Souris

Des souriceaux de vingt et un jours sont gavés d'antibiotiques trois jours de suite, mis à jeun six heures, gavés de glucose, incisés à la queue puis saignés huit fois. 100 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 40 nourries cinq semaines d'un régime pauvre en protéines. Chacune est aussi anesthésiée chaque semaine, cinq semaines durant, pour que sa taille soit mesurée. Le porteur répète que le régime "n'induit pas de sensation de faim ni de phénotype délétère" et que les antibiotiques "ne devraient pas avoir d'effet sur le bien-être", pour un protocole qu'il classe lui-même en souffrance modérée.

Objectifs

La malnutrition infantile est un problème majeur à travers le monde. Des études ont montré que le microbiote (ensemble des micro organismes vivant dans un environnement spécifique chez un hôte) des individus mal nourris était sévèrement impacté. Il est également observé une différence de réponse au régime pauvre en protéines en fonction du sexe, avec des bactéries n’apparaissant que chez les femelles. De plus, ces variations étaient reliées à des variations du métabolisme e chez les souris, ainsi qu’une variation de l’apparition de la puberté. Cela incite donc à explorer de façon détaillée l’effet du microbiote sur le métabolisme et la maturation sexuelle afin de déterminer si celui-ci peut expliquer les différences observées entre les sexes. En utilisant un modèle murin de malnutrition protéique, permettant d’étudier la communication inter-organes, l'objectif de ce projet est de caractériser finement le métabolisme et la maturation sexuelle de souris subissant une ablation partielle du microbiote intestinal par un traitement antibiotique

Bénéfices attendus

Les altérations métaboliques induites pas la malnutrition dans un contexte juvénile sont encore mal connues, de même que le rôle précis du microbiote intestinal dans les altérations physiologiques associées. Ce projet permettra d’identifier les modifications précises qui s’opèrent lors d’un régime métaboliquement délétère et d’évaluer le rôle potentiel du microbiote intestinal, qui sera déplété par un traitement antibiotique. Nous pourrons ainsi identifier au cours du projet de futures cibles thérapeutiques permettant d’optimiser à long terme la prise en charge des enfants souffrant de malnutrition au travers d’un traitement adapté basé sur la nutrition et le microbiote.

Procédures

40 souris seront soumises à un régime nutritionnel pauvre en protéines pendant 5 semaines au maximum. Ce régime n’induit pas de sensation de faim (isocalorique d’un régime contrôle) ni de phénotype délétère. 100 souris auront leur taille mesurée toutes les semaines, pendant 5 semaines, sous anesthésie générale. 100 souris seront pesées chaque semaine, pendant 5 semaines, ce qui prend moins d’une minute. 50 souris seront gavées avec de l’eau (souris contrôles) à P21, P22 et P23, suite à une contention. Ce geste dure environ 10 secondes. 50 souris seront gavées avec un cocktail antibiotique à P21, P22 et P23, suite à une contention. Ce geste dure environ 10 secondes. Les antibiotiques ne devraient pas avoir d’effet sur le bien-être des souris. 50 souris auront des antibiotiques de façon continue dans l’eau de boisson, de P24 à P56. Les antibiotiques ne devraient pas avoir d’effet sur le bien-être des souris. 80 souris seront mises à jeun pendant 6 heures. 80 souris seront gavées avec du glucose après les 6 heures de jeûne, suite à une contention. Ce geste dure environ 10 secondes. 80 souris auront une incision sous anesthésie locale à la queue. Ce geste dure environ 1 seconde. 80 souris subiront 7 prélèvements à la queue d’environ 3 µL de sang. Ce geste dure environ 5 secondes. 80 souris subiront un prélèvement additionnel à la queue d’environ 20 µL par prélèvement pour mesurer l’insulinémie. Ce geste dure environ une minute.

Impact sur les animaux

Ce projet ne devrait entraîner que des nuisances modérées sur les animaux. Le gavage des animaux ne devrait entraîner qu’un léger stress lié à la contention et un inconfort mineur lors du gavage. Le marquage des animaux à la patte et la mesure de la taille des animaux de (du jour 21 post natal au jour 56) n’induiront qu’un léger stress lors de l’induction de l’anesthésie. Les pesées et la caractérisation de la maturation sexuelle induiront un léger stress associé à la contention de l’animal. Le traitement antibiotique dans l’eau de boisson a été utilisé dans la littérature et n’engendre ni perte de poids ou d’appétit, ni diarrhées. Le jeûne de 6 heures induit un stress léger sur la souris. Le test de tolérance au glucose induira un stress modéré lié à la contention et au gavage des souris, puis à l’incision d’un bout de queue d’environ 1 mm et au prélèvement de gouttes de sang au niveau de la queue

Devenir

L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d'intérêt.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires et d’une bactérie probiotique, ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier dans un contexte de malnutrition et pour l'étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C'est pourquoi cette étude nécessite l'expérimentation animale. La souris sera utilisée car il s'agit d'un bon modèle pour étudier les modifications induites par une malnutrition protéique sur le métabolisme dans un contexte physiologique, ainsi que les conséquences locales et systémiques de ces modifications.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle des paramètres étudiés. Chaque groupe expérimental contient 10 animaux. Des tests statistiques appropriés seront utilisés. Dans une optique de réduction, nous allons prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser (muscle, tissu adipeux par exemple) mais sur lesquels nous n’avons pas prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures. Notre protocole expérimental utilisera des souris issues d’une reproduction chez un fournisseur agréé. Le choix d’utiliser des souris issues d’un fournisseur nous permettra de mieux contrôler certains paramètres liés à l’âge et à la croissance juvénile afin d’assurer une analyse pertinente et un résultat statistiquement significatif. Les mères pourront être réutilisées pour d’autres procédures.

Raffinement

La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine grâce à une anesthésie légère. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. Des points limites suffisamment prédictifs seront établis pour anticiper tout stress et toute souffrance animale. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental, ainsi que le prélèvement en veine porte avant mise à mort ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale. Le prélèvement terminal est réalisé sous anesthésie générale, avec une analgésie appropriée. Le traitement antibiotique a été décrit dans la littérature et n’entraîne pas de modification du bien-être animal.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet d'un antibiotique dans une étude nutritionnelle. L'objectif du projet est d'étudier les effets d’une déplétion du microbiote sur le métabolisme et la puberté pendant la période juvénile. Pour cela, les animaux doivent être inclus dans la procédure dès le sevrage, qui est une période clé pour la croissance, la maturation sexuelle et la maturation métabolique.

Quatorze jours d'injections sous-cutanées quotidiennes pour reproduire des symptômes de schizophrénie, et un libre accès à l'alcool dès l'âge de quatre semaines : 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent d'abord une puce sous la peau sous anesthésie, puis passent des tests de locomotion, d'anxiété, de mémoire de travail et d'interaction sociale. Le produit injecté leur provoque une hyperlocomotion, des troubles sociaux et des troubles de mémoire, présentés comme la reproduction des symptômes vécus par les patients. 96 souris sont tuées par chirurgie terminale pour prélèvement d'organes, tandis que 24 autres, utilisées comme "souris attractives" pendant les tests sociaux, partent vers un autre projet.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'impact de la consommation volontaire d’alcool à l’adolescence sur la symptomatologie (symptômes de type positif et négatif, symptômes cognitifs) dans un modèle pharmacologique de schizophrénie (administration subchronique de PCP) chez des souris mâles et femelles C57Bl/6. En effet, il existe une prévalence élevée de patients atteints de schizophrénie qui présentent un trouble de la consommation d'alcool. Les consommations d'alcool sont fréquentes à l'adolescence aussi bien dans la population générale que chez les sujets qui risquent de présenter la maladie. Nous chercherons donc à étudier le rôle de ces expositions précoces d'alcool sur les comportements des modèles animaux de la schizophrénie. L’objectif secondaire sera d’étudier une éventuelle consommation exagérée d’alcool à l’âge adulte des modèles animaux de la schizophrénie.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet devrait permettre d’une part, une meilleure compréhension de la comorbidité entre trouble de l’usage d’alcool -schizophrénie, et d’autre part de valider un modèle robuste et reproductif de ce type de comorbidité qui permettra par la suite d’identifier des stratégies thérapeutiques de traitement dans ce domaine.

Procédures

Afin de pouvoir être facilement identifiables, les animaux auront une puce électronique (1,4 mm x 8 mm) implantée en sous-cutanée à l’aide d’un système miniaturisé de micro-injecteur stérile sous anesthésie (durée de la procédure : 5 minutes). Les animaux seront soumis à un traitement chronique par voie sous-cutanée chaque jour pendant 14 jours. Chaque injection nécessite une contention de l’animal et prendra environ 1 minute par souris. Les animaux vont effectuer plusieurs tests comportementaux afin tout d’abord de mesurer de l’activité locomotrice/exploratrice et du comportement de type anxieux (1 session de 10 minutes), puis de mesurer les performances de mémoire de travail (1 session de 5 minutes) et enfin de mesurer les intéractions sociales (1 session de 5 minutes suivie de 2 sessions de 10 minutes). Pour finir, les animaux subiront une procédure sans réveil sous anesthésie et analgésie en vue de prélèvement d’organes (durée de la procédure : 10 minutes).

Impact sur les animaux

Durant deux périodes, les animaux auront à leur disposition un libre choix entre eau et alcool (nuisance légère). Les autres nuisances attendues sur les animaux sont tout d’abord liées au modèle de schizophrénie choisi. Il s’agit d’un modèle pharmacologique basé sur un traitement chronique par voie sous-cutanée chaque jour durant 14 jours (nuisance modérée). Outre les aspects stressants des injections quotidiennes, ces administrations induisent des modifications comportementales qui miment certains symptômes rencontrés dans la schizophrénie (hyperlocomotion, troubles sociaux, troubles de mémoire, etc.). A la fin de l’étude comportementale, les animaux seront mis à mort par une chirurgie terminale (procédure sans réveil).

Devenir

Les 96 animaux réalisants les tests comportementaux seront mis à mort alors que les 24 souris servant de souris attractives lors du test des interactions sociales seront réutilisées pour un autre projet.

Remplacement

Le projet présenté ici concerne une pathologie psychiatrique très complexe mettant en jeu de multiples facteurs liés au fonctionnement du cerveau. Ces facteurs qui ne sont pas tous connus, ni maitrisés nécessitent d’utiliser des animaux vivants et entiers. De plus, les aspects comportementaux qui seront étudiés et qui miment les symptômes très invalidants que vivent les patients, ne peuvent à l’heure actuelle pas être modélisés d’une autre manière.

Réduction

L’étude sera réalisée en parallèle chez des souris mâles et femelles. Pour ailleurs, nous utiliserons une seule cohorte d’animaux pour toute l’expérience afin de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. Les animaux seront suivis de façon longitudinale et réaliseront toute l’expérience. Un total de 120 souris sera nécessaire pour cette étude (48 femelles et 48 mâles pour les tests et 12 mâles et 12 femelles comme souris attractives lors du test des interactions sociales), nombre permettant d’obtenir une puissance des analyses statistiques suffisante.

Raffinement

Diverses mesures seront prises pour raffiner les expérimentations qui ne seront réalisés que par du personnel formé et ayant un livret de compétences à jour. Après leur arrivée au laboratoire, une période d’acclimatation de 5 jours (cycle inversé) est effectuée où les animaux seront stabulés par groupe de 6 souris (mâles et femelles séparés), avec un enrichissement de la cage d’hébergement (maisonnette, papier kraft, tunnel et bâtonnet en bois). Durant cette période, ils seront manipulés (5 min par jour) et pesés quotidiennement. A leur arrivée au laboratoire et en tenant compte de leur jeune âge (3 semaines), des coupelles de croquettes humides seront mises à disposition des animaux. Ceci sera prolongé jusqu’à 2 jours après le puçage (période de récupération de l’anesthésie). Le puçage est fait 5 jours après leur arrivée sous anesthésie gazeuse et sur couverture chauffante. Une semaine après leur arrivée, les souris seront hébergées par 12 dans des cages intelligentes, pendant 16 jours (2 jours d’adaptation puis exposition choix eau/alcool), puis replacées dans les cages classiques pendant 6 semaines puis de nouveau hébergées pendant 3 semaines dans les cages intelligentes (accès intermittent à l’alcool). L’intérêt de l’utilisation des cages intelligentes est en particulier d’éviter l’isolement des animaux durant les périodes d’exposition à l’alcool et donc de minimiser le stress induit par cet isolement, tout en pouvant contrôler leur consommation individuelle (mesure du nombre de « licks » de chaque biberon). Les animaux seront pesés deux fois par semaine (suivi de poids individuel). Si, au cours de ce projet, des animaux ont des difficultés à s’alimenter (aucune difficulté observée dans de précédents protocoles), nous adapterons l’alimentation par l’ajout de gelée alimentaire. L’utilisation d’anesthésique volatil sera effectuée pour chaque mise à mort et un analgésique puissant sera également utilisé afin de réduire la douleur lors de la procédure de perfusion.

Choix des espèces

L’espèce choisie est la souris (mus musculus). Il s’agit, comme le rat, d’un animal sur lequel ont été mis au point des modèles de schizophrénie très utiles à la recherche des dysfonctionnements cérébraux liés à cette pathologie. La souris est une espèce plus facile que le rat à maintenir, en termes de coût et de place. Son comportement est bien connu et détaillé dans la littérature et sa proximité génétique avec l’espèce humaine permet d’accéder à des mécanismes cérébraux communs et à des fonctions cognitives et des comportements en beaucoup de points similaires et mesurables (mémoire à court et à long terme, sociabilité, activité spontanée). Par ailleurs, les cibles pharmacologiques des traitements sont similaires chez l’homme et la souris (récepteurs NMDA pour la PCP). Les animaux seront utilisés à l’âge adolescent (ou jeune adulte) (arrivée au laboratoire à l’âge de 3 semaines et début de l’exposition volontaire à l’âge de 4 semaines) car l’étude vise à étudier l’effet de l’exposition à l’alcool au stade de l’adolescence. L’étude longitudinale se poursuivra jusqu’à l’âge de 18 semaines. Les souris stimuli seront âgées de 6 semaines au moment des tests de sociabilité et reconnaisssance sociale sur la base de données bibliographiques.

Toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes, 3 900 souris vont être utilisées dans des travaux menés en prestation pour des laboratoires privés et publics, avec un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent du tamoxifène par gavage ou injection cinq à dix jours de suite, ou dans leur nourriture pendant un mois, puis un second composé dans l'eau de boisson qui leur provoque une inflammation aiguë de l'intestin, avec perte de poids et diarrhées. Le nombre, la durée et la voie d'administration des composés immunothérapeutiques sont fixés par le partenaire commercial. Ni analgésique ni anti-inflammatoire ne leur seront administrés, le porteur écrivant que cela biaiserait la réponse observée, et il justifie le recours aux souris par une évaluation à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Les différents laboratoires privés et publics pour lesquels nous réalisons des prestations cherchent à connaitre la fonction de gènes d’intérêts sur le système immunitaire en condition normale ou lors d’une inflammation intestinale et dans certain cas tester des traitements pour voir l’impact de ceux-ci sur le système immunitaire en condition normale ou lors d’une inflammation intestinale lorsque la fonction d’un gène est modifiée. En utilisant un système moléculaire inductible à un traitement appelé tamoxifène, nous pouvons réguler l’expression de gènes d’intérêt en les supprimant, ou en les augmentant (surexpression). En effet, ce système permet de contrôler l’expression de gènes dans le temps et l’espace ouvrant ainsi de nouvelles possibilités pour l’étude de la fonction des gènes. Ainsi, nous traiterons avec du tamoxifène des souris génétiquement modifiées pour lesquelles le gène d’intérêt est modulable et nous évaluerons l’effet de sa suppression ou surexpression sur le système immunitaire à l’état basal. Nous évaluerons aussi l’effet de la modulation de ce gène en condition pathologique où nous induirons une inflammation intestinale. Enfin nous évaluerons également l’impact d’un traitement sur le système immunitaire lorsqu’un gène est supprimé ou surexprimé en condition normale ou lors d’une inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Ce projet est mis en œuvre dans le cadre général de la validation de modèles animaux génétiquement modifiés pour des études précliniques in vivo. Il vise donc à évaluer de façon qualitative et quantitative l’impact de la régulation de gène d’intérêt par induction au tamoxifène et/ou l’impact d’un traitement immunothérapeutique en présence ou non d’une inflammation aigüe de l’intestin.

Procédures

La procédure expérimentale consiste en l’induction d’un gène cible, par administration d’un premier composé chimique, afin d’évaluer sa fonction sur le système immunitaire de la souris, dans les conditions ou non d’une inflammation aigüe de l’intestin qui sera elle induite par l’administration d’un second composé chimique 1) L’administration du 1er composé peut se faire de différentes manières en fonction du type de gène à moduler, du type cellulaire et/ou tissulaire ciblé et de la demande du partenaire et sur 5 jours minimum (sans jamais excéder 10 jours) par injection et gavage ou sur 1 mois maximum dans l’alimentation : -Par injection : sur souris vigile, la souris sera pesée puis une contention sera réalisée afin de réaliser l’injection (30 secondes par souris). Ou -Par gavage : sur souris vigile, la souris sera pesée puis une contention sera réalisée afin de pouvoir réaliser le gavage à l’aide d’une aiguille de gavage (30 secondes par souris) . Ou -Par alimentation : Les souris seront soumises à un régime alimentaire avec des croquettes au tamoxifène. 2) Des pesées hebdomadaires : sur souris vigiles (10 secondes par souris). Deux collectes de sang : sur souris vigile, une contention sera réalisée afin de pouvoir réaliser le prélèvement (30 secondes par souris). Dans le cas où nous devrons être dans les conditions d’une inflammation aigüe de l’intestin : 3) Suite à l’induction par le 1er composé, les souris seront traitées avec le second composé (sur une durée de 7 jours consécutifs). Le second composé est préparé dans de l’eau de boisson + des pesées quotidiennes sur souris vigiles (10 secondes par souris). Dans le cas où nous devrons traiter les individus avec un composé immunothérapeutique : 4) Les administrations des composés immunothérapeutiques (le nombre, la durée et la voie d’administration sera défini par le partenaire). Suivant la voie d’administration sélectionnée par le partenaire, celles-ci seront réalisés sur souris vigiles (30 secondes/souris) ou sur souris anesthésiées (anesthésie gazeuse courte : 1minute/souris).

Impact sur les animaux

Prérequis : Les tests de toxicité des composés immunothérapeutiques seront effectués en amont par les partenaires. Les doses injectées n'induiront donc aucun effet indésirable sur les animaux dans le cadre de ce projet. Les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress tel que : 1) Les administrations du composé n°1 soit par gavages oraux ou injections intrapéritonéales sur 5 jours consécutifs minimum (sans jamais excéder 10 jours) ; 2) Des pesées hebdomadaires ; 3) Deux prélèvements de sang (60 à 100μL), Une semaine d’écart entre les prélèvements sera impérativement respectée ; 4) En fonction du projet, un traitement par un second composé dans l’eau de boisson suite à l’administration du 1er composé afin de créer une inflammation aiguë de l’intestin pouvant amener à une perte de poids et des selles molles/diarrhées. 5) Injections de composés immunothérapeutiques par voie sous cutanée, intra péritonéale, intramusculaire, intraveineuse ou gavage.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de procéder au prélèvement des organes et à leur analyse.

Remplacement

Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, l’étude du système immunitaire et le modèle inflammatoire testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse.

Réduction

Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Le nombre utilisé pour ces expériences est de 6 animaux par génotype et par lot expérimental afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience.

Raffinement

Les animaux en expérimentation seront hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu sera enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un nid compact de lanières de papier Kraft. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et un temps d’acclimatation d’une semaine sera respecté entre la réception des animaux et le début du protocole expérimental. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel de zootechnie formé et qualifié et des points limites seront préalablement établis. En ce sens, une grille de score sera utilisée prenant en compte le comportement naturel et provoqué de l’animal, la variation pondérale et la caractérisation. Des points limites seront établis pour chaque observation (valeur maximale de la grille de score) qui entraineront la mise à mort de l’animal s’ils sont atteints. Dans ce projet nous étudions le système immunitaire, toute administration d’analgésique entrainerait un biais de la réponse cellulaire observée. Ainsi, nous ne pouvons pas utiliser d’analgésique. De plus, dans le cas de l’inflammation aigüe de l’intestin, nous étudierons l’impact de la surexpression ou délétion d’un gène dans la modulation d’une inflammation, aucun anti-inflammatoire ne pourra être administré aux souris.

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, la souris est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose de bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Nous utiliserons des souris adultes uniquement, à partir de 8 semaines pour une analyse du système immunitaire mature. L’étude d’un système immunitaire en développement ou vieillissant ne fait pas l’objet de ce projet.

Pour trier des souris entre résilientes et vulnérables à la dépression, 528 d'entre elles sont soumises huit semaines à des conditions d'hébergement rendues stressantes et imprévisibles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur état est mesuré par un test de désespoir, un test de motivation, un test d'anxiété et une mesure hebdomadaire de deux heures de leur consommation de sucre, censée révéler la perte de plaisir. Celles qui sont classées vulnérables reçoivent ensuite un antidépresseur en injection quotidienne pendant cinq semaines, avant que toutes soient tuées pour analyse métabolique et génomique. Le porteur chiffre le coût mondial de la dépression à 350 milliards de dollars par an et renvoie les retombées à des biomarqueurs qui restent à identifier.

Objectifs

La prévalence au cours de la vie (environ 20 %) et le fardeau économique (350 milliards de dollars par an) associés aux troubles de dépression majeure (TDM) en font l'une des maladies neuropsychiatriques les plus courantes et les plus débilitantes. Le diagnostic du TDM et des comportements suicidaires est subjectif et il manque des biomarqueurs quantitatifs pour une détection précoce et une évaluation à long terme. Sans ces biomarqueurs objectifs, le diagnostic, la surveillance et les ajustements thérapeutiques reposent exclusivement sur un examen clinique sous-optimal. L’accent mis sur l’utilisation du carburant cérébral comme différenciateur de la vulnérabilité et de la résilience au stress est un concept nouveau et original qui n’a pas été exploré de manière approfondie.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus peuvent conduire à une compréhension étendue et plus détaillée du métabolisme du cerveau et du corps normal et dysfonctionnel. L'étude a le potentiel d'identifier de nouvelles cibles innovantes pour promouvoir la résilience et améliorer le diagnostic, la surveillance et le traitement du TDM. L’étude des liens mécanistiques à travers les niveaux d’analyse (épigénome, métabolome, comportement) aidera à expliquer comment et quand des facteurs de stress spécifiques et divers conduisent à des changements durables dans le cerveau et produisent des déficits fonctionnels durables en matière de santé mentale liés au comportement. Nous allons rechercher ces changements qui contribuent au maintien de la santé ou des états pathologiques.

Procédures

Nous modifions les conditions d'hébergement stressantes sans que celles-ci puissent être anticipées. Les animaux peuvent alors engager 2 styles d'adaptation: la résilience ou la vulnérabilité au développement de troubles du comportement de type dépressif et anxieux que nous mesurerons par des tests de désespoir, de motivation et d'anxiété appliqué une seul fois sur une durée de 10 minutes au cours des 8 semaines de protocole. Le 1er objectif vise à sélectionner les sujets résilients ou vulnérables à la dépression. Le 2e objective vise à évaluer la stabilité du trait phénotypique avec ou sans traitement antidepresseur (injection quotidienne pendant 5 semaines). Le protocole débutera à l'age de 3 mois et durera 8 semaines. Dès la 3e semaines d'exposition les animaux seront triés en groupes de résilients et de vulnérables selon leurs scores de consommation de sucrose lors d'un test de mesure d'anhédonie (diminution de la capacité à ressentir le plaisir), pratiqué 1 fois sur 2 heures par semaine pendant 8 semaines. Des prélèvements sanguins (20 microlitres) sur deux minutes sont prévus à l'issu du 1er objectif (1 fois à la 3e semaine) et du 2e objectif (1 fois à la 8e semaine).

Impact sur les animaux

Stress léger chronique chez la souris Douleurs d’injection Douleurs de prélèvements de sang

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de vérifier la validité des interventions génétiques et phamarcologiques. Des échantillons seront prélevés pour permettre les analyses métaboliques et d'expression du génome qui differencieraient les individus résilients des vulnérables malgré leur exposition identique au stress chronique léger.

Remplacement

Les facteurs de stress sont hétérogènes et ne peuvent être réduits à une seule expérience. Un paradigme peut conduire à des réponses uniques chez différentes espèces. Par conséquent, il sera testé plusieurs modèles complémentaires avec des collaborateurs. Cette application concerne un modèle murin exclusivement. Une manipulation expérimentale rigoureuse est obligatoire étant donné que la réponse au stress peut varier en fonction du moment, de l'intensité, de la durée, de la chronicité, du contexte et des sexes biologiques. Les réponses des sujets sont à la fois dynamiques et multiformes, nécessitant des études longitudinales sur les mêmes sujets. La précision de la conception expérimentale nous a amenés à choisir le stress chronique léger (CMS) comme paradigme expérimental adapté aux rongeurs pour développer de nombreux styles d'adaptation (résistance et vulnérabilité) comme chez les êtres humains. Nous utiliserons la souris comme modèle, qui selon l’état de l’art peut résister ou être susceptibles aux conséquences néfastes liées au stress. Les autres collaborateurs impliqués dans ce projet étudient le rat, ou bien des souches murines sélectionnées pour leurs critères de résistance ou de vulnérabilité innés, ou bien des patients atteints de dépression majeure. Chaque centre utilise un modèle complémentaire pour interroger les mécanismes conservés entre espèces. Il n’est pas raisonnable d’utiliser des modèles alternatifs réducteurs in vitro pour étudier la relation physiologique entre le cerveau et le comportement des résilients et des vulnérables. Il n’existe pas de solution in vitro alternative conservant les systèmes de communication multicellulaires nécessaires pour ce projet. Nous étudierons des modèles génétiques murins caractérisés pour leurs similitudes génétiques et physiologiques aux corrélats de pathologies humaines.

Réduction

Une seule souche de souris sera utilisée ce qui limitera le nombre d'animaux à utiliser. Le nombre d'animaux utilisés sera réduit grâce à une approche longitudinale rationnelle et qui augmentera la puissance statistique des données collectées. Nous ne pouvons pas étudier un seul sexe puisque les différences entre les sexes sont associées à la physiopathologie de la depression et à la réponse au traitement.

Raffinement

Une grille de score des points limites adaptés est mise en place pour identifier quand raffiner. Un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance est établi pour déterminer quels individus sont concernés. L'administration d'analgésique permettra de corriger des douleurs éventuelles. La mise à mort en dernier recours serait effectué si le score des points limites venait à dépasser les critères de raffinement prérequis.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’un modèle animal présentant une grande similitude avec le cerveau humain en terme de structure, d’organisation et de connectivité. Un modèle mammifère semble donc être le plus adapté pour répondre à nos besoins. Les rongeurs ont été choisi à cause de leurs manipulations génétiques bien étudiées. De plus, les rongeurs ont déjà été utilisés comme modèle fiable et solide pour l'étude de conditions de vulnérabilité et de résilience au stress. Les processus que nous étudierons ne sont pas reproductibles à ce jour par des modèles in vitro ni par la modélisation in silico. La souris demeure le modèle de choix. Les souris seront âgées de 3 mois au début du protocole de stress qui durera pendant 8 semaines. Nous ciblons en particulier des jeunes adultes afin de comparer les résultats avec l'étude clinique chez l'homme conduites chez les patients dépressifs par notre collaborateur. Le même protocole de stress léger sera aussi appliqué par nos collaborateurs sur des espèces complémentaires.

Une souris qui perd 15 % de son poids, titube ou cesse de se toiletter deux jours d'affilée est retirée de l'étude et tuée par dislocation cervicale. 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie du crâne de quatre-vingt-dix minutes pour l'injection de vecteurs viraux dans deux populations de neurones, puis vit seule en cage pendant dix semaines et demie, avec six injections dans l'abdomen et deux semaines de mesure continue de sa prise alimentaire et de sa course. Le porteur compense cet isolement par sept carrés de cellulose et un morceau de bois, et renvoie les retombées à la compréhension de l'obésité et de l'anorexie chez l'être humain.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de comprendre comment les réseaux neuronaux participent à la balance énergétique et la motivation pour l'exercice. Pour cela, des souris transgéniques permettant de manipuler de façon concomitantes les deux sous-populations neuronales principales impliquées dans la motivation recevront des injections de vecteurs viraux permettant de manipuler spécifiquement l'activité de ces deux populations. Différents tests comportementaux permettront d'étudier la prise alimentaire exacte, la dépense énergétique et la motivation pour courir de chaque souris afin de mieux disséquer les mécanismes biologiques impliqués dans cette balance énergétique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d'identifier les mécanismes sous-jacents aux régulation métaboliques et de l'activité physique, dimensions altérées en particulier dans les troubles du comportement alimentaire tels que l'obésité ou l'anorexie.

Procédures

- Procédure chirurgicale (environ 90 minutes x 1 fois/ animal) - Isolement (environ 10.5 semaines) - Injections intrapéritonéales (1 injection/ jour x 6 fois, environ 3 secondes par injection)-Tests comportementaux: étude de la prise alimentaire et de l'activité locomotrice (2 semaines au total, 24h/24) et étude de la motivation pour l'activité physique (2 semaines au total, 1h/jour)

Impact sur les animaux

Les différents tests utilisés dans ce projet nécessitent de pouvoir étudier la prise alimentaire individuelle des souris. Celles-ci seront donc hébergées de manière individuelle dès l'âge de 8 semaines et ce jusqu'à la fin des procédures. Cette absence d'interaction sociale peut être une source de stress pour les animaux. La chirurgie stéréotaxique pour l'injection bilatérale de virus peut entrainer des risques de douleurs post opératoires ou d'infections. Ces douleurs devraient s'estomper dans les jours suivant la chirurgie grâce au traitement analgésique mis en place. Enfin, les injections intrapéritonéales durant la période dans les cages métaboliques ou durant les tests de ratio progressifs peuvent également entrainer une douleur. Afin de diminuer la gêne engendrée par ces injections, le côté de l'animal qui sera injecté sera interverti chaque jour. Les traitements médicamenteux, les injections intrapéritonéales, et produits utilisés (et les doses) sont bien contrôlés en laboratoire et tolérés par les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour procéder à des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico. De plus l'utilisation d'invertébrés, serait incompatible avec l'étude de la motivation pour une récompense telle que l'activité physique.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux à inclure sera de 12/groupe. Ce n d’animaux/groupe a été fixé (i) en utilisant des calculs de puissance nous permettant d’obtenir une différence significative pour les différentes variables d’intérêt qui seront évaluées dans l’étude et de rejeter une hypothèse nulle, et (ii) en se référant à des publications du domaine (iii) en prenant en compte la variabilité que nous retrouvons habituellement dans le comportement d'intérêt. Nous utiliserons 2 cohortes d'animaux (n=12/groupe/cohorte) afin de valider la reproductibilité des résultats et en prenant en compte que certains animaux pourraient ne pas apprendre la tache comportementale opérante (pourcentage de succès de 50-60%). Nous avons regroupé dans la mesure du possible différents tests comportementaux sur les mêmes lots de souris, et avons conçus nos expériences de manière à obtenir un maximum d'informations à partir des mêmes animaux.

Raffinement

Comme prévue par la Directive 2010/63/CE, un enrichissement du milieu (7 carrés de cellulose) ainsi qu’un morceau de bois à ronger seront utilisés pour réduire les stress des animaux lié à l'isolement que ce soit dans les cages métaboliques ou dans les cages d'hébergement des souris. Les souris seront manipulées grâce à un tunnel en carton (présent dans leur cage d'hébergement) afin de les déplacer dans les cages métabolique ou dans les chambres opérantes. En ce qui concerne la période pré et post-opératoire, les animaux recevront un traitement analgésique et suite à la chirurgie stéréotaxique, chaque animal est suivi quotidiennement (poids, prise alimentaire, aspect général) et une étiquette est accrochée au dos de sa carte de cage individuelle pour le personnel animalier, avec l’ensemble des informations concernant son suivi post-opératoire sur une semaine (médication, poids corporel, aspect général). La récupération des animaux est normalement totale après 1 semaine. Pour le point limite, nous le définissons par un état anormal constaté sur deux jours consécutifs (perte de poids de 15%/jour, ataxie, hypolocomotion, pelage non soigné). Si ce point est atteint, nous préviendrons immédiatement la vétérinaire de l’établissement afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (comme la poursuite du traitement analgésique). En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort par dislocation cervicale afin de lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

Ce projet nécessite l'utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement dans des modèles souris et permet la reproductibilité et la comparaison avec les résultats obtenus dans le laboratoire auparavant et avec la communauté scientifique plus large. Des modèles animaux moins évolués (par exemple: ver C. elegans ou poisson zèbre) ne peuvent convenir pour l'étude d'une récompense naturelle comme l'activité physique. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 8 semaines) qui se justifie par l'immaturité du système nerveux au cours de l'adolescence.

Nourries six mois d'un régime enrichi en sucres et en graisses, isolées quarante-huit heures en cage de calorimétrie puis vingt et une heures en cage d'actimétrie, 72 souris enchaînent rotarod, grip test, marche en équilibre sur planche à trous et open field de trente minutes. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et courent jusqu'à l'âge de dix-huit mois. Le porteur qualifie ces tests de non invasifs, tout en reconnaissant que le régime enrichi peut mener à une obésité et que l'isolement répété stresse les animaux. Toutes sont tuées à la fin, pour analyse histologique et moléculaire de leurs tissus.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier la locomotion et le métabolisme chez des souris qui semblent résistantes à la prise de poids. En effet, nous avons développé un modèle de souris avec une perte d’expression d’un gène spécifique, et à notre surprise ces animaux sont résistants à la prise de poids. Des analyses complémentaires montrent une masse musculaire normale mais une non-accumulation de la masse graisseuse dans ces animaux à l’âge d’un an. Nous souhaitons donc explorer plus en avant ce phénotype, notamment via des analyses longitudinales de la composition corporelle, du métabolisme, de l’activité locomotrice et de la calorimétrie de ces animaux, complété par des analyses sanguines, et ceci à la fois en diète normale ou enrichie en lipides. Nous espérons que cette approche nous permettra de mieux comprendre la résistance à la prise de poids dans ce modèle.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la locomotion et la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude de l’activité locomotrice et du métabolisme.

Procédures

1 – Les prélèvements sanguins requièrent moins d'une minute. 2 – L’analyse de la masse corporelle se fera par qNMR, qui est une analyse non-invasive d’une durée de 1 minute. 3 - L’analyse du métabolisme se fera par des tests de Calorimétrie indirecte, qui se déroulent dans des cages d’hébergement individuelles pendant 48 heures. 4 – De même, un test d'actimétrie réalisé aux âges de 6 et 12 mois nécessite de placer les souris dans des cages individuelles pour une durée de 21h. 5 – L’analyse de la locomotion des animaux se fera par une batterie de tests non invasifs réalisés sur une durée de 3 à 4 semaines selon un protocole classique : pour le rotarod, 3 tests de 5 min sont réalisés par souris ; le grip test et la marche en équilibre sur planche à trou sont aussi réalisés trois fois (environ 5 min) par souris et l’open field est un test de 30 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Nous souhaitons étudier le métabolisme et l’activité locomotrice chez des souris résistantes à la prise de poids, et ceci via des tests classiques et non invasifs. Nous souhaitons aussi analyser les paramètres biochimiques de ces souris et ceci via un prélèvement d’une faible quantité de sang. Ces analyses peuvent induire des contraintes décrites ci-dessous : -Une partie de l’étude du métabolisme se fait chez des animaux avec une diète enrichie en sucres et en lipides, ce type de régime peut conduire à la longue à une obésité avec ces problèmes associés (difficulté à se déplacer, etc.). Nous allons donc restreindre ce régime enrichi en sucres et en lipides à une période de 6 mois. - L’étude de l’actimétrie et l’étude du métabolisme nécessitent des tests se déroulant dans des cages d’hébergement individuelles, conduisant donc à un isolement des animaux pendant 21 heures (actimétrie) ou 48 heures (métabolisme). Toutefois ce test est de courte durée et une fois terminé, les animaux sont remis dans leurs cages d’origine avec les mêmes dispositions d’avant le test (les mêmes souris dans la même cage, et les cages sont gardées dans le même état qu’avant le début du test, et ceci afin que les animaux retrouvent leur environnement). - Concernant les prélèvements sanguins, ceux-ci peuvent entrainer un stress et/ou éventuellement à une légère douleur. Les animaux seront donc anesthésiés quelques minutes avant le prélèvement sanguin.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs tissus pour des analyses histopathologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris d’une maladie humaine génétique. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la locomotion et la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude de la locomotion et du métabolisme. Enfin, nous espérons que l’analyse de ce modèle murin permettra de mieux comprendre la faiblesse musculaire et la perte de poids de noter maladie d’intérêt.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents et l’étude de la littérature nous ont permis d’établir que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs, et compte tenu de notre projet d’analyser deux conditions (souris contrôle ou souris sans notre gène d’intérêt) sous deux types de nourriture (normale ou enrichie en lipide), nous estimons que l’étude de 72 animaux sur 3 ans est nécessaire.

Raffinement

Afin de limiter la prise de poids des animaux, le régime enrichi sera limité à 6 mois. De plus, les prélèvements sanguins à la veine temporale superficielle se feront sous anesthésie. Les point limites seront alors déterminés en fonction des observations faites d'une part pendant l'anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l'animal) et d'autre part pendant et après le prélèvement sanguin (changement du comportement : akinésie, prostration, paralysie, non réponses à des stimuli externes). L'anesthésie et la procédure de prélèvement seront arrêtés si ces points limites sont atteints. Enfin, les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Néanmoins, si des signes de douleur apparaissaient (réduction de l’appétit, diminution de la mobilité et du comportement exploratoire, tendance à l’isolement, poil terne et hérissé, dos voûté), nous ferons alors un traitement analgésique et anti-inflammatoire. De plus, de la nourriture gélifiée sera de plus mise à disposition de l'animal dans la cage dès les premiers signes de problème moteur pour palier tout risque de réduction de prise de nourriture. Toutefois, en cas de douleur forte (isolement, immobilité, automutilation, ca66chexie, etc.) et/ou d’échec des traitements précèdent ; les animaux seront euthanasiés rapidement pour éviter toute souffrance et l’expérience sera stoppée.

Choix des espèces

Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude du métabolisme. Nous allons étudier le métabolisme et l’activité locomotrice par des tests non invasifs sur 72 souris adultes, et ceci sur une période de 6 mois pour l'étude du métabolisme, à 18 mois pour l'étude de la locomotion, Ce protocole a été choisi d’après nos expériences précédentes et par l’étude de la littérature et ceci afin de reproduire l’aspect progressif de la perte de force et de la prise de poids des animaux.