Souris
Genotypage invasif des lignees transgéniques
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système respiratoire
Une biopsie de l'oreille ou du bout de la queue, moins d'une minute de contention, moins de 5 mm de tissu prélevé : l'acte est bref et il concerne 100 000 souris. Toutes sont déclarées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, 10 000 sont annoncées comme réutilisées, les autres sont tuées, à l'issue d'un projet autorisé ou dès le génotypage quand elles ne portent pas le génotype recherché. Le porteur indique qu'au moins la moitié des souris nées dans son animalerie ne portent pas ce génotype, qu'un quart est utilisé pour des prélèvements de tissus et un quart pour des projets validés par le ministère. Le chiffre de 100 000 n'est adossé à aucun calcul dans le résumé, ni à un nombre de lignées, ni à une durée.
Objectifs
L'objectif est la caractérisation génétique des individus dans le cadre de la gestion d’élevage d'animaux génétiquement altérés
Bénéfices attendus
Il est nécessaire d'identifier tous les individus génétiquement modifiés dans le cadre de la gestion d’élevage afin de répérer les animaux d'intérêt pour les différents projets scientifiques.
Procédures
Prélèvement d'une biopsie (auriculaire ou caudale) par animal (contention et biopsie < 1 minute, prélèvement en lui même < 1s, taille du prélèvement < 5mm)
Impact sur les animaux
L’effet indésirable qui peut survenir est une douleur légère et très passagère (quelques secondes) lors du prélèvement.
Devenir
Les animaux génotypés sont utilisés soit pour l'élevage, soit pour l'expérimentation. Dans le cas de l'expérimentation, les animaux sont euthanasiés à l'issue d'un projet scientifique autorisé par le ministère. L'élevage a pour but de produire les animaux nécessaire à l'expérimentation. Les animaux qui n'ont pas le génotype nécessaire pour les expérimentations ou le maintien de la lignée seront euthanasiés lorsqu'ils ne peuvent pas être réutilisés dans des projets indépendants de leur génotype.
Remplacement
Les animaux produits dans l'animalerie sont nécessaires pour des projets scientifiques validés par différents organismes scientifiques, projets pour lesquels il n'existe aucune méthode alternative in vitro ou in silico. Avant de déposer cette demande, une alternative non-invasive (arrachage de bulbe pileux) a été testée mais n’a pas donné de résultats exploitables. De plus, cette méthode, ainsi que d’autres méthodes non-invasives (analyse de fécès, prélèvement buccal) entraînant toutes un niveau de stress équivalent à la biopsie invasive à la queue ou à l’oreille, n’ont pas été retenues.
Réduction
L'animalerie élève de nombreuses lignées pour prélèvement de tissus ou pour des protocoles d'expérimentation animale. L'élevage a pour but de produire les animaux nécessaire à l'expérimentation. Le maintien des lignées par reproduction nécessitant un génotypage est nécessaire pour éviter la consanguinité, et pour la production de contrôles dans la même portée. Cela contribue à diminuer la variabilité génétique des animaux et donc des résultats, permettant la réduction du nombre d’animaux nécessaires aux expériences. Selon les lignées et les projets, au moins la moitié des animaux n'ont pas le génotype nécessaire à l'expérimentation, environ un quart est utilisé pour prélèvement de tissu, et un autre quart dans des projets scientifiques validés par le ministère. Lorsque c'est possible, les animaux qui n'ont pas le génotype adéquat sont réutilisés dans d’autres projets.
Raffinement
Les méthodes de prélèvement (biopsie à l’oreille ou à la queue) et de marquage (boucle d'oreille lors du sevrage, ou tatouage avant sevrage) ont été choisies pour minimiser l'inconfort en fonction de l'âge des animaux (et donc du développement de la queue et de l'oreille). La biopsie à l’oreille prélevée lors du marquage au sevrage des animaux n'induit pas de stress supplémentaire par rapport au marquage. Cette méthode n'induit pas de signes majeurs d'incomfort, et du fait que l'oreille est très peu vascularisée, n'engendre pas de saignement. Dans le cas de biopsies précoces, quand l'oreille n'est pas assez développée, la biopsie est prise sur l'extrémité de la queue, qui n'est pas ossifiée dans les 10 jours après la naissance. Le saignement est minime (moins d'une goutte) et s'arrête immédiatement. Le marquage comme le prélèvement sont réalisés avec du matériel adapté, le geste est rapide et sûr, réalisé en routine par du personnel formé. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les animaliers. Ainsi, de même que pour tous les animaux de l'élevage, biopsiés ou non, si une infection ou signe d'inconfort est observé, un incident est rapporté concernant l'animal. Un traitement adapté est alors décidé, en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle idéal pour l'utilisation de lignées modifiées génétiquement permettant l'étude ciblée de systèmes biologiques complexes. 5 à 10% des animaux sont utilisés après sevrage (entre 21 et 30 jours après la naissance) lorsqu'un génotypage précoce n'est pas nécessaire. Pour minimiser le stress, sexage, marquage et biopsie sont réalisés en même temps.
Etude de la stéatose hépatique non alcoolique chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
2 130 souris pour une seule maladie provoquée par l'alimentation, 1 380 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 750 un niveau léger, toutes tuées. Chacune peut recevoir une injection intrapéritonéale par semaine pendant 24 semaines, subir trois microcoupures de la queue, une biopsie de la pointe de la queue à dix jours, un gavage et deux jeûnes de six et quinze heures. Le régime riche en graisse les fait grossir jusqu'à 45 grammes et les rend moins actives, effet recherché puisque le projet reproduit la stéatose hépatique liée à l'obésité et au diabète de type 2. Les souris dont le génotype ne convient pas sont tuées à trois ou quatre semaines de vie, et le porteur justifie l'ensemble en une phrase, les modèles in vivo étant "indispensables" pour analyser la signalisation entre organes.
Objectifs
La stéatose hépatique non-alcoolique est une maladie chronique caractérisée par une accumulation de graisses dans le foie associée à une inflammation. Elle est plus fréquente chez les personnes atteintes d’obésité et/ou du diabète de type 2. Nous allons soumettre des modèles de souris à différents régimes induisant des dommages au foie pour comprendre le développement et les facteurs contribuant à cette maladie et proposer des solutions thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche fondamental a pour objectif de définir une nouvelle approche thérapeutique dans la stéatose hépatique non-alcoolique et ses complications. Il apportera des connaissances fondamentales nécessaires au développement de thérapies ciblées sur les macrophages hépatiques. Des médicaments pourraient être developpés pour inhiber/activer spécifiquement les voies métaboliques spécifiques des macrophages révélées par ce projet. Considérant que la stéatose hépatique touche environ 1 être humain sur 4, les bénéfices de ce projet sont importants.
Procédures
-Microcoupure à la queue : 3X,5 seconds. -Biopsie de l'extrême pointe de la queue à l’âge de 10 jours: 1X, 5 seconds. Injection intrapéritonéale, 10s, 1X par semaine, pendant 24 semaine et 7X pendant une semaine. - Mise à jeun, 15h, 1X par animal. - Mise à jeun, 6h, 1X par animal. - Gavage, 10s, 1X par animal.
Impact sur les animaux
Régime riche en graisse: les souris vont prendre du poids au fur et à mesure des semaines (jusqu’à 45 grammes) et devenir un peu moins actifs. - Injection intrapéritonéale (IP) : douleur légère due à la piqure et possible nécrose ou irritation. - Microcoupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. - Mise à jeun : Les animaux n’auront plus accès à la nourriture, ils pourront subir une gêne due à la sensation de faim. - Gavage : stress dû à la contention et à la sonde de gavage. - Biopsie de l'extrême poite de la queue à l'age de 10 jours pour génotypage: douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en oeuvre les différentes techniques qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet. Les animaux dont le génotype n'est pas conforme seront également mis à mort à l'issue du génotypage (3-4 semaines de vie).
Remplacement
Pour réaliser les tests de métabolisme systémique et d’analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables.
Réduction
Le nombre de souris est reduit a son minimum. De nombreux tissus seront collectes apres mise a mort, afin d'approfondir les etudes moleculaires et cellulaires. Chaque souris generera donc de nombreuses informations. De plus nous avons determine un nombre de souris par groupe en fonction de donnees de la litterature et grâce à l’utilisation d’un outil statistique adapté.
Raffinement
Nous appliquerons strictement les points limites définis dans le projet et la douleur sera limitée à son maximum. Pour limiter les nuisances/effets indésirables par exemple Injection intrapéritonéale, nous utiliserons d’une aiguille fine pour gavage un sonde souple. Les souris seront sous surveillance journalière de la part de l’équipe professionnelle de zootechnie et lorsque cela est nécessaire une grille de score adaptée à la procédure sera mise en place. Les personnel seront formé à ces techniques.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus pertinent dans notre étude car elle se rapproche physiologiquement des pathologies humaines. Dans la littérature, les modèles murins sont largement utilisés dans les études sur l’obésité. Les souris utilisées pour les procédures expérimentales seront adultes uniquement.
Déchiffrer le code de compatibilité entérofécal après transplantation de microbiote fécal pour contourner la resistance aux inhibiteurs des points de contrôle immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 136 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et, selon les protocoles, chacune peut recevoir une tumeur, deux administrations orales de matières fécales de souris, jusqu'à quatre traitements d'immunothérapie et une prise de sang par semaine. Certaines procédures ajoutent une chirurgie de cinq minutes sous anesthésie générale pour injecter un traceur qui suit la migration des cellules. Toutes les souris sont tuées à la fin de chaque procédure pour l'analyse de leurs organes. L'équipe cherche à comprendre pourquoi une transplantation de microbiote fécal réussit ou échoue à lever la résistance des patients aux immunothérapies contre le cancer, avec un bénéfice renvoyé à plus tard, mieux choisir donneurs et patients, quand la douleur liée à la tumeur et une possible perte de poids sont prévues pour les souris.
Objectifs
Des précédentes études ont montré l'impact de la composition du microbiote intestinal (MI) sur la réponse immunitaire et la réponse aux traitements par immunothérapies contre le cancer. Il a d’abord été montré que la prise d’antibiotiques (ATB), en créant une dysbiose intestinale, est associée à une diminution de l’efficacité de ces immunothérapies dans de nombreux types de cancers. Puis, des compositions spécifiques du microbiote intestinale ont été mises en évidence comme étant associées à la réponse ou à la résistance aux immunothérapies. Ensuite, des travaux sur des modèles de souris ont permis de démontrer que la transplantation de microbiote fécal (TMF) à partir de selles de patients répondeurs ou résistants aux immunothérapies conduisait à la réponse ou à la résistance aux immunothérapies chez ces souris, respectivement. Finalement, la transplantation de microbiote fécal chez les patients parait être une approche efficace pour contourner la résistance aux immunothérapies induite par une dysbiose intestinale. Malgré des résultats prometteurs en clinique, il est nécessaire de comprendre les mécanismes qui expliquent la réussite ou l'échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux immunothérapies. L'objectif principal de ce projet est de décrire les effets de la transplantation de microbiote fécal sur le système immunitaire et son implication dans la réponse antitumorale.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de comprendre les mécanismes expliquant la réussite ou l'échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux immunothérapies. Cela permettra par la suite de mieux sélectionner les donneurs pour la transplantation, ainsi que de mieux sélectionner les patients pouvant recevoir la transplantation de microbiote fécal. De plus, ce projet apportera plus de compréhension sur les liens existants entre le microbiote intestinale, le cancer et la réponse aux immunothérapies. Enfin, par la compréhension des ces mécanismes, les patients ayant une dysbiose intestinale et résistants aux immunothérapies pourront bénéficier d'une tranplantation de microbiote fécal afin de contourner cette résistance.
Procédures
Les interventions prévues seront pour certaines procédures l'implantation d'une tumeur (une fois, d'une durée d'1 minute), l'administration orale de matières fécales murines (2 fois, durée 1 minute), l'administration de traitements d'immunothérapie (4 fois maximum, durée 1 minute), l'injection au niveau de la queue (une fois, durée 1 minute, anesthésie locale). De plus, il est prévu pour certaines procédures d'utiliser un traceur pour suivre la migration cellulaire, nécessitant une procédure chirurgicale, sous anesthésie générale, d'une durée de 5 minutes (une fois). Enfin, des prélèvements de sang seront réalisés, au maximum 1 fois par semaine (durée 5 minutes). Les injections seront réalisées sous anesthésie locale.
Impact sur les animaux
Les contraintes principales pour les animaux seront pour certaines procédures une douleur et une gêne modérée liée à l'implantation d'une tumeur, un inconfort lié à l'administration de matières fécales par voie orale au moment de l'administration, ainsi qu'une potentielle perte de poids liée à la tumeur, aux traitements et à l'administration des matières fécales.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure, afin de prélever les organes pour analyser les tissus, les cellules, doser des protéines ou de l'ADN.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale, intestinale et périphérique et l’effet de la transplantation de microbiote fécal sur l'immunité et la réponse antitumorale, avec toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles, dont certaines dites "GO-NO-GO", et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. Notre critère de jugement principal est le suivi de la croissance tumorale. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons défini un nombre maximal théorique d'animaux par groupe. Cela a permis de définir le nombre d'animaux nécessaire et suffisant pour observer l'effet recherché. L'analyse des résultats sera faite en utilisant des méthodes statistiques.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être : stabulation conventionnelle, régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière quotidienne permettra le suivi clinique de la souris ainsi que de son comportement, permettant l’éventuelle mise en place de mesures d'analgésie. Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie locale. Les souris auront un examen clinique quotidien et des pesées régulières. Les points limites précoces seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. La génétique et l'immunotlogie sont proches de celle de l’Homme et bien connues. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, la plus susceptible d’apporter les résultats satisfaisants pour nous au vu des objectifs du projet. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des bactéries et de la transplantation de microbiote fécal sur l’immunité et la réponse antitumorale. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de 6-7 semaines de développement, les cancers cibles touchant l’adulte. De plus, à cette âge là, les animaux sont matures du point de vue immunologique.
Etablissement du phénotypage de modèles de phase maniaque du trouble bipolaire chez la souris par injections répétées de stimulants 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
400 souris sont utilisées dans ce second établissement du projet, 320 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 80 un niveau modéré, toutes tuées et leur cerveau prélevé pour des études ultérieures. Injections répétées d'amphétamine ou d'un bloqueur du transporteur de la dopamine, contentions, isolement, six à huit tests comportementaux passés une fois chacun. Le projet vise l'acquisition par le laboratoire de méthodes d'étude de la phase maniaque du trouble bipolaire, aucun traitement n'étant évalué à ce stade. Le porteur écrit que le stress chez l'animal "comme modèle de pathologie psychiatrique humaine" repose sur l'observation du comportement, et qu'aucune méthode in vitro n'y répond.
Objectifs
Le trouble bipolaire est une cause d’invalidité majeure dans le monde avec plus de 45 millions de personnes atteintes. Il est caractérisé par une alternance entre des phases dépressives similaires à la dépression majeure et des phases maniaques présentant une élévation anormale de l’humeur ainsi que des altérations cognitives allant de la distractibilité à des comportements à risque. L’espérance de vie des patients est réduite en moyenne de 10 ans à cause du risque élevé de mort par suicide (1 patient sur 10) et de comorbidités (par exemple les troubles de l’addiction et de l’anxiété). Cependant, les mécanismes neurobiologiques ainsi que les éléments précipitant les différentes phases restent largement méconnus, à tel point qu’il n’existe pour l’instant pas de modèle expérimental récapitulant les principaux aspects de la maladie. Le but de ce projet est à court terme d’établir des méthodes d’étude de la phase maniaque du trouble bipolaire au niveau comportemental. En effet, notre laboratoire dispose déjà de l’expertise nécessaire pour étudier les phénotypes anxiodépressifs, mais pas des phénotypes maniaques inhérents au trouble bipolaire. Nous proposons donc ici d’établir des tests comportementaux pertinents pour des études ultérieures avec un modèle simple à mettre en œuvre avec administration d’un stimulant mimant certains aspects de la manie chez des souris des deux sexes. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les études précliniques sont peu nombreuses sur le trouble bipolaire et sont critiques pour mieux comprendre sa neurobiologie et de nouvelles thérapies. Cette étude participera à établir de nouveaux tests comportementaux dans notre laboratoire pertinents pour développer de nouveaux modèles murins de trouble bipolaire, mais qui pourront aussi servir pour étudier d’autres pathologies étudiées dans notre équipe de recherche.
Procédures
Selon le groupe traité, 5 à 7 injections intrapéritonéales sont réalisées respectivement 1 jour sur 2 (GBR, un stimulant spécifique du transporteur de la dopamine) ou tous les jours (amphétamine). Les tests comportementaux ont pour objectif d'évaluer les comportements se rapprochant de la phase maniaque ou dépressive du trouble bipolaire. Chaque test n'a lieu qu'une seule fois (6 à 8 tests selon le groupe). Ils ne durent que 5 à 10 minutes par souris, en-dehors du test de préférence au sucrose (qui a lieu sur 5 jours) et du test du nid (qui a lieu sur 24h). Les deux premier groupes (80 animaux au total) seront réalisés dans l'EU1, le reste dans l'EU2.
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales (5 à 7 fois), sont espacées de 24h au moins, et les doses de GPR et AMPH sont modérées par rapport à celles utilisées dans la littérature. Elles peuvent provoquer une légère douleur au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux sont couramment utilisés et peuvent provoquer un stress modéré en lien avec la manipulation, les contensions et l’isolement dans certains cas. Les stimulants eux-même peuvent générer de l’anxiété en lien avec leurs effets aigus et des phénotypes anxio-dépressifs en lien avec le sevrage.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et les cerveaux seront récupérés pour des études ultérieures
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale nécessite également l’utilisation d’animaux.
Réduction
Les effectifs sont optimisés, les analyses comportementales nécessitent une taille d’effectifs suffisante compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n = 20 sujets en tenant compte de cette variabilité). Notre stratégie des 8 groupes suit une analyse statistique de puissance a priori : avec deux groupes (contrôles et stressés), un effet attendu modéré, on utilisera un test utilisé de manière standard dans la communauté scientifique.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. En cas d’hypothermie, chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Les éxpérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine. Dans ce cas, une euthanasie (injection létale) sera réalisée afin d'éviter toute souffrance supplémentaire. Aucun transport d'animaux ne sera réalisé entre les deux sites.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, l’implémentation de modèles de troubles de l’humeur, ainsi que la possibilité d’utiliser des vecteurs viraux permettant l’utilisation de l’optogénétique font de la souris le modèle le plus pertinent. Les techniques précédemment mentionnées seront mises en œuvre ultérieurement une fois les modèles mieux caractérisés. Les souris seront adultes, âgées de 8 semaines ou plus. Les modèles stimulants ayant été développé chez des animaux adultes et les patients étant typiquement diagnostiqués à l’âge adulte, nous nous focalisons sur le stade adulte dans un premier temps.
Utilisation systémique de cellules sanguines comme stratégie de délivrance d’une solution thérapeutique au muscle squelettique
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Cinq jours d'injections quotidiennes pour vider leur moelle osseuse, une greffe de moelle par voie intraveineuse le sixième jour sous anesthésie, jusqu'à cinq prises de sang, et pour certaines une injection de cardiotoxine qui lèse un muscle de la patte : 815 souris vont être utilisées, 455 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 360 un niveau léger. Le porteur indique que la greffe échoue dans environ 20 % des cas, la souris cessant alors de produire des cellules sanguines, s'affaiblissant et montrant des signes d'anémie avant sa mise à mort. Les gestes se répètent sur deux à cinq mois. Toutes sont tuées pour prélever muscles, rate, poumons et moelle, les géniteurs à 30 semaines, les femelles non génitrices dès la naissance.
Objectifs
Les dysfonctions et faiblesses musculaires, causées par des maladies héréditaires, le cancer ou le vieillissement, comptent parmi les problèmes de santé publique les plus dévastateurs. Un obstacle majeur au développement de thérapies musculaires est de parvenir à̀ délivrer les molécules thérapeutiques aux muscles, qui sont repartis dans tout l'organisme. Il est essentiel qu'un traitement puisse cibler efficacement tous les muscles affectés. Ce projet vise à̀ développer une nouvelle stratégie de délivrance musculaire, basée sur l'utilisation de cellules immunitaires modifiées pour fusionner à ces cellules musculaires. En effet, les cellules immunitaires ont la capacité naturelle d’atteindre tous les tissus de l’organisme, et dans la plupart des maladies musculaires, on observe une infiltration importante de cellules immunitaires au niveau des muscles. Ce projet utilise donc la capacité des cellules immunitaires à atteindre tous les muscles de l’organisme. En modifiant ces cellules pour les rendre capables de fusionner avec les cellules musculaires, nous cherchons à̀ générer un outil de délivrance qui puisse délivrer des traitements thérapeutiques aux muscles blessés. Cette approche est testée chez la souris, dans la lignée naturelle puis dans le modèle de myopathie de Duchenne, pour apporter une preuve de concept. Les cellules immunitaires modifiées sont administrées par une greffe de moelle osseuse, afin que tous les types cellulaires sanguins soient porteurs de cet outil thérapeutique de manière durable. Ceci permettra d’analyser la stratégie globale et d’identifier plus précisément quel type de cellules immunitaires sont importantes dans ce processus. Le projet permet de tester la capacité de fusion des cellules du sang génétiquement modifiées avec les fibres musculaires dans un contexte inflammatoire aigu (lésion) ainsi que dans un contexte inflammatoire chronique (modèle de myopathie). Il est important d'évaluer la fusion dans les deux contextes car il est bien documenté que les acteurs inflammatoires présents lors de la régénération musculaire, et la signature qui les accompagne, sont différents entre inflammation aigüe et chronique. On pourra ensuite utiliser cet outil dans le contexte thérapeutique en ajoutant une solution thérapeutique dans les cellules du sang afin qu’elle soit délivrée aux muscles dystrophiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si l’utilisation du système immunitaire en tant que système de délivrance aux muscles squelettiques est une piste clinique pertinente. En effet, l’enjeu majeur est aujourd’hui la délivrance systémique des outils pour atteindre tous les muscles squelettiques afin les soigner. Nous pourrons montrer, non seulement la pertinence de cet outil in vivo pour une pathologie type dystrophie musculaire, la dystrophie de Duchenne, mais aussi ouvrir la voie pour d’autres dystrophies en adaptant la solution thérapeutique contenue dans le vecteur (les cellules du sang). Ce projet permettra aussi de comprendre plus précisément comment les différents types de cellules immunitaires thérapeutiques participent à la régénération en condition d’inflammation aigue (lésion) ou chronique (modèle de la myopathie de Duchenne), pour préciser les mécanismes de cette stratégie thérapeutique.
Procédures
Afin de réaliser la préparation des animaux pour la greffe de cellules souche de moelle osseuse, des injections auront lieu 1 fois par jour sur une durée de 5 jours sur animaux vigiles avec une contention maximum de 1 minute. Le sixième jour, la greffe de moelle est réalisée en injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse (injection en 2 minutes, temps total d’anesthésie 10 minutes maximum avec endormissement) et anesthésie locale (gouttes anesthésiantes préalablement administrées). Par la suite, la prise de greffe est contrôlée par prélèvement sanguin sous anesthésie: 1 à 5 fois par individu dépendamment des procédures, en respectant le maximum de prélèvement de 7,5% du volume sanguin 1 fois par semaine maximum (durée totale maximum d’anesthésie 10 min avec endormissement). Deux procédures incluent l’injection d'une molécule provoquant une lésion musculaire et déclenchant la régénération musculaire. Cette injection est réalisée sous anesthésie gazeuse (injection en 30 secondes, temps total d'anésthésie 10 minutes maximum avec endormissement) avec administration préalable d’analgésique.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent présenter des signes de stress liés à leur manipulation lors des expérimentations et des pesées. Les procédures sont classées sévères de par la répétition des gestes expérimentaux sur une durée maximale de 2 ou 5 mois et la douleur que peut ressentir l’animal. Les souris peuvent présenter : - une sensibilité́ de la peau au niveau des zones d’injection pendant une durée de 5 jours. - une douleur de légère à modérée au niveau de l’œil pour une durée de 5 min minimisée par antalgique et anesthésique. - une perte de poids pendant 15 jours. - une douleur légère après la lésion musculaire au niveau de la patte minimisée par antalgique et une boiterie légère (quelques heures) du fait de la perte de volume musculaire localisée. L’utilisation d’un protocole de déplétion de moelle puis de greffe de moelle afin de reconstituer un système hématopoïétique « thérapeutique » comporte le risque que la greffe ne prenne pas. Ainsi parfois les cellules souches injectées ne parviennent pas à coloniser la niche et la souris ne produira plus de cellules sanguines nécessaires à sa survie (environ 20% des cas). Dans ce cas, l’animal s’affaiblit et montre des signes d’anémie par manque de globules rouges. Il est alors mis à mort dès la détection des points limite (suivi quotidien). Durant la période de reconstitution du système sanguin, le système immunitaire est affaibli, les souris sont donc manipulées en conditions stériles ainsi que nourries avec de la nourriture stérile afin d’éviter toute contamination. Le phénotype de la lignée génétiquement modifiée (modèle de la myopathie de Duchenne), n’induit pas de douleurs ni signes cliniques à l'âge choisi pour ce projet. Des difficultés de locomotion ou une gêne cardio-respiratoire peuvent apparaitre vers environ 18 mois après épuisement des capacités de régénération musculaire à cause des cycles de régénération musculaire réguliers dûs au phénotype (inflammation chronique). La lignée doit régulièrement être recroisée avec des souris de type naturel afin d’éviter la consanguinité. Il faudra alors réaliser des biopsies (queue) et identification par tatouage pour retrouver des couples homozygotes après les croisements.
Devenir
Pour chacune des procédures, on réalise des analyses histologiques des muscles concernés. Cela nécessite donc des prélèvements de muscles post mortem. On prélèvera également des organes impliqués dans le système immunitaire tels que la rate, les poumons, la moelle osseuse pour des analyses histologiques du devenir des cellules du système sanguin. Pour le maintien de lignée ainsi que la production, les géniteurs seront mis à mort post production ou dès qu’ils atteindront 30 semaines. Les femelles non génitrices seront mises à mort à la naissance et/ou pourront servir à d’autres équipes pour des prélèvements.
Remplacement
Une preuve de principe validant la stratégie a déjà été obtenue in vitro, et les constructions génétiques thérapeutiques sont toutes validées in vitro au préalable. Les validations comprennent : la validation de l’expression des gènes d’intérêt par les constructions dans un modèle hétérologue in vitro, l’infectiosité des lentivirus sur les cellules souches hématopoïétiques, l’expression par les promoteurs dans celles-ci, et enfin la viabilité des cellules souches lors de l’induction des gènes d’intérêts. Le projet vise maintenant à déterminer si une délivrance systémique de cellules sanguines modifiées peut permettre de cibler les muscles, ce qui doit nécessairement être réalisé in vivo chez l’animal. L’organisme de la souris pourra permettre de comprendre l’influence du micro-environnement de la lésion musculaire et l’implication des cellules en périphérie des muscles sur notre modèle thérapeutique.
Réduction
Pour les étapes impliquant la cardiotoxine, l’étude de la régénération musculaire se fait en comparant le muscle lésé, et celui en contralatéral, témoin. Cela permet de réduire le nombre de souris utilisées. Le calcul du nombre d’animaux par procédure s’appuie sur des analyses statistiques qui nous permettent d’avoir des résultats statistiquement significatifs. Par ailleurs, tout animal mis à mort peut être utilisé pour obtenir d'autres tissus pour d’autres projets de l’équipe ou de l’institut. En particulier les femelles produites lors de la formation des lots de souris modèle de la myopathie de Duchenne mâles mais non utilisées dans ce projet pourront être partagées avec des équipes de l’institut ne possédant pas de colonie.
Raffinement
Les protocoles choisis en priorité sont ceux qui limitent la douleur et l’inconfort de l’animal. Des analgésiques et des anesthésiants sont utilisés pour réduire au maximum la douleur et le stress de l’animal. Les manipulations pour les pesées seront effectuées avec l'utilisation de tunnel ou de préhension douce sur la main. Les premières étapes de ce projet permettront de préciser les conditions expérimentales de protocole (voie d’administration) afin de raffiner la méthode pour les étapes suivantes. Des enrichissements et de la nourriture stériles sont utilisés afin de réduire les risques notamment lors de la phase immunodéficiente. En particulier, une alimentation enrichie (graine de tournesol, gels) sera fournie aux animaux pour encourager la prise de poids. Des antibiotiques peuvent être administrés en cas d'infection sur consultation du vétérinaire référent. Une attention particulière pour des signes de douleur est portée aux animaux dans les deux jours qui suivent l’injection de cardiotoxine, ou dans les deux semaines qui suivent la greffe de moelle, afin de veiller aux points limites décrits. La lésion musculaire à la cardiotoxine est communément utilisée et est administrée en même temps qu’un antidouleur afin d’assurer le bien-être animal. Une régénération totale du muscle est attendue en deux semaines. Les animaux modèles de myopathie participeront au protocole avant l'apparition de signes cliniques liés à la maladie. Les prises de sang hebdomadaires seront réalisées conformément au respect des volumes sanguins : maximum 7,5% du volume sanguin total sera prélevé et une semaine de délai sera respectée pour la reconstitution du sang. Par exemple, pour une souris le volume sanguin total est en moyenne de 70-80 mL/kg soit une souris de 25g : vol sanguin 1,75 mL : vol prélevé max 131 µL. Le plan d’expérience a été assisté grâce à l’outil EDA (https://eda.nc3rs.org.uk) proposé par le nc3r.
Choix des espèces
Ce projet permet de tester l’efficacité de la stratégie de diffusion à l’échelle systémique de la solution thérapeutique. Il n’existe actuellement aucun moyen de reproduire cela in vitro, d’où l’utilisation de modèles animaux. La souris est couramment utilisée dans le domaine de l’immunologie pour des expériences de greffe de moelle osseuse et les protocoles associés à cette technique sont hautement normalisés. Le protocole suivi pour la préparation des cellules greffées est au plus proche de ce qui est actuellement utilisé en clinique. De plus, le modèle murin dystrophique sert couramment de modèle de dystrophie musculaire dans des études précliniques. En effet, les souris ont une organisation musculaire squelettique très similaire à celle de l’Homme . On dispose donc chez la souris de tous les éléments permettant de tester notre stratégie : des modèles de la myopathie de Duchenne et des techniques essentielles (greffe de moelle osseuse, modification de gènes, etc.). Les souris de type naturel seront utilisées entre 8 et 10 semaines en début de procédure. Tout d’abord, le développement musculaire chez la souris se termine vers 5 semaines. De plus, la déplétion de moëlle ne se réalise usuellement pas avant 8 semaines de vie minimum. Malgré leur utilisation en tant que modèle de maladie, les souris modèle de la myopathie de Duchenne se comportent normalement, elles peuvent commencer à avoir un phénotype dommageable aux alentours de leurs 18 mois. Les animaux géniteurs ou utilisés pour les procédures sont mis à mort au plus tard à 30 semaines. Cependant les animaux seront utilisés entre leurs 2 et 6 mois, période durant laquelle la régénération musculaire est la plus intense et bien avant l'épuisement des capacités de régénération, et donc une éventuelle apparition de signes cliniques . Pour les géniteurs ils seront gardés 30 semaines au maximum pour s’assurer de bonnes capacités de reproduction.
Etablissement du phénotypage de modèles de phase maniaque du trouble bipolaire chez la souris par injections répétées de stimulants 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Mettre au point des tests comportementaux dont le laboratoire déclare ne pas disposer mobilise 400 souris, 320 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 80 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Cinq à sept injections intrapéritonéales d'amphétamine ou d'un stimulant du transporteur de la dopamine précèdent six à huit tests comportementaux, dont le test de préférence au sucrose sur cinq jours et le test du nid sur vingt-quatre heures. Le porteur indique que les stimulants peuvent provoquer de l'anxiété par leurs effets aigus, et des phénotypes anxio-dépressifs au sevrage. La mise à mort intervient en l'absence d'amélioration au bout d'une semaine, seule limite temporelle que le résumé oppose à la souffrance sévère déclarée pour 320 souris.
Objectifs
Le trouble bipolaire est une cause d’invalidité majeure dans le monde avec plus de 45 millions de personnes atteintes. Il est caractérisé par une alternance entre des phases dépressives similaires à la dépression majeure et des phases maniaques présentant une élévation anormale de l’humeur ainsi que des altérations cognitives allant de la distractibilité à des comportements à risque. L’espérance de vie des patients est réduite en moyenne de 10 ans à cause du risque élevé de mort par suicide (1 patient sur 10) et de comorbidités (par exemple les troubles de l’addiction et de l’anxiété). Cependant, les mécanismes neurobiologiques ainsi que les éléments précipitant les différentes phases restent largement méconnus, à tel point qu’il n’existe pour l’instant pas de modèle expérimental récapitulant les principaux aspects de la maladie. Le but de ce projet est à court terme d’établir des méthodes d’étude de la phase maniaque du trouble bipolaire au niveau comportemental. En effet, notre laboratoire dispose déjà de l’expertise nécessaire pour étudier les phénotypes anxiodépressifs, mais pas des phénotypes maniaques inhérents au trouble bipolaire. Nous proposons donc ici d’établir des tests comportementaux pertinents pour des études ultérieures avec un modèle simple à mettre en œuvre avec administration d’un stimulant mimant certains aspects de la manie chez des souris des deux sexes. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les études précliniques sont peu nombreuses sur le trouble bipolaire et sont critiques pour mieux comprendre sa neurobiologie et de nouvelles thérapies. Cette étude participera à établir de nouveaux tests comportementaux dans notre laboratoire pertinents pour développer de nouveaux modèles murins de trouble bipolaire, mais qui pourront aussi servir pour étudier d’autres pathologies étudiées dans notre équipe de recherche.
Procédures
Selon le groupe traité, 5 à 7 injections intrapéritonéales sont réalisées respectivement 1 jour sur 2 (GBR, un stimulant spécifique du transporteur de la dopamine) ou tous les jours (amphétamine). Les tests comportementaux ont pour objectif d'évaluer les comportements se rapprochant de la phase maniaque ou dépressive du trouble bipolaire. Chaque test n'a lieu qu'une seule fois (6 à 8 tests selon le groupe). Ils ne durent que 5 à 10 minutes par souris, en-dehors du test de préférence au sucrose (qui a lieu sur 5 jours) et du test du nid (qui a lieu sur 24h). Les deux premier groupes (80 animaux au total) seront réalisés dans l'EU1, le reste dans l'EU2.
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales (5 à 7 fois), sont espacées de 24h au moins, et les doses de GPR et AMPH sont modérées par rapport à celles utilisées dans la littérature. Elles peuvent provoquer une légère douleur au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux sont couramment utilisés et peuvent provoquer un stress modéré en lien avec la manipulation, les contensions et l’isolement dans certains cas. Les stimulants eux-même peuvent générer de l’anxiété en lien avec leurs effets aigus et des phénotypes anxio-dépressifs en lien avec le sevrage.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et les cerveaux seront récupérés pour des études ultérieures
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale nécessite également l’utilisation d’animaux.
Réduction
Les effectifs sont optimisés, les analyses comportementales nécessitent une taille d’effectifs suffisante compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n = 20 sujets en tenant compte de cette variabilité). Notre stratégie des 8 groupes suit une analyse statistique de puissance a priori : avec deux groupes (contrôles et stressés), un effet attendu modéré, on utilisera un test utilisé de manière standard dans la communauté scientifique.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. En cas d’hypothermie, chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Les éxpérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine. Dans ce cas, une euthanasie (injection létale) sera réalisée afin d'éviter toute souffrance supplémentaire. Aucun transport d'animaux ne sera réalisé entre les deux sites.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, l’implémentation de modèles de troubles de l’humeur, ainsi que la possibilité d’utiliser des vecteurs viraux permettant l’utilisation de l’optogénétique font de la souris le modèle le plus pertinent. Les techniques précédemment mentionnées seront mises en œuvre ultérieurement une fois les modèles mieux caractérisés. Les souris seront adultes, âgées de 8 semaines ou plus. Les modèles stimulants ayant été développé chez des animaux adultes et les patients étant typiquement diagnostiqués à l’âge adulte, nous nous focalisons sur le stade adulte dans un premier temps.
Etude de la fonction des cellules endothéliales en contexte physiologique, de régénération du thymus et de dissémination leucémique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées a 12 ou 18 mois, choisies pour leur involution thymique avancée, d'autres reçoivent une injection de cellules leucémiques. 295 souris vont être utilisées, 175 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 120 un niveau sévère, toutes tuées pour analyse. Deux séries de quatre injections quotidiennes éliminent un récepteur dans les cellules des vaisseaux sanguins, avant trois injections du ligand testé et des prises de sang sur animaux vigiles. Le porteur décrit une leucémie qui génère un inconfort et une douleur prolongée, précise que ce modèle est létal au-delà de 21 jours, et fixe la mise à mort au dixième jour au plus tard.
Objectifs
Notre projet de recherche porte sur la régulation du développement des lymphocytes T (LT). Les LT se développent au sein du thymus, hébergeant leur production et leur sélection. Or, le thymus est un organe extrêmement sensible aux perturbations de la physiologie tel que le vieillissement. En effet, avec l’âge, le thymus subit une réduction drastique en taille et en fonctionnalité. Ce processus résulte en une forte altération de la production de nouveaux LT, réduisant ainsi fortement leur renouvellement dans l’organisme. Ceci résulte en une susceptibilité accrue de l’organisme aux infections, aux pathologies auto-immunes et aux cancers. De manière intéressante, notre équipe a identifié que l’administration d’une protéine ligand-X capable de se fixer sur un récepteur-Y spécifique présent sur les cellules du thymus promeut la régénération de cet organe et la production des LT au cours de l'involution associée à l'âge. Nos résultats montrent que l’action de cette molécule est médiée par une amélioration du nombre et de la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins. Ce projet s’intéresse à comprendre comment ce Ligand-X agit sur la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins du thymus. Ainsi, le premier objectif de notre projet est de caractériser le rôle de l’axe ligand-X/ récepteur-Y dans la physiologie des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques ainsi que de déterminer le rôle de ces cellules dans la régénération du thymus. De plus, puisque le ligand-X est important pour la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques et que nos résultats démontrent que les cellules leucémiques produisent fortement cette protéine ligand-X, nous émettons l’hypothèse que l’axe ligand-X/récepteur-Y dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins est impliqué dans la dissémination des cellules leucémiques. Ainsi, le deuxième objectif vise à démontrer et caractériser le rôle de cet axe dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques au cours de la leucémie. Ce projet permettra d’évaluer le rôle de l’axe ligand-X/récepteur-Y dans la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques en contexte physiologique, de régénération du thymus, de dissémination leucémique et de réponse vaccinale.
Bénéfices attendus
Du fait du vieillissement progressif de la population et de l’amélioration de l’espérance de vie, l’immunodéficience liée à l’âge, étroitement corrélée avec le processus d’involution thymique, devient une préoccupation de santé publique majeure. Notamment, de nombreuses études révèlent un lien étroit entre le vieillissement et l’incidence des cancers. Ainsi, notre projet est susceptible d’avoir des retombées majeures dans la compréhension et la lutte contre le vieillissement immunitaire. A moyen terme, notre étude évaluera le rôle des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques et de l’axe ligand-X/récepteur-Y dans la régénération thymique. Par ailleurs, notre étude du rôle de l’axe ligand-X /récepteur-Y dans la dissémination leucémique permettra de mettre en avant une nouvelle cible thérapeutique, particulièrement en ciblant cet axe afin de limiter l’invasion dans les tissus. A plus long terme, nos études devraient participer au développement des thérapies promouvant le vieillissement en bonne santé en corrigeant les défauts de développement thymique liés à l’âge et pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des patients atteints de leucémies.
Procédures
Pour l’étude du rôle du ligand-X dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques, des souris âgées de 8 semaines, 12 mois (involution thymique avancée) ou 18 mois (involution thymique très avancée) vigiles recevront 2 séries d’injections (1 injection quotidienne par série de 4 jours, espacée de 3 jours de la suivante) permettant d’éliminer le récepteur Y dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins. Trois jours après la dernière injection, les souris âgées de 12 et 18 mois seront traitées avec le ligand-X ou un contrôle par injection sous anesthésie gazeuse légère, 3 injections par animal sur 3 jours consécutifs. Une partie des animaux recevront des progéniteurs de lymphocytes T par injection sous anesthésie gazeuse légère. La fonctionnalité des cellules sera ensuite analysée. Pour le modèle de leucémie, les souris âgées de 8 semaines recevront 2 séries d’injections (1 injection quotidienne par série de 4 jours, espacée de 3 jours de la suivante) permettant d’éliminer le récepteur Y dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins. Trois jours après la dernière injection, les animaux recevront une injection de cellules leucémiques sous anesthésie gazeuse légère durant 2 minutes par animal. Aux jours 3 et 6 après l’injection des cellules leucémiques, les animaux seront soumis à un prélèvement de sang sur animaux vigiles. Finalement, pour les tests de réponse vaccinale, des souris de 12 mois seront traitées avec le ligand-X ou un contrôle sous anesthésie gazeuse légère, 3 injections par animal sur 3 jours consécutifs. 28 jours après la première injection, les animaux recevront par voie sous-cutanée une protéine A en tant que modèle de vaccination sous anesthésie gazeuse légère.
Impact sur les animaux
Les injections intraveineuses (sous anesthésie gazeuse légère) et intrapéritonéales peuvent générer un stress, un inconfort et une douleur légère de courte durée. Concernant le modèle de leucémies, la maladie peut générer des nuisances caractérisées par un inconfort et une douleur prolongée. Bien que ce modèle puisse être léthal au-delà de 21 jours, les souris seront mises à mort et analysées à un temps court (maximum 10 jours) dans le cadre de ce projet. Les nuisances possibles sont : un stress, une perte de poids et une potentielle douleur prolongée. Concernant le modèle de réponse vaccinale, les injections sous-cutanées (sous anesthésie gazeuse légère) peuvent générer un stress et une douleur légère de courte durée et peuvent éventuellement générer une inflammation locale, qui sera surveillée quotidiennement attentivement. Les nuisances possibles sont : un stress, une perte de poids et une potentielle douleur modérée et prolongée.
Devenir
Les animaux utilisés seront mis à mort pour l'analyse à la fin des procédures.
Remplacement
A ce jour, aucune alternative non animale permet d’étudier l’effet de la régénération de la production du thymus par le traitement ligand-X. De plus, l’étude de la dissémination leucémique au sein des tissus nécessite l’utilisation du modèle in vivo. Notre projet nécessite donc une approche in vivo afin de mettre en relation les différentes composantes tissulaires et cellulaires impliquées dans la réponse étudiée.
Réduction
Le choix du nombre d’animaux est réalisé afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Il prend en considération la variabilité inter-individuelle, la variabilité de réponse au traitement et la variabilité de charge leucémique. Après la première expérience, le nombre d'animaux à utiliser sera ajusté après estimation du nombre d'animaux nécessaires pour garantir un résultat fiable. D’après nos analyses de la littérature et notre expérience passée, un nombre de 9 à 15 animaux par groupe devraient fournir des résultats suffisamment robustes et interprétables. Afin d’éviter les biais expérimentaux, les animaux seront répartis en aveugle dans les différents groupes de traitement par un expérimentateur tiers. Afin de réduire le nombre de souris contrôles utilisées, un maximum de groupes différents seront constitués lors d’une même expérience, e.g. l'étude de la dissémination leucémique chez les animaux et l’étude de l’effet d’une neutralisation du ligand-X chez ces animaux.
Raffinement
Afin de réduire les nuisances, plusieurs mesures seront prises. Concernant le stress de manipulation, les animaux seront manipulés par un seul expérimentateur sauf pour l’étape de répartition dans les groupes. Les animaux seront soumis à une anesthésiés gazeuse légère par inhalation gazeuse avant chaque injection intraveineuse. Les animaux bénéficieront par ailleurs d’une surveillance quotidienne ou tous les deux jours selon la procédure, afin d’identifier tout signe de gêne ou de douleur, à l’aide d’une grille d’évaluation dans le cas de la leucémie. Entre autres, les animaux seront pesés tous les jours avec une balance de précision, et seront soumis à une surveillance accrue dès l’identification d’une perte de poids. En cas de faiblesse pouvant générer un défaut d’alimentation ou de perte de poids importante, une alimentation hydratée spécifique sera déposée dans le fond de la cage. Les signes de douleurs seront monitorés avec précision selon la grille d’évaluation, et des analgésiques seront administrés à l’apparition de signes de douleurs.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix des divers projets de l’équipe, adapté à l’analyse du système immunitaire, et en particulier du thymus, ainsi qu’à l’oncologie. Les souris génétiquement modifiées que nous utiliserons ont un fond génétique stable et après traitement, le récepteur Y sera spécifiquement mutée dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques . Trois âges sont prévus : -stade jeune : souris de 8 semaines. -stade avancé d’involution thymique : souris âgées de 12 mois. -stade très avancé d’involution thymique : souris âgées de 18 mois.
Etude de la vulnérabilité aux maladies psychiatriques chez un modèle murin hypocholinergique
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Quinze minutes d'observation par jour pendant trois semaines sous pulvérisations de spray sucré, dix injections intrapéritonéales en dix jours, une restriction alimentaire faisant perdre jusqu'à 25 % du poids : 1 000 souris vont être utilisées, 336 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère et 664 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Certaines subissent en plus une chirurgie cérébrale de deux heures pour injecter un virus et implanter des fibres. Le porteur cherche à provoquer des comportements compulsifs, toilettage excessif, anorexie d'activité sur roue, effets de substances psychoactives, chez une lignée porteuse d'un variant sur-représenté dans des populations humaines poly-toxicomanes et anorexiques. Il affirme que l'absence de méthodes alternatives l'"oblige" à recourir à ces modèles murins, et ne dit rien de ce qu'un comportement de souris permet de conclure sur un trouble psychiatrique humain.
Objectifs
Ce projet de recherche s’intéresse aux mécanismes communs sous jacents aux maladies psychiatriques. Les comportements habituels persistants et la compulsion sont considérés comme des caractéristiques communes à plusieurs pathologies telles que les troubles obsessionnels compulsifs, les troubles liés à la consommation de substances et les troubles du comportement alimentaire. L’identification d’un variant sur-représenté dans des populations humaines poly-toxicomanes et anorexiques constitue un atout pour étudier les mécanismes moléculaires, cellulaires et comportementaux pouvant être à l’origine de ces désordres psychiatriques à composante compulsive sur un modèle murin. Les objectifs de ce projet sont 1) identifier la vulnérabilité aux compulsions de ce modèle murin, 2) comprendre comment ce variant module l’activité de certaines régions cérébrales au cours de la mise en place de ces comportements compulsifs et 3) identifier des stratégies thérapeutiques pharmacologiques pour rétablir un comportement normal chez ce modèle murin.
Bénéfices attendus
Notre projet tend à comprendre les mécanismes neuronaux sous jacents à la mise en place de maladies psychiatriques à composante compulsive. A l’heure actuelle très peu de données permettent d’y voir clair et d’envisager une thérapie visant à empêcher voir réduire la sévérité de ces pathologies pour certaines mortelles. Notre travail permettra une meilleure compréhension sur ce sujet ainsi que d’approfondir nos connaissances sur ces pathologies psychiatriques. Nos travaux identifieront des facteurs et des processus qui permettront par la suite d’envisager de nouvelles approches thérapeutiques afin de lutter contre ces maladies dévastatrices.
Procédures
Six procédures expérimentales seront effectuées afin de comprendre les bases neurobiologiques des désordres compulsifs. En utilisant des modèles murins nous évaluerons l’efficacité d’un traitement pharmacologique sur le rétablissement d’un comportement normal. Un premier aspect consistera à s’intéresser à la mise en place comportementale de la compulsion en étudiant le toilettage compulsif chez les animaux (procédures 1 et 4) à travers l’exposition et l’analyse comportementale des animaux exposés à des pulvérisation de spray sucrée sur le pelage (15 min d’observation quotidienne durant 3 semaines max) avec ou sans administration de traitement pharmacologique en intrapéritonéale (10 injections max à raison 1 fois par jour pendant 10 jours–quelques secondes). Nous nous intéresserons ensuite à la compulsion observée lors de la mise en place de troubles du comportement alimentaire (procédures 2 et 5). Les animaux seront individualisés, exposés à une roue d’activité (libre accès dans la cage durant 3 semaines environ) et l’apport en aliment sera contrôlé (sur une période de 10 jours max) avec ou sans administration de traitement pharmacologique en intrapéritonéale (7 injections max à raison 1 fois par jour pendant 7 jours max–quelques secondes). Enfin, nous nous intéresserons aux effets après administration ou non de substances psychoactives (procédure 3) délivrées quotidiennement en intrapéritonéale (1 injection par jour durant 6 jours – quelques secondes) et leur comportement sera enregistré avec ou sans administration de traitement pharmacologique en intrapéritonéale en amont (6 injections maxi à raison 1 fois par jour pendant 6 jours–quelques secondes). Les procédures 4 et 5 incluront une unique chirurgie au niveau cérébral qui se déroulera avant la mise en place des comportements de compulsion. Cette chirurgie d’une durée de 2 heures max effectuées sous anesthésie et analgésie permettra de pouvoir suivre les modifications neurobiologiques. Enfin, la procédure 6, inclura une chirurgie au niveau cérébral permettant d’administrer des vecteurs viraux permettant de modéliser différents modèles. Cette chirurgie d’une durée de 2 heures max effectuées sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront ensuite exposés aux 2 types de compulsions (toilettage et alimentaire) de manière successive avec un temps de repos entre les deux. Les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés pour effectuer des analyses de prélèvements biologiques.
Impact sur les animaux
1/ La mise en place de la compulsion de toilettage peut entrainer un stress ou une anxiété chez les animaux (perte de poids 5-1 pourcents) 2/ L’isolement peut entraîner un stress et une souffrance chez les les animaux 3/ L’ABA nécessitant une restriction alimentaire progressive entraine une perte de poids conséquente chez l’animal après plusieurs jours (5-25 poucents) 4/ L’injection ip peut entraîner une douleur légère au point de piqure 5/ Les chirurgies stéréotaxiques (injections de virus et implantation de fibres) peuvent entraîner un affaiblissement des animaux pendant les heures suivant celles-ci. Un risque d’inflammation peut aussi être considéré suite aux sutures 6/ Un risque d’hypothermie est possible sous anesthésie tout comme un arrêt cardio-respiratoire
Devenir
L'ensemble des souris sera euthanasié afin de prélever les cerveaux nécessaires à la réalisation des analyses immunohistochimiques et moléculaires.
Remplacement
Un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs impliqués dans la mise en place des désordres psychiatriques que nous étudions. Ainsi l’utilisation de rongeurs est nécessaire dans la mise en œuvre de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires, moléculaires et neuronaux rentrant en jeu dans ces pathologies. L’absence de méthodes alternatives quant à l’étude des comportements compulsifs (de toilettage, du comportement alimentaire et de l’addiction) nous oblige à utiliser les modèles murins proposés.
Réduction
Le projet impliquera un total de 1000 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-individuelles et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Les animaux sont hébergés dans les conditions standard sur le plateau de phénotypage. Sauf procédure expérimentale le nécessitant, les souris seront hébergées par groupe de 2-5 dans des cages adaptées à leur taille et leur nombre. Dans ces cages, l’enrichissement utilisé sera du nid végétal. Les animaux seront suivis durant l'ensemble de la procédure. A minima, une pesée hebdomadaire sera effectuée. Une détérioration de leur état général (perte de poids, prostration, poils souillés) entrainera un arrêt immédiat de la procédure, un suivi journalier de l’animal avec traitement antalgique et éventuellement une euthanasie pour éviter toute souffrance. Pour tous les tests comportementaux, les animaux sont habitués à être manipulés par les expérimentateurs avant le début des tests afin de réduire le stress. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent se battre et se blesser ; elles sont, dans ces cas, prises en charge immédiatement avec l’avis du comité de bien être animal et/ou du vétérinaire-référent de notre établissement utilisateur. Nous avons défini des points limites pour toutes les procédures. Si ces points limites sont atteints, nous consultons notre vétérinaire référent pour décider du devenir des souris.
Choix des espèces
Notre projet est basé sur l’étude d’un variant identifié chez des patients humains. L’expression de celui-ci chez la souris est indispensable pour mieux comprendre la vulnérabilité qu’il confère aux humains envers diverses maladies psychiatriques. Ainsi, le modèle souris constitue un atout pour développer efficacement notre projet. L’étude d’animaux est indispensable puisque nous explorerons les altérations physiopathologiques dans le cerveau et leurs conséquences sur le comportement. Les mécanismes qui sous-tendent le contrôle du comportement par le système nerveux central ne peuvent pas être abordés uniquement par des études à l’échelle cellulaire. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont essentielles pour comprendre les dysfonctionnement cérébraux opérants dans la mise en place des comportements compulsifs. Nous disposons de techniques adaptées à cette espèce (électrophysiologie, comportement, chirurgie et génomique). Nos études sur la mise en place des compulsions dans les maladies psychiatriques seront importantes non seulement pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de celles-ci mais permettront également d’envisager de nouvelles pistes thérapeutiques. Dans nos études, nous utilisons des animaux adultes, de plus de 8 semaines au moment du début des procédures décrites. En effet, nos études visant à identifier les bases neurales de la mise en place de comportements compulsifs se focalisent pour le moment chez l’adulte.
Evaluation de 2 nouvelles formulations à 2 doses sur la cicatrisation chez la souris Hairless Skh-1
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Tester deux formulations de gel cicatrisant à deux doses mobilise 40 souris hairless, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une plaie de 6 mm est découpée sur toute l'épaisseur de la peau du flanc gauche de chaque souris sous anesthésie générale, puis traitée et pansée tous les deux jours sous anesthésie jusqu'à cicatrisation complète. Chaque souris reste seule en cage transparente pendant toute l'étude, pour éviter qu'elles ne s'arrachent mutuellement leurs pansements. Le porteur prévoit la mise à mort de celles qui perdent plus de 20 % de leur poids maximal ou 15 % entre deux pesées, comme de celles qui présentent cachexie, vocalises ou convulsions.
Objectifs
L’objectif de notre projet est d’évaluer les effets de 2 nouvelles formulations sous forme liquide formant un gel, administrées par application cutanée locale (voie topique) à 2 doses, sur le processus de cicatrisation sur un modèle de plaies cutanées induites par excision cutanée complète chez la souris. Une plaie cutanée sera réalisée sur le flanc gauche de chaque souris. Les 2 nouvelles formulations seront appliquées tous les 2 jours directement sur les plaies cutanées induites jusqu’à cicatrisation complète de celles-ci. Après cicatrisation complète de leur plaie cutanée, les souris seront euthanasiées avant réalisation d’un prélèvement cutané pour la réalisation d’analyses biologiques.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité sur la cicatrisation de 2 nouvelles formulations en cours de développement, formulations ayant montré des effets bénéfiques sur la prolifération cellulaire in vitro. L’évaluation se fera par des observations tous les 2 jours des plaies cutanées avec scorage de différents paramètres, la mesure de leur surface, la détermination du temps nécessaire à la cicatrisation complète, et après cicatrisation complète, par des analyses biologiques de prélèvements cutanés effectués au large de la région d’induction des plaies cutanées. Les données issues de ce projet sont d’un intérêt majeur pour déterminer les effets biologiques sur le processus cicatriciel de ces 2 nouvelles formulations in vivo dans un modèle préclinique avant d’envisager des études cliniques chez l’Homme avec l’une et/ou l’autre des 2 formulations testées.
Procédures
Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction des plaies cutanées. Sous anesthésie générale, une plaie cutanée de 6 mm de diamètre sur toute l’épaisseur de la peau sera effectuée sur le flanc gauche de chacune des 40 souris nécessaires à la réalisation de ce projet. Un traitement analgésique des souris sera administré 1 heure avant la chirurgie puis 6 heures après. La chirurgie sera réalisée en 5 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les plaies cutanées seront traitées immédiatement après leur induction puis tous les 2 jours jusqu’à cicatrisation complète. Les plaies cutanées seront protégées par un pansement de couverture changé tous les 2 jours sous anesthésie générale et seront observées et scorées lors de chaque change effectué. Chaque retrait du pansement de couverture, observation et traitement des plaies cutanées et mise en place d’un nouveau pansement de couverture seront réalisés en moins de 10 minutes pour chaque souris. Un suivi quotidien des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des souris en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le pansement de couverture permettant le maintien des traitements appliqués au contact des plaies cutanées et la protection de celles-ci.
Impact sur les animaux
L’induction des plaies cutanées peut engendrer une douleur au cours des premières heures suivant celle-ci. La répétition des anesthésies même de courte durée (moins de 10 minutes), nécessaires afin d’enlever délicatement le pansement de couverture pour observer, photographier puis traiter les plaies cutanées avant de mettre en place un nouveau pansement de couverture, induiront une nuisance pour les souris. D’autre part, un stress dû à la limitation des interactions sociales directes pourra être induit par l’hébergement en cage individuelle transparente des souris, rendu nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le pansement de couverture permettant le maintien des traitements appliqués au contact des plaies cutanées et la protection de celles-ci.
Devenir
A l’issue de l’unique procédure expérimentale permettant l’induction des plaies cutanées puis le traitement et le suivi de celles-ci jusqu’à leur cicatrisation complète, les souris seront euthanasiées. Un prélèvement cutané sera réalisé au large de la zone d’induction des plaies cutanées pour la réalisation d’analyses qui permettront de caractériser les effets des traitements effectués sur la régénération du tissu cutané.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro (culture de cellules cutanées) ou ex vivo (explants cutanés) qui ne pourraient pas être maintenus dans un état physiologique pendant une durée prolongée, au moins 2 semaines selon notre expérience du modèle de plaie cutanée utilisé. D’autre part, le processus cicatriciel met en jeu des mécanismes complexes entre différents types cellulaires qu’il est pour le moment impossible à reproduire in vitro ou ex vivo (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, formation de nouveaux vaisseaux sanguins fonctionnels…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé par un calcul de puissance statistique effectué à l’aide d’un logiciel adapté. Selon ce test de puissance statistique, il est ainsi nécessaire de n’utiliser que 8 animaux avec 1 plaie cutanée par animal (soit 8 plaies cutanées) par groupe expérimental pour mettre en évidence des différences significatives.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celles-ci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré tous les 2 jours à chaque renouvellement de pansement, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint ou de 15% entre 2 pesées est observée, ou si des signes de toxicité des traitements, d’infection des plaies cutanées ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les souris seront placées individuellement dans des cages de taille adaptée dans une animalerie maintenue en cycle de lumière inversé afin d’observer leur comportement avant et après traitement pendant leur phase active. Cela permet de respecter leur horloge biologique (chronobiologie) et d’évaluer l’influence des traitements sur leur activité (chronopharmacologie). Des morceaux de papier absorbants et de papier kraft seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière effectué 2 fois par semaine.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire des plaies cutanées représentatives des plaies à traiter chez l’Homme, et la souris Hairless est un modèle très utilisé et largement décrit dans la littérature scientifique pour les études dans le domaine de la Dermatologie et plus spécifiquement sur la cicatrisation. De plus, elle présente une structure de la peau relativement proche de celle de l’Homme permettant ainsi une bonne transposition des résultats obtenus. Les animaux seront de jeunes souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur la cicatrisation (généralement 6 à 8 semaines), et de souris utilisées lors d’études précédentes menées dans notre laboratoire selon le même protocole expérimental et ayant donné des résultats très intéressants.
Raffinement et évaluation du niveau de stress pendant l’hébergement d’une lignée murine
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
Exposées à un prédateur, isolées deux heures, agitées une heure sur plaque, laissées douze heures dans une cage inclinée à 45 degrés puis douze heures sur de la litière sale de rat, éclairées en continu pendant trente-six heures : dix souris subissent un stress chronique et imprévisible, la moitié des tests répétés deux fois pour éviter l'habituation. Le lot complet compte 30 souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, avec trois pesées par semaine et deux prises de sang sous anesthésie. Le projet est déclaré au titre du bien-être animal et mesure le stress selon les conditions d'hébergement, hormone du stress dans les selles, globules blancs, test d'anxiété, poids. Aucune souris n'est tuée à l'issue, toutes sont gardées vivantes pour être réutilisées dans des formations réglementaires à l'expérimentation animale.
Objectifs
Notre unité est une unité d'appui à la recherche dont une des fonctions principales est d'élever et d'héberger des rongeurs (souris, rats, hamsters...) à des fins d'utilisation dans des projets expérimentaux. La prise en compte du bien-être animal regroupe le respect des 5 libertés individuelles : absence de faim, de soif et de malnutrition, absence de peur et de détresse, absence de stress physique et/ou thermique, absence de douleur, de lésions et de maladie et la liberté d'exprimer le comportement normal de son espèce. Certaines de ces libertés individuelles sont faciles à mettre en oeuvre comme l'absence de faim, de soif et de malnutrition tandis que l'absence de peur, de détresse et de stress physique sont difficilement évaluables. Le stress aboutit à la production d'hormone qui modifie des fonctions biologiques dans l'organisme avec des conséquences sur le métabolisme, la reproduction, la croissance, le système immunitaire...Ces conséquences ont un retentissement sur la qualité des résultats des expérimentations mises en oeuvre dans notre animalerie par les chercheurs dans des disciplines variées. Nous souhaiterions par ce projet évaluer le niveau de stress d'animaux hébergés dans différentes conditions (1: standard de notre animalerie; 2: avec un raffinement augmenté;3 : en condition dégradée par un stress chronique). Différents paramètres seront étudiés : niveau d’hormone du stress dans les selles, analyse des quantités et des types de globules blancs circulants, test de mesure de l’anxiété, nourriture consommée et masse corporelle.
Bénéfices attendus
Nous espérons pouvoir quantifier différents niveaux de stress. Ce projet doit nous permettre de déterminer si nos conditions d'hébergement standard induisent un stress chez nos animaux et si nous pourrions le diminuer en raffinant nos conditions de change et de manipulation des animaux (tail handling vs cup handling). Nous déterminerons des valeurs de référence relative à l’hormone du stress et au différentes populations de globules blancs pour notre animalerie pour envisager des contrôles ponctuels ultérieurs.
Procédures
Les animaux seront manipulés 3 fois par semaine pour être pesés vigiles (2 minutes par pesée). Les animaux subiront deux prélèvements de sang sous anesthésie (50µl prélevés,2 minutes d'anesthésie gazeuse chacune, l'interval sera proche de 3 semaines). Tous les protocoles de stress induiront une nuisance pour les animaux du lot 3 (5 mâles et 5 femelles) : - test 1 exposition à un prédateur ; durée 30 minutes - test 2 stress d'isolement ; durée 2 heures - test 3 stress d'agitation sur plaque ; durée 1 heure - test 4 exposition à un nouvel environnement ; durée 30 minutes - test 5 changement multiple de cage ; durée 4 heures - test 6 inclinaison de cage à 45° ; durée 12 heures - test 7 exposition à de la litière sale de rat ; durée 12 heures - test 8 absence de litière et de raffinement ; durée 12 heures - test 9 exposition à une lumière continue ; durée 36 heures - test 10 inversion de cycle jour/nuit ; durée 48 heures. Les tests 1,2,3,5,6 et 7 seront faits 2 fois non consécutives pour faire varier le type de test en tenant compte de la faisabilité pendant certains jours de la semaine et pour éviter une habituation.
Impact sur les animaux
Tous les animaux subiront un stress pour les prises de sang au début et à la fin du projet. Ils seront anesthésiés par inhalation de gaz anesthésiant et la quantité de sang prélevée sera environ de 50µl. Les animaux du lot 3 soit 10 animaux (5 mâles et 5 femelles) subiront un stress chronique et imprévisible au cours des différents protocoles de stress.
Devenir
Les animaux seront tous gardés en vie afin de pouvoir les réutiliser dans des projets pour lesquels nous avons une autorisation à savoir des formations règlementaires à l'expérimentation animale .
Remplacement
Le remplacement du modèle murin in vivo n'est pas possible car il n'existe pas de système ex vivo qui nous permette de déterminer les marqueurs biologiques de stress décrits dans la littérature à savoir le niveau de corticostérone et le ratio polynucléaires neutrophiles/ lymphocytes. Les tests de Maze ne peuvent être effectué que sur animaux vigiles.
Réduction
Nous avons déterminé 3 groupes d'animaux (5 mâles et 5 femelles) pour étudier l'effet sur les deux sexes. L'effectif de 5 animaux par sexe et par groupe est suffisant pour observer une variation significative de 10%.
Raffinement
Les animaux seront manipulés après une période d'acclimatation de 1 semaine. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les animaux sont hébergés dans des salles ou l'hygrométrie et la température sont controlées. L'eau et la nourriture sont ad libitum. Des points limites ont été définis à savoir la présence d'une blessure ou une perte de poids > 20% déterminée par la pesée des animaux pendant la procédure.
Choix des espèces
La souris a été choisie car notre unité est spécialisée dans l'hébergement, l'élevage et l'appui à l'expérimentation animale sur des rongeurs. Les marqueurs de stress comme la corticosterone sont facilement dosables par des kits commerciaux et les automates d'hématologie sont adaptés à la mesure des parmètres hématologiques de la souris. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte car les animaux que nous recevons pour hébergement sont âgés de 6 semaines et les animaux qui proviennent de nos élevages sont très généralement impliqués dans des procédures expérimentales à l'âge adulte.
Rôle des vésicules extracellulaires tumorales dans la douleur associée au cancer
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
458 souris pour une injection unique sous la plante de la patte chacune, suivie de tests de douleur mécanique et thermique dans les vingt-quatre heures. Toutes sont tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis disséquées pour prélever la patte, les ganglions rachidiens et la moelle épinière. Le porteur explique que le seuil de douleur est "repéré par l'animal lui-même", le test s'arrêtant au retrait de la patte. L'objet réel est de savoir si des vésicules issues de tumeurs pancréatiques rendent les nerfs plus sensibles, question posée loin en amont de toute application pour les malades.
Objectifs
Le cancer du pancréas est de très mauvais pronostic et douloureux. Nous pensons que cette douleur est causée par des substances libérées par les cellules cancéreuses. Ces substances peuvent rendre les nerfs plus sensibles à la douleur et favoriser leur croissance dans la tumeur, mais leur nature exacte demeure inconnue. Nous proposons d’étudier le rôle potentiel des petites vésicules extracellulaires (appelées EVs) dans ce processus. Notre objectif est de caractériser l’impact des EVs produites par les cellules cancéreuses pancréatiques sur les réseaux nerveux et la douleur associée au cancer chez les souris. Pour cela, nous voulons observer si l'injection de ces EVs dans les pattes des souris provoque : 1/ Une sensibilité accrue à la douleur 2/ Des changements dans l’innervation de la patte 3/ Une activation des circuits neuronaux impliqués dans la douleur.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats de ce projet augmenteront nos connaissances sur les mécanismes fondamentaux régulant l’innervation tumorale et la génération de la douleur dans le cancer. A plus long terme, les résultats pourraient avoir des applications médicales concrètes dans le traitement du cancer et de la douleur afin d’améliorer la qualité de vie des patients.
Procédures
Les animaux auront une injection intraplantaire unique avant de subir les tests de comportements pour évaluer la douleur.
Impact sur les animaux
Les injections intraplantaires peuvent causer de la douleur suite à la pénétration de la peau avec l’aiguille au moment de l’injection. Les souris peuvent donc développer un stress, pour éviter cela, elles seront anesthésiées sous isoflurane. Pour les tests de comportement, le stimulus mécanique ou thermique peut provoquer de la douleur qui sera visualisée par un retrait de la patte de l’animal. Le point limite (seuil nociceptif) est donc repéré par l’animal lui-même. Le test est arrêté au retrait de la patte de l’animal donc on ne dépassera pas le seuil. Les expériences sont arrêtées au maximum à 24h post-injection. Une grille de score servira de repère pour vérifier l’état de l’animal.
Devenir
Ces animaux ne peuvent être réutilisés pour d’autres procédures. Par conséquent, à la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort puis disséqués pour récupérer différents organes (patte, les ganglions de la racine dorsale et la moelle épinière) afin d’être analysés.
Remplacement
Notre recherche vise à comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires de la douleur associée au cancer. Nous explorons l'idée que les petites vésicules (EVs) provenant des tumeurs pancréatiques pourraient causer une sensibilité accrue à la douleur en modifiant les nerfs dans la tumeur. Pour étudier cette question, notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes in-vitro. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. Ainsi, l’observation du comportement animal est nécessaire pour comprendre comment la douleur est perçue et transmise au cerveau. Cette approche est d’autant plus pertinente que des différences comportementales entre mâles et femelles peuvent également influencer la façon dont les signaux sensoriels sont traités à différents niveaux dans le corps. En résumé, l'utilisation de souris est essentielle pour étudier les causes pathophysiologiques de la douleur cancéreuse et mener à bien notre projet de recherche.
Réduction
Nous mettrons en place des stratégies pour limiter l'utilisation d'animaux supplémentaires tout en collectant suffisamment de données pour répondre à nos questions de recherche. Cela implique de définir précisément nos protocoles comportementaux et de choisir judicieusement nos contrôles. Nous utiliserons également des outils statistiques pour estimer le nombre optimal d'animaux nécessaires. En contrôlant les paramètres environnementaux et en surveillant la santé des animaux, nous réduirons la variabilité des résultats expérimentaux et, par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ces procédures sont bien établies dans notre institut et nos chercheurs sont expérimentés dans leur mise en œuvre et dans l'évaluation de l'impact sur le bien-être des animaux. En optimisant notre plan expérimental et en analysant attentivement le nombre d'animaux requis, nous minimisons ainsi l'utilisation d'animaux tout en maintenant la qualité et la validité de nos résultats scientifiques.
Raffinement
Les souris utilisées dans notre projet seront élevées en groupes sociaux et bénéficieront d'un environnement enrichi avec du coton et/ou un dôme pour assurer leur bien-être et favoriser un comportement normal, réduisant ainsi au maximum leur stress. L'élevage des souris est effectué dans notre établissement agréé par une équipe de cinq personnes dédiées à leur organisation et leur entretien. Nous contrôlons quotidiennement la santé et les conditions environnementales des animaux pour assurer leur bien-être. Les procédures expérimentales seront minutieusement planifiées, y compris la disponibilité des locaux, du matériel et la période d'acclimatation des animaux, afin de minimiser leur stress et d'assurer la fiabilité des résultats. Avant les tests comportementaux, les souris seront habituées pendant 45 minutes dans l'enceinte pour s'adapter à leur environnement. Nous établirons également des points limites les plus précoces possibles en fonction des tests comportementaux utilisés. Toutes ces mesures sont mises en place dans le but de réduire, voire d'éliminer, la souffrance des animaux et d'assurer leur bien-être tout au long de l'étude.
Choix des espèces
Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. Travaillant sur la physiologie d’animaux adultes, nos tests comportementaux et nos analyses moléculaires seront réalisés sur des souris âgées de 8 à 12 semaines.
Modifications de la signalisation calcique dans un modèle murin de maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Les souris de cette lignée transgénique perdent spontanément leurs synapses à partir de six mois, dégénérescence construite pour reproduire la maladie d'Alzheimer. 700 vont être utilisées, 620 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère et 80 un niveau modéré, toutes tuées. Un fragment de queue est prélevé sur les souriceaux de 7 à 10 jours pour lire leur génotype, une partie subit une injection intracérébrale sous anesthésie d'une heure, une autre une injection intrapéritonéale. Les reproducteurs sont gardés jusqu'à six mois puis tués, le porteur indiquant qu'il ne sera possible ni de les placer ni de les réutiliser du fait de leur modification génétique.
Objectifs
Au cours de la maladie d’Alzheimer, des pertes de synapses, les connexions entre les neurones, se produisent dans le cerveau. Ces pertes sont bien corrélées à l’intensité des troubles cognitifs caractérisant la maladie. Ainsi, des traitements visant à réduire ces pertes pourraient protéger contre les déficits cognitifs. Un contrôle local des quantités de calcium au niveau des synapses est indispensable à leur maintien. Notre objectif est de déterminer si les pertes de synapses dans un modèle murin de maladie d’Alzheimer pourraient être dues à des altérations de la régulation du calcium au niveau des synapses.
Bénéfices attendus
On estime que plus de 850 000 personnes sont affectées par la maladie d’Alzheimer en France, avec une espérance de vie de 8 à 12 ans à partir du moment où le diagnostic est établi. Le mécanisme des pertes de synapses dans la maladie d'Alzheimer est encore très mal connu. Ce projet a pour objectif de tester l’implication d’altérations du contrôle des niveaux de calcium au niveau des synapses dans ces pertes. La preuve de l’implication de telles altérations pourrait, à plus long terme, orienter vers une nouvelle piste thérapeutique.
Procédures
Un élevage de souris transgéniques modèles de maladie d'Alzheimer présentant des pertes de synapses sera effectué. Cela nécessitera de prélever un fragment de queue à l’âge de 7 à 10 jours (une fois, durée de moins d’une minute par animal) pour déterminer leur patrimoine génétique. Des souris auront une chirurgie consistant en une injection intracérébrale unique sous anesthésie générale, avec une prise en charge analgésique adaptée. Cette procédure durera une heure et sera faite une seule fois. D’autres souris recevront une injection intrapéritonéale unique d’un traitement pharmacologique (une fois, durée de moins d’une minute par animal). Les souris seront euthanasiées en fin de période de maintien par une méthode réglementaire pour prélèvement et analyses.
Impact sur les animaux
Les animaux ressentiront une légère et brève douleur lors du prélèvement de l’extrémité de la queue pour déterminer leur patrimoine génétique. Les souris génétiquement modifiées que nous utilisons dans ce projet développent spontanément une perte de synapses avec l'âge, mais elles seront euthanasiées au début de cette perte. La contention des souris nécessaire pour les manipulations et notamment pour les injections peut entrainer du stress.. Les injections peuvent entrainer une légère douleur au point d’injection. La chirurgie effectuée sous anesthésie générale comporte des risques rares associés à l'anesthésie (hypothermie, arrêt cardio-respiratoire). De plus, les souris pourraient ressentir un inconfort et des douleurs post-opératoires suite à la chirurgie.
Devenir
A la fin des procédures les souris seront euthanasiées afin de prélever leur cerveau pour analyser l'effet des traitements. Les animaux reproducteurs seront maintenus jusqu’à 6 mois pour garder des facultés de reproduction optimales. Ils seront ensuite euthanasiés car il ne sera pas possible de les replacer ou les réutiliser du fait de leurs modification génétique.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet le mécanisme de la neuro-dégénérescence dans la maladie d’Alzheimer n’est pas connu. Or les modèles animaux de la maladie d’Alzheimer sont les seuls à permettre d’étudier la perte progressive de synapses adultes au sein d’un organisme où les voies de signalisation sont interconnectées.
Réduction
Au cours du projet nous estimons que nous produirons au maximum 700 souris. Les animaux générés permettront de renouveler les reproducteurs de notre élevage, de réaliser les procédures expérimentales, et de réaliser des analyses nécessitant uniquement la collecte de tissus post-mortem. Nous ne produirons que le nombre strictement nécessaire d’animaux. De plus, le nombre d’animaux utilisés pour les procédures expérimentales (320) est réduit au maximum, la taille des groupes d’animaux ayant été établie pour obtenir une puissance statistique suffisante. Il sera en effet nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Le prélèvement d’un fragment de queue pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera limité à une taille minimale et sera réalisée en même temps que l’identification pour limiter le nombre de manipulations des souriceaux. Il est réalisé dans un endroit calme par des personnes compétentes. Si un reprélèvement était nécessaire il sera réalisé au niveau de l’oreille de l’animal et n’aura lieu que s’il est justifié auprès de la structure chargée du bien-être animal. Pour réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse : (i) les souris ont à disposition, comme élément d’enrichissement, des composants de nidification et des batonnets ; (ii) une surveillance quotidienne des paramètres environnementaux (lumière, température, hygrométrie) est réalisée ; (iii) une surveillance quotidienne des animaux est effectuée, afin de détecter un état de stress ou de douleur. Des points limites sont définis pour chaque procédure et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. La procédure chirurgicale est réalisée sous anesthésie avec une analgésie adaptée. Nous réaliserons un suivi rapproché en post-opératoire afin de détecter tout signe de douleur de l’animal. Les souris que nous utilisons dans ce projet présentent une perte de synapses à partir de l’âge de 6 mois, elles seront euthanasiées à ce moment là donc au début de la perte de synapses, et donc avant que cela n’engendre un impact visible sur leur état général.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris génétiquement modifiées, modèle de la maladie d’Alzheimer. Il n’existe pas à notre connaissance de modèles autres que ces souris pour atteindre les objectifs du projet. Le traitement visant à prévenir les pertes de synapses sera effectué à 3 mois, avant que les pertes de synapses ne soient observées chez les souris, et ses effets seront analysés 3 mois après injection, quand ces pertes sont significatives. Le traitement pharmacologique visant à réverser la perte de synapses sera effectué à 6 mois, quand cette perte est significative. Ses effets seront analysés après 1 jour, 1 semaine et 1 mois pour déterminer s’il y a un effet, et combien de temps il persiste. Les géniteurs seront utilisés entre 2 et 6 mois d'âge, période optimale pour la reproduction des souris.