Souris

Un quart seulement des souriceaux de chaque portée porte la mutation recherchée, et ceux dont le second gène est invalidé meurent le premier jour de vie. 4 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut subir jusqu'à six échocardiographies sous anesthésie gazeuse, six injections dans l'abdomen, six tests de force et six passages sur tapis roulant, plus une biopsie de génotypage et des transports vers un centre extérieur. Celles qui portent la première mutation développent une cardiomyopathie et peuvent, dès neuf semaines, perdre du poids et adopter une posture anormale, pendant que le porteur décrit la création de ces modèles comme une étape "nécessaire" à un traitement qui n'existe pas.

Objectifs

Les maladies dues à un défaut de production d’énergie, sont de maladies génétiques très rares et incurables. Ces maladies peuvent se manifester à tout âge et peuvent affecter plusieurs types d'organes en même temps. Les mutations du notre gènes d’intérêt n 1 et 2, codant des protéines essentielles pour la production d'énergie dans nos cellules, provoquent des maladies affectant le cerveau et le cœur. Comme ces maladies affectent les cellules qui ne se divisent pas, la culture cellulaire ne peut pas aider à comprendre comment le dysfonctionnement mitochondrial affecte le fonctionnement des organes affectés et le développement de la maladie. Ainsi, un modèle animal doit être utilisé pour comprendre les mécanismes physiopathologiques de ces maladies. Nous avons décidé d'utiliser les souris comme modèle parce que les souris sont plus proches de l’humain et la physiologie mitochondriale chez l’homme et la souris sont très similaires. Nos objectifs sont les suivants : - Création et étude d'un modèle de souris pour l'étude du développement des maladies associées au gène d’intérêt 1 et 2. La création de ces deux modèles animaux et la compréhension du développement de la maladie mitochondriale sont des étapes nécessaires à la mise au point d'un traitement efficace.

Bénéfices attendus

Ce projet fournira des modèles murins pour les maladies mitochondriales et permettra de découvrir leurs mécanismes pathologiques. Ces deux points sont des étapes essentielles pour le développement d'un traitement pour ces maladies encore incurables.

Procédures

-échocardiographie (20 min par souris; 6 fois maximum par souris) -anesthésie gazeuse (20 min par souris; 6 fois maximum par souris) -injection intra-péritonéale (1 min par souris ; 6 fois maximum par souris) -grip-test (5 min par souris ; 6 fois maximum par souris) -treadmill (5 min par souris ; 6 fois maximum par souris); biopsie pour génotypage: (1 min par souris; 1 fois par souris )

Impact sur les animaux

Les souris où l’expression du notre gène d’intérêt 1 est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée), développeront une cardiomyopathie.. À partir de 9 semaines, ces souris peuvent commencer à perdre du poids et avoir une mobilité réduite avec une posture anormale. Les souris où l’expression du notre gène d’intérêt 2 est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée), développeront maladie neurologique et meurent le premier jour de vie. Les autres nuisances que les souris subiront sont le stress pendant le test comportementaux, pendant l’échocardiographie, pendant l’injection intra péritonéal et le stress pendant le transport vers le centre expert de l’échocardiographie.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort, pour analyser les tissus.

Remplacement

L’objectif de notre projet est d’étudier la pathophysiologie des maladies mitochondriales. Pour cette raison l’utilisation d’un modèle animal est nécessaire. La préparation des cultures cellulaires primaires, pour l'étude du rôle moléculaire des protéines codées par notre gènes d’intérêt, aide à réduire le nombre d'animaux utilisés mais ils ne peuvent malheureusement pas remplacer l'utilisation du modèle animal.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris utilisées pour les expériences, nous nous sommes basés sur nos précédents travaux sur l’étude d’autres modèles murins de maladies mitochondriales et sur de méthodes et analyses statistiques. De plus, lorsque cela est possible, les prélèvements d’une même souris seront utilisés pour plusieurs analyses. L’échocardiographie est elle-même une méthode de réduction car elle permet un suivi longitudinal des souris, par opposition à une mise à mort séquentielle.Nous utiliserons des méthodes statistiques comme des tests t de Student et Anova en fonction des groupes d’animaux comparés.

Raffinement

Dans un contexte de raffinement adapté, les animaux seront surveillés quotidiennement par les techniciens de l'animalerie (dans les weekends par les personnes d’astreinte), et une fois par semaine par les chercheurs travaillant sur ce projet, pour détecter un éventuel état de souffrance et/ou d’angoisse. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Concernant l'échocardiographie, les souris seront anesthésiées, pour être capable de mesurer correctement les différents paramètres du système cardiaque et éviter le stress. Concernant les injections le volume injecté sera réduit au minimum possible et la solution sera chauffée à la température ambiante. Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupée dans un milieu enrichi avec des carrés de coton, des maisonnettes et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti en évitant tout isolement prolongé. Le transfert des souris vers le centre expert de l’échocardiographie se fera dans des cages de transport sécurisées dans des véhicules dédiées tout en réduisant les vibrations et le bruit.

Choix des espèces

Les souris sont génétiquement, physiologiquement et anatomiquement proches des humains. La physiologie mitochondriale et la tissu-spécificité des fonctions mitochondriales chez l’homme et la souris sont très similaires. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge (nouveau-nés, souris juvéniles et juvéniles adultes). Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris âgées de 3 semaines et plus.

180 souris subissent une craniotomie de trente minutes, avec incision de la peau, injection stéréotaxique dans le cerveau et sutures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce comme effets possibles des saignements, des douleurs postopératoires, une infection de la suture et une perte de poids passagère. Il présente les cellules souches de pulpe dentaire comme une alternative dénuée de "conflits éthiques", par opposition aux cellules embryonnaires, et se félicite de transformer un "déchet biologique" en source thérapeutique. Toutes les souris sont tuées à la fin de la procédure, pour électrophysiologie sur tranches de cerveau ou étude histologique.

Objectifs

L'un des défis les plus importants auxquels est confronté la société d'aujourd'hui est la recherche de thérapies neurorégénératives efficaces qui aident à résoudre les blessures du système nerveux causées par des événements traumatiques, des maladies neurodégénératives ou même celles plus récemment connues dérivées de l'inflammation provoquée par le SARS-COV-2. Ces blessures sont dans la plupart des cas irréversibles, entraînant des coûts économiques et sociaux élevés tant pour les patients que pour leurs familles. De plus, le système nerveux a une faible capacité d’auto-réparation, puisque le processus de neurogenèse diminue avec l’âge et que les neurones endommagés ne sont pas facilement remplacés. Ces dernières années, diverses études se sont concentrées sur la recherche de candidats cellulaires efficaces pour ce type de thérapie. Au vue des problèmes éthiques et juridiques liés à l'utilisation de cellules souches dérivées d'embryons, les cellules souches de pulpe dentaire ont été identifiées comme une alternative prometteuse dans ce domaine.Elles se distinguent par leurs nombreux avantages par rapport aux autres cellules, tels que : leur facilité d'obtention et l'absence de conflits éthiques, leur capacité à sécréter des facteurs neuronaux, sa capacité à exprimer des marqueurs et des récepteurs neuronaux, sa capacité à se différencier en neurones sans avoir besoin d'être génétiquement modifiés. Dans le cadre de la thérapie cellulaire, le projet actuel a pour but de valider l’utilisation des cellules souches de pulpe dentaire sur les circuits cérébraux, sur le remodelage des synapses et sur leur action neuroprotectrice. Nous validerons les effets des vésicules extracellulaires qui ont pour avantage de limiter les besoins direct d'un implant cellulaire, et de réduire le risque de rejet du greffon de thérapie cellulaire.

Bénéfices attendus

Le projet validera le potentiel des cellules souches de pulpe dentaire à être utilisées dans des modèles in vivo dans le système nerveux central. Cela démontrera pour la première fois qu'elles peuvent être différenciés en neurones fonctionnels et intégrés dans le système nerveux, ce qui ouvrira de futures perspectives d'utilisation en thérapie substitutive. D’autre part, l’utilisation de vésicules extracellulaires démontrera leur fonctionnalité dans un environnement sain, leur permettant d’être le point de départ de leur utilisation dans de futurs modèles de lésions et/ou d’inflammation du système nerveux. Tout cela présente un énorme intérêt pour pouvoir réutiliser du matériel considéré comme un « déchet biologique » et le transformer en une source cellulaire capable d’être réutilisé pour la thérapie cellulaire.

Procédures

Les 180 animaux de cette demande d’autorisation subiront une chirurgie pour l’injection de cellules souches ou de vésicules extracellulaires (30min)

Impact sur les animaux

Les différentes étapes de la chirurgie tels que l’incision de la peau, la craniotomie, l’injection stéréotaxique, et la réalisation des points de sutures peuvent entrainer des effets indésirables comme des saignements, des douleurs post chirurgicales, une infection au niveau de la suture et une légère perte de poids de courte durée. .

Devenir

L'ensemble des animaux est euthanasié à la fin de la procédure afin de réaliser des expériences d'électrophysiologie in vitro ou des études histologiques.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives, pour évaluer la fonctionnalité et l’intégration des cellules greffées dans un système neuronal complexe.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les conditions de l'élevage seront standardisées et en adéquation avec le bien-être des animaux de façon à obtenir des groupes d'animaux les plus homogènes possibles et ainsi diminuer le nombre d'individus pour les analyses statistiques. L’utilisation de tests statistiques pour ces expériences nous permet d’estimer un nombre minimal de souris nécessaires pour satisfaire les conditions statistiques de significativité.

Raffinement

Les souris seront acclimatées pendant 4 jours après leur arrivée dans l’animalerie . Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel, nid) sur un portoir filtrant. Les animaux sont surveillés chaque jour par les zootechniciens. Cette surveillance est renforcée (2/jours) dans les jours qui suivent la chirurgie jusqu’à récupération complète des animaux. Des critères de bien être seront évalués : allure du poil, dos vouté, blessures dues à des bagarres entre congénères, lésions cutanées, agressivité ou repli, respiration accélérée/saccadée. Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraine la création d’une « fiche individuelle de soin » (FIS), qui renseigne les soins prodigués (réchauffement, soins médicamenteux, etc…) et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animal à surveiller ». Cette fiche est fermée quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Un suivi spécifique établi pour les procédures de chirurgie sera décrit dans les procédures. La chirurgie est réalisée sous anesthésie. Un contrôle de la respiration et de l’absence de reflex sera effectué tout le long de la chirurgie. La douleur induite par l’incision sera couverte par l’injection préalable en sous cutané d’un anesthésique local. L’injection d’un morphinique, en sous cutané en début de chirurgie va permettre une couverture analgésique jusqu’au réveil de l’animal. Une seconde injection est réalisée en fin de chirurgie pour assurer une couverture analgésique pendant les 4-6 heures post-opératoire. Les jours suivants si l’animal montre des signes de souffrance, il recevra en sous cutanée une injection quotidienne d’un anti inflammatoire non stéroïdien, jusqu’à disparition des signes de mal être.La mise à mort est précédé d’une injection d’une double dose d’analgésique et d’un euthanasiant. L’absence de reflexe est vérifié avant toute incitions afin de contrôler la profondeur de l’anesthésie de l’animal.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes synaptiques sur l’adaptation comportementale. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 à 8 semaines d'âge, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.

472 souris vont être utilisées et toutes tuées pour conserver leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 230 chirurgies stéréotaxiques d'injection virale ou de pose de fibre optique. Chaque animal opéré passe ensuite sept jours seul en cage, puis subit un enregistrement électrophysiologique de l'hippocampe pouvant durer une heure. Le protocole prévoit aussi 84 souris exposées à un biberon d'éthanol toutes les vingt-quatre heures pendant six semaines, 80 immobilisées quinze minutes en contention et 360 soumises cinq jours durant à des tests de reconnaissance des émotions avec enregistrement de leurs vocalisations ultrasonores. Le porteur qualifie la contention de "stress psychogène modéré" et prête à l'exposition à l'alcool des effets "positifs de type anxiolytiques, relaxant et euphorisants".

Objectifs

L’OMS raporte que 5% de décès dans le monde peuvent être attribués à l’abus d’alcool. Le fléau sociétal et de santé publique que repésente l’alcoolisme motive la recherche de facteurs de risques génétiques et environnementaux, dans le but de développer des interventions thérapeutiques plus efficaces. Des études génétiques chez l’Homme ont permis de montrer un lien entre une modification du gène des récepteurs nicotiniques de type α5 et la probabilité de développer une dépendance à l’alcool. Malheureusement, le lien causal entre cette altération génétique et l’alcoolisme est difficile à étudier chez l’homme. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle de cette altération dans la consommation d’alcool, la gestion des émotions et comportements sociaux, à l’aide de lignées de souris exprimant la même altération génétique que l’Homme. Afin de connaitre les conséquences de cette altération génétique sur l’activité neuronale, nous enregistrerons la réponse à la stimulation des neurones situés dans les régions du cerveau impliquées dans la reconnaissance des émotions. Enfin, dans le cas ou des déficits sont observés chez les animaux porteurs de la modication génétique, nous tenterons d’améliorer le déficit socio-émotionel en corrigeant, par thérapie génique, l’altération génétique du récepteur α5 dans le cerveau de souris. Ce même traitement pourrait aussi régulariser leur consommation d’alcool.

Bénéfices attendus

Bien que des études génétiques chez l’Homme aient montré un lien entre une modification du gène responsable de l’expression des récepteurs nicotiniques de type α5 et la probabilité de développer une dépendance à l’alcool, les mécanismes à l’origine de cette vulnérabilité demeurent inconnus. Or, il existe différentes formes (ou types) d’alcoolisme associées à des comportements émotionnels et sociaux différents voire opposés, par exemple à une hyperanxiété ou une hypoanxiété. Chez l’Homme, il est très difficile de déterminer si ces traits comportementaux et émotionnels sont dus à la consommation d’alcool, ou s’ils correspondent à des traits de personnalité qui préexistent, voire facilitent cette consommation. A ce jour, les traitements ne prennent généralement pas en compte les différents types alcooliques, ce qui pourrait expliquer au moins en partie le taux de rechute élevé (80 à 90% selon les études). L’un des principaux intérêts de notre projet est donc de mieux comprendre la relation entre les traits comportementauxs socio-émotionnels et la consommation d’alcool, en permettant de dissocier les effets de la consommation chronique d’alcool du profil de personnalité préexistant. De façon importante, ces traits sont aussi fortement liés au sexe, par exemple les profils hyperanxieux sont principalement observés chez les patients de sexe féminin, à l’inverse l’hypoanxiété et l’émoussement émotionnel sont principalement observés chez les patients de sexe masculin. Pour cette raison, nous comparerons les réponses comportementales et neuronales de souris mâles et femelles. Ainsi, l’apport éventuel de notre projet pourrait se situer à plusieurs niveaux. Premièrement, en prenant en compte les profils émotionnels et non simplement le niveau de consommation, il pourrait aider à comprendre les mécanismes par lesquels une mutation des récepteurs a5 induit un risque de dépendance à l’alcool. Si le lien entre profils socio-émotionels et risque de dépendance à l’alcool est observé chez l’animal, cela permettrait de tester certaines interventions thérapeutiques, qu’elles soient pharmacologiques ou psychologiques, pour adapter les traitements de façon « personnalisée » chez l’Homme. De nouvelles stratégies pharmaco et/ou psychothérapeutiques prenant en compte le profil socioémotionnel des patients pourraient ainsi se révéler beaucoup plus efficaces pour faciliter l’arrêt de la consommation d'alcool, voire de diminuer les risques de rechute.

Procédures

Les animaux seront soumis à : • La chirurgie stéréotaxique d’injection de virus et/ou d’implantation de fibre optique (geste réalisé sous anésthesie générale avec suivi analgésique), dure environ 30 minutes (n=230). • L’enregistrement de l’activité electrophysiologique dans l’hippocampe (geste effectué sur animal anesthesié) pendant une période maximale de 60 minutes (n=230). • L’activation neuronale via photostimulation optogénétique sur animal vigile pendant 3 minutes lors d’une session par animal (n=82). • L’exposition volontaire d’un biberon contenant une solution d’éthanol toutes les 24 heures pendant 6 semaines (n=84). • Un test de reconnaissance des émotions avec enregistrement des vocalisations ultrasonores pendant 5 jours à raison de 10 minutes par jour (n=360). • Un stress de contention sur animal vigile pendant 15 minutes, geste effectué une seule fois (n=80). • Un isolement en cage individuel

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à : • La chirurgie stéréotaxique d’injection de virus et/ou d’implantation de fibre optique (geste réalisé sous anésthesie générale avec suivi analgésique) qui dure environ 30 minutes (n=230). Cette procédure induit une perte de poids légère et transitoire normale (1-2j) et une douleur modérée qui répond bien à une injection sous-cutanée d’AINS (INFLACAM©) efficace pendant plus de 12h. • L’enregistrement de l’activité électrophysiologique de deux régions du cerveau : le CA1v et CA1d pendant une période maximale de 60 minutes (n=230). Ce geste est effectué sur animal en anesthésie générale profonde. • L’activation neuronale des voies BLA-CA1v via photostimulation optogénétique sur animal vigile pendant 3 minutes lors d’une session par animal (n=82). Ce geste peut générer éventuellement une anxiété légère qui n’est pas systématique (Feliz-Ortiz et al, 2015). • L’exposition volontaire d’un biberon contenant une solution d’éthanol toutes les 24 heures pendant 6 semaines (n=84). Ce traitement, qui dépend d’un choix libre de l’animal, génère plutôt des effets psychopharmacologiques et physiques positifs de type anxioloytiques, relaxant et euphorisants. • Un test de reconnaissance des émotions avec enregistrement des vocalisations ultrasonores pendant 5 jours à raison de 10 minutes par jour (n=380). Induit un stress léger, comparable au stress induit par de nombreux tests comportemntaux considérés comme faiblement stressants. • Un stress de contention sur animal vigile pendant 15 minutes, geste effectué une seule fois (n=80) et considéré comme un stress psychogène modéré auquel les animaux s’habituent. • L'isolement en cage individuelle pendant les 7 jours qui succèdent aux chirurgies stéréotaxiques: Cet isolement est prévu pour éviter que les animaux se blessent entre eux lors de la phase de cicatrisation post-opératoire. Au bout de 7 jours les animaux seront replacés en hébérgement collectif en respectant les mêmes compositions de cage qu'avant les chirurgies (n=230).

Devenir

A la fin des procédures les animaux sont euthanasiés sous anesthésie générale profonde pour la conservation des tissus (cerveau), qui seront analysés ultérieurement.

Remplacement

Le projet étant basé sur la reconnaissance des émotions chez la souris et sa relation avec la consommation d’alcool, il n’est pas possible à ce jour de remplacer l’utilisation d’animaux par une autre approche. En revanche, les effectifs peuvent être optimisés en remplaçant les tests indépendants par l’utilisation d’une batterie de tests longitudinaux qui permet d’optimiser le recueil des données pour chaque animal. Ceci implique d’une part de choisir, sur la base de la littérature et de résultats préliminaires, des tests ne modifiant pas le comportement à long terme; et d’autre part d’espacer ces tests dans le temps. Ainsi, deux tests à court terme réalisés en séquentiel divisent par deux l’effectif total sans impacter significativement les résultats.

Réduction

En plus de l'utilisation de batteries de tests (voir ci-dessus), des études pilotes avec un petit nombre de sujets (n=4-5) permettront de déterminer si les effets justifient l'application d'un protocole complet, ce qui peut réduire de façon importante l'effectif total. Ce nombre n’est pas suffisant pour garantir un effet statistique solide mais il permet de décider, sur la base de statistiques descriptives, de compléter l’expérience à 10 animaux par groupe qui est l’effectif minimum nécessaire pour une significativité acceptable avec les tests statistiques paramétriques d’analyses de moyenne et de variance.

Raffinement

Toutes les dispositions permettant de préserver le bien-être des animaux seront prises: anesthésie générale pour l'opération, traitement post-opératoire anti-inflammatoire préventif. Par ailleurs l'ensemble des animaux est maintenu dans des conditions d'environnement enrichi, avec à disposition un matériau pour construction de nid. Après chaque intervention chirurgicale (classe modérée) les animaux seront isolés afin d’éviter tout risque de blessures ou de souffrance. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens formés en expérimentation animale (niveau appplicateur) qui informent le concepteur/expérimentateur immédiatement lorsque que des dispositions doivent être prises en cas de signe de souffrance. L'atteinte des points limites entraine l'application du protocole de réponse en fonction du score défini dans chaque procédure. Il faut noter que les tests sociaux utilisés, en permettant aux animaux d’interagir librement de façon quotidienne pendant la durée des expériences, peuvent être considéré comme un enrichissement. L’ensemble des expérimentateurs/soigneurs intervenant sur les animaux a suivi une formation à l’expérimentation animale (niveau 1 ou 2).

Choix des espèces

La souris représente une espèce de référence pour l’étude du système nerveux central chez les vertébrés supérieurs. L’organisation du système nerveux murin permet une extrapolation raisonnable des résultats obtenus chez la souris à l’espèce humaine. Par ailleurs, la souris est une espèce qui peut être manipulée génétiquement, fournissant des outils essentiels à la compréhension des mécanismes neurobiologiques et des mécanismes neuronaux impliqués dans de nombreuses maladies et déficits cognitifs. Grâce aux modèles transgéniques, il est aussi possible de relier les données de la génétique humaine des maladies à l'altération de molécules/récepteurs spécifiques dont la fonction peut être analysée avec des modèles précliniques de ces maladies. Par exemple, l'implication de mutations des récepteurs cholinergiques nicotiniques dans la dépendance à l’alcool peut être étudiée à l'aide des souris dépourvues (α5KO) de certains de ces récepteurs et à des souris exprimant un polymorphisme génétique humain (α5KI) qui sont utilisées dans le projet présent. Les animaux seront utilisés au stade âge adulte mature (3–6mois). Cet âge constitue une période de stabilité durant laquelle on considère que le développement est achevé et les effets liés au vieillissement minimum.