Souris

Une lésion démyélinisante créée par injection dans la moelle épinière, sous anesthésie, en une heure d'opération au plus : c'est la principale procédure infligée à une partie des 2 084 souris de ce projet. Toutes seront tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 044 d'entre elles et modéré pour 1 040. Les autres reçoivent cinq injections quotidiennes dans le ventre pour supprimer une protéine dans leurs oligodendrocytes, puis une partie passe huit semaines seule en cage avant un test de sociabilité de cinquante minutes, l'objet étant de comprendre comment la myéline se reforme. Le porteur décrit la souris comme un animal grégaire entretenant de fortes interactions sociales, et en isole certaines pendant huit semaines pour mesurer ce que cet isolement fait à leur myéline.

Objectifs

Dans le système nerveux central (cerveau et moelle épinière), les neurones communiquent sous forme d’influx électrique, appelé influx nerveux, transporté le long de leurs axones. Afin d’assurer le bon transport de l’information électrique, la formation de gaines isolantes autour de l’axone est essentielle. Ces gaines sont nommées ‘gaines de myéline’. Elles sont formées par des cellules appelées les ‘oligodendrocytes’ et permettent donc de moduler la vitesse de conduction de l’influx nerveux afin que les messages transmis dans le cerveau se déplacement de façon coordonnée. Ces gaines de myéline sont formées au cours du développement post-natal mais sont dynamiques et modifiées tout au long de la vie afin d’assurer l’adaptation du circuit cérébral à l’environnement. Certaines pathologies, telles que la sclérose en plaque, sont caractérisées par une perte de ces gaines, menant à une perte de l’axone et un défaut cognitif et/ou moteur en fonction du site de la perte myélinique. Il a été démontré que la gaine de myéline peut parfois se reformer spontanément, mais les mécanismes à l’origine de cette remyélinisation ne sont pas bien compris. Il a été démontré qu’une protéine A, présente dans les oligodendrocytes, est essentielle à la formation de ces gaines de myéline, de par son action sur le « cytosquelette d’actine », un des échafaudages de la cellule lui permettant d’adopter plusieurs morphologies. Une première étude de cette protéine A chez la souris a permis de valider son rôle dans la myélinisation du cerveau au cours du développement. L’objectif de ce projet est de continuer l’étude du rôle de la protéine A dans la formation des gaines de myéline chez la souris afin de mettre en évidences de nouvelles cibles thérapeutiques. En effet, nous voulons étudier en profondeur les effets la protéine A sur (1) la modulation des gaines de myéline à l’âge adulte et (2) la réparation de la myéline (remyélinisation). La validation potentielle de la protéine A en tant que cible moléculaire permettant d’actionner cette dynamique chez l’adulte représente ainsi un espoir thérapeutique très important dans plusieurs pathologies de la myéline. Selon nos résultats préliminaires la protéine A est un excellent candidat à cibler pour exercer l’un de ces rôles, voire éventuellement les deux. En effet, puisque cette protéine régule la myélinisation développementale, il est possible qu’elle contrôle également la myélinisation adaptative et, ou la remyélinisation.

Bénéfices attendus

A terme, l’étude approfondie du rôle de la protéine A dans le contrôle de la myélinisation adaptative (myélinisation adulte) et de la remyélinisation permettra de mettre en avant de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de stimuler la myélinisation et sa réparation.

Procédures

Pour obtenir les souris porteuses du génotype d’intérêt permettant cette étude, nous devons générer des accouplements de souris. Les petits issus de ces croisements seront identifiés génétiquement à un stade juvénile (prélèvement d’un petit bout de queue par une personne compétente une seule fois sur animal vigile en moins de 2 minutes). Cela permettra de sélectionner les bons animaux qui sont porteurs des gènes d’intérêt. L’ensemble des souris génétiquement modifiées, porteuses du génotype d’intérêt seront sujettes à une injection en intrapéritonéal (injection à l’âge adulte sur animal vigile, 60 jours de vie, sur cinq jours consécutifs), cela permettra de supprimer la présence de la protéine A dans les oligodendrocytes de ces souris. Puis, une partie de ces souris sera inclue dans une expérience de sociabilisation (hébergement groupé ou isolé pendant huit semaines, puis à l’issue de ces huit semaines, évaluation de la sociabilisation par un test non invasif de 50 minutes au total). Une autre partie des souris sera sujette à une chirurgie à 90 jours de vie afin de créer une lésion démyélinisante et observer comment l’absence de la protéine A affecte les capacités de la souris à remyéliniser cette lésion. Cette chirurgie sera effectuée une seule fois (une heure au total au maximum), par une personne compétente sur souris anesthésiées et analgésiées avant, pendant et après l’opération. Elles seront suivies de près en postopératoire afin de détecter au plus tôt les signes de souffrance ou d’infection potentielle. Une partie de l’étude sera effectuée sur souris sauvages, non génétiquement modifiées. Ces souris recevront un traitement thérapeutique quotidien par voie orale pendant 6 semaines. L’euthanasie des animaux sera effectuée en fin de période de maintien par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Une légère et brève douleur au moment du prélèvement de peau sur l’extrémité de la queue (1mm) pour le génotypage au stade juvénile de la souris. Un stress peut être observé chez les souris transgéniques suite à la contention et à l’injection d’une molécule en intrapéritonéal (but de ce traitement : supprimer l’expression de la protéine A dans les cellules d’intérêt. Mais les principales nuisances attendues sont liées à l’acte chirurgical lors de l’étude de la remyélinisation : injection au niveau de la moelle épinière sous anesthésie générale de la souris (risques d’hypothermie, douleur au point d’injection, hématome, risque anesthésique, saignement, infections). De plus, il est possible que les animaux soient stressés suite à l’étude en condition d’isolement. Enfin, de façon générale, les tests comportementaux peuvent représenter un stress pour les animaux : nouvel environnement et manipulation.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés : -Soit avant le sevrage puisqu’ils ne seront pas porteurs du génotype d’intérêt -Soit à des fins expérimentales pour une étude structurelle de la myéline -Soit s’ils sont devenus trop vieux pur être utilisés comme reproducteurs

Remplacement

La myéline est une structure en trois dimensions : une extension de la membrane des oligodendrocytes qui s’enroule autour d’un axone électriquement actif. Suivant le principe de remplacement, nous avons déjà étudié en détail le rôle de la protéine A de manière in vitro (sur des cellules). Cependant, il est essentiel dans le cadre de cette étude, de passer par une étude in vivo (chez la souris) de la mutation afin de pouvoir observer la formation de la myéline impactée par toutes les interactions cellulaires présentes dans le cerveau. D’autant plus que nous voulons étudier le rôle de la protéine A sur la modulation de la myéline à l’âge adulte (myélinisation dite ‘adaptative’, modulée par l’expérience sociale) et sur la remyélinisation. Les interactions sociales et leurs impacts ne peuvent être observées que sur un animal complexe susceptibles d’interagir avec des congénères.

Réduction

Nous optimiserons l’utilisation de nos animaux (2084 souris). Ainsi, le nombre d’animaux utilisés sera limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables. Toutes les expériences seront réalisées sur des mâles et des femelles afin d’évaluer la présence éventuelle d’un sex-ratio. Toutes les quantifications se feront en aveugle. Nous travaillerons en étroite collaboration avec des statisticiens pour définir toutes les tailles d’échantillons et les tests statistiques appropriés (taille des effectifs calculés avec un calcul de puissance, test statistiques fiables pour une bonne interprétation des résultats).

Raffinement

L’animalerie est agréée, les conditions d’hébergement (température, hygrométrie, éclairage et espace) et les conditions d’enrichissement de l’environnement (coton, bâtonnet à ronger), d’alimentation et soins quand nécessaires seront contrôlés. Une période d’habituation à la manipulation par l’expérimentateur d’une semaine sera effectuée avant toute procédure expérimentale pour ne pas stresser l’animal. Les animaux seront suivis régulièrement (deux fois par semaine de façon générale, tous les jours pendant une semaine après la chirurgie) et de manière adaptée aux différentes procédures par notre équipe et la zootechnie, ainsi que par notre vétérinaire. Pour la condition expérimentale d’animal hébergé de façon isolée, un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage (papier kraft, maison en carton). Les injections de cette étude seront toutes faites par des personnes compétences. La lésion de démyélinisation (chirurgie) sera pratiquée sous analgésie et anesthésie, et reste localisée pour éviter les conséquences d’une démyélinisation plus globale. Des points limites sont mis en place et respecter pour éviter toute souffrance, sans décision ou prise en charge rapide des animaux.

Choix des espèces

De toute évidence, l’étude de la myéline nécessite l’utilisation de modèles animaux vertébrés. En effet, seuls les systèmes nerveux de vertébrés sont myélinisés. De plus, puisque nous étudions une voie moléculaire spécifique dans l’établissement de la myélinisation avec une visée thérapeutique future, il est indispensable que le modèle que nous choisissions ait une forte homologie de séquence génétique de cette dite voie moléculaire avec l’Homme. Le modèle souris présente plusieurs avantages pour notre étude : c’est un vertébré dont les gènes codant la voie étudiée présentent une forte homologie de séquence avec ceux de l’Homme. La plasticité de la myéline, similaire à celle retrouvée chez l’Homme, a été bien établie chez la souris, ce qui nous permet de mener à bien nos expériences de plasticité et de sauvetage de la myéline à l’âge adulte. Les souris entretiennent de fortes interactions sociales (animal grégaire) qui vont être le étudiées ici (hébergement isolé versus hébergement en groupe). Pour la génération de lignée de souris transgénique, les souris seront mises en accouplement à partir de 8 semaines (âge de maturité sexuelle). Pour l’étude sur la myélinisation adaptative, nous induirons la délétion de l’expression de la protéine A chez le jeune adulte (à 60 jours de vie) et étudierons les conséquences de cette délétion plus tard, à 120 jours de vie. Ainsi, nous pourrons étudier comment l’absence de la protéine A influence le cerveau déjà formé (le cerveau adulte). Pour l’étude de la remyélinisation, nous induirons la délétion de l’expression de la protéine A (ou bien nous modulerons l’activité de cette protéine) chez le jeune adulte (à 60 jours de vie. Nous effectuerons la lésion démyélinisante un mois après (donc à 90 jours de vie). L’étude des animaux sera ensuite effectuée à quatre stades post-chirurgie (4, 7, 14 et 30 jours après la lésion démyélinisante), afin d’observer successivement l’évolution des différents stades mis en jeu dans la remyélinisation.

La cornée abrasée sous anesthésie puis exposée à des molécules inflammatoires, ou les glandes lacrymales retirées en quinze minutes de chirurgie : 1 600 souris mâles subissent l'un de ces deux modèles de douleur oculaire. Toutes sont tuées pour prélèvements et analyses post-mortem, 1 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 600 un niveau léger. Le porteur attend les mêmes sensations que chez les patients humains, picotements, démangeaisons, brûlures, impression de corps étranger et sensibilité accrue à la lumière, et fait passer aux souris des tests de sensibilité cornéenne sur animal éveillé, une à quatre fois selon le modèle. L'effectif de 1 600 est présenté comme le fruit d'un calcul de puissance, sans que le nombre de groupes ni la répartition entre les deux modèles ne soient donnés, et rien n'indique combien de souris subissent l'ablation des glandes lacrymales.

Objectifs

La douleur oculaire est un symptôme d'alerte en réaction à une inflammation ou un traumatisme, affectant particulièrement la cornée, la sclérotique et la conjonctive. La douleur oculaire est remarquable par la variabilité de l'intensité qu'elle peut générer, allant d'une simple gêne oculaire à une douleur intense, voire insupportable. les douleurs chroniques de la surface oculaire entraînent, au-delà de la souffrance exprimée par les patients, une réelle altération de leur qualité de vie puisqu'on estime que près de 60 pour cent des patients sont gênés dans leurs activités quotidiennes. Diverses maladies inflammatoires ou infectieuses, des troubles neurologiques et des interventions chirurgicales oculaires peuvent être la cause sous-jacente de douleur cornéenne chronique. Dans les cas pathologiques graves, les lésions des nerfs cornéens peuvent entraîner une sensibilité accrue à la lumière et/ou des douleurs, une altération des fonctions physiques et sociales, une privation de sommeil, une anxiété et une dépression. Le poids des maladies de la surface oculaire, associant des symptômes douloureux intenses, des comorbidités émotionnelles et des altérations psychosociales, nous a conduit à en étudier les mécanismes sous-jacents. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués est un des enjeux cruciaux pour le développement de nouvelles stratégies de prise en charge et thérapeutiques efficaces pour soulager la douleur oculaire chronique.

Bénéfices attendus

Les douleurs chroniques de la surface oculaire entraînent, au-delà de la souffrance exprimée par les patients, une réelle altération de leur qualité de vie puisqu'on estime que près de 60 pour cent des patients sont gênés dans leurs activités quotidiennes. La prise en charge de la douleur chronique oculaire est actuellement un enjeu majeur alors que les traitements restent peu efficaces. Le bénéfice de ce projet est d’aboutir à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués, principalement inflammatoires et neurogènes, qui sont des enjeux cruciaux pour le développement de stratégies de prise en charge et thérapeutiques efficaces pour soulager la douleur oculaire.

Procédures

Deux modèles seront mis en œuvre dans le cadre de ce projet. Le modèle de douleur inflammatoire est induit par l’abrasion de la cornée effectuée sous anesthésie et analgésie (1 fois -10 minutes) associé à l’instillation de molécule inflammatoires le jour de l’abrasion lors de la même anesthésie (quelques secondes) et une seconde fois 3 jours après sur animal vigile par simple contention (quelques secondes). Le modèle de sécheresse oculaire est induit par exérèse des glandes lacrymales. Cette chirurgie est effectuée sous anesthésie et analgésie et dure au maximum 15 minutes. Ces modèles reproduisant le contexte de la maladie étudiée sont réalisés sous anesthésie et analgésie dans le respect des normes et recommandations concernant le bien-être animal et l’éthique en vigueur Dans toutes les procédures, les animaux seront soumis à des tests de sensibilité cornéenne, d’imagerie de la cornée, avant, durant et après la mise en place des modèles mimant ces douleurs. Ces tests ne durent qu’entre 1 à 5 minutes. Ils seront réalisés 2 fois chez les souris modèles de douleur inflammatoire, 4 fois chez les souris modèles de sécheresse oculaire. - Test de sensibilité cornéenne : animal vigile (pas d’anesthésie), durée du test : 1 minutes/session - Imagerie de la cornée par biomicroscopie : animal anesthésié, 1 injection d’anesthésique et le test dure 3 minutes. - Imagerie de la cornée par imagerie confocale in vivo : animal anesthésié, durée du test : 5 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l’aide de techniques non invasives (lampe à fente, biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’Homme par un ophtalmologiste sous anesthésie locale et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Le test de la sensibilité cornéenne se fera chez l’animal vigile contrairement aux études d’imagerie de la cornée qui nécessitent une immobilisation complète de l’animal et qui seront alors pratiqués sous anesthésie générale. Toutes les procédures comprennent une euthanasie qui sera réalisé selon une méthode réglementaire effectuée sous anesthésie générale et analgésie en vue des différents prélèvements pour analyses.

Impact sur les animaux

Des contentions de courtes durées et les injections sur animal vigile nécessaires aux anesthésies pourront être sources de stress ou d’inconfort pour l’animal. Les nuisances attendues dans les modèles de sécheresse oculaire sont celles observées chez l’Homme à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brulure, de corps étrangers dans l’œil, une sensibilité accrue à la lumière. L'anesthésie durant la chirurgie peut entrainer une détresse respiratoire ou cardiaque, une hypothermie. Les tests pratiqués peuvent engendrer une gêne transitoire de courte durée comme on peut le constater chez l’Homme

Devenir

Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux à la fin de chaque procédure.

Remplacement

À l’heure actuelle, ce projet nécessite l’utilisation d’animaux car aucune alternative in vitro ne peut mimer la pathologie de sécheresse et douleur oculaire qui lui est liée. La complexité et l’interaction du circuit mis en jeu (cornée, ganglions trigéminés et cerveau) et activité du système immunitaire inné ne peuvent également être étudiés et remplacés par un modèle vitro. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiologiques mis en jeu dans cette pathologie chez l’Homme, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à travers l’utilisation d’un modèle rongeur. De plus, une veille bibliographique réalisée confirme qu’à l’heure actuelle, aucun model in silico n’existe pour répondre à ces questions.

Réduction

Nous utiliserons au maximum 1600 animaux dans ce projet. Afin de respecter la règle de réduction, notre étude portera sur plusieurs structures (cornée, ganglion trigéminal, cerveaux,) de chaque animal. Nous utiliserons un nombre limité de souris et de groupes tout en gardant la significativité des résultats via une analyse statistique adaptée. Ces effectifs ont été établis grâce à une calcul de puissance statistique.

Raffinement

Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. L’hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignés de souris. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compacté, tube en carton) et maintien des animaux en groupe de 5 congénères afin d’éviter le stress de l’isolement. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. La température de la zone d’hébergement est maintenue à température règlementaire et suit un cycle d’éclairage non inversé 12h jour/12h nuit. Les animaux seront observés et manipulés quotidiennement afin de minimiser le stress et la douleur qui seront évalués à l’aide de points limites validés par le comité local du bien-être animal en concertation avec les responsables de l’animalerie. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie. L’application de cette échelle permettra de modifier la procédure en cours avec l’administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou enfin d'euthanasier l’animal en dernier recours. Pour éviter toute souffrance les procédures de chirurgie se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Les tests d’imageries qui peuvent induire un stress et nécessitent que l’animal soit immobile seront réalisés sous anesthésie générale légère.

Choix des espèces

Le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l'animal de choix car (1) elle possède les structures oculaires et cérébrales adéquates, (2) nous avons accès à tous les outils génétiques requis. Ce projet nécessite l’utilisation de souris mâles adultes sauvages C57BL/6J, de souris mâles adultes issus des lignées transgéniques. Ces animaux arriveront à l’animalerie à l’âge de 7 semaines (poids environs 20-25g) afin de respecter une semaine d’acclimatation et seront utilisés à l’âge de 8 semaines (âge de la maturité sexuel). Cela permettra de travailler sur des souris adultes tout en évitant des biais liés au changement physiologique de l’animal vieillissant. En effet l’ensemble des procédures de ce projet durant entre 3 à 11 semaines maximum. Les souris auront donc au maximum 19 semaines en sortie de procédure.

Une injection intraveineuse sous anesthésie générale, jusqu'à cinq prises de sang à la veine mandibulaire réparties sur douze mois, et cinq séries de cinq tests moteurs et sensitifs : les souris de ce projet portent la mutation d'une neuropathie mortelle et sans traitement chez l'être humain. 1 200 animaux vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la plupart et modéré pour 180 d'entre eux. Le porteur affirme que le phénotype de la lignée ne diffère pas du modèle sauvage pendant les douze mois d'expérimentation, tout en indiquant ailleurs que les défauts moteurs et sensoriels apparaissent dès trois mois aux tests comportementaux, ces mêmes tests servant à mesurer l'efficacité de la thérapie génique. Les anciens reproducteurs et les animaux au génotype non voulu sont tués, ceux du protocole sont tués pour prélever leurs organes, et une partie de la production part vers les autres projets de l'équipe en utilisation continue.

Objectifs

Ce projet concerne l'élevage d’une lignée de souris modèles d’une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle il n’existe aujourd’hui aucun traitement, et le développement d’une thérapie génique pouvant constituer un traitement curatif pour cette pathologie. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène, et cela entraine des troubles moteurs et sensoriels chez les patients dès l’enfance. La thérapie génique consiste donc à compenser le gène défectueux en important une copie du gène fonctionnelle dans l’organisme. Précédemment, nos collaborateurs ont développé un modèle souris qui reproduit pour la première fois les troubles moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients. Nous avons élaboré une méthodologie avec ce modèle pour développer notre thérapie. L’objectif de cette étude est d’élever les animaux nécessaires pour pouvoir évaluer les bénéfices de ce protocole de thérapie génique grâce à un essai pré-clinique dans notre modèle sur une durée de 12 mois. Nous évaluerons ses bénéfices en évaluant le comportement et l’effet sur l’organisme de ces souris.

Bénéfices attendus

La validation de notre protocole et l’évaluation des bénéfices de notre thérapie génique chez la souris constituerait un premier pas vers une thérapie adaptable à l’Homme dans le cadre d’une maladie génétique rare (50 familles identifiées dans le monde). De plus, lors des analyses sanguines, nous aimerions pouvoir mettre en évidence des marqueurs sanguins de cette maladie. Ces marqueurs pourraient être utilisés également dans le cadre du diagnostic d’autres maladies neurodégénératives

Procédures

Les animaux auront un prélèvement d’un petit fragment de queue pour connaitre leur patrimoine génétique (1min par animal, une seule fois). Une partie des souris recevront une injection intraveineuse (durée : 5mn) sous anesthésie générale. Une partie des souris auront 5 prélèvements sanguins maximum répartis sur 12 mois (durée : 5mn) au niveau de la veine sous mandibulaire sous anesthésie générale. Ces mêmes animaux réaliseront 5 fois une série de tests comportementaux moteurs et sensitifs (5 tests comportementaux répartis sur 5 jours, durée : entre 30s et 15mn par test) entre 1 mois et 12 mois. Ces tests permettront d’évaluer les capacités motrices et sensorielles des animaux permettant de rendre compte de l’efficacité de l’approche thérapeutique. Les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire à la fin de la procédure.

Impact sur les animaux

L’injection intraveineuse, et les prises de sang par la veine sous mandibulaire pourront induire un stress faible chez les animaux et un léger inconfort au site d’injection ou de prélèvement respectivement. Un risque d’hypothermie et d’arrêt respiratoire lors des anesthésies reste possible mais très rare. Les tests comportementaux pourront induire un stress variable chez les animaux allant de faible à modéré. Un phénotype dommageable est développé par les souris à partir de 15 mois ce qui n’aura pas d’impact ici sachant que les souris sont maintenues jusqu’à 12 mois au maximum. Les animaux pourront ressentir une légère et brève douleur lors du prélèvement de queue pour connaitre leur patrimoine génétique.

Devenir

les anciens reproducteurs et les animaux porteurs de genotypes non souhaités seront euthanasiés. Les animaux utilisés pour évaluer les bénéfices de la thérapie devront être euthanasiés pour le prélèvement d’organes post mortem pour l’analyse. Une partie des animaux produit sera en utilisation continue dans nos autres projets de recherche.

Remplacement

Le projet a pour but de valider un premier essai pré-clinique de thérapie génique pour une maladie neuromusculaire fatale et incurable chez l’Homme. Les modèles in vitro (cellules immortelles et neurones en culture) ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire etcellulaire de cette approche. Cette approche thérapeutique nécessite d’être validée dans un organisme modèle de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez la souris.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire au maximum le nombre d’animaux par condition expérimentale tout en conservant un nombre suffisant de souris par lot pour pouvoir analyser nos résultats de façon statistique et ne pas avoir besoin de reconduire ce type de projet. Les accouplements seront contrôlés afin de générer que les animaux nécessaires pour le projet. Un total de 1200 animaux est prévu pour le projet.

Raffinement

Nos animaux seront hébergés dans une animalerie agréée avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Ils bénéficieront d’un enrichissement règlementaire. Le phénotype de notre modèle murin ne diffère pas du modèle sauvage durant le temps de l’expérimentation (12 mois maximum) permettant un hébergement en cage collective pour respecter leurs besoins sociaux. L’injection intraveineuse de notre thérapie génique est réalisée sous anesthésie générale avec un réveil post-anesthésie dans une cage chauffée, du gel ophtalmique est appliqué post-injection et mise en place d’une analgésie si besoin. Les prises de sang sont effectuées sous anesthésie générale avec réveil post-anesthésie dans une cage chauffée. L’organisation des tests comportementaux seront précédés d’une phase d’entrainement et une période de récupération d’au moins une demi-journée voire 1 jour entier est prévue afin de limiter au maximum le stress des animaux. Chaque animal sera surveillé de façon individuelle et de façon quotidienne. A chaque étape du projet, des points limites ont été établis et seront respectés pour soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Avec 98 pourcents d’identité protéique avec l’Homme, la souris constitue un modèle idéal pour reproduire les pathologies humaines afin de les étudier dans un contexte physiologique mais également de pouvoir tester et valider des approches thérapeutiques. L’étude de caractérisation du modèle utilisé dans ce projet a montré qu’il reproduit pour la première fois les désordres moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients atteints de neuropathies à axones géants, justifiant son utilisation pour valider notre approche de thérapie génique. Les souris seront prélevées pour connaitre leur patrimoine génétique à l’âge de 7 à 10 jours. Notre projet utilisera le stade juvénile (1 mois) pour l’injection. En effet, les premiers symptômes se développant chez l’Homme à 2 ans, il est nécessaire de débuter la stratégie le plus tôt possible afin d’être le plus en amont possible afin de limiter au mieux les symptômes (1 mois) et de la poursuivre jusqu’au stade adulte (12 mois) pour valider notre protocole et évaluer ses bénéfices au niveau comportemental et histologique. Notre modèle murin présente des défauts moteurs et sensoriels (visibles uniquement au moment de tests comportementaux à partir de 3 mois). Un phénotype dommageable est développé par les souris à partir de 15 mois ce qui n’aura pas d’impact dans notre projet sachant que nos animaux seront maintenus jusqu’à 12 mois au maximum.