits animaux au développement et à la reproduction rapides. Les modèles murins génétiquement modifiés sont très utilisés pour comprendre des pathologies humaines, notamment l’infertilité, car les souris possèdent de grandes similarités génétiques avec l'être humain. La production des cellules sexuelles est bien décrite dans cette espèce et il est donc aisé, par comparaison, de positionner le rôle d’un nouveau gène. Chez les vertébrés, il n’existe pas d’autre modèle dans lequel autant de mutations affectant la fertilité aient été décrites. Chez les organismes modèles invertébrés (levure, ver, mouche) de nombreuses mutations affectant la fertilité sont rapportées mais la conservation des gènes est relativement faible vis-à-vis de l’espèce humaine. Les biopsies de queues sont réalisées sur des animaux âgés d’au moins 10 jours. Le génotypage (pour visualiser le(s) gène(s) d’intérêt) des lignées est essentiellement réalisé à cet âge pour permettre d'avoir le résultat au sevrage et de sélectionner uniquement les animaux d'intérêt à l’âge adulte.
L’axe cerveau-intestin comme voie d’élimination des protéines toxiques de la maladie d’Alzheimer.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour vérifier si une voie de communication entre le cerveau et l'intestin élimine les déchets cérébraux, 485 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 115 d'entre elles sans jamais se réveiller et 370 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une neurochirurgie de quinze minutes, un prélèvement sanguin, une heure d'imagerie sous anesthésie et une injection dans l'abdomen pratiquée sur animal vigile. Le porteur indique que ces gestes peuvent provoquer une douleur post-opératoire, une perte de poids et une accumulation de liquide dans le cerveau. Le bénéfice annoncé se limite à de nouvelles perspectives de diagnostic précoce, et le choix de l'espèce repose sur des souris transgéniques exprimant les protéines toxiques de la maladie d'Alzheimer, auxquelles s'ajoutent des souris rendues déficientes pour l'élimination des déchets du cerveau.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer est la principale cause de démence chez l’Homme. Elle résulte d'une dégénérescence irréversible des neurones responsable d’un déclin progressif des principales fonctions d'apprentissage et de mémorisation dû à une accumulation cérébrale de protéines toxiques. Les patients doivent endurer une perte irréversible de leurs fonctions cérébrales puisqu'à l'heure actuelle, aucun traitement ne permet de stopper l'évolution de la pathologie. Une nouvelle voie de communication entre le cerveau et l’intestin a été identifiée, celle-ci pourrait être impliquée dans l’élimination des déchets du cerveau. Ce projet a pour but de confirmer cette hypothèse afin de développer de nouvelles méthodes de diagnostics de la maladie et donc d’augmenter l’efficacité des traitements.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de mettre en évidence une nouvelle voie d'élimination des protéines toxiques impliquées dans la maladie d’Alzheimer. Ce nouveau mécanisme pourrait donner de nouvelles perspectives de diagnostic précoce de la maladie.
Procédures
Les animaux subiront une neurochirurgie (15 minutes), un prélèvement sanguin (moins de 10 minutes), un examen d'imagerie médicale (1 heure) et une injection dans l'abdomen (moins de 5 minutes). Seule l'injection dans l'abdomen se déroulera sur des animaux vigiles. La neurochirurgie, le prélèvement sanguin et l'examen d'imagerie médicale se dérouleront sous anesthésie.
Impact sur les animaux
La neurochirurgie et l'injection dans l'abdomen peuvent induire une douleur légère post-opératoire ainsi qu'une perte de poids. L'effet indésirable serait l'apparition d'une accumulation de liquide dans le cerveau. L'examen d'imagerie médicale peut induire une légère hypothermie.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort pour des examens sur les tissus prélevés.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants permettant cette étude. Ce projet porte sur un mécanisme d’interaction indirecte entre le cerveau et l’intestin nécessitant la mise en place de réseaux qu’il n’est pas possible de reproduire par des modèles de culture cellulaire ou d’autres approches in vitro. De plus, le modèle souris permet d’avoir accès à des lignées génétiquement modifiées, modèles de la pathologie humaine.
Réduction
Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Les mises au point seront réalisées sur de petits groupes d’animaux.
Raffinement
Pour les animaux recevant des injections dans le cerveau, leur état de santé sera suivi tout au long de l’expérience. Des médicaments anti-douleur généraux et locaux seront injecté en sous-cutané en pré et post-opératoire afin de prévenir le développement de douleurs. Ces chirurgies se feront sous anesthésie. Les yeux seront protégés durant l’anesthésie avec un protecteur oculaire. Les animaux seront disposés sur une couverture chauffante à température contrôlée afin d’éviter l’hypothermie. En cas de signe d’alerte, l’alimentation sera supplémentée par une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie. Aussi, des critères d'arrêt des souffrances seront clairement identifés afin de limiter les souffrances des animaux.
Choix des espèces
Le modèle souris permet d’avoir accès à des modèles transgéniques mimant certaines pathologies humaines. Dans ce projet, l'existence de modèles transgéniques rongeurs exprimant des protéines toxiques impliquées dans les formes familiales génétiques de la maladie permet de mimer la maladie d’Alzheimer. De plus, des souris démontrant une déficience dans l'élimination des déchets du cerveaux seront également utilisées. La similarité moléculaire, cellulaire et fonctionnelle de cette espèce en fait un modèle de choix pour cette étude. Les animaux seront utilisés à l’âge de 3 mois ou 9 mois afin d’étudier différents stades de la pathologie.
Évaluation du phénotype d’une lignée de souris génétiquement modifiées pour 2 gènes impliqués dans la formation et le fonctionnement de l’appareil uro-génital
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Ces souris sont créées pour vérifier si une double modification génétique les rend malades, sans que soit connue l'incidence des atteintes ni le délai de leur apparition. 232 vont être utilisées, 190 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère et 42 un niveau modéré. Le porteur anticipe des malformations possibles, absence d'un rein ou des deux gonades, insuffisance rénale, déshydratation, stérilité, et encadre le suivi par deux grilles d'observation et des points limites précoces. Les croisements courent sur trois générations, 190 souris reçoivent une injection, 42 sont déclarées réutilisées dans un projet ultérieur sur le développement embryonnaire, et le résumé indique par ailleurs que tous les animaux seront mis à mort.
Objectifs
Dans ce projet, nous allons créer des animaux avec des caractéristiques spéciales et vérifier s'ils présentent des problèmes de santé sur trois générations. Si nous ne remarquons aucun problème majeur qui pourrait les faire souffrir ou mettre leur vie en danger, nous continuerons à les élever et à vérifier pendant trois générations. Si encore sur la 3ème génération leur état de santé reste le même, certains de ces animaux seront utilisés pour une étude sur la prolifération des cellules. Les autres animaux seront utilisés dans un projet futur pour examiner comment un certain gène affecte le développement des embryons. Nous avons calculé que nous aurons besoin de 232 animaux au total.
Bénéfices attendus
Les anomalies congénitales sévères représentent un enjeu majeur de santé publique. A titre d’exemple, l’incidence sur la malformation rénale concerne un nouveau-né sur 500 en Europe. Au-delà des nouvelles connaissances sur les mécanismes d’action du gène en question, nos travaux contribueront à une meilleure compréhension et prise en charge des pathologies humaines qui ont pour l’origine des malformation congénitales.
Procédures
- Accouplements naturels de mâles et de femelles provenant de 2 lignées à phénotype non dommageables (10 secondes) plusieurs fois. A partir du sevrage : - Prélèvement par earpunch pour le génotypage (30 secondes). -Pesée 2 fois par semaine (20 seconds) jusqu’à l’âge de 2 mois puis 1fois/semaine jusqu’au 3ème mois puis 1 fois/mois jusqu’au 6ème mois. - Autre intervention : 1 injection sur 190 animaux vigiles (20 secondes par injection).
Impact sur les animaux
Dans l’état actuel de nos connaissances nous ne savons pas si les animaux vont avoir des problèmes de santé. C’est la raison pour laquelle nous envisageons de faire cette évaluation. Nous ne connaissons pas l’incidence de maladie sur ce modèle de souris ni le temps que cela peut prendre à se manifester. Les animaux pourraient développer des malformations (exemple : absence d’un rein ou des 2 gonades. Si ces malformations sont moins majeures, elles peuvent engendrer des dysfonctionnements des organes uro-génitaux comme l’insuffisance rénale, la déshydratation ou la stérilité. La contention cause du stress et la piqure cause une légère douleur.
Devenir
A terme d’observation sur 3 générations, et l’analyse de prolifération cellulaire, tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Nous avons les outils et l’expertise d’étudier certaines fonctions de notre gène d’intérêt dans une boîte de pétri et nous le réalisons à chaque étape que nous le pouvons. Toutefois, ce gène a un rôle important dans la formation de plusieurs organes pendant la formation de l’embryon. Par conséquent pour mieux comprendre le fonctionnement de ce gène, il est nécessaire de l’étudier dans sa globalité en occurrence dans un organisme vivant.
Réduction
En nous appuyant sur la littérature et notre propre expérience, nous prévoyons l’analyse de 4 portées issus de 4 couples indépendants au cours de 3 générations pour évaluer le phénotype de la lignée générée dans ce projet. Le nombre minimum d’animaux nécessaire a été établi en nous appuyant sur les probabilités génétiques et des schémas d’accouplement optimisés. Le nombre minimum d’animaux nécessaire pour l’analyse de la prolifération cellulaire que nous envisageons a été déterminé par des calculs statistiques basé sur un calcul de puissance associé à l’utilisation de tests de significativité statistiques.
Raffinement
L’élevage des animaux est maintenu à l’état hétérozygote pour prévenir l’apparition du phénotype dommageable. Outre de leur fournir un environnement enrichi pour satisfaire leur besoin de rongeur et leur instinct de nidification, de les héberger en permanence avec leur congénère de même portée, de les surveiller au quotidien, nous avons établis 2 grilles d’observation selon lesquels, les personnels formés et compétents noteront la moindre anomalie susceptible de compromettre leur état de santé, leur comportement et leur bien-être et prévoyant des points limites précoces et adaptés. Les accouplements seront programmés afin d’optimiser la surveillance des animaux au cours de laquelle des scores critiques pourraient être atteints (avortement spontané, risques de dystocie). Un vétérinaire dédié de manière permanente à notre animalerie est disponible à toutes nos requêtes sur l’état de santé de nos animaux et plus particulièrement de ceux sous la procédure.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme. Le modèle de souris mutante pour le gène étudié dans ce projet mime fidèlement la pathologie humaine résultant du dysfonctionnement de gènes humains homologues. Les stades du développement : Depuis la naissance jusqu’ à l’âge de 6 mois, période nécessaire et suffisante pour évaluer le bien-être de la lignée génétiquement modifiée créée dans ce projet. Les femelles âgées de 8 semaines à l’optimum de leur maturité sexuelle pour la production d’embryons objets de l’étude.
Analyse du rôle d’un gène dans la prédisposition et la progression des lésions précancéreuses pancréatiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Six injections abdominales par jour pendant deux jours, puis six par jour un jour par semaine pendant quatre semaines, après quatre premières injections quotidiennes à l'âge de cinq semaines : 160 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces injections déclenchent les modifications génétiques et favorisent des lésions précancéreuses du pancréas, dont le porteur attend une légère perte de poids le lendemain de chaque séance. Les souriceaux sont tatoués à la base des phalanges et amputés de moins de 2 mm de queue pour le génotypage. Le modèle repose sur des souris génétiquement modifiées prédisposées à ces lésions, tuées avant le stade du cancer pour analyser ce qui le précède.
Objectifs
Les cellules acineuses du pancréas sécrètent des enzymes digestives transportées dans les canaux pancréatiques jusqu’au tube digestif pour la digestion des aliments. La grande majorité des cancers du pancréas sont initiés par la transformation de ces cellules, notamment via l’activation du gène KRAS connu pour favoriser les cancers. Une inflammation progressive du pancréas associée à une perte des cellules acineuses constituent la pancréatite chronique. Elle peut être causée par des calculs biliaires, l’alcool, le tabagisme et des facteurs génétiques, mais environ 20 % des cas de pancréatite chronique ont une cause inconnue. Ces modifications du tissu pancréatique sont des facteurs de risque de cancer du pancréas. Ce cancer, en constante augmentation, est un des plus agressifs (taux de survie à 5 ans inférieur à 8%), notamment parce qu’il est dans la majorité des cas diagnostiqué trop tardivement. Il est crucial de mieux comprendre les causes de la pancréatite chronique et les facteurs qui favorisent les étapes précoces du cancer du pancréas. Notre objectif est d’étudier le rôle d’un gène de prédisposition au développement du cancer du pancréas. Pour ce faire, nous utilisons des souris génétiquement modifiées pour étudier le rôle des gènes et l’impact de leur inactivation sur le développement des lésions précancéreuses. Ceci a un intérêt pour l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ces modèles de souris sont nécessaires pour comprendre les causes de prédisposition et de progression des lésions pré-cancéreuses pancréatiques, ce qui a un intérêt pour le développement de stratégie de dépistage et de stratégie thérapeutique du cancer du pancréas.
Procédures
Les souriceaux sont marqués par tatouage à la base des phalanges et un prélèvement d’un petit bout de queue (moins de 2 mm) est effectué pour le génotypage, c'est à dire l'identification des modifications génétiques induites chez chaque animal. La manipulation est très rapide et n’induit pas de modification du comportement du souriceau, et la queue cicatrise très rapidement à ce stade. Les souris sont traitées par injections au niveau de l’abdomen (1 fois par jour pendant 4 jours consécutifs à l’âge de 5 semaines, puis 4 semaines après elles sont injectées 6 fois par jour pendant 2 jours consécutifs, puis 6 fois par jour 1 jour par semaine pendant les 4 semaines suivantes. La nécessité de ce nombre d'injection a été établie par des travaux de mise au point validés dans différents laboratoires dans le monde). Ces injections servent à induire les modifications génétiques et à favoriser le développement des lésions pré-cancéreuses pour étudier les causes de leur initiation et de leur progression.
Impact sur les animaux
Les souris sont traitées par un certain nombre d’injections, au niveau de l’abdomen. Cela peut entrainer une légère perte de poids le jour suivant l’injection. Les souris vont développer des lésions microscopiques pré-cancéreuses au niveau du pancréas. Les souris seront euthanasiées précocement pour l’analyse de ces lésions avant le stade de cancer.
Devenir
Les animaux de la procédure sont euthanasiés pour des analyses effectuées sur le pancréas (visualisation et études de molécules) afin d’étudier les lésions précancéreuses.
Remplacement
Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être actuellement obtenues par d’autres méthodes compte-tenu de la complexité physiologique du développement des lésions précancéreuses, nous obligeant à travailler à l'échelle d'un organisme. Des études in vitro sur des cellules et des "mini-organes" en culture ou issus de prélèvements de lésions humaines sont également possibles en complément mais ne peuvent pas remplacer cette étude avec ce modèle physiologique. Les retombées de ce travail sont utiles du point de vue des implications thérapeutiques à terme chez l'homme.
Réduction
Nous utilisons l'effectif minimal de souris, determiné par des résultats obtenus précédemment et dans les publications scientifiques pour ce type d’analyse, et qui permet d'obtenir des résultats statistiques permettant la validation de l'étude.
Raffinement
Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les souris sont placées dans des conditions optimales d'élevage, en portoirs ventilés. Les souris sont 5 individus par cage au maximum pour avoir assez de place dans la cage sans pour autant être isolés car ce sont des animaux grégaires. La température, l'hygrométrie, la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours. En plus de la litière, les cages sont enrichies avec des cotons et des petits abris. Une surveillance quotidienne du personnel de l'animalerie et un suivi régulier de l'expérimentateur (au moins 1 fois par semaine) avec la prise en compte de différents éléments bien définis tels que l'aspect du pelage et des yeux, le poids et le comportement des souris permet d'éviter toute souffrance des animaux. Nos analyses sont précoces et concernent les phases de lésions pré-cancéreuses. Les souris sont euthanasiées pour analyse avant de développer un cancer.
Choix des espèces
Les souris modifiées génétiquement sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes physiopathologiques de pathologie humaine. L’objectif du projet est d’étudier le développement et l’évolutivité de lésions pré-cancéreuses pancréatiques grâce au modèle de souris et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Les souris seront utilisées à l’âge de 5 semaines car au tout début de l’âge adulte. On laisse les lésions pré-cancéreuses se développer dans ce modèle de souris jusqu’à l’âge de 4 mois (ce qui correspond à environ 1/4 de la durée de vie de la souris). Cela permet d’étudier l’impact de notre gène d’intérêt dans l’initiation et la progression de ces lésions précancéreuses.