Souris

96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à J2 ou J14 pour prélever leurs muscles. Elles reçoivent une à sept injections dans l'abdomen, dont une drogue qui détruit chimiquement leurs nerfs sympathiques, des gavages, puis une injection dans l'orbite sous anesthésie juste avant la mise à mort. Le projet cherche à savoir si le système nerveux sympathique règle le comportement des cellules souches du muscle sain, avec des retombées annoncées, à terme, pour des maladies neuromusculaires comme la dystrophie de Duchenne. Parmi les raisons du choix de la souris, le porteur cite sa petite taille, sa gestation rapide et sa "durée de vie courte compatible avec notre étude".

Objectifs

Le processus de régénération musculaire est très important pour la restauration de la fonctionnalité du tissu après une lésion. La niche des cellules souches du muscle est un environnement complexe impliquant des interactions entre les cellules interstitielles, les cellules des vaisseaux et les cellules souches. Le muscle est également un tissu innervé par le système nerveux somatique responsable de la contraction volontaire ainsi que par le système nerveux sympathique dont les neurones sensoriels sont capables de capter les contraintes mécaniques et sensitives appliquées au tissu musculaire. Tout changement dans la niche comme le vieillissement peut altérer le potentiel de régénération du muscle. Pour cette raison, il est capital d’élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires nécessaires au maintien fonctionnel de la niche. Par ailleurs, plusieurs myopathies sont causées par l'épuisement et la perte du potentiel de réparation musculaire et à une altération de l'organisation du réseau vasculaire. Le présent projet a pour objectif d’étudier l’interaction entre les nerfs sympathiques, les cellules vasculaires et les cellules souches en conditions physiologiques. Le rôle du système nerveux sympathique a récemment été décrit dans la niche des cellules souches hématopoïétiques et des cellules souches intestinales mais n'a été parfaitement étudié dans le muscle. Des observations sur des coupes de tissu musculaire ont permis d’émettre l’hypothèse que le système nerveux sympathique pourrait intervenir dans la régulation des fonctions des cellules souches musculaires via une modulation des signaux moléculaires émis par les cellules composant les microvaisseaux.

Bénéfices attendus

Nombre de pathologies du muscle sont liées à des perturbations du fonctionnement intrinsèque de la cellule souche musculaire mais également de sa niche. L'implication du système nerveux central mais surtout périphérique en tant que modulateur de la niche reste encore peu exploré. Cette étude vise à identifier un nouveau mécanisme contrôlant la quiescence des cellules souches musculaires par le système nerveux autonome sympathique via le relais des cellules des vaiseaux. En effet, la modulation de ce circuit neuro-vasculaire aura des implications significatives pour mieux comprendre le comportement des cellules souches musculaires dans les maladies neuromusculaires, comme la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Effectivement, l'innervation sympathique et les signaux de la niche vasculaire, sont déréglés et peuvent altérer directement la fonction des cellules souches dans la DMD. Ainsi, comprendre les mécanismes de la modulation des voies signalisation impliquées dans le dialogue nerf-muscle, ouvre potentiellement sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les maladies neuromusculaires.

Procédures

Les drogues utilisées pour la dénervation, pour stimuler la voie de signalisation cible seront injectées par voie intrapéritonéale. La drogue inhibitrice de la voie de signalisation ciblée sera administrée par voie orale. Les anticorps inhibiteurs de la voie de signalisation ciblée et les anticorps contrôles seront injectés par voie intrapéritonéale. La molécule permettant de visualiser les vaisseaux sanguins sera administrée par voie retro-orbitale une seule fois avant la mise à mort. Toutes les autres administrations seront faites 1 jour sur deux pendant 1 à 14 jours soit 1 à 7 injections selon le jour de mise à mort (J2 ou J14). Les injections intrapéritonéales et par gavage sont rapides et durent de quelques secondes à 30 secondes pour le gavage, en respectant les volumes autorisés à injecter. L'injection par voie retro-orbitale est également assez rapide et sera effectué sous anesthésie pour éviter le stress et la douleur.

Impact sur les animaux

Les animaux sont régulièrement surveillés et manipulés par du personnel qualifié afin de les habituer à l’homme et éviter tout stress lors des procédures expérimentales. Après chaque injection, les souris seront surveillées (signes de détresse, comportement, poids corporel, prise de nourriture) et en cas de signes de douleur, un anti-douleur sera administré pendant 24h. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleurs chez les animaux.

Devenir

Les animaux sont tous mis à mort pour prélèvement de leurs muscles à des fins d'analyses histologiques et moléculaires ou de mise en cultures cellulaires.

Remplacement

La niche des cellules souches du muscle squelettique est un environnement tissulaire complexe impliquant de nombreuses interactions cellulaires notamment avec les cellules vasculaires, les cellules inflammatoires et le systèmes nerveux moteur et sympathique. Expérimentalement, il n’est pas possible de reproduire la complexité de cet environnement dans un système cellulaire in vitro ou par modélisation mathématique. C’est pourquoi, l’utilisation des modèles animaux reste nécessaire à la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires intégrés à la base du fonctionnement de la niche et qui peuvent influencer la régénération musculaire. Cependant en préambule à l'étude proposée, la présence de récepteurs du système nerveux autonome a été mis en évidence in vitro sur les cellules musculaires et vasculaires, ces récepteurs permettant l'activation et/ou l'inhibition de ces cellules. Les études in vivo permettront de valider l'hypothèse de travail ainsi que les résultats obtenus in vitro.

Réduction

Pour avoir des résultats statistiquement significatifs, il faut un minimum de 6 animaux par groupe dans les différentes procédures en raison de la variabilité dans un même groupe d’animaux et afin d'avoir assez de matériel pour réaliser toutes les analyses prévues. Cela devrait également éviter d'avoir à répéter l’expérience. Par ailleurs, l'expérience du laboratoire sur les modèles animaux a permis de déterminer que l'utilisation d'une solution saline comme contrôle en injection intrapéritonéale ou en injection intramusclaire ne provoquait aucun effet secondaire ou altération sur le processus de régénération musclaire, aussi ces contrôles ne seront pas systématiquement inclus afin de limiter le nombe d'animaux utilisés. Ne seront injectées que les solutions qui n'ont jamais été utilisées et pouvant potentiellement avoir des effets sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Les animaux sont dans des cages ventilées dans des zones dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les souris ont en permanence accès à l’eau et à la nourriture et ne sont jamais isolées, elles restent avec leurs congénères et sont uniquement séparées par sexe afin d’éviter les accouplements non contrôlés. Les animaliers sont formés à procéder à l’amélioration des conditions d’hébergement par ajout de papier et d’abris en carton dans les cages. Les animaux sont régulièrement surveillés et manipulés par du personnel qualifié afin de les habituer à l’homme et limiter tout stress lors des procédures expérimentales. Après chaque injection, les souris seront surveillées (signes de détresse, comportement, poids corporel, prise de nourriture) et en cas de signes de douleur, un anti-douleur sera administré pendant 24h et si cela n'est pas suffisant, une mise à mort compassionnelle sera réalisée avec approbation du vétérinaire référent. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour étudier les mécanismes de l’innervation sympathique sur le tissu musculaire car la dénervation chimique chez la souris est un procédé assez rapide et bien caractérisé. La souris est par ailleurs un modèle de petite taille, avec une gestation rapide et une durée de vie courte compatible avec notre étude. Les souris utilisées seront des adultes âgés de 16 semaines parce qu'à cet âge le système nerveux sympathique est mature.

Des parasites sont injectés dans l'abdomen de souris pour déclencher une toxoplasmose, suivis d'un gavage quotidien pendant sept jours et de quatre séances d'imagerie sous anesthésie. 2 127 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit pourtant que les souches de type I conduisent systématiquement à la mort des animaux infectés en l'absence de traitement, et que les kystes formés par les souches de type II persistent toute la vie de l'hôte. Toutes les souris seront tuées, notamment pour disséquer leur cerveau et y compter les kystes.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet de recherche est double, visant à approfondir notre compréhension d'une maladie due à une infection par des parasites, et à développer des approches thérapeutiques innovantes. Dans un premier volet, l'équipe se concentre sur l'identification et la caractérisation des des protéines sécrétées par les parasites lors de l'infection de la cellule hôte. L'objectif ultime est de déterminer le rôle de ces protéines dans le processus de virulence du parasite chez son hôte intermédiaire naturel, la souris. Ce volet comprend une analyse in vivo, en se penchant particulièrement sur la phase initiale de la maladie et la formation de kystes pendant la phase persistante de la maladie. Dans un second volet, le projet a pour objectif d'évaluer l'efficacité in vivo de composés antiparasitaires, préalablement sélectionnés parmi des molécules approuvées par la "U.S. Food and Drug Administration" (FDA, fda.gov). La FDA veille à ce que des médicaments sûrs et efficaces soient disponibles pour améliorer la santé de la population des États-Unis. Ces composés sont donc déjà utilisés dans le traitement de différentes maladies, garantissant leur non-toxicité chez l'humain. L'objectif est de comparer leur efficacité à la sulfadiazine, un médicament antiparasitaire utilisé actuellement en clinique, tout en confirmant in vivo leur cible moléculaire. Notez que ce projet se déroulera dans deux Etablissements Utilisateurs (nommés EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche présente des avantages significatifs sur plusieurs aspects. Tout d'abord, il vise à répondre à des questions fondamentales sur les infections causées par les parasites, en éclairant le rôle des protéines sécrétées dans la virulence et le processus infectieux. À moyen terme, ces réponses permettront de mieux comprendre le dialogue établi entre le parasite et son hôte ainsi que les mécanismes permettant le contrôle de l'infection, guidant ainsi le développement de nouvelles approches thérapeutiques. En ce qui concerne le deuxième volet, l'évaluation in vivo des composés antiparasitaires présente un intérêt majeur. À long terme, si ces composés s'avèrent efficaces, cela pourrait ouvrir de nouvelles perspectives dans le traitement contre les infections parasitaires, offrant des alternatives potentielles aux traitements actuels, tout en minimisant les effets secondaires. Il est important de souligner ici qu'il n'existe jusqu'à présent aucun traitement contre les formes persistantes d’infections parasitaires. Une fois établis, les kystes persistent théoriquement pendant toute la durée de vie de l'hôte. Pour information, il est estimé que 30% de la population mondiale est infectée par un parasite. En somme, ce projet offre une approche globale, alliant une compréhension approfondie des mécanismes d'infection à des solutions thérapeutiques novatrices. Les connaissances générées et les avancées thérapeutiques potentielles contribueront à la lutte contre les maladies parasitaires, avec des implications positives pour la santé publique à moyen et long terme.

Procédures

Lors de ce projet, les interventions sur les animaux vivants seront de trois types : (i) Les injections au niveau abdominal (1 par expérience et par souris, durée du geste : quelques secondes) des parasites dans le but de déclencher l'infection parasitaire avec une charge parasitaire contrôlée. Cette étape sera réalisée dans l’Etablissement Utilisateur EU1. (ii) Traitement des animaux par administration par voie orale des composés à l'aide de sondes de gavage adaptées à la souris (1 gavage par jour pendant 7 jours consécutifs et par souris, durée du geste : quelques secondes à chaque gavage). Cette étape sera réalisée dans les Etablissements Utilisateurs EU1 et EU2. (iii) Pour les expériences d'imagerie in vivo, les animaux sont anesthésiés et le produit luminescent est injectée dans l’abdomen des animaux (4 fois par souris à J0, J2, J5, et J7, durée du geste : quelques minutes chaque jour). Cette étape sera réalisée dans l’Etablissement Utilisateur EU2.

Impact sur les animaux

Les infections parasitaires peuvent est caractérisées par deux phases distinctes : la première phase de l’infection, qui correspond à la phase de dissémination des parasites dans les différents organes de l'hôte (la souris ou l’homme). Celle-ci peut être mortelle chez la souris comme chez l'homme si elle n'est pas contenue et contrôlée par le système immunitaire. Les souches de type I sont particulièrement virulentes chez les souris de laboratoire et conduisent systématiquement à la mort des animaux infectés en l'absence de traitement. Les souches de type II, non-virulentes, induisent une première infection légère, conduisant systématiquement à une infection parasitaire persistante sans symptômes. Cette phase correspond à l'étape où la multiplication des parasites est contenue par le système immunitaire de l'hôte, et seuls les parasites capables de s'enkyster dans les muscles et le cerveau vont survivre. Cette étape se met en place plus tardivement, et les kystes vont persister pendant toute la durée de vie de l'hôte.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de réaliser des prélèvements sur les animaux morts tels que le prélèvement du sang dans le but de détecter la présence d’une réaction immunitaire contre le parasite et la dissection du cerveau pour la détection et la quantification des parasites sous forme de kystes dans le cerveau des animaux.

Remplacement

Volet "étude des protéines sécrétées par les parasites" : Des études préliminaires réalisées in vitro en culture cellulaire nous ont permis d’identifier spécifiquement des gènes (24 gènes candidats) du parasite codant pour des protéines du parasite sécrétées dans la cellule infectée et ayant donc un rôle potentiel dans le contrôle de la virulence chez l’animal. De même, que des études de biochimie ont permis de montrer que ces protéines s’associent avec des protéines de la cellule hôte confirmant leur rôle potentiel dans la régulation des interactions hôte-parasite. Il est donc essentiel de pouvoir réaliser des expériences chez la souris afin de déterminer l’importance de ces gènes dans le contrôle de la virulence, ainsi que dans la capacité des parasites à persister chez l’animal sous forme de kystes (infection persistante). En effet, aucune autre approche alternative in vitro ou de culture cellulaire ne permet de répondre à ces questions. Le modèle murin d’étude des maladies parasitaires est communément utilisé par la communauté scientifique. En effet, la souris constitue un hôte intermédiaire naturel et privilégié étant donné que le cycle sexué du parasite s’effectue exclusivement chez les félidés en tant qu’hôte définitif, après ingestion de proies infectées. Contrairement aux études in vitro de culture cellulaire, la souris permet l’étude de l’infection parasitaire avec la formation de kystes dans les tissus. Volet "évaluation de l'efficacité de composés parasiticides" : L'activité antiparasitaire des composés (27) a été déterminée à travers des tests effectués sur des cellules in vitro. Il est maintenant essentiel de tester ces composés in vivo chez la souris afin de confirmer leur activité parasiticide chez un mammifère. En effet, des essais cliniques chez l'homme ne seront envisageables que si des études précliniques chez l'animal ont été réalisées.

Réduction

Volet "étude des protéines sécrétées par les parasites" : Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, 3 souches mutantes différentes seront testées en parallèle d’une souche sauvage parentale de référence. Par exemple, les souches mutantes de type I seront comparées entre elles et à la souche sauvage de référence de type I. Idem pour les souches parasitaires de type II. Concernant les souches de type I (virulentes), une première lignée des souris seront d’abord testées. Si une atténuation de virulence est observée, l’analyse sera poursuivie sur lignée différente de souris. Ces dernières étant plus sensibles, cette expérience permettra d'évaluer la robustesse de l’atténuation de virulence. Si aucun effet du mutant n’est observé sur la virulence avec la première lignée de souris, l’expérience ne sera pas poursuivie sur la deuxième lignée de souris, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux. Volet "évaluation de l'efficacité de composés parasiticides dans les phases initiale et persistante de l’infection parasitaire" : La première expérience sera conduite avec 2 à 3 animaux par condition à tester (totalisant 13 souris pour cette première expérience). L'objectif est d'assurer une efficacité totale des composés, et les expériences subséquentes ne seront menées que si la survie atteint 100% parmi les souris traitées avec les composés testés lors de cette première expérience. Si les composés se révèlent seulement partiellement efficaces, le protocole ne sera pas poursuivi. De plus, les contrôles sont mutualisés puisque les trois composés sont testés simultanément. En cas de réussite, les expériences ultérieures seront menées avec 2 à 5 animaux par condition à tester.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un établissement utilisateur agréé par du personnel formé. Les souris seront maintenues en groupes autant que possible, dans des cages offrant un enrichissement du milieu de vie, et leur bien-être sera régulièrement contrôlé. Les animaux seront logés dans un environnement contrôlé, exempt de germes dangereux pour les animaux, afin d'éviter toute infection supplémentaire pouvant biaiser l'interprétation des résultats obtenus. Dès le début de chaque expérience, les souris sont observées 3 fois par semaine jusqu'à l'apparition des symptômes, puis quotidiennement (jusqu'à deux fois par jour) jusqu’à la fin de la procédure expérimentale et elles seront euthanasiées dès l'apparition des premiers signes cliniques dû à l’infection parasitaire, avec le point limite défini dans ce document. Les composés testés, non toxiques, seront mis en solution selon une formulation préalablement déterminée. Pour l'expérience d'imagerie in vivo réalisée dans une autre animalerie, les animaux seront transportés dans des conditions optimisées afin de limiter le stress lié au transport.

Choix des espèces

Le modèle murin utilisé pour étudier les infections parasitaires est largement adopté par la communauté scientifique. La souris, en tant qu'hôte intermédiaire naturel du parasite, offre un cadre privilégié, car le cycle sexué du parasite se produit exclusivement chez les félidés, en tant qu'hôtes définitifs, après l'ingestion de proies infectées. Les souris développent ainsi une infection parasitaire avec une réponse immunitaire comparable à celle observée chez l'homme. Les souches de souris utilisées présentent des niveaux de sensibilité variables aux parasites. Il est donc pertinent d'explorer le potentiel rôle des effecteurs parasitaires dans la virulence des différents types de parasites (Type I virulent et Type II non-virulent), ainsi que chez des souris présentant divers niveaux de sensibilité à cette infection. De plus, les modèles murins sont particulièrement adaptés pour étudier l'efficacité de composés antiparasitaires, car les souris peuvent reproduire les différentes phases de l’infection, tant infection initiale que persistante. Seules des expériences in vivo, réalisées sur des modèles murins, permettront de confirmer l'efficacité de ces composés au cours des différentes phase de l’infection parasitaire, et de répondre à la question cruciale : représentent-ils de véritables candidats médicaments ? Par conséquent, les expériences seront réalisées sur de jeunes adultes, car le système immunitaire doit être mature afin de pouvoir répondre à l’infection parasitaire.

864 souris subissent une chirurgie d'environ vingt minutes pour se voir implanter une tumeur dans le cerveau, puis deux séances d'IRM sous anesthésie. Avec les 960 autres, injectées sous la peau, 1 824 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Un groupe de 32 porte pendant six semaines un dispositif appliqué en continu sur l'abdomen, et l'ulcération ou la nécrose de la tumeur figure parmi les effets attendus. Le porteur qualifie la majorité des procédures de peu traumatisantes et annonce un vaccin thérapeutique contre le glioblastome, tumeur cérébrale pour laquelle il indique lui-même qu'aucun traitement connu ne fonctionne.

Objectifs

Le cancer reste une maladie souvent mortelle, pour laquelle la recherche de traitements innovants est requise. Le succès récent de l’immunothérapie dans divers cancers a renouvelé l'intérêt pour les vaccins anti-tumoraux. Actuellement aucun vaccin a montré une efficacité dans les cancers, probablement à cause de la faible activation de lymphocytes cytotoxiques capables d’attaquer les cellules du cancer par les formulations vaccinales classiques utilisant aluminium ou émulsions comme adjuvants. Nous avons développé une formulation vaccinale innovante qui permet de stimuler de façon exceptionnelle la réponse immunitaire lymphocytaire contre un antigène tumoral. Notre but est de poursuivre le développement de notre formulation afin d’obtenir à terme un vaccin thérapeutique pour le traitement des cancers humains, en nous concentrant plus particulièrement sur le glioblastome, la plus fréquente des tumeurs cérébrales, pour lequel il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement satisfaisant. Devant la résistance du glioblastome à tout traitement connu à l’heure actuelle, la stratégie la plus prometteuse semble être l’association de plusieurs thérapies. Dans ce projet différentes combinaisons thérapeutiques de notre vaccin avec des traitements anti-cancéreux seront évaluées : chimiothérapie, traitements immunomodulants, thérapies qui permettent d’augmenter le passage de molécules thérapeutiques et lymphocytes dans le cerveau.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra la validation de l’efficacité de notre vaccin innovant dans un modèle intracrânien de glioblastome et de sélectionner les meilleures stratégies thérapeutiques de combinaison du vaccin avec des traitements couramment utilisés pour le glioblastome (chimiothérapie) et d’autres traitements immunomodulateurs ou potentiellement synergiques avec l’immunothérapie.

Procédures

960 Souris subiront des injections sous anesthésie générale (durée totale de la procédure de 5 minutes) et 864 Souris une intervention chirurgicale (durée de la procédure d’environ 20 minutes). Pour l’administration des traitements, toutes les Souris auront des injections à fréquence variable selon la molécule entre une fois par jour et une seule injection dans toute la durée de l'experience (durée d’environ une minute). Un groupe de 32 Souris sera traité avec un dispositif appliqué au niveau abdominal 24/24h pendant maximum 6 semaines. Afin d’évaluer l’effet des différents traitements sur la croissance tumorale, nous réaliserons 2 IRM aux Souris avec le modèle intracérébral (864 souris). Durée totale de la procédure : environ 30 minutes. 216 Souris seront mises à mort par chirurgie terminale sans réveil sous anesthésie générale profonde et analgésie. Aucun prélèvement sera réalisé chez l’animal vivant mais toujours après mise à mort.

Impact sur les animaux

Aucune de ces lignées de Souris ne présente de phénotype dommageable à l’état basal. Concernant les injections réalisées sous anesthésie générale (injection de cellules tumorales), les animaux subiront un léger stress pour l’induction de l’anesthésie. Un effet indésirable attendu, susceptible d'entrainer une douleur modérée, est l'apparition d'une ulcération ou d'une nécrose de la tumeur. En ce qui concerne les injections des médicaments, les animaux subiront un léger stress pour la contention et les effets indésirables sont une rougeur, un gonflement, une démangeaison ou une douleur au point d'injection. Les effets indésirables attendus pour le dispositif appliquant un courant sont une rougeur au niveau de la zone d’application du dispositif. Les examens d'imagerie réalisés sont non invasifs et atraumatiques et impliquent l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. Néanmoins, le souris subiront un léger stress pour l’induction de l’anesthésie.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de limiter la souffrance (selon points limite) et aussi afin de prélever les différents organes et les analyser pour pouvoir comprendre les mécanismes d’efficacité ou échappement du cancer aux traitements.

Remplacement

Il s’agit d’une étude qui nécessite d’être réalisée in vivo pour évaluer la réponse immunitaire et antitumorale après immunisation par voie sous-cutanée. Aucun modèle in vitro n’est en effet prédictif d’une réponse immune chez l’animal ou chez l’Homme, en raison de la complexité des mécanismes biologiques impliqués. Cependant, les corrélations entre les résultats obtenus chez l’animal et les résultats des études in vitro menées en parallèle seront évaluées en permanence dans l’objectif de remplacer le modèle in vivo par la prédiction in vitro lorsque cela sera possible.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au nombre minimum nécessaire et suffisant pour permettre l’analyse statistique des données. Afin de limiter le nombre de souris avec un modèle de tumeur intracrânien, uniquement les stratégies de combinaison thérapeutique les plus prometteuses selon les résultats des modèles sous-cutanées seront évaluées dans ce modèle. Les protocoles de ce projet utiliseront des modèles validés par la littérature, permettant d’obtenir des résultats reproductibles. De plus, les expériences sont conçues de façon à utiliser les mêmes groupes contrôles pour plusieurs traitements ce qui permettra de limiter encore davantage le nombre d’animaux. Au total, 1824 souris seront utilisées dans ce projet.

Raffinement

La majorité des expériences nécessiteront des procédures peu traumatisantes (injections sous-cutanées ou intra-péritonéales, traitements par voie orale). La bonne tolérance des formulations vaccinales a été préalablement démontrée dans notre laboratoire. Chez les animaux porteurs de tumeurs sous-cutanées, la croissance tumorale est mesurée 3 fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse, ce qui constitue une procédure non invasive, non douloureuse et peu perturbante pour l’animal. En ce qui concerne les animaux porteurs de tumeur intracrânienne, l’implantation sera réalisée sous anesthésie locale et générale et après analgésie locale. Afin de prévenir la douleur post-chirurgicale, un traitement analgésique pendant 3 jours après l’implantation sera également administré. Tous les animaux de toutes les procédures font l’objet d’une surveillance quotidienne afin de déceler précocement des signes de souffrance et d’y mettre un terme par une mise à mort anticipée si nécessaire, selon les points limite.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l'étude du développement tumoral et de la réponse immunitaire. Le système immunitaire des souris est bien caractérisé et de nombreux outils pour l’analyse de la réponse immunitaire aux immunothérapies sont disponibles. Les animaux seront âgés de 5 à 7 semaines en début d’expérimentation, ce qui permet d’utiliser des animaux jeunes adultes dotés d’un système immunitaire mature.

80 souris femelles au système immunitaire en partie défaillant reçoivent chacune deux greffes de tumeurs humaines, une par flanc, précisément pour qu'il en faille moins. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et seront toutes tuées, pour prélever les deux tumeurs et le maximum de sang. Le protocole prévoit la greffe sous anesthésie, dix jours consécutifs d'injections dans l'abdomen, des pesées et des mesures de tumeur au pied à coulisse. Le porteur annonce que ces travaux valideront le potentiel de certains gènes comme cibles thérapeutiques, la perspective de nouvelles thérapies contre le cancer colorectal restant renvoyée à une étape ultérieure.

Objectifs

Dans ce projet nous souhaitons étudier les mécanismes responsables de l'apparition du Cancer, et notamment du cancer colorectal. Le but est d’observer dans un modèle de greffe tumorale si la perte d’expression des gènes étudiés induit une diminution de la croissance tumorale. Cela mettrait en évidence ces molécules comme de futures cibles pour traiter le cancer.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à montrer l’impact de la perte d’expression de gènes sur la croissance tumorale. Cela permettra de valider alors le potentiel comme cible thérapeutique de ces gènes, le but étant de proposer ensuite de nouvelles thérapies curatives contre le cancer colorectal.

Procédures

Greffes de cellules tumorales d'origine humaine, durée de l'anesthésie au réveil environ 5 minutes. Une seule fois durant le protocole. Traitement par voie intra-péritonéale, tous les jours pendant 10 jours consécutifs. 30 secondes par traitement chaque jour. Les souris seront pesées régulièrement, nécessitant le transfert de la souris sur la balance et le retour dans la cage (15 secondes par souris). Les tumeurs seront mesurées régulièrement à l'aide d'un pied à coulisse électronique. Cela va nécessiter le maintien de la souris afin d'effectuer les mesures (environ 30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir un stress modéré lors de la manipulation (pesée hebdomadaire, observation) et lors de l’initiation de l’anesthésie gazeuse. Les animaux pourront ressentir de la douleur lors de la greffe de cellules tumorales humaines ainsi que lors des injections en intra-péritonéale. Risque de plaie ou d’infection au point d’injection.

Devenir

A l'issu de la procédure tous les animaux seront mis à mort car nous souhaitons (1) prélever les deux tumeurs et (2) prélever un maximum de sang afin de pouvoir obtenir un maximum de sérum (pour pouvoir réaliser des dosages si besoin sur de nombreux marqueurs sériques).

Remplacement

Notre équipe développe un axe de recherche afin de mettre en évidence des cibles potentielles pour lutter contre le Cancer. Nous possédons une forte expertise dans les méthodes de criblages cellulaires et l’analyse des bases de données afin d’identifier les gènes impliqués. Nous possédons également une forte connaissance des outils de modification cellulaire et de validation in vitro. Toutefois, une fois la validation réalisée sur des méthodes in vitro nous devons alors vérifier nos hypothèses. Dans ce projet nous voulons étudier l'impact de la perte d'expression de protéines impliquées dans la régulation de gènes sur la croissance tumorale en lien avec l'induction de la sénescence cellulaire. Nous ne pouvons donc pas nous passer pour cette phase de notre recherche de modèles complexes comme les modèles murins.

Réduction

Pour ce protocole nous souhaitons réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. Pour cela nous grefferons deux tumeurs par souris. Des résultats préliminaires nous ont permis de connaitre le pourcentage de prises tumorales dans les conditions que nous souhaitons utiliser. Le volume des tumeurs étant petits nous ne pouvons utiliser qu'une tumeur par technique. C'est cela qui a donc conditionné le nombre de souris que nous devons utliser, soit vingt souris par groupe. Nous utiliserons également uniquement des souris femelles.

Raffinement

Dès leur arrivée dans l’animalerie, à l’âge de 6 semaines, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation aux expérimentateurs de 7 jours. Les animaux seront pesés une fois par semaine, et observés à la fois par le personnel animalier (une fois par semaine lors du change) et les expérimentateurs (une à deux fois par semaine, hors geste expérimental) dans le cadre du suivi de l’état général des souris. Une liste précise permettant de scorer les signes éventuels de souffrance sera alors utilisée afin d’évaluer si les animaux présentent des signes de souffrance ou d’atteinte d’un point limite qui entrainerait leur mise à mort. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements comme du coton de nidation, des batonnets de bois et éventuellement des tunnels.

Choix des espèces

Nous utiliserons le modèle murin car c'est un modèle classiquement utilisé dans les études de cancérologie, de par son homologie avec le génôme humain. De façon plus spécifique ici les souris possèdent un système immunitaire en partie défaillant. Cela facilite alors la prise de greffes de cellules tumorales d'origine humaine. Les animaux seront utilisés à un stade jeune adulte avec une arrivée à l'animalerie à 6 semaines et une greffe de cellules à 7 semaines. A ce stade de développment la prise tumorale est optimale. Avec des souris plus âgées le pourcentage de prise tumorale serait moindre.

Mesurer la puissance paralysante de formulations de toxine botulique, destinées au traitement de la spasticité comme à des usages cosmétiques, occupe ici 4 650 souris et 1 550 rats. Tous vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tous seront tués, par prélèvement intracardiaque, le dernier jour. La toxine est injectée dans le muscle du mollet sous anesthésie, ce qui provoque une paralysie plus ou moins marquée des membres postérieurs, une perte de poids et des difficultés à atteindre la mangeoire, puis chaque animal passe dix à trente tests d'écartement des orteils sur cinq à vingt-cinq jours. Le porteur indique que des cultures de neurones humains ont été proposées comme alternative sans être validées par la communauté scientifique ni par les autorités, et conclut que l'étude ne peut se faire que sur animaux vivants.

Objectifs

Les neurotoxines botuliques (BoNTs) sont utilisées depuis près d’un demi-siècle dans le traitement des troubles liés à une contractilité musculaire excessive. Elles sont classiquement utilisées dans le soulagement des troubles du mouvement tels que la dystonie et la spasticité, ainsi que pour des fins cosmétiques. En plus les formulations dérivées de BoNTs bénéficient à un éventail beaucoup plus large de patients souffrant de vessie hyperactive, de dysfonction érectile, d’arthropathie, de douleurs neuropathiques et de cancer. La recherche de nouvelle formulation de BoNTs est très active en ce moment et il est nécessaire de mettre au point de test in vivo rapides mais précis, pour évaluer l’efficacité de différents types de BoNTs, autant naturels que recombinants. L’objectif de cette étude est de réaliser une évaluation in vivo de l’efficacité de molécules thérapeutiques à base de neurotoxine botulique nouvellement développées ; le protocole expérimental consiste à exécuter le test du score d’abduction des orteils (DAS) chez le rongeur. La puissance d’une préparation de neurotoxine botulique (BoNT) donnée peut être évaluée régulièrement en utilisant le test DAS, qui mesure la réduction de la force musculaire des doigts de la patte après injection de BoNT dans le muscle squelettique de la patte arrière chez les rongeurs. Il est bien connu en littérature que les rats ont des sensibilités différentes aux différentes types de toxines botuliques par rapport à la souris. Selon le type de toxine étudié, il sera donc nécessaire d’utiliser l’espèce animale la plus sensible entre le rat et la souris.

Bénéfices attendus

Les neurotoxines botuliques (BoNTs) sont utilisées dans le traitement des troubles liés à une contractilité musculaire excessive. Ils sont classiquement utilisés dans le soulagement des troubles du mouvement tels que la dystonie et la spasticité, ainsi que pour des fins cosmétiques. En plus les formulations dérivées de BoNTs bénéficient à un éventail beaucoup plus large de patients souffrant de vessie hyperactive, de dysfonction érectile, d’arthropathie, de douleurs neuropathiques et de cancer. La recherche de nouvelle formulation de BoNTs est très active en ce moment et il est nécessaire de mettre au point de test in vivo rapides mais précis, pour évaluer l’efficacité de différents types de BoNTs. Nos études vont participer à la recherche et la mise en place de ces nouvelles formulations de toxine botulique et aider dans le futur les patients atteint de ces troubles.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs test DAS (test du score d’abduction des orteils) entre 10 à 30 tests, sur une durée de 5 à 25 jours. La durée d'un test DAS est de 3 minutes. Les animaux seront soumis également à une seule injection en intra-musculaire de toxine botulique sous anesthésie. La durée de cette intervention est de 10 minutes. Et pour finir les animaux seront soumis à un seul prélèvement en intra-cardiaque, le dernier jour d'expérimentation. La durée de cette intervention est de 15 minutes.

Impact sur les animaux

À la suite de l'injection dans le muscle gastrocnémien, avec la toxine botulique, les animaux vont développer une paralysie des membres inférieures plus ou moins élevées ; les animaux risquent également de présenter une perte de poids, des poils piqués, la présence d'un excédent de porphyrine. Une difficulté à atteindre la mangeoire risque d'être présent, mais pour permettre à l'animal de se nourrir et de boire, une alimentation spécifique sera mise en place.

Devenir

Etant donné la réalisation d'un prélèvement de sang et des muscles, les animaux seront tous mis à mort à la fin de l'intracardiaque.

Remplacement

A ce jour, à cause de la complexité de la structure protéique de la toxine botulique, il n’y a pas de test in silico validés pour effectuer un criblage des effets paralysant des différentes toxines botuliques et de ses dérivés. Afin de tester un grand nombre de dérivés de la toxine botulique, des modèles in vitro alternatif à l’expérimentation animale ont été proposé par le passé, en utilisant des cultures cellulaires de neurones humains. Toutefois ces modèles in vitro ne sont pas encore validés par la communauté scientifique ni par les autorités régulatoires, car ne sont pas capables de prédire exactement les effets des toxines botulique chez l’homme ou l’animal, donc l’étude ne peux se faire que sur animaux vivants.

Réduction

Le nombre d'animaux pour chaque groupe expérimental sera de 6 à 10 animaux, étant donné la variabilité interindividuelle que nous pourrions rencontrer. Le nombre de groupes est déterminé en fonction du nombre des doses à tester pour chaque molécule. Le nombre d'animaux est réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisamment robustes et permettant une analyse statistique appropriée. Du point de vue statistique, les groupes expérimentaux (entre 5 à 31 groupes expérimentaux, nombre d'animaux par groupes égal à 6 à 10) seront comparés entre eux en utilisant des tests statistiques appropriés. Pour déterminer le chiffre exact d’animaux par groupe, cela dépendra des premiers résultats des premiers animaux, le chiffre 10 ne sera pas dépassé. Nous utiliserons les tests statistiques les plus appropriés afin d'analyser nos données.

Raffinement

Tous les efforts seront mis en place afin de minimiser la douleur, l'angoisse et la souffrance animale. Les cages sont de type IVC (cage individuelles ventilée pouvant contenir plusieurs animaux par cage) en surpression et sont rangées sur portoirs ventilés. Les animaux seront hébergés 5 ou 6 par cage pour les souris et 2 ou 3 par cage pour les rats, en fonction de leur poids corporel et ainsi permettre aux animaux de pouvoir interagir et entretenir des liens sociaux avec leurs congénères, tout en gardant un espace suffisant. Des morceaux de coton, des igloos, des tunnels et des bâtonnets en bois seront intégrés dans les cages d'hébergement. Après les intra-musculaires, quelques croquettes d'aliment seront placées dans le fond de la cage et de la pâté humide sera également donnée, au cas où les animaux n'arrivent plus à s'alimenter et la taille des tétines des biberons seront ajustées en conséquence. Des tapis chauffants seront utilisés pendant la durée des anesthésies et les réveils des animaux. Les responsables de l'application des procédures, de la manipulation et du bien-être des animaux, sont une technicienne en recherche et développement et un ingénieur, tous deux expérimentés et formés pour reconnaitre tout signes éventuels de stress, douleurs et inconfort. Ils observeront les animaux tous les jours (du lundi au dimanche), pour déceler les mauvais signes cliniques et remplirons quotidiennement une fiche de suivi par animal. La zootechnicienne, en charge de la surveillance et du change des animaux, observeras également les animaux une fois par jour (du lundi au vendredi) et s'assurera que tous les animaux disposent assez d'aliment et d'eau de boisson.

Choix des espèces

Les rongeurs sont utilisés très fréquemment en recherche préclinique pour les études utilisant de la toxine BONT/A, dans le cadre d’amélioration de la contractibilité musculaire. Les paramètres physiologiques et pathologiques liés aux problèmes de contractilité musculaire sont très bien caractérisés chez les rongeurs, ce qui facilite la comparaison des résultats entre différents laboratoires. Les rats et les souris seront utilisés, car ces espèces sont largement utilisées pour ce type d’étude (nombreuses références bibliographiques). D’autres modèles expérimentaux, notamment, le chien, le chat et les primates, posent de nombreux problèmes éthiques et d’infrastructures d’hébergement. Adultes, entre 6 et 12 semaines ; car les adultes possèdent des membres inférieurs plus gros et cela permet une meilleure visualisation de la patte et donc le résultat du DAS est plus optimal. Les animaux adultes sont aussi plus résistants face à la perte de poids et aux différents signes cliniques.

Trente minutes de nage forcée dans une piscine réparties sur deux jours, puis treize jours d'un test d'apprentissage : 45 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. Elles subissent quatre tests de mémoire étalés sur six semaines, mémoire spatiale, reconnaissance d'objets, olfaction et apprentissage d'une tâche, le porteur indiquant que la nage peut provoquer une légère hypothermie. L'objet déclaré est de savoir si la perte d'un gène dans les cellules immunitaires du cerveau modifie la mémoire, dans le cadre d'une forme de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence. Le choix de la souris tient à l'existence de tests comportementaux déjà établis chez elle, et l'effectif de 45 est présenté comme le minimum fixé par des consignes internationales de la discipline.

Objectifs

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui touche 7000 adultes en France, caractérisée par une atteinte des motoneurones (cellule nerveuse spécialisée dans la commande des mouvements) et résultant par la paralysie et le décès des patients 2 à 5 ans après le diagnostic. Tandis que la plupart des cas de SLA ont une cause non-identifiée, certaines formes sont familiales. Certains cas de SLA peuvent aussi être associés à une Démence Fronto-Temporale (DFT), on appelle ce syndrome SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Les formes génétiques de SLA (et SLA-DFT) sont cruciales pour la recherche car elles permettent de modéliser la maladie. Récemment, des mutations dans un nouveau gène ont été identifiées comme étant impliquées dans la SLA-DFT. Nous étudions le rôle de ce gène dans différents types de cellules du cerveau. Le but est de savoir si la déficience de ce gène peut changer le comportement des souris, en termes de défaut de mémoire, ce qui est lié aux symptômes de la DFT dans le syndrome SLA-DFT.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre le rôle de notre gène d'intérêt, dans différents types de cellules du cerveau. Ceci est cliniquement important car des mutations dans ce gène peuvent causer la sclérose latérale amyotrophique (SLA) avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT) - donc, SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Si nous montrons que la perte de ce gène dans différents types de cellules du cerveau peut induire des anomalies du comportement, cela aiderait à expliquer pourquoi et comment des mutations dans ce gène peuvent causer la SLA-DFT et donc à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront transportés de l’établissement d’élevage à l’établissement utilisateur à l’âge de 2 mois. Dans l’EU les souris réaliseront 4 tests de comportement répartis sur 6 semaines, à partir de l’âge de 4 mois. Ces tests permettent de tester la mémoire des souris Le premier test permet d’évaluer la mémoire spatiale des souris et nécessite 30 minutes par souris répartis sur 2 jours. Le second test permet d’évaluer la capacité à reconnaitre et mémoriser des objets et dure 10 minutes par jour pendant 4 jours. Il est suivi par un test d’olfaction qui dure 20 minutes sur une journée. Le dernier test permet d’évaluer l’apprentissage d’une tâche, puis la mémoire spatiale, et dure 30 minutes réparties sur 13 jours (soit 1 habituation d’1min + 4 répétitions de 1 minute par jour pendant 7 jours + 2x 1 minute dernier jour). Les tests seront espacés d’au moins 4 jours pour éviter de stresser les animaux. Ces 4 tests de comportement ne produisent pas de douleurs et sont réalisés sur des animaux vigiles, libres de leurs mouvements. Ces tests permettent d’évaluer différentes formes de mémoire des souris. A la fin de la procédure, toutes les souris sont euthanasiées par une méthode règlementaire, et les tissus d’intérêts sont prélevés après vérification de la mort des animaux.

Impact sur les animaux

Les tests de comportement peuvent induire un stress et angoisse chez l'animal. L’un des tests consistera à faire nager les animaux dans une piscine ce qui pourrait induire une légère hypothermie.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris sont euthanasiées pour prélever des tissus d’intérêts.

Remplacement

Avant de réaliser les expériences in vivo que nous proposons dans ce projet, nous avons mené des études in vitro, pour tester si notre hypothèse est solide. Nous avons utilisé des cultures primaires de cellules immunitaires du cerveau (microgliales) avec une délétion du gène d’intérêt, pour tester si les fonctions normales des cellules microgliales sont défectueuses (réaction en réponse à une molécule stimulante). Nos résultats étant prometteurs, nous nous sommes demandé si cela pourrait entrainer un phénotype comportemental subtile in vivo. Même si on peut modéliser certaines interactions pathologiques entre cellules microgliales et cellules neuronales in vitro, déterminer un effet sur le comportement est seulement possible chez l’animal.

Réduction

Pour les tests de comportement, nous avons besoin de 15 souris par génotype avec 3 génotypes étudiés soit 45 souris au total. Il s’agit du nombre minimal de souris nécessaire pour évaluer un modificateur génétique sur le comportement - défini par des consignes internationales de la communauté de la recherche contre la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) et la SLA avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT), donc, ALS-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Comme les quatre différents tests de comportement ne produisent qu'un stress mineur sur les souris, nous utiliserons les mêmes souris pour ces 4 tests, avec au moins 4 jours de repos entre chaque test, pour en utiliser le moins d'animaux possible

Raffinement

Les souris seront transférées de l’EU d’élevage à l’EU d’expérimentation. Elles seront mises dans une boite de transport adaptée, entre congénères (1boite par cage). Le transfert sera rapide (moins de 1h), car les deux EU sont géographiquement très proches. Les conditions d’hébergement sont agréées. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et un enrichissement correspondant à leurs besoins. Pour la stimulation environnementale, nous utilisons du coton, permettant de faire des nids dans chaque cage, et des bâtonnets à ronger. Les animaux seront hébergés entre fratrie autant que possible, mais pourraient être séparés en cas de bagarre. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Avant la réalisation des tests comportementaux, une habituation à l’expérimentateur sera réalisée par manipulation des animaux pendant une semaine tous les jours. De plus, avant chaque session de test il y aura une habituation à la pièce pour les animaux en déposant les cages dans la salle d’expérimentation 30min à 1heure avant le début de l’expérimentation. Une surveillance particulière des animaux testés sera faite durant les tests comportementaux. Nous respecterons une période de repos au moins 4 jours entre chaque type de test comportemental et nous réaliserons les tests du moins au plus stressant. Pour le test nécessitant de faire nager les animaux, à la sortie de l’eau ils seront séchés à l’aide d’un torchon avant d’être replacés dans leur cage d’hébergement.

Choix des espèces

Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), et la SLA avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT), donc SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale): souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre neurones et cellules immunitaires dans un système nerveux central de mammifère. Par conséquent, nous avons besoin d’un système complexe pour répondre à nos questions. Les tests comportementaux que nous voulons utiliser sont bien établis chez la souris. Il existe également de solides données dans la littérature qui ont montré que la microglie (cellules immunitaires du cerveau) peut influencer le comportement chez la souris. Les souris sont utilisées à l'âge jeune (à 4 mois).