Souris

Fabriquer chez la souris deux versions d'une insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée, puis comparer laquelle ressemble le plus à la maladie humaine : 60 souris vont être utilisées pour cela dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement du cœur. 22 reçoivent par chirurgie un réservoir sous la peau diffusant un produit en continu, 22 autres suivent cinq à neuf semaines de régime gras avec un produit pharmacologique dans l'eau de boisson. Toutes sont immobilisées deux à trois fois pendant un quart d'heure pour la mesure de pression artérielle, et endormies pour l'échocardiographie. Une grille de score portant sur l'apparence, le comportement et les signes cliniques déclenche selon le résultat une analgésie supplémentaire ou la mise à mort.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. Parmi elles, l’insuffisance cardiaque a un pronostic grave, avec plus de 75% des hommes et plus de 50% des femmes décédant 5 ans après le diagnostic. L’insuffisance cardiaque est une incapacité du cœur à fournir suffisamment de sang à l’organisme, tout d’abord en condition d’exercice physique, puis avec l’évolution de la pathologie également au repos. Ce mauvais fonctionnement du cœur peut venir de défauts pendant sa contraction ou pendant son relâchement. Jusqu’à maintenant, une majorité d’études se sont intéressées au défaut dans la contraction cardiaque (insuffisance cardiaque à facteur d’éjection réduite). Cependant, depuis quelques années, des études cliniques ont démontré que chez les patients avec un défaut principalement dans la relaxation cardiaque (insuffisance cardiaque à facteur d’éjection préservée) la mortalité est similaire ; il s’avère que les traitements actuels, développés pour les défauts de contraction, ne sont pas adaptés. De plus, un effet lié au sexe est possible car il y a plus de femmes que d’hommes souffrant de cette maladie. Une limite majeure pour étudier les mécanismes de la maladie et développer de nouveaux traitements est le manque de modèles expérimentaux. Cette maladie étant fréquemment associée à plusieurs facteurs de risque tels l’obésité et l’hypertension, nous allons tester deux modèles qui combinent l’insuffisance cardiaque avec une obésité (génétique ou par régime gras) et une hypertension (par traitement pharmacologique). Le but de ce projet est de comparer deux modèles expérimentaux qui présentent des caractéristiques similaires à la condition clinique, et de réaliser les premières études sur les défauts au niveau des cellules.

Bénéfices attendus

L'insuffisance cardiaque est une maladie affectant plus d’1 million de personnes en France dont environ la moitié souffrent d’insuffisance cardiaque à facteur d’éjection préservée. Cela représente un coût socio-économique et humain majeur pour le système de santé en France. La fonction cardiaque et la qualité de vie chez les patients souffrant de cette maladie sont gravement altérées. En effet, le cœur de ces patients n’arrive pas à éjecter suffisamment de sang vers les organes car il n’arrive pas à se relâcher suffisamment durant la phase de relaxation. Ce dysfonctionnement conduit à une intolérance à l’exercice physique et à des effets néfastes sur d’autres organes comme les poumons (hypertension pulmonaire) et les muscles du reste du corps. Les traitements contre l’IC à fraction d’éjection réduite ne sont pas ou peu efficaces pour les patients souffrant d’IC à fraction d’éjection préservée. Il est donc essentiel de poursuivre la recherche pour mieux comprendre la maladie et trouver des traitements. Le bénéfice principal attendu de ce projet est d’établir un modèle expérimental que reproduit bien l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée. Ce modèle pourra ensuite être utilisé par différentes équipes au niveau de notre laboratoire et au niveau national et international afin de déterminer les mécanismes et tester des thérapies adaptées.

Procédures

22 animaux seront soumis à une intervention chirurgicale légère sous anesthésie et sous analgésie : implantation sous la peau d'un petit réservoir qui diffuse un médicament en continu ; durée de la chirurgie, environ 10 minutes. 22 animaux seront soumis à un régime alimentaire particulier (riche en gras) et un produit pharmacologique dans leur eau de boisson ; 5 à 9 semaines. Tous les animaux auront une mesure de la pression artérielle : mesure non invasive mais qui nécessite l'immobilisation des animaux ; durée environ 15 minutes, 2 à 3 fois. Tous les animaux auront une exploration de la structure et fonction cardiaque : mesure non invasive par échocardiographie, sous anesthésie.

Impact sur les animaux

L'implantation sous la peau du réservoir peut causer une douleur liée à l'ouverture et la suture de la peau.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux sont euthanasiés car nous avons besoin de prélever les cœurs ainsi que d'autres organes pour faire d'autres analyses pour caractériser les modèles.

Remplacement

Le cœur est un organe complexe, composé de plusieurs compartiments et de plusieurs tissus spécialisés. Il comporte plusieurs sortes de cellules au rôle et au propriétés spécialisées. Il n’existe actuellement aucun système cellulaire (lignées, organoïdes, organes bio-artificiels ou organs-on-a-chip) qui permette d’analyser la fonction et les défauts cardiaques. Ainsi le recours à des modèles animaux reste impératif. De plus, notre étude vise à comparer des modèles pathologiques, il est donc indispensable d’étudier le cœur intégré à l’organisme ; les modélisations par ordinateur ne sont pas suffisantes pour mimer une telle complexité. Il est donc nécessaire pour l’évaluation de la fonction cardiaque d’utiliser un mammifère entier adulte afin de s’approcher le plus possible des mécanismes physiopathologiques humains. La souris est un bon modèle car les gènes impliqués sont largement conservés.

Réduction

Une planification à l’aide de logiciels de statistiques nous a permis de déterminer le nombre d’animaux minimum nécessaires pour obtenir des résultats fiables. De plus, nous allons obtenir les données de la fonction cardiaque par des méthodes non invasives, ce qui permet de mesurer plusieurs fois sur le même animal et donc de réduire le nombre d’animaux. Le groupe de souris contrôle (sans pathologie) est commun aux deux modèles.

Raffinement

Les animaux hébergés au sein de l’animalerie seront pris en charge et observés pendant toute la durée de leur présence. Les cages des animaux seront enrichies et les animaux seront suivis par un personnel spécifiquement formé. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles, dans une pièce où les paramètres environnementaux (température, hygrométrie, lumière) et sanitaires sont contrôlés. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne et de pesées régulières en fonction des procédures. Une grille de score a été définie, évaluant les paramètres suivants : apparence, comportement naturel et provoqué, signes cliniques. Des points limites, en fonction du score obtenu selon cette grille, ont été décidés, menant à l’administration d’analgésie supplémentaire ou à l’euthanasie. Toutes les procédures impliquant une chirurgie sur l'animal seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et analgésiques.

Choix des espèces

La souris est un des modèles les plus utilisés en recherche biomédicale. La structure des tissus musculaires et cardiaques de la souris sont très proches de celle de l’homme et la plupart des gènes conservés. De plus les souris se reproduisent rapidement et de nombreuses études sur l’insuffisance cardiaque ont été réalisées chez la souris ce qui nous permettra plus tard de discuter nos résultats par rapport aux autres études publiées. Des souris adultes âgées de 3 mois (adulte) seront utilisées car les maladies cardiaques se déclarent essentiellement à l’âge adulte.

Jusqu'à vingt et une administrations espacées de huit heures et dix micro-prélèvements de sang à l'extrémité de la queue, sur quarante-huit heures au minimum : 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour recueillir les échantillons. Le projet mesure la concentration sanguine de quatre-vingts candidats médicaments par an pendant cinq ans, à raison de trois souris par condition testée. Le porteur écrit renoncer à toute grille de score parce qu'un score obligerait à maintenir la souffrance de l'animal pour en suivre l'évolution, et prévoit la mise à mort dès 2 à 5 % d'écart de poids. Le choix de la souris tient à ce qu'elle est l'espèce la plus utilisée pour cette mesure et à ce que sa petite taille consomme moins de composé, certains candidats médicaments étant difficiles à synthétiser.

Objectifs

Pour le développement de nouveaux médicaments, il est nécessaire d'étudier le devenir de la substance active dans l'organisme, dans le but de déterminer : l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’élimination du composé (ADME), des propriétés qui vont influencer la posologie du candidat-médicament (dose administrée et fréquence d'administration). L’objectif scientifique est de suivre la concentration sanguine de produits pharmacologiques en cours de développement chez la souris. Les produits pourront être de différentes natures (chimique, peptidique, oligo-nucléotidique) et/ou pour diverses applications : analgésie, anti-inflammatoire, antibiotique, immunodépresseur, anticancéreux, cardio-protecteur, anti-arthrosique, antidépresseurs, neuro-protecteur…

Bénéfices attendus

La mesure de la concentration sanguine au court du temps des candidats-médicaments permettra de sélectionner les plus adaptés et d’en affiner la posologie (dose et fréquence d’administration) selon les résultats de l’ADME. Ce projet s'inscrit pleinement dans les étapes indispensables au développement des candidats-médicaments. Il permet de réduire drastiquement le nombre de candidat-médicament à tester dans les études d’activité et le nombre d'études nécessaires pour mesurer ensuite l’activité des candidats-médicaments sélectionnés, tout en augmentant les probabilités d'obtenir un médicament.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections pour l'administrer les candidat-médicaments étudiés. Les candidat-médicaments et médicaments étudiés seront administrés 1 à 21 fois avec un minimum de 8h entre chaque administration. Une anesthésie de quelques minutes est nécessaire pour le rasage des animaux et pour les administrations ID, IN, IT. Afin de suivre la concentration sanguine du candidat médicament au cours du temps, un maximum de 10 micro-prélèvements de sang (environ 1min) seront réalisés à l’extrémité de la queue et sur une durée minimum de 48h.

Impact sur les animaux

Les injections entraînent une douleur légère de courte durée, de même que la section de la pointe de la queue (moins d’un demi millimètre) utilisée pour permettre les prélèvements sanguins.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses

Remplacement

Les candidats-médicaments auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…). Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l’ADME d’un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans l’absorption, la distribution, la dégradation et l’élimination des médicaments. Ces phénomènes biologiques sont liés à la circulation sanguine, aux barrières biologiques et aux voies d'élimination (dégradation par le foie, élimination biliaire et rénale...) et régulent l’activité des médicaments. Pour ces raisons, une approche chez l’animale reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. La mesure de la pharmacocinétique sera réalisée chez le souris, car cette espèce est la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments.

Réduction

La réalisation des procédures par un technicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. La procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une mesure efficace à l’aide de 3 souris par condition testée. La mise en place de micro-prélèvements répétés chez un même animal permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés pour suivre la concentration sanguine des candidats médicaments. Les résultats sont exploités sous la forme de courbes cinétiques et aucune comparaison statistique n’est requise. Il est prévu de mesurer la pharmacocinétique de 80 composés chaque année sur une période de 5 ans soit un maximum de 1200 souris.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les souris seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’un tube de change et de matériaux de « nidification ». Une période d'acclimatation et d'habituation de 2 semaines sera respectée mais pourra exceptionnellement être ramenée à une semaine minimum en cas de contraintes temporelles (délai de livraison, délai trop court avant une période de travaux ou avant le vide sanitaire suivant…). Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état des animaux par l’expérimentateur. Les souris seront anesthésiées pour permettre certaines administrations (intranasale, intratrachéale, intradermique, intramusculaire). Les souris seront alors placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments ou des sondes, pour mettre en évidence tous signes de toxicité imprévue qui nécessiterait la mise à mort de l’animal. Aucun animal ne sera maintenu en vie s’il présente des signes de douleur ou d’inconfort. Pour cette même raison, aucun « scoring » n’est envisagé, car il nécessite de maintenir la souffrance de l’animal pour en évaluer l’évolution. Il arrive cependant qu’aucun signe extérieur de douleur ne puisse être observé, et que seule une perte ou absence de prise de poids soit mise en évidence. Dans ce cas, les animaux seront mis à mort dès la mise en évidence d’une différence significative (généralement dès 2 à 5% d’écart). Les micro-prélèvements de sang sont réalisés sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention), à même de signifier librement tout manquement

Choix des espèces

La mesure de la pharmacocinétique est réalisée chez la souris, car cette espèce est la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments. Certain candidat-médicament sont très difficile à synthétiser et la petite taille de la souris nécessite beaucoup moins de composé. Enfin, ce choix permet aussi de mesurer l’ADME d’un composé chez la même espèce que pour les futures études d’activités, elles-mêmes nécessitant le plus souvent le recourt à des animaux génétiquement modifiés, plus facile à trouver ou générer chez la souris. L’âge des souris sera déterminé en fonction de l’objectif scientifique et de la pathologie visée. Les souris seront âgées d’au minimum 4 semaines afin que la procédure puisse être réalisée sans remettre en cause le bien-être de l’animal.

Les souris utilisées ici sont immunodéficientes, choisies pour ne pas rejeter les fragments de tumeurs prélevés sur des patients, certaines portant en plus un système immunitaire humain reconstitué. 13 340 souris vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement de tissus. Elles subissent une chirurgie de greffe de cinq à vingt minutes, jusqu'à deux mois de traitements par des molécules dont le porteur écrit ignorer la nature et les effets secondaires, et jusqu'à dix prélèvements sanguins. Le nombre d'animaux par groupe, treize, ne repose sur aucun test statistique : le porteur le fixe à partir de son expérience et de la littérature.

Objectifs

Ce projet a déjà obtenu une autorisation de projet qui doit être renouvelée au bout des 5 ans échus. Les cancers sont en progression constante de nos jours et touchent plusieurs organes. Aux stades avancés, ils sont réfractaires à toute thérapie malgré le développement des thérapies ciblées. De nouvelles options thérapeutiques doivent donc être impérativement développées. Depuis plusieurs années, nous avons mis en place une importante plateforme de xénogreffes tumorales issues de patients (PDX Patient-derived xenograft) pour les cancers urologiques dans un premier temps du fait de notre thématique de recherche (mais d’autres domaines pourraient être testés) et de proposer ces modèles pour une évaluation fiable de candidats médicaments. L’objectif du projet est d’évaluer l’effets de candidats médicaments dans des modèles de xénogreffes de tumeurs issues de patients chez la souris immunodéficiente et/ou humanisée.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de cancer.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse ou par voie fixe pour subir une chirurgie pour l’implantation de la tumeur. Ces chirurgies sont courtes et durent environ 5-20 min selon la voie choisie. Des antalgiques seront administrés aux animaux en sous-cutané pour limiter la douleur. Les animaux recevront également des traitements avec des candidats médicaments à tester (traitements pendant 2 mois maximum). Les voies et fréquences sont dépendantes de chaque protocole expérimental. Ces gestes étant réalisés par du personnel qualifié seront très rapides (environ 1 min) pour diminuer au maximum la contention des animaux et un stress possible. Les animaux pourront avoir des prélèvements sanguins sur animal vigile ou anesthésié (geste qui dure environ 1 min et 5-10 prélèvements maximum). La mesure des tumeurs se fera par palpation de la tumeur et évaluation de sa taille. Ce geste est très rapide (1 minute maximum) et ne provoque pas un grand stress à l’animal.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies et chirurgie sur les animaux peuvent provoquer du stress, une douleur, des lésions. De plus, nous greffons une tumeur cancéreuse aux animaux qui croit plus ou moins doucement selon les modèles pouvant entraîner une perte de poids des animaux, une gène…

Devenir

Les animaux seront euthanasiés car des prélèvements de tissus seront réalisés

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de certains cancers. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peut mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Les modèles expérimentaux en oncologie préclinique sont: - les lignées cellulaires in vitro et in vivo ; - les tumeurs induites chimiquement ; - les souris transgéniques ; - les xénogreffes tumorales issues de patient (PDX). Ce dernier modèle est reconnu comme le plus pertinent car il reflète l’hétérogénéité tumorale et est décrit dans la littérature. Cette approche est encore peu répandue pour la sphère urologique et la communauté scientifique manque de modèles de PDX pour évaluer les candidats médicaments. De plus, l’approche immunothérapeutique prend une grande ampleur en oncologie, ainsi il est important de développer des modèles de double humanisation (PDX implantés sur des souris humanisées) pour tester ces nouvelles immunothérapies (non réalisé à ce jour dans notre laboratoire mais en forte perspective pour les prochains mois). Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer une valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle). La mesure de la croissance tumorale se fera via une méthode non invasive de palpation ou à l’aide d’un caliper pour des volumes plus importants. Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. De plus, le fait de pouvoir congeler/décongeler des tumeurs issues de la biobanque et de pouvoir l’incrémenter avec des nouvelles tumeurs évite d’avoir toujours les tumeurs à amplifier dans les animaux pour les conserver, diminuant à terme le nombre d’animaux. Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience en expérimentation animale et principalement dans ces modèles, les publications scientifiques, 13 animaux seront utilisés par groupe expérimental car c’est le minimum requis pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence entre plusieurs groupes (tests paramétriques ou non-paramétriques selon la normalité des groupes).

Raffinement

En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée et administration d’antalgiques avant et après toute chirurgie. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type igloo, morceau de bois, carré de coton…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de symptômes pouvant aller jusqu’à un point limite (définition de points limites adaptés). Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères. Du fait de la perte de poids des animaux possible en fonction de certaines tumeurs, une alimentation humide type Diet gel sera ajoutée dans la cage de ces animaux si nécessaire. Si un animal présentait un symptôme pouvant amener à un point limite, il serait hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin, soigné et pris en charge en fonction de son état (isolement en dernier recours mais possible selon l’agressivité de ses congénères). Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Le modèle expérimental décrit dans ce projet est très bien décrit dans la littérature et nécessite l’utilisation d’animaux immuno-déprimés pour permettre la greffe d’un tissu étranger. L’espèce de référence pour les études en oncologie préclinique est la souris du fait de sa facilité d’utilisation et des nombreux modèles de souris immunodéprimées et humanisées produits. Nous utiliserons des souris jeunes (4-6 semaines à la livraison) pour faciliter la prise de greffe pour les primo-implantations et les tests d’efficacité de candidats médicaments. Pour les études d’immunothérapie, nous utiliserons des souris d’environ 14 semaines, lorsque le système immunitaire humain est bien reconstitué.

Anesthésiées pour recevoir des cellules cancéreuses directement dans la vessie, pesées jusqu'à une fois par jour, traitées jusqu'à trois fois par semaine, puis endormies à l'isoflurane trois fois par semaine pour un suivi de la tumeur en bioluminescence, 2 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent en plus une greffe sous la peau pour reproduire une situation métastatique, d'autres subissent des prélèvements de sang ou l'amputation de l'extrémité de la queue, la fréquence de ces gestes dépendant des demandes des clients. Le porteur indique que la croissance tumorale peut rendre les souris incapables d'uriner et de s'alimenter, et que les anesthésies répétées constituent en elles-mêmes une nuisance. Toutes sont tuées à la fin des études pour prélever leurs organes, le modèle ne permettant pas de les réutiliser.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer de nouveaux traitements pour les cancers de la vessie, dont les besoins sont non satisfaits, chez la souris dans des modèles orthotopiques (injection de cellules cancéreuses au site correspondant à celui de la tumeur d’origine). Pour ces modèles, des lignées cellulaires cancéreuses de la vessie soit d’origine murine (syngénique) soit d’origine humaine (xénogreffe) seront inoculées directement dans la vessie par administration intravésicale. En fonction des cellules injectées, des souris immunocompétentes, immunodéficientes ou humanisées pour le système immunitaire seront utilisées. Les études consistent à administrer le ou les composé(s) à potentiel thérapeutique à des souris porteuses de tumeur, puis à mesurer la croissance tumorale, les niveaux de biomarqueurs, les concentrations sanguines et/ou tissulaires du composé d’intérêt. Les mesure de concentrations du composé permettront d’établir un modèle entre la pharmacodynamie et pharmacocinétique du composé, indispensable pour la détermination des doses à utiliser dans les études d’efficacité, de toxicologie réglementaire et enfin de prédire les doses des phases de preuve de concept en développement clinique chez l’homme. Le suivi de croissance tumorale permettra d’évaluer l’efficacité du ou des composé(s). Celui-ci sera réalisé par imagerie non-invasive de bioluminescence sur animal anesthésié. Des prélèvements tissulaires post-mortem pourront être réalisés pour des analyses ex vivo complémentaires : histologiques, par cytométrie en flux… L’ajout de tumeur ectopique (injection des cellules par voie sous-cutanée) en plus d’une tumeur orthotopique (injection par voie intravésicale) pourra être utilisé pour tester l’efficacité de molécules anticancéreuses dans un contexte de tumeurs métastatiques ; aussi appelé modèle abscopal. L’effet abscopal est la régression de la lésion métastatique (ex : s.c.) après un traitement local de la tumeur primaire (i.e. vésicale). Le suivi de la croissance de la tumeur ectopique s’effectuera par mesure non-invasive par caliper.

Bénéfices attendus

Dans les pays développés, le cancer de la vessie est au 4ème rang par sa fréquence chez l’homme et 9ème chez la femme. En France, chaque année, plus de 11 000 nouveaux cas de cancer de la vessie sont diagnostiqués et les statistiques font état de 4 500 décès annuels. Le traitement du cancer de la vessie repose aujourd’hui principalement sur la chirurgie (exérèse partielle), une ablation totale de la vessie pouvant être pratiquée en cas de cancer infiltrant. La survie nette à 10 ans des patients atteints d’un cancer de la vessie est de l’ordre de 40%. Le taux de récurrence à 5 ans est entre 31 et 78%, ce qui souligne l’inefficacité des traitements actuels et la nécessité de développer de nouvelles thérapies. Les procédures qui constituent ce projet s’inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. A court terme, elles permettront de prédire l’efficacité de nouveaux candidats médicaments. A plus long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l’Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.

Procédures

Les gestes techniques concernant tous les animaux : • Inoculation des cellules cancéreuses dans la vessie (1 fois ; 15 min à 30min) sur l’animal anesthésié par injection intrapéritonéale d’un analgésique injectable • Pesées (maximum 1 fois par jour sur la durée du protocole ; 30 sec) sur animal vigile • Administration intrapéritonéale (maximum 3 fois par semaine sur la durée du protocole ; 30 sec) sur animal vigile • Suivi de la croissance tumorale par bioluminescence (maximum 3 fois par semaine sur la durée du protocole ; 15 min à 1h) sur animal anesthésié par inhalation d’isoflurane (3-4% pour l’induction et de 1-3% pour l’entretien) Les gestes techniques concernant tous les animaux ou en partie (dépendra des demandes clients) : • Prélèvements de sang (30 sec) : la fréquence dépendra là encore des demandes clients mais elle sera adaptée en fonction du volume prélevé en accord avec la consigne en vigueur. Les sites seront la veine submandibulaire sur animal anesthésié à l’isoflurane (3-4%) ou veine caudale, ou amputation unique de la queue (coupe < 2 mm sur l’extrémité non inervée de la queue) sur animal vigile. • Injection sous-cutanée de cellules cancéreuses (1 fois ; 1 min) sur animal anesthésié par inhalation d’isoflurane (3-4% pour la l’induction et de 1-3% pour l’entretien) • Mesure de la croissance tumorale au pied à coulisse (maximum 3 fois par semaine sur la durée du protocole ; 1 min) sur animal vigile • Administrations des composés à potentiel thérapeutique : la fréquence dépendra là encore des demandes clients mais elle sera en accord avec la consigne interne en vigueur. Les voies envisagées sur animal vigile seront les voies (30 sec) : per os, intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse via la veine caudale ou intramusculaire. Les voies possibles sur animal anesthésié par inhalation d’isoflurane (pour induction 3-4%, pour maintien 1-3%) seront intradermique (1 min), intraveineuse via le sinus rétro-orbital (30 sec) ou intravésicale (15 min à 1h).

Impact sur les animaux

Ces modèles peuvent engendrer une dégradation de l’état de santé de l’animal pouvant se traduire par une perte de poids, un comportement anormal (animal prostré, ne répondant pas aux stimuli) et/ou une altération des fonctions normales (impossibilité d’uriner et de s’alimenter). Ces effets apparaissent potentiellement au fur et à mesure de la croissance tumorale. Les effets indésirables possibles seront systématiquement demandés au client avant tout traitement pour les anticiper. Les animaux seront également soumis à des mesures de tumeur par bioluminesence post-administration des cellules tumorales/potentiels médicaments par voie intravésicale ce qui nécessite des anesthésies répétées. Ces anesthésies répétées peuvent constituer une nuisance notamment au travers de la contention de l’animal pour le placer dans la chambre à anesthésie ou pour l’administration de ketamine/xylazine.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des études afin notamment de prélever des organes d’intérêts qui feront l’objet d’analyses (ex : dosage de biomarqueurs, dosage des concentrations des composés à potentiel thérapeutiques …). Les modèles décrits ne permettent pas la réutilisation des animaux.

Remplacement

Principalement 2 approches sont utilisées pour mimer les événements biologiques associés aux processus de cancer : une approche in vitro, basée sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux de laboratoire, chez lesquels des cellules cancéreuses sont inoculées. Les modèles in vitro ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules antitumorales. De plus, à notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser la relation pharmacodynamique et pharmacocinétique dans un contexte tumoral. L’écosystème nécessaire pour la pharmacodynamie et la pharmacocinétique intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.

Réduction

Dans le modèle orthotopique, la croissance tumorale sera suivie au cours du temps par imagerie de bioluminescence. Dans le modèle sous-cutané, la croissance sera mesurée par caliper. L’utilisation de ces techniques non-invasives permet d’observer au cours du temps un seul animal simplement anesthésié (pour l’imagerie de bioluminescence), là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, d’une manière générale, les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex : un récepteur, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base principalement sur les données de la littérature complétés d'analyses de puissance statistique et des tests de détermination de la taille des groupes expérimentaux à l'aide de logiciels spécifiques, généralement basés sur des tests type test de Student bilatéral, afin que les nombres utilisés soient réduits au minimum nécessaire. Il est prévu environ 50 études (10 études par an) et 150 molécules testées au regard du nombre d’animaux utilisés. Chaque étude comportera en moyenne 5 groupes avec 10 animaux par groupe et 3 molécules à tester par étude.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux standards règlementaire de la directive n°2010/63/UE. Les locaux d’hébergement font l’objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d’hébergement et d’animaux sentinels. Les animaux seront groupés dans des cages contenant de l’enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Le nombre de manipulations liées à l’étude sur l’animal sera réduit au strict nécessaire ( ex : pesées, bioluminescence).Les procédures générant douleur, inconfort ou stress se feront systématiquement sous anesthésie.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. De nombreuses données sur les modèles orthotopiques de cancer de la vessie chez la souris existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références etc.). La souris est un modèle d’étude de choix car : 1/ sa petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo (ou plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie), et 2/ la disponibilité des souris immunodéficientes (nécessaires pour l’utilisation de cellules humaines). Le stade adulte est utilisé :les données de la littérature indiquent clairement que les rongeurs adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine du cancer.

Pour compléter une étude déjà menée, 30 souris vont être rendues neutropéniques par deux injections dans le ventre, infectées par Klebsiella pneumoniae, puis tuées deux heures plus tard afin de mesurer la charge bactérienne de leurs poumons et de leur rate. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré. L'infection passe par le nez, sous anesthésie brève, et le porteur la décrit comme un léger inconfort de quinze secondes. Il affirme que de nouvelles options thérapeutiques sont "indispensables" et que ces témoins supplémentaires sont "nécessaires" pour appuyer sa démarche auprès des acteurs publics de la santé.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer la charge bactérienne pulmonaire et splénique après 2h d’infection pulmonaire par des souches bactériennes résistantes chez la souris neutropénique. Ce projet est une étude complémentaire. En effet, dans ce modèle, différents traitements ont été testés et ont donnés des résultats très encourageants dans le traitement de ces infections. Cependant, des témoins supplémentaires sont nécessaires pour appuyer cette démarche auprès des acteurs publics de la santé.

Bénéfices attendus

Les pneumonies bactériennes dues à des espèces multi résistantes constituent un challenge pour les professionnels de santé. En effet, ces pathogènes bactériens deviennent de plus en plus difficiles à traiter en raison de leur capacité à produire des mécanismes de résistance. Ces bactéries résistantes sont de plus en plus communes dans les systèmes de santé nord-américains et européens et de nouvelles options thérapeutiques sont indispensables pour traiter ces infections. Ce projet s’inscrit dans la complémentarité d’une autre étude menée où un traitement antibactérien a montré une réelle efficacité contre ces infections et pourrait représenter une nouvelle ligne thérapeutique pour lutter contre ces infections. Le bénéfice de ce présent projet serait donc d’appuyer cette théorie en ajoutant comme données complémentaires la charge bactérienne pulmonaire et splénique réelle avant l’initiation des traitements (c’est-à-dire 2h après l’infection).

Procédures

Les souris recevront deux injections intrapéritonéales (de 5 secondes) à J-4 et J-1 avant infection. L’infection se fera par voie intranasale par l’injection de 50µL (2 secondes) à l’aide d’une pipette et sous une courte anesthésie volatile.

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue est l’injection intrapéritonéale pour l’immunodépression des souris. Ce geste entraine une légère douleur au moment de la piqure mais dure moins de 5 secondes et l’animal retrouve sa mobilité. Ce protocole est bien défini et n’entraine aucune autre nuisance. L’administration intranasale de la suspension bactérienne sera réalisée par du personnel compétent et expérimenté. Cette intervention entraine un léger inconfort de courte durée (temps d’infection 15 secondes).

Devenir

Tous les animaux (30) seront mis à mort 2h post infection afin de dénombrer la charge bactérienne présente dans les poumons et dans la rate.

Remplacement

A ce jour, le recours à des animaux est une étape obligatoire et règlementaire dans le développement de molécules à visée thérapeutique. En effet, Dernièrement, des études ont démontré une activité intéressante de cet antibiotique couplé à une molécule contre ces multi résistantes. La mesure de l’efficacité de cette combinaison ne peut se faire sans avoir recours au modèle animal ce d’autant que certains échecs de traitement ne peuvent être anticipés autrement.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude est de 10 souris par groupe ce qui permettra d’effectuer une analyse statistique fiable (estimation de la diminution de la charge bactérienne dans les poumons par une analyse statistique.

Raffinement

D’une façon générale pour l’ensemble de l’étude, la prise d’anti-inflammatoires est contre indiquée et risquerait même de faire flamber l’infection. L’infection sera réalisée sous anesthésie. Un programme d’enrichissement de l’environnement sera mis en place pour prévenir les comportements anormaux et problèmes de santé lié au stress de l’animal. Les animaux seront hébergés à 10 par cage. S’agissant d’une étude très courte (2h) aucun sepsis n’est attendu, et les souris seront surveillées tout au long de cette expérience.

Choix des espèces

Les souris CD1 représentent classiquement un des modèles de choix pour l’évaluation de la charge bactérienne. D’autre part, il s’agit de l’espèce utilisée dans l’étude précédente ayant montré des résultats encourageants. Souris de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel d’environ 20-22g (même poids que pour les précédentes études).

Le poids, le comportement et l'apparence des souris porteuses de tumeurs sont contrôlés chaque jour pour décider du moment de leur mise à mort. 4 011 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Un groupe de 2 100 subit une injection puis un unique prélèvement sanguin sous anesthésie terminale, un autre de 1 001 reçoit une incision du flanc, une greffe de cellules cancéreuses dans la glande mammaire, huit injections du produit testé puis, deux fois par semaine pendant quatre mois au plus, une injection de luciférine suivie d'un examen d'imagerie sous anesthésie. L'objet du projet est de comparer des nanoparticules ciblant HER2 selon leur taille et leur composition, et les souris chez qui la tumeur n'a pas pris sont tuées elles aussi, parce qu'elles ont reçu des cellules tumorales.

Objectifs

Le cancer du sein est le premier cancer chez la femme en France, dont 10 à 20% sont HER2 positifs (protéine exprimée à la surface des cellules positives). Cependant, des résistances aux traitements proposés actuellement se développent, et la toxicité systémique (toxicité qui affecte l’ensemble de l’organisme) des traitements existants reste problématique. Il reste donc indispensable de chercher de nouveaux traitements contre le cancer du sein. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de valider l’efficacité thérapeutique de nouvelles molécules associées à des nanoparticules ciblant HER2, réduisant les effets secondaires dans le traitement du cancer du sein. Nous espérons ainsi ouvrir de nouvelles pistes pour résoudre cette problématique de santé publique. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Menée à bien, cette étude devrait permettre de connaître la place des différentes nanoparticules dans l’arsenal thérapeutique actuel du cancer du sein. La comparaison des différentes nanoparticules ciblées devrait permettre de mieux comprendre l’influence de la taille et de la composition des nanoparticules sur le ciblage de la tumeur, et de montrer leur intérêt d’un point de vue pharmacocinétique. Cela montrera l’intérêt des nanoparticules pour réduire les toxicités associées aux traitements du cancer du sein humain grâce à l’amélioration de la pharmacocinétique par rapport aux chimiothérapies classiques.

Procédures

- Un groupe de 700 souris subira 1 injection du médicament sur animal vigile d’une durée de 10 secondes, puis 2 prélèvements sanguin à deux jours d’intervalle, sous anesthésie (durée : environ 30 secondes). Les souris subiront cette séquence d’une semaine sur 4 semaines (4 injections et 8 prélèvements au total). - Un groupe de 2100 souris subira 1 injection du médicament sur animal vigile d’une durée de 10 secondes, puis un prélèvement sanguin sous anesthésie terminale (sans réveil) (durée : 30 secondes). - Un groupe de 210 souris subira 2 injections de cellules cancéreuses (10 secondes chacunes) sur animal anesthésié, puis une injection du médicament (7 à 15 jours après) sur animal vigile d’une durée de 10 secondes ; puis sera observée à 7 temps différents par imagerie sous anesthésie (durée : 30 secondes) réparties sur 3 jours. - Un groupe de 1001 souris subira 1 incision sous anesthésie et analgésique (durée 10 secondes) suivie d’une injection de cellules cancéreuses dans la glande mamaire sous anesthésie et analgésique (durée 10 secondes), puis 10 à 20 jours plus tard, huit injections du médicament (10 secondes) sur animal vigile, et deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude (4 mois maximum), une injection de la luciférine (nécessaire à l’imagerie) sur animal vigile (durée 10 secondes) suivie de l’examen en imagerie (durée 1 min) sous anesthésie. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs. Les animaux concernés par l’étude de la dose maximale tolérée et de toxicité et de pharmacocinétiques seront réceptionnés, hébergés, injectés et sacrifiés dans l'EU1. Dans le cadre de l’étude de biodistribution ; la réception, hébergement, la greffe et la pousse tumorale se fera dans l'EU1, puis les animaux seront transférés dans l'EU2 pour l’injection des formulations et le suivis jusqu’à euthanasie. L’ensemble des animaux de l'étude d’efficacité thérapeutique sera réalisée dans l'EU2 (réception, hebergement, greffe/pousse tumorale, injection des formulations).

Impact sur les animaux

Il n’y a pas de nuisances attendues sur les souris saines autre que la toxicité éventuelle de la molécule à haute dose (perte de poids, perte de poils). Le poids, le comportement et l’apparence physique de la souris sera alors contrôlée quotidiennement pour l’euthanasier selon des points limites prédéfinis. Les nuisances attendues pour l’incision du flanc sont des douleurs au niveau de la zone incisée. Les nuisances attendues pour les souris porteuses de tumeurs sont la nuisance due à la tumeur : perte de poids, nécrose, etc. Le poids, le comportement et l’apparence physique de la souris sera alors contrôlée quotidiennement pour l’euthanasier selon des points limites prédéfinis. Après injection intraveineuse, des irritations au point d’injections peuvent apparaître et seront surveillés.

Devenir

Les souris sont prélevées post-mortem pour des analyses ultérieures, elles seront donc toutes mises à mort. Les souris dont la pousse tumorale n'a pas prise seront mises à mort car elles ont étés injectées avec des cellules tumorales.

Remplacement

Nous avons préalablement réalisé des études in vitro afin de remplacer en partie l’expérimentation in vivo autant que possible, mais à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. En effet, cette étude préclinique, visant à évaluer la pertinence clinique de l’utilisation des nanoparticules pour le traitement du cancer du sein nécessite obligatoirement l’utilisation d’animaux entiers pour déterminer la biodistribution des nanoparticules, leur pharmacocinétique et leur efficacité.

Réduction

Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus pour l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales lorsque cela était possible grâce au suivi par imagerie non invasive et non irradiante (croissance tumorale et biodistribution des formulations dans les modèles de souris porteuses du cancer du sein). Une étude préliminaire, avec un nombre restreint de groupes conditionnera la suite du projet, le nombre d’animaux annoncé est donc un nombre maximum.

Raffinement

Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Un analgésique sera localement appliqué sur les sites d’ouverture de la souris. Les souris seront observées quotidiennement et la croissance des tumeurs sera mesurée tous les 3 jours. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en portoir ventilés en groupe sociaux selon les normes en vigueur avec des conditions d’hébergement et d’enrichissement de leur environnement conformes à la validation de la structure du bien-être animale. Pour le transport des animaux, ces derniers seront installés dans des boites spécifiques assurant leur confort et leur sécurité (isolation thermique, filtre sanitaire, chaufferette) pour un temps de transport estimé entre 5 à 10 minutes. Une période d’acclimatation de 12 à 24h minimum sera observée suite à leur transferts.

Choix des espèces

La raison la plus importante du choix des souris pour nos études est leur similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. La plupart des antécédents génomiques de la souris sont similaire à ceux de l’homme (env. 95%), ce qui rend les souris particulièrement utiles pour la recherche sur les maladies humaines. Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 6-8 semaines, âge adulte de manière à avoir un poids corporel plutôt stable d’environ 20g.

Une constriction du nerf sciatique sous anesthésie, une injection d'adjuvant de Freund dans le coussinet plantaire, des plaques à 4 et à 55 degrés, huit séries de filaments de von Frey : les procédures de ce projet consistent à provoquer de la douleur puis à la mesurer. 342 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyses cellulaires et moléculaires. Le porteur indique que l'injection dans la patte peut entraîner des douleurs modérées et persistantes, des difficultés à se mouvoir et des automutilations, et que la chirurgie s'accompagne de risques de destruction des sutures, de cannibalisme et de décès au réveil. Le niveau de souffrance déclaré reste modéré pour l'ensemble, alors que le protocole retient la constriction du nerf sciatique comme le modèle admis des douleurs neuropathiques chroniques chez l'être humain.

Objectifs

Le projet vise à établir le rôle des lymphocytes T régulateurs (Treg) dans la perception de la douleur chez la souris. Les Treg sont des cellules supprimant la réponse immunitaire. Ils sont donc bénéifiques dans les maladies auto immunes mais nuisibles dans le cancer. Notre hypothèse est que les lymphocytes T régulateurs masquent la douleur directement de par leur capacité à sécréter des analgésiques naturels. Nous utiliserons des lignées de souris mutantes et des tests de sensibilité à la douleur dans différentes conditions inflammatoires et non inflammatoires. Nous évaluerons particulièrement la douleur ressentie dans un modèle de cancer, dans un modèle de chimiothérapie et dans un modèle inflammatoire induit. Nous évaluerons aussi le rôle des Treg dans la douleur dans un modèle de chirurgie du nerf sciatique, le modèle communément admis de douleurs neuropathiques chroniques chez l'homme. Nous mesurerons l'intensité de la douleur percue par stimulation mécanique ou par des observations comportementales. L'ensemble des résultats de ce projet permettra de proposer un nouveau mécanisme de régulation de la douleur chez la souris avec de possibles implications cliniques chez l'homme.

Bénéfices attendus

Les patients atteints de cancer et traités par chimiothérapie souffrent souvent d'une sensibilité thermique altérée. Notre projet va permettre de préciser les mécanismes associés afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales sur animal vigile, nécessaire à l’induction des modèles génétiquement modifiés à raison de cinq injections à un jour d'intervalle (moins d’une minute/injection). Une première partie des animaux seront impliqués dans une injection unique dans le coussinet plantaire effectuée sous anesthésie générale gazeuse (environ 5 minutes). Une deuxième partie des animaux seront soumis à une injection sous-cutanée de cellules tumorales effectuée sous anesthésie gé nérale gazeuse (environ 5 minutes). Une troisième partie des animaux seront impliqués dans une unique chirurgie de constriction du nerf sciatique ischio-jambier (environ 30 minutes) effectuée sous anesthésie et analgésie pré et post-opératoire. La sensibilité à la douleur sera mesurée à l’aide d'un test de référence (filaments Von Frey) à raison de 8 mesures de 3 à 9 jours d'intervalles (environ 60 minutes). Enfin, une quatrième partie des animaux seront impliqués dans une injection unique voie intrapéritonéale d’une molécule d’intérêt (environ 1 minute) et la sensibilité́ thermique sera mesurée à l’aide de test de référence en exposant les animaux sur une courte durée sur un plaque au froid (4 degrés) et au chaud (55 degrés) et en mesure le temps de retrait (maximum 1 minute/animal). Ce test sera effectué 4 fois avant et après l’induction du modèle génétiquement modifié. A l’issue de ces actes, l’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en vue des prélèvements et des analyses nécessaires pour répondre à la question scientifique.

Impact sur les animaux

Les injections intra péritonéales entrainent une douleur légère et brève, L'injection d'adjuvant complet de Freund dans la patte est susceptible d'entrainer douleurs modérées mais persistantes, difficultés à se mouvoir et auto-mutilations. Les animaux sont opérés avec une chirurgie invasive, entrainant une douleur modérée. Il existe des risques infectieux suite à la chirugie. Le comportement des souris peut être altéré suite à l'anesthésie et à la chirurgie. Des comportements aggressifs peuvent apparaitre avec destructions de sutures et cannibalisme. L'anesthésie en tant que telle présente des risques tels que hypothermie, difficultés respiratoires pouvant aller jusqu'à l'arrêt cardiaque. Le réveil de l'anesthésie est une étape critique avec un risque certain de décès. La croissance des tumeurs en sous cutanée pourrait entrainer douleurs et perte de poids liées soit à la croissance de la tumeur localement, soit à la dissémination métastatique de la tumeur. Les tests thermiques peuvent entrainer une douleur légère à modérée, objet de l'étude.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour analyses cellulaires et moléculaires complémentaires.

Remplacement

Selon la définition de la Douleur par l'Association Internationale de l'Etude de la douleur (1979), " La douleur est une expérience sensorielle et émotionnelle désagréable, associée à un dommage tissulaire présent ou potentiel, ou décrite en terme d'un tel dommage. ", on perçoit le caractère pluridimensionnel et plurifactoriel de la notion de douleur. Au regard de notre thématique faisant appel à des mesures de variation de la nociception, il nous est par conséquent impossible de palier à l’utilisation d’animaux vivants (anesthésiés ou vigiles). Notre projet est basé sur la perception de la douleur chez l'animal sans possibilité de remplacement par des expérimentations in vitro, la douleur n'étant pas quantifiable par des paramètres biochimiques connus.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum (342) sans compromettre la validité statistique des analyses des résultats. Après calculs, nous avons établi que 6 animaux par groupe dans 3 expériences indépendantes assurait la fiabiité statistique des résultats. Une approche de réduction du nombre d’animaux utilisés est aussi de réaliser les expériences sur les deux lignées de souris génétiquement modifiées en même temps afin de les comparer au même groupe témoin.

Raffinement

L’état général des animaux sera suivi de manière journalière par le personnel qualifié de l'animalerie ou par les membres habilités de l'équipe. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en oeuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu sera enrichi avec du carton pour permettre aux souris de faire un nid. Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. Les animaux reçoivent nourriture et eau en quantité non limité. Les animaux provenant de l'extérieur seront acclimatés une semaine avant leur inclusion dans les protocoles. Les animaux sont anesthésiés durant les procédures pouvant engendrer de la souffrance. Les animaux entrant dans le cadre d’une chirurgie seront traités avec des analgésiques/anti-inflammatoires avant et après la chirurgie.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les espèces animales utilisées depuis de nombreuses années pour ce type d’étude. La souris représente un très bon modèle pour réaliser des expériences de comportement, des études de neuroanatomie, de physiologie et de biologie cellulaire et moléculaire. En outre le choix des rongeurs dans les études portant sur la douleur est admis depuis de nombreuses années et les modèles expérimentaux de douleurs chroniques sont bien caractérisés tant du point de vue des études comportementales que des analyses cellulaires ou moléculaires. La disponiblité de souris génétiquement manipulées pour les gènes d'intérêt rend aussi l'utilisation de cette espèce indispensable à la réalisation de ce projet. Dans ce projet 3 lignées différentes de souris génétiquement modifiées seront utilisées. Ces animaux sont issus d'élevage réalisés dans notre animalerie. Des souris de 8 à 12 semaines d'âge seront utilisées pour travailler avec un système immunitaire mature. De plus, des souris adultes résistent mieux à l'anesthésie, ce qui garantit un réveil rapide et sans séquelles.