Souris
Exploration du statut inflammatoire et du stress oxydant chez des souris ob/ob nourries avec des régimes supplémentés de lait contenant des bioactifs issus du colza
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Comparer des tourteaux de colza pour améliorer la qualité du lait de vache et la santé du bétail : 60 souris ob/ob, génétiquement obèses, sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent pendant cinq semaines des croquettes fabriquées à base de laits de vache lyophilisés, avec recueil d'urines et de fèces, puis sont mises à mort sous anesthésie pour prélever le sang cardiaque et les organes. Le porteur qualifie les méthodes de non invasives et affirme qu'aucune méthode de substitution in vitro ou in silico n'existe pour étudier l'effet de ces extraits sur l'inflammation et le stress oxydant. Les groupes comptent neuf animaux, six pour le témoin, et le bénéfice mis en avant reste la sélection de sources de choline pour la filière du colza et de l'alimentation du bétail.
Objectifs
L’objectif fondamental de ce projet est d’optimiser la qualité des tourteaux de colza pour améliorer la santé du bétail, la qualité du lait produit et la santé du consommateur humain. Par ailleurs, des études précédentes ont démontré que les plantes de la famille des Brassicacées comme le colza, ont des propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires importantes. Dans cette étude, nous chercherons à comparer le potentiel santé (antioxydant et anti-inflammatoire) de différents tourteaux de colza chez un modèle d’obésité génétique ob/ob caractérisé par stress oxydant et une inflammation élevée.
Bénéfices attendus
Dans cette étude, nous comparerons les effets santés de laits de vache ayant consommé différents tourteaux de colza, notamment leurs capacités à réduire l’inflammation et le stress oxydant chez un modèle de souris ob/ob. Pour cela, des marqueurs génétiques et biochimiques inflammatoires et du stress oxydant seront mesurés ainsi que les modifications métaboliques. En termes de bénéfices du projet, nous évaluerons les capacités d’un lait de vache contenant des bioactifs du colza pour améliorer le statut inflammatoire et le stress oxydant chez un modèle préclinique d'obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis à un nourrissage ad libitum aux différents régimes pendant 5 semaines, prélèvements d’urines et de fèces puis mise à mort et prélèvements de sang et d’organes.
Impact sur les animaux
Une nouvelle alimentation pourrait engendrer un stress chez l’animal. Une période d’acclimatation d’une semaine en début de la procédure sera réalisée afin d’habituer les souris au nouveau régime alimentaire (croquettes régimes fabriqués à base de laits de vache lyophilisés).
Devenir
Tous les animaux à l’issue de la procédure seront mis à mort pour le recueil du matériel biologique nécessaire aux analyses comprenant le sang cardiaque et les organes.
Remplacement
Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode de substitution in vitro ou in silico pour étudier l’impact des extraits bioactifs issus de l'alimentation sur l’inflammation et le stress oxydant.
Réduction
Le nombre d’animaux est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes. Notre expérience sur l’étude du statut inflammatoire et du stress oxydant chez des souris ob/ob nourries avec des régimes supplémentés de lait contenant des bioactifs issus du colza sera conduite sur des groupes de 9 animaux. En effet, notre experience avec les souris ob/ob montre qu’un minimum de 9 souris est nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les paramètres biologiques étudiés, à l'aide de tests statistiques appropriés. Des études similaires ont été conduites sur des groupes de 9 à 10 animaux. Nous chercherons à mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes au niveau des analyses biochimiques et métabolomiques à l'aide de méthodes statistiques appropriées. Un groupe de souris contrôle négatif nourries avec un régime AIN nous permettra de valider l’effet « matrice ». Ce groupe contrôle ne comportera que 6 animaux. Des points limites stricts et spécifiques seront appliqués.
Raffinement
Les méthodes utilisées sont non invasives. Les animaux sont hébergés en cage de 3. L’environnement sera enrichi par la présence d’un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Enfin, une anesthésie sera réalisée lors du prélèvement final.
Choix des espèces
La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les liens entre l’alimentation et les réponses anti-inflammatoires et anti-oxydantes. Le modèle ob/ob est une souche reconnue pour présenter une inflammation et un stress oxydant important. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l'achat et d'environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir des paramètres confondants tels que le vieillissement.
Evaluation préclinique d’un nouvel intracorps dans le traitement de la sclérose latérale amyotrophique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pesées à chaque manipulation, puçées sous anesthésie, testées jusqu'à deux fois par semaine sur leur fonction motrice et neuromusculaire, injectées chaque mois et exposées trois fois à des traceurs radioactifs pour une heure d'imagerie, les souris de ce projet développent en plus spontanément une paralysie progressive. 596 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit une atrophie musculaire, des troubles de la marche et une dysfonction intestinale responsable d'un décès prématuré, tout en ramenant les nuisances liées aux actes expérimentaux à des douleurs au point d'injection et à un stress de manipulation. Toutes seront mises à mort pour prélever différents tissus, la décision étant prise après 48 heures sans amélioration chez les souris qui montrent des signes de mal-être.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative caractérisée par une dégénérescence des neurones impliqués dans la motricité (motoneurones) et aboutissant à la mort dans les 2 à 5 ans suivant la détection des symptômes. Les mécanismes à l’origine de la maladie sont encore mal compris, et il n’y a aucun traitement efficace existant actuellement. Une caractéristique de la maladie est l’agrégation d’une protéine dans les motoneurones et les cellules gliales (cellules formant l’environnement des neurones). Donc, cibler ces agrégats et empêcher leur formation pourrait constituer une démarche thérapeutique d’intérêt. Nous avons récemment identifié un fragment d’anticorps (appelé intracorps) se fixant spécifiquement à la protéine concernée et qui présente des effets protecteurs in vitro. L’objectif de ce projet est d’évaluer ses effets in vivo dans un modèle murin de SLA. .
Bénéfices attendus
Pour la première fois, nous allons i) Apporter des données longitudinales sur ce modèle de SLA, utiles pour tout nouveau test de médicament et ii) Apporter des données sur les effets de l’intracorps.
Procédures
- Pesée lors de chaque manipulation (duree :
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques, modèle de sclérose latérale amyotrophique, développent spontanément un phénotype neurodégénératif, avec des symptômes moteurs, des troubles de la marche, une perte de poids et une atrophie musculaire. Ce modèle développe également une dysfonction intestinale responsable d’un décès prématuré, qu’il est possible de prévenir par la mise en place d’une alimentation gélifiée. Les nuisances attendues liées aux actes expérimentaux réalisés sur les animaux sont les suivantes : Injection du placebo ou de l’intracorps: douleur au point d’injection. Nuisances liées à l’imagerie: stress lié à la manipulation, douleur au point d’injection du traceur ou risque d’hématome . Prélèvements sanguins: douleur mandibulaire au point de prélèvement ou risque d’hématome si prélévement par veine caudale. Tests comportementaux: stress lié à la manipulation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser des analyses sur différents tissus prélevés.
Remplacement
Les modèles in vitro que nous utilisons pour nos projets sont inopérants dans une telle étude qui vise à étudier un organisme dans son ensemble. En revanche, l’intracorps a d’abord été testé dans des modèles cellulaires surexprimant la cible du médicament. Le candidat a démontré sa capacité à réduire l’aggrégation de la protéine dans ces modèles. Le candidat a fait l’objet d’un brevet sur sa séquence du fait de ses effets dans des modèles in vitro (publication en cours) et les essais pré-cliniques sont indispensables à la poursuite du développement du candidat.
Réduction
le nombre de groupe a été optimisé et le nombre d’animaux par groupe a été réduit à son maximum. De plus, l’utilisation de l’imagerie in vivo au cours du temps permet la réduction du nombre d’animaux utilisés. Huit groupes de 24 souris, soit 576 souris sur 5 ans + 20 souris d’entrainement seront utilisées dans le projet. Les effectifs ont été choisi sur la base d’une analyse bibliographique, de l’utilisation d’un test de puissance, de la prise en compte de la fragilité du modèle.
Raffinement
Les souris transgéniques développant des troubles de la dysfonction intestinale liés au développement de la maladie, de la nourriture gélifiée sera également mise à disposition dès le stade présymptomatique afin de prévenir l’apparition de ce symptôme. Les conditions d’élevage inclueront un enrichissement du milieu (papier absorbant, cabanes, et/ou tubes). Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. En cas de blessure, les animaux recevront un traitement analgésique jusqu’à la disparition des signes de douleur (Injection sous-cutanée d'un antidouleur ). La blessure est également désinfectée. Une surveillance accrue d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris montrant des signes de mal-être (hypothermie, prostration, etc...) et intervenir si nécessaire (injection sous-cutanée de solution saline à 37°C pour l’hydratation, nourriture appétente Des points limites sont appliqués : les animaux surveillés sont pesés et auscultés quotidiennement (hydratation, température, état de la blessure si blessures). Les points limites seront déterminés selon une grille de cotation. La décision de mise à mort est prise s’il n’y a pas d’amélioration dans les 48h. L’imagerie en tomographie d’émission de positons (TEP) est une méthode permettant de suivre l’évolution de la maladie sur un même sujet évitant ainsi l’évaluation par autopsie nécessitant des mises à mort à différents temps, ce qui constitue une mesure de réduction et de raffinement. Imagerie : Pendant 4 jours avant l’imagerie du radiotraceur, pour minimiser leurs stress, une habituation des animaux sera réalisée. Cette période d’habituation consiste pendant les 4 jours précédents l’imagerie à prendre l’animal en contention pour mimer l’injection du traceur en i.p., placer l’animal dans une cage maintenue à une température de 37°C pour une durée de 30 min, puis replacer l’animal dans sa cage. Le jour de l'imagerie l’induction d’anesthésie sera réalisée en gazeux et pendant les imageries les animaux seront maintenus à 1,8-2%. Une protection oculaire sera appliquée. L’animal sera maintenu durant toutes les expérimentations d’imagerie sur lit chauffant, le rythme respiratoire et la température corporelle seront surveillés. Dès son réveil, l’animal sera remis dans sa cage d’hébergement.
Choix des espèces
Il y a peu d’animaux modèle de la SLA, seul le modéle de souris transgénique possède les caractéristiques recherchées pour notre projet. Les modèles in vitro que nous utilisons pour d’autres projets sont inopérants pour notre étude qui vise à étudier un organisme dans son ensemble. Les souris seront reçues à leur 7ème semaine de vie. Ceci permettra de débuter le traitement avant le début d’apparition des symptômes de la SLA.
Analyse des anomalies de cellules du cerveau dans un modèle de lésions cérébrales induites par la naissance prématurée chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Injectés d'interleukine 1 bêta pendant leurs cinq premiers jours de vie pour provoquer une inflammation cérébrale, des souriceaux peuvent en mourir dans 5 à 10 % des cas. 3 508 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements de cerveau. Le projet teste un traitement donné au sevrage pour éliminer les cellules microgliales, puis évalue à 2 mois la mémoire par un test de peur qui associe une sonnerie à trois chocs électriques à la patte, et le comportement social par le choix entre un congénère inconnu et un objet. Une partie des souris subit à 45 jours une incision de la peau du crâne et une perforation de l'os pour l'injection d'un produit qui lèse le cerveau, opération qui peut entraîner, dans 10 % des cas, des infections, des troubles de la conscience persistants ou des troubles moteurs. Le porteur retient des souris blanches pour la taille des portées et les "qualités maternelles" des mères, censées limiter le stress des souriceaux injectés sans anesthésie.
Objectifs
La prématurité est la première cause de mortalité et de handicap chez les enfants de moins de 5 ans. Un lien causal entre infection maternelle et naissance prématurée a été mis en évidence. En effet, une réaction inflammatoire chez le fœtus peut entrainer une inflammation cérébrale et par conséquent, des lésions cérébrales connues sous le nom d’encéphalopathie du prématuré. Ces lésions favorisent ensuite l’apparition de troubles du développement neurologique, en particulier les troubles du spectre autistique. Parmi les acteurs clés de l'inflammation cérébrale, on retrouve les cellules microgliales ou microglies, cellules immunitaires résidentes du cerveau. La morphologie et les fonctions des microglies sont altérées lors d’un stimulus inflammatoire précoce, conduisant notamment à des altérations moléculaires et comportementales (diminution du comportement social) caractéristiques des troubles du développement neurologique. De plus, il a été montré dans des modèles animaux associant une inflammation néonatale à une deuxième agression cérébrale, cette fois à l’âge adulte, un phénomène de sensibilisation, aggravant l’intensité de cette 2ème agression. Le remplacement spontané de ces cellules microgliales altérée par de nouvelles cellules, après leur élimination par un traitement médicamenteux (que l'on nomme recolonisation microgliale), pourrait contribuer à la correction de certaines de ces anomalies dont le rétablissement de la maturité des neurones et du comportement social. Les objectifs de cette étude sont donc d’abord de préciser les conséquences de cette inflammation précoce sur la mise en place des structures cérébrales et le comportement chez les adultes des deux sexes, de déterminer le potentiel de ce traitement quant à la correction de ces troubles neurologiques, et ensuite d’étudier le rôle des cellules microgliales dans la sensibilisation à une 2ème agression à l’âge adulte, et de déterminer le potentiel thérapeutique de la recolonisation microgliale dans ce contexte.
Bénéfices attendus
Grâce à ce modèle souris d’inflammation précoce, nous déterminerons pour la première fois l'efficacité de l’élimination de cellules microgliales cérébrales altérées et leur remplacement pour traiter les troubles du développement neurologique. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur la capacité de cette approche à être appliquée dans une stratégie médicale précise. De plus, nous déterminerons pour la première fois l'efficacité de la stratégie de renouvellement des microglies sur l’intensité des lésions cérébrales pouvant survenir à l’âge adulte dans ce modèle de trouble du neuro développement en fonction du sexe. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur la capacité de cette approche à être appliquée dans une stratégie médicale précise.
Procédures
Les injections réalisées sur les souriceaux d’une molécule inflammatoire connue, l'interleukine-1beta (IL-1β), durant les 5 premiers jours de vie peuvent causer une douleur transitoire et locale. La séparation de leur mère le temps des injections peut causer un stress transitoire. Le traitement testé sera ensuite administré dans l’alimentation au sevrage des animaux à la troisième semaine de vie et pendant 3 semaines. Les animaux seront soumis à deux tests afin d’évaluer leur mémoire et leur comportement social à 2 mois. Pour la mémoire, les animaux recevront un léger choc électrique suite à une sonnerie à 3 reprises. Deux jours plus tard, ils seront placés dans cet environnement et leur comportement de peur lors du retentissement de cette sonnerie, se traduisant par une immobilisation de l’animal, sera évalué. En termes de comportement social, les souris auront le choix d’interagir avec un nouvel animal ou avec un objet, une préférence pour l’interaction avec l’animal est attendue. L’interaction avec le nouvel animal devrait susciter l’intérêt et constituera le critère d’évaluation (reniflements, etc.). Des animaux seront aussi soumis, à 45 jours de vie, à une chirurgie pour injection intracranienne d'un produit créant une lésion du cerveau : sous anesthésie générale, la peau du crâne est incisé, une perforation de l'os du crâne est réalisée, puis le produit en question est injecté dans le cerveau. A l’issue de la chirurgie, les animaux seront maintenus vivant 5 jours avant euthanasie pour réalisation d’analyses. Enfin, des animaux subiront une chirurgie à 60 jours afin de mesurer l’activité neuronale dans différentes zones du cerveau. Pour cela, les animaux seront endormis et un antidouleur leur sera administré. L’imagerie est ensuite effectuée. L’animal est ensuite euthanasié.
Impact sur les animaux
Pour les souriceaux durant la première semaine de vie, les injections peuvent causer une douleur transitoire et locale. Les injections induisent une inflammation, par conséquent les souriceaux peuvent présenter des signes de déshydratation, ont un retard de croissance, et un retard dans la pousse du pelage par rapport aux souris contrôles. Ces effets perdurent environ 2 semaines. Les injections peuvent également, mais rarement, entraîner une hémorragie interne dans l’abdomen, ou leur mort dans 5 à 10% des cas. Pour cette raison, l'apparition d'hémorragie sera particulièrement surveillée entre le premier et le 5e jour de vie. Bien que les injections durant les premiers jours de vie soient des gestes très rapides, ils peuvent induire un stress lié à la séparation avec la mère pendant ce laps de temps. Concernant le traitement médicamenteux pour éliminer les cellules microgliales, il sera administré pendant 3 semaines dans le régime alimentaire ou par injection pendant 5 jours selon les résultats d’une étude préliminaire. Les effets indésirables qui pourraient survenir incluent un changement de la structure du visage et du crâne. Les tests comportementaux peuvent également induire un stress chez l’animal, en particulier le test comprenant un choc à la patte. Pour cela, nous avons déterminé les durées minimales nécessaire afin d’étudier ces comportements pour minimiser la présence de nos animaux dans des environnements qui pourraient impacter leur bien-être. La chirurgie n’induira pas de nuisances, l’animal étant endormi par anesthésie et sa douleur contrôlée par un antidouleur, il est ensuite euthanasié. Concernant les injections intracrâniennes du produit créant une lésion cérébrale, il s’agit d’une chirurgie pouvant entrainer des douleurs (incision de la peau du crâne et perforation de l'os du crâne) qui sera pris en charge par administration d'un traitement antidouleur, et dans de rares cas (10%) : - des infections du site opératoire - des troubles de la conscience persistants - des troubles moteurs. Ces complications peuvent entrainer un défaut d’hydratation et d’alimentation des animaux. Une surveillance spécifique est donc mise en place post procédure.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés aux stades d’intérêt (Jour 42 et 60 après leur naissance) pour les analyses. Les prélèvements de cerveaux permettront d'étudier de manière approfondie l’inflammation cérébrale et l’efficacité du traitement pour la protection du cerveau en développement.
Remplacement
L’étude de la complexité de la réponse inflammatoire au niveau cérébral, ses conséquences et son traitement requiert l’utilisation d’un organisme vivant complet avec une maintenance du milieu physiologique et des interactions entre les différentes cellules et organes à plusieurs stades de développement. Pour cela, cette étude n’est envisageable qu’in vivo.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux est utilisé pour traiter des données statistiquement exploitables. De ce fait, il est nécessaire d’avoir n=10 animaux par groupe expérimental, avec 10% d’animaux supplémentaires dans les groupes recevant la molécule inflammatoire, compte-tenu de la mortalité probable due à l’inflammation. Une seule et même analyse sera dupliquée seulement en cas de variabilité. Les études de mises au point de nos techniques sont également indispensables et comptent le nombre minimum d'animaux. Les analyses requièrent des processus de préparation différentes, un seul et même prélèvement ne peut donc pas servir pour plusieurs analyses.
Raffinement
Les mères et les souriceaux sont hébergés dans des cages enrichies en essuie-tout pour qu’elles puissent y faire leur nid. Les femelles souris blanches ont d’excellentes qualités maternelles, ce qui constitue un bon choix pour minimiser le stress des souriceaux qui subiront la procédure d’injection, même si c’est un acte peu douloureux, réalisé sur animal sans nécessité d’anesthésie. Après le sevrage les animaux seront hébergés avec un maximum de 6 animaux par cage. Pendant les 5 jours d’injection, on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités, et le tonus ; à distance de l’inflammation on réalisera une surveillance régulière pour détecter une fluctuation importante du poids ou des troubles du comportement (isolement, agressivité). Si l’un de ces points limites est atteint, les animaux concernés seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. À la fin de l’étude les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires.
Choix des espèces
Le choix de la souris est pertinent d’un point de vue scientifique en termes de reproductibilité, des connaissances biologiques de l’espèce et du temps de reproduction. L’administration de l’interleukine-1β permettra d’étudier les voies impliquées dans la neuroinflammation et établir des stratégies neuroprotectrices. Cette inflammation au niveau du cerveau pendant les 5 premiers jours de vie permet de simuler une inflammation pendant la grossesse chez l’Homme. Suite à l’inflammation, les cellules altérées dans le cerveau seront éliminées par un traitement chez les souris avant l’adolescence et remplacées spontanément par des nouvelles cellules. La correction des troubles structuraux et comportementaux sera ensuite étudiée à l’âge adulte (2 mois). En plus d’une connaissance bien établie sur le développement neurologique chez la souris, les souris blanches présentent de nombreux avantages pour une étude développementale tels que le nombre de souriceaux par portée, qui permet de réduire le nombre de femelles gestantes, ainsi que les qualités maternelles de la mère.
Caractérisation d’un nouveau gène candidat impliqué dans les myopathies congénitales
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Toutes tuées à la fin de l'étude pour des analyses histologiques et moléculaires, 24 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Douze portent l'invalidation d'un gène candidat des myopathies congénitales, les douze autres forment le groupe témoin. Après une biopsie de phalanges vers le sixième jour de vie, chaque souris passe un test de coordination motrice tous les mois de 2 à 8 mois, puis, à 8 mois, avant et après une heure de course forcée sur tapis roulant, un test de douleur où sa queue est exposée à une source de chaleur et 24 heures d'isolement dans une cage de mesure d'activité. Elle est ensuite anesthésiée, son muscle tibial antérieur disséqué pour en mesurer la contraction, puis elle est tuée. Le porteur juge l'emploi de souris "indispensable" et y voit un "modèle d'étude idéal de myopathies", en invoquant 96 % d'homologie de la protéine étudiée et des techniques de mesure perfectionnées depuis des années dans son équipe.
Objectifs
Notre travail est principalement axé sur l’étude de nouveaux gènes impliqués dans les myopathies congénitales. Après analyse de données de séquençage d’ADN de plus de 500 patients atteints de myopathies, trois mutations dans un même gène ont été identifiées. Néanmoins, nous ne savons pas si ces mutations sont la cause de la myopathie ou si elles sont là par hasard. Au cours de notre projet, des analyses moléculaires effectuées sur cellules humaines suggèrent que ces mutations mènent à la perte de fonction de la protéine et donc à un effet pathologique. La mesure de l’activité motrice et neuro-sensitive des souris présentant une invalidation du gène d’intérêt permettra éventuellement de confirmer la présence de symptômes associés aux myopathies, tels que retrouvés chez les patients, et cela à l’échelle d’un organisme entier. En dernier lieu, des analyses sur tissus prélevés chez les souris permettront de comprendre les mécanismes de la maladie liée à ce gène et ainsi d’ouvrir des perspectives thérapeutiques. Le gène étant sur le chromosome X, cette maladie concerne très rarement les femmes. Nous n'étudierons donc que les souris mâles. Nous utiliserons 12 mâles dont le gène d’intérêt est intact et 12 mâles dont le gène est invalidé que nous comparerons.
Bénéfices attendus
Les différents tests d’activité motrice et de neurosensibilité chez la souris permettront de rendre compte de symptômes similaire à ceux des patients atteints de myopathies et d’ainsi confirmer à l’échelle d’un organisme entier ce qui est observé au niveau moléculaire. Les souris analysées constitueront ainsi un modèle murin de myopathie. L’étude de l’activité des souris par test de coordination motrice chaque mois permettra d’observer ou non une différence d’activité en fonction de l’âge de la souris et ainsi de confirmer que nos études à l’âge de 8 mois sont appropriées. Les mesures de neurosensibilité et d’activité spontanée dans la cage sont réalisés avant et après effort sur tapis roulant. Cette décision a été prise car les patients ayant une mutation du gène présentent des douleurs et faiblesses à l’effort. Une fois que l’implication de ce gène dans les myopathies est confirmée, le diagnostic de patients présentant une mutation de ce gène sera facilité et leur prise en charge sera améliorée. Des études plus approfondies permettront de comprendre les mécanismes de la maladie et d’ainsi envisager des nouveaux traitements.
Procédures
Chacune des 24 souris seront soumises à une série de 5 tests au total. De 2 à 8 mois et de manière mensuelle, la coordination motrice des souris sera analysée une fois par mois pendant moins d'une heure sur animal vigile. A 8 mois, des tests de douleur avec exposition au chaud (~1h) et test de mesure d'activité spontanée dans une cage (~24h) seront réalisés avant et après effort sur tapis de course (~1h). Ces trois tests seront réalisés sur animal vigile. A la fin de ces tests, toutes les souris subiront une mesure d'activité contractile sur muscle tibial antérieur dissequé (~1h par souris). L'animal sera anesthésié au préalable. Les muscles seront conservés pour des tests histologiques et moléculaires. Une biopsie de phalanges des souris est effectuée autour du sixième jour de vie dans le but d’analyser l’ADN de l’animal et d’ainsi vérifier la présence ou non du gène d’intérêt. Cette même biopsie servira également à l'identification de l'animal.
Impact sur les animaux
Nous nous attendons à observer un phénotype dommageable après effort sur tapis, de manière similaire aux patients présentant les mutations du gène étudié. En effet, les patients présentent des douleurs musculaires après activité physique. D’anciens travaux préliminaires sur ce modèle animal n’ont relevé aucun phénotype dommageable avant 4 mois. Etant donné que nos tests débutent à 2 mois, nous nous attendons à potentiellement observer des nuisances dès l’âge de 2 mois. Une faiblesse physique et douleur chez la souris pourra mener à une difficulté à se déplacer dans les cages, une difficulté à manger et éventuellement à respirer et une diminution des comportements sociaux et d’exploration. Parmi les différents tests, nous nous attendons à observer des nuisances lors de l’activité sur tapis qui provoque une fatigue de l’animal. La locomotion de la souris après retour dans sa cage risque d’être impactée. Le test de mesure de la douleur qui expose la queue de la souris à une source de chaleur provoque une douleur de très courte durée, égal au temps de réaction de la souris. La mesure d’activité spontanée dans une cage implique un isolement social pendant 24h. La mesure des propriétés contractiles musculaires nécessite une injection d'anesthésique et d'antalgique au préalable. La biopsie des phalanges décrite en 5.6.1 provoque une douleur légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette étude afin de procéder à des analyses histologiques et/ou moléculaires.
Remplacement
Afin de limiter les tests sur animaux, des études de l’activité à l’échelle moléculaire et cellulaire sont réalisées sur cellules humaines. L'utilisation d’animaux est cependant indispensable car les symptômes observés chez les patients atteints de myopathies et mécanismes de la maladie ne peuvent être observés et confirmés que dans un organisme entier. En effet, l’ensemble du tissu musculaire en lien avec le système nerveux sont étudiés. Le produit du gène étudié est très bien conservée chez la souris avec 96% d’homologie, ce qui suggère une fonction similaire chez l'humain et la souris. De plus, la souris possède une structure et physiologie du système musculaire et nerveux assez proche de l’Homme pour les comparer et mener à des conclusions. Des techniques de mesure d’activité musculaire sur la souris ont été développées et perfectionnées dans notre équipe depuis de nombreuses années, ce qui fait de la souris un modèle d’étude idéal de myopathies.
Réduction
Etant donné que le suivi en fonction de l’âge par test de coordination n’est pas invasif, cela va permettre de réutiliser les souris pour les autres tests et ainsi réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Chacune des souris subira la totalité des tests au cours de sa vie. Etant donné que le test de force musculaire nécessite l’anesthésie puis la mise à mort de l’animal, les tissus d’intérêt pour analyses histologiques seront prélevés au même moment. Aucun autre animal ne sera donc sacrifié à cet effet. En ce qui concerne les tests avant et après efforts, ceux-ci n’ont de sens pour comparaison statistique que si un même animal effectue les tests avant et après l’effort. Cela réduit encore une fois le nombre d’animaux utilisés. Enfin, le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum tout en permettant d'obtenir une puissance statistique suffisante. Nous pouvons affirmer d’après la littérature qu'au total 24 souris seront nécessaires pour conclure sur le projet : 12 souris modèles de myopathie et 12 souris contrôles saines.
Raffinement
Une vigilance accrue aux moindres signes de douleur pendant les tests ou dans la cage sera appliquée grâce à une grille d’évaluation de la douleur. Les nuisances sur l’animal seront évitées autant que possible et le test arrêté si une des nuisances apparait. La mise à mort de l’animal sera appliquée si la douleur est trop élevée. De la nourriture en gel sera déposée dans la cage dès l'apparition des premiers signes de difficulté pour se déplacer et notamment après l’activité forcée sur tapis. A partir du sevrage, une perte de poids de 20% en moins de 2 semaines ou une immobilité prononcée conduira à la mise à mort. Le suivi du poids se fera une fois par semaine, voire 1 fois par jour si une baisse de poids est observée. Afin de réduire le stress des souris, celles-ci subiront une habituation à l’environnement du test un jour avant les tests et seront toujours manipulées à l’aide de tunnels. Lors de la mesure de force musculaire, les souris seront profondément anesthésiées à l’aide d’un anesthésique puissant. Afin d’éliminer toute forme d’inconfort et de douleur, une molécule à fort potentiel analgésique sera également administrée accompagnée d’un anxiolytique utilisé pour son fort pouvoir sédatif. L’animal est ensuite déposé sur une plaque chauffée afin d'éviter une hypothermie. Afin de protéger et humidifier l’œil, un gel sera appliqué. Avant de débuter l’opération, l’efficacité et la profondeur de l’anesthésie sont vérifiées par une pression exercée manuellement sur les pattes et la queue. Si le rongeur ne montre aucune réaction, l’opération chirurgicale et le test peuvent être réalisés.
Choix des espèces
La protéine issue de notre gène d’intérêt est très bien conservée chez la souris avec 96% d’homologie, ce qui suggère une fonction similaire chez l'humain et la souris. De plus, la souris possède une structure et physiologie du système musculaire et nerveux assez proche de l’Homme pour les comparer et mener à des conclusions. Des techniques de mesure d’activité musculaire propres à la souris ont été développées et perfectionnées dans notre équipe depuis de nombreuses années, ce qui fait de la souris un modèle d’étude idéal de myopathies. Les animaux subiront un test de coordination chaque mois de 2 à 8 mois afin d'obtenir un suivi de l'activité motrice selon l'âge. Cette gamme d’âges permettra d’avoir le plus de données possibles pour conclure, tout en maximisant le temps de repos des souris. Les autres tests moteurs et neurosensitifs seront effectués à l'âge de 8 mois, âge où la souris atteint ses capacités musculaires maximales. Les souris seront sexuellement matures lors de l’ensemble des tests. Elles seront adolescentes de 2 à 3 mois et adultes de 3 à 8 mois jusqu’à la fin des tests.
Acquisition et maintien de compétences techniques sur le rongeur
- Formation professionnelle
Rats : 400
Hamsters dorés : 180
Autres rongeurs : 550
Recrutés autant que possible parmi des rongeurs de réforme, 1 930 rongeurs, 800 souris, 400 rats, 180 hamsters dorés et 550 autres rongeurs, vont être utilisés pour former doctorants et personnels de laboratoire, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil. Les apprenants les saisissent, les contiennent, leur font une injection, parfois par gavage avec un risque de fausse route, deux prises de sang par session, notamment à la queue par coupe ou incision, et un frottis vaginal pour les femelles. Sur ce total, 1 000 sont déclarés réutilisés, le porteur annonçant la réutilisation des rongeurs sans dommage et la mise à mort de ceux qui atteignent un point limite, alors que les procédures prévoient aussi une prise de sang terminale sous anesthésie. Il écarte toute méthode de remplacement, ces gestes exigeant selon lui "un organisme dans sa globalité".
Objectifs
Le projet vise à répondre à la réglementation française sur l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques ou éducatives qui par l'arrêté du 1er février 2013 oblige à ce que tout personnel des établissements utilisateurs qu'il soit personnel de recherche ou étudiant soient formés aux gestes et déclaré compétent pour les gestes qu'il aura à réaliser ultérieurement dans le cadre de ses activités scientifiques. L'objectif est donc de former aux gestes de bases employés en expérimentation animale sur rongeurs comme la préhension, la contention de l'animal mais également l'administration de substances et le prélèvement de sang sur animal vigile. Une partie de cette formation consistera à délivrer la partie pratique de la formation intiale niveau concepteur aux étudiants en première année de thèse : préhension, contention, injections élémentairtes et la formation dans son ensemble s'adressera aux personnels de laboratoires ou personnels zootechniques dans le cadre de leur formation lors de leur recrutement ou du maintien des compétrences tout au long de leur carrière.
Bénéfices attendus
La phase pratique des séances de formations en expérimentation animale permet aux personnes d'appréhender les grands principes de manipulation et d'avoir un premier enseignement des bonnes pratiques zootechniques lors de l'utilisation d'animaux. Selon les besoins en rapport avec les projets de recherche développés ensuite dans les laboratoires, l'apprentissage des gestes réalisés avec un tuteur technique puis validé par un membre de la cellule du bien-être animal permettra de garantir la compétence acquise et au personnel ou étudiant formé de devenir autonome dans ces pratiques expérimentales. Concernant la formation continue des personnels déjà en poste le bénéfice sera de garantir le niveau des compétences requises en lien avec leurs missions zootechniques ou expérimentales. La formation continue permettra également de créer une dynamique en contribuant à faire évoluer les pratiques en expérimentation animale en tenant des évolutions éthiques notamment en terme de raffinement et donc d'inclure les méthodes alternatives développées.
Procédures
Les animaux seront soumis à une préhension et contention qui ne durera pas plus de 5-10 minutes le temps de réaliser les injections (durée 1 minute). Ils seront également soumis à deux prélèvement sanguins sur animal vigile ou anesthésié qui ne dureront pas plus de 15 minutes, à un frottis vaginal (animaux femelles uniquement) sur animal vigile d'une durée de 2 minutes . Ils seront soumis sous anesthésie/analgésie à un prélèvement sanguin terminale d'une durée de 5 minutes. Chaque animal ne pourra subir qu'un type d'injection et deux prélèvements sanguins au cours de chaque session de formation. Les animaux seront soumis sous anesthésie/analgésie à un prélèvement sanguin terminale d'une durée de 5 minutes
Impact sur les animaux
La préhension et la contention peuvent provoquer un stress ponctuel pour l'animal. Les injections pourraient provoquer un saignement, un hématome, une inflammation. L'administration par voie orale (gavage) pourrait provoquer une fausse route. Le prélèvement sanguin à la queue (coupe ou incision) pourrait conduire à une inflammation . Les prélèvements sanguins pouraient entrainer une douleur aigue , un hématome.
Devenir
A l'issu des procédures les animaux seront soit réutilisés si aucun dommage n'a été observé, soit mis à mort si les points limites ont été atteints.
Remplacement
La formation intègre des gestes techniques en lien avec l'expérimentation animale qui ne peuvent être réalisés que sur animal vivant entier car ces gestes nécessitent un organisme dans sa globalité (système cardio-vasculaire fonctionnel et intègre, cerveau...).
Réduction
Aucune analyse statistique ne sera réalisée car il s'agit de formation. Le nombre d'animaux/procédure a été estimé en fonction du niveau des apprenants et des attendus des tuteurs. Pour les formations spécifiques réglementaires, il s'agit d'une initiation aux gestes et donc il n'y a donc aucune validation des gestes. Un seul animal/apprenant suffit donc à cette initiation aux gestes. Pour l’acquisition de nouvelles compétences techniques ou la formation initiale et continue des personnels de laboratoire ou zootechniques, les gestes enseignés pourront faire l'objet d'une validation de la part des tuteurs. Nous avons alors évalué le nombre d'animaux/apprenant à N=2. Il s’agira autant que possible d’animaux de réforme. Un maximum de trois gestes seront réalisés sur un même animal réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Lorsque cela sera nécessaire, pour des raisons liées aux gestes réalisés ou à l'espèce manipulée, les animaux seront anesthésiés pour limiter le stress, la souffrance ou l'inconfort. Tous les animaux utilisés seront au préalable habitués à la préhension et contention avant chaque session de formation afin de limiter le stress lorsque ces gestes seront réalisés par les apprenants. En alternative à la préhension par la queue ou le corps , pour la souris ou le rat, la méthode du tunnel qui consiste à apprendre à l'animal à entrer de façon volontaire dans le tunnel intégré en tant qu'enrichissment dans la cage sera proposée ce qui permet de sortir les animaux de leur cage sans les manipuler au risque de les stresser. Les animaux seront maintenus en groupe dans des cages enrichies avec le matériel dédié à chaque espèce leur permettant ainsi d'exprimer des comportements naturels comme ronger et nidifier. Pour limiter la souffrance animal des points limites prédictifs ont été définis pour chaque procédure du projet.
Choix des espèces
Le rat et la souris seront les espèces animales prinicpalement utilisées dans le cadre de la formation pratique incluse dans la formation des étdudiants puisque ces deux espèces sont les plus manipulées et utilisées dasn les projets de recherche scientifiques. D'autres espèces de rongeurs plus spécifiques des domaines de recherche ciblés par les apprenants seront également utilisées afin de former les étudiants et personnels impliqués dans les projets de recherche. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte à partir de 3 mois. Selon les gestes enseignés, nous pourrions être amenés à affiner notre choix en prenant également en considérant le poids et le sexe de l'animal.
Etude transcriptionnelle des stades de la spermatogenèse par synchronisation chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Un médicament proposé à la bouche avec une pipette chaque jour, dès le lendemain de la naissance et jusqu'au huitième jour de vie : 105 jeunes souris mâles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Toutes sont tuées entre 70 et 84 jours par surdose d'anesthésique suivie d'une perfusion de fixateur histologique, pour prélever les testicules. Le blocage puis la relance de la différenciation des spermatogonies servent à synchroniser la spermatogenèse et à lire jour après jour les gènes exprimés, les retombées annoncées sur l'infertilité humaine et sur un contraceptif masculin restant au conditionnel. Le porteur affirme que seule une approche expérimentale sur des animaux répond à ces questions, la souris partageant selon lui 99 % d'identité de gènes avec l'être humain et les mécanismes de l'acide rétinoïque étant conservés dans le testicule.
Objectifs
La spermatogenèse décrit le processus de production des spermatozoïdes à partir des spermatogonies. Il se déroule dans les tubes séminifères du testicule, débute à la naissance et se poursuit jusqu'à l'age adulte. Il s'agit d'un processus asynchrone permettant une production continue de spermatozoïdes. Le fait que ce processus soit asynchrone rend son etude difficile. En synchronisant les testicules des animaux avec 2 médicaments on s'assure de pouvoir étudier précisément chaque étape de la spermatogenèse. Les testicules des animaux traités servent à réaliser des analyses qui permettent de mettre en évidence les gènes exprimés.
Bénéfices attendus
Dans la mesure où les médicaments utilisés ici agissent sur la différenciation des spermatogonies de la même manière chez l'homme et chez la souris, il est logique de penser que les mécanismes régissant la spermatogenèse qui sont découverts dans ce projet sont pertinents pour l'Homme. Ainsi, en identifiant les gènes nécessaires à la différenciation des spermatogonies, nous obtiendrons des pistes pour évaluer des cas d'infertilité Humaine, qui sont en augmentation constante dans le monde. De plus, la possibilité de perturber temporairement la signalisation de l'acide rétinoïque représente également une stratégie pour développer de nouveaux contraceptifs masculins non chirurgicaux.
Procédures
Toutes les interventions décrites ci-dessous nécessitent d’immobiliser les souris avec la main (contention non traumatisante de 20 à 30 secondes). L'administration de médicament pour bloquer la différenciation des spermatogonies est réalisée quotidiennement de l’âge de 2 jours jusqu'à l'âge de 8 jours. L'administration de médicament pour rétablir et synchroniser la différentiation des spermatogonies est réalisée 1 fois à l’âge de 8 jours. L'administration d’anesthésique/analgésique en dose létale pour perfuser un fixateur histologique (étape finale de mise à mort) est réalisée entre l’âge de 70 jours et 84 jours. Les souris sont sous anesthésie générale profonde en moins de 5 minutes. La perfusion qui dure 10 minutes résulte en la mort de l’animal.
Impact sur les animaux
Il y a une nuisance liée au fait que les souriceaux sont manipulés à partir du jour suivant leur naissance. Ils reçoivent quotidiennement un médicament par voie orale (à l'aide d'une pipette). La pointe de la pipette est proposée à la bouche du souriceau jusqu'à ce qu'il commence à boire. En ce qui concerne l'administration du 2ème médicament ou d’anesthésique, la douleur est similaire à celle provoquée par l'introduction d'une aiguille sous la peau.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure pour prélèvements de tissus en vue d'analyses
Remplacement
La spermatogenèse est un processus complexe qui fait intervenir plusieurs types cellulaires du testicule. Les interactions entre les cellules somatiques et des cellules germinales sont essentielles pour assurer une production continue de spermatozoïdes. Notre étude vise à examiner le profil d’expression des gènes impliqués dans la spermatogenèse dans un contexte physiologique où ces interactions cellulaires sont préservées. Il est important de souligner que seule une approche expérimentale impliquant des animaux permet de répondre à ces questions. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.
Réduction
Dans le cadre de ce projet, nous ferons usage de souris issus d'un fond génétique mixte. Étant donné que notre étude se concentre sur la spermatogenèse, seuls les mâles (statistiquement, représentant la moitié des naissances) sont employés dans les expériences. Nous réalisons une analyse des testicules jour après jour pendant deux cycles complets de spermatogenèse, s'étalant sur une période de 15 jours. Le nombre d’animaux est calculé de manière à respecter les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés, tout en garantissant la qualité et la robustesse statistique des résultats obtenus. Le projet est arrété dès que nous obtenons 3 animaux dont le testicule contient 1 des 12 stades du cycle de l'épithélium séminifère.
Raffinement
Toutes les mesures requises sont mises en place pour assurer le bien-être des animaux. Un nid de coton ou un nid végétal est ajouté dans chaque cage pour diminuer le stress de l’animal et faciliter la thermorégulation de l’animal, comme cela est fait dans toutes les cages. Nous surveillons régulièrement le bien-être et l’état de santé des animaux et nous apportons des soins appropriés en cas de besoin, notamment l'administration d'analgésiques. Toute modification de leur comportement indiquant une souffrance ou de l'anxiété est immédiatement signalée aux responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) afin de prendre les mesures correctives nécessaires. Les manipulations et les traitements sont effectués par un expérimentateur qualifié afin de minimiser toute perturbation potentielle pour les animaux. Nous appliquons le principe du raffinement (troisième "R" de la règle des 3R) dans notre projet en optimisant les conditions de travail avec les animaux.
Choix des espèces
Notre étude vise à identifier les gènes exprimés lors de la spermatogenèse dans un système physiologique, notamment dans ses fonctions paracrines (entre les différents types cellulaires du testicule) et endocrines (dans l'organisme entier). Seule une approche expérimentale avec des animaux permet de répondre à ces questions. D’autre part la souris possède 99% d’identité de gènes avec l’Homme, et les mécanismes cellulaires à l’œuvre et impliquant l’acide rétinoïque dans le testicule de souris sont conservés dans le testicule de l’Homme. Dans ce projet, nous utilisons des souris mâles provenant d'un fond génétique mixte. Pour couvrir la totalité des stades de la spermatogenèse nous prélevons les testicules tous les jours à partir de l'age de 70 jours, pendant 15 jours.
Etude des effets cardiovasculaires de l’infection au Sars- Cov2 dans des modèles murins EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Modifiées par transgénèse pour exprimer le récepteur humain du SARS-CoV-2, les souris de ce projet sont rendues infectables par un virus qui provoque chez elles une maladie pulmonaire et parfois intestinale. 1 680 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 562 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent un prélèvement caudal pour génotypage, des administrations intranasales sous anesthésie, jusqu'à trois semaines d'hypoxie chronique, une chirurgie du cou avec injection intratrachéale et jusqu'à cinq injections intrapéritonéales. Le porteur indique que les conséquences peuvent aller de la perte de poids et de la diarrhée à l'affaiblissement, la malnutrition puis la mort, et que la mise à mort finale sert à mesurer la pression pulmonaire sous anesthésie avant de prélever les tissus.
Objectifs
L’objectif de notre recherche est de mieux comprendre les altérations vasculaires et cardiaques liées à l'infection au SARS-Cov2. Nous allons utiliser des modèles murins (des souris transgéniques exprimant le récepteur humain du virus) afin de pouvoir suivre in vivo les effets de l'infection et de l'inflammation induite par cette infection. Notre but est d'augmenter les connaissances sur les conséquences au long cours du Covid19 pour améliorer la prise en charge des patients. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2) car des étapes ne peuvent pas être réalisées dans l'établissement d'origine et nécessite l'utilisation d'un établissement secondaire. Aucun animal supplémentaire n'est ajouté par rapport au projet principal déjà autorisé 1/2.
Bénéfices attendus
Ces études nous permettront d’évaluer au long cours les altérations de la fonction cardiovasculaire à la suite d’une infection au SARS-Cov2. Nous utiliserons 2 lignées de souris afin de déterminer les mécanismes impliqués dans ces effets. Les résultats serviront à mieux comprendre été prévenir les conséquences pulmonaires, vasculaires et cardiaques du Covid19.
Procédures
Chaque animal sera soumis une seule fois dans sa vie à un prélèvement caudal pour génotypage (EU1). Cet acte ne dure que quelques secondes. Certaines souris seront soumises à une administration intra-nasale sous anesthésie pendant 15 minutes (EU1). Certaines souris recevront dans l’eau de boisson un anti-hypertenseur pendant 10 jours (EU1). Certaines souris seront étudiées par échocardiographie effectuée sous anesthésie pendant 20 minutes (EU2). La pression artérielle sera aussi mesurée à la queue sur animaux vigiles (procédure indolore) après accoutumance à la contention pendant 5 jours (EU2). Certaines souris seront en plus soumises à une hypoxie chronique pendant 3 semaines avant l’étape finale (EU2). Pour les procédures chirurgicales sous anesthésie, la douleur sera évitée par l’administration d’anesthésiques et d’analgésiques (EU2). Certaines souris subiront une petite chirurgie au niveau du cou comprenant une anesthésie et une analgésie pendant 15 minutes et une injection intra-trachéale avant l’étape finale (EU2). Certaines souris recevront 1 à 5 injections intrapéritonéales (1 par jour) ou administrations intranasales sous anesthésie générale pendant 15 minutes avant l’étape finale (EU2). Pour toutes les souris, l’étape finale sera une procédure chirurgicale effectuée sous anesthésie avec analgésie pendant 15 minutes avant l’euthanasie (EU2).
Impact sur les animaux
Le transport des animaux entre les 2 sites peut engendrer une anxiété temporaire. L’infection induit une maladie pulmonaire et chez certains animaux une maladie intestinale avec des conséquences qui peuvent être très sévères selon la lignée murine: les plus forts sont la perte de poids, la diarrhée, l’affaiblissement allant jusqu’à la malnutrition puis la mort. les souris seront soumises à un stress hypoxique. L'hypertension pulmonaire induite par l’hypoxie chronique est modérée chez la souris normale mais pourrait être sévère chez les souris post infection induisant un stress physique. Un stress (peur ou détresse) des animaux est possible lors de l’acclimatation à la prise de pression systémique vigile. L’anesthésie peut induire des effets tels que l’hypothermie, des difficultés respiratoires ou dans les cas les plus critiques un arrêt cardio-respiratoire. La procédure chirurgicale peut également être source d’hémorragie ou de douleur post-opératoire. Les procédures d’injection peuvent potentiellement conduire à des infections.
Devenir
Les 1680 animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés en fin d’expérimentation à l’issue d’une mesure de la pression pulmonaire sous anesthésie dans l'EU2. Les animaux sont utilisés à des fins expérimentales qui nécessitent leur euthanasie afin de pouvoir mesurer leurs paramètres hémodynamiques et étudier les tissus. Ce projet est multisite, aucun animal supplémentaire n'est ajouté par rapport au projet 1/2.
Remplacement
Pour comprendre les conséquences au niveau de la fonction et de la structure des vaisseaux pulmonaires de l’infection au SARS-Cov2, il est nécessaire d’infecter des animaux afin d’être dans les conditions les plus proches des patients et afin de conserver l’ensemble des phénomènes intervenants dans la régulation des vaisseaux pulmonaires : inflammatoires (interactions cellules immunes et cellules vasculaires), vasculaires (interactions des cellules vasculaires entre elles), respiratoires (hypoxie locale) et éventuellement nerveux. Les études in vitro ne permettent pas d’évaluer les conséquences de façon intégratives. De plus, la régulation de la pression artérielle pulmonaire ou systémique et de la fonction cardiaque ne peuvent être évaluées qu'in vivo. Cependant, une fois ces conséquences tissulaires et cellulaires identifiées in vivo, les voies et les molécules impliquées seront étudiées in vitro sur des cellules en culture (cellules vasculaires en culture) infectées ou non.
Réduction
1680 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Ces expériences n'ont jamais été réalisées ni en France, ni dans le monde, par d'autres équipes dans un protocole expérimental semblable.
Raffinement
Les volumes injectés sont les plus petits possibles en accord avec le poids de l’animal. Le poids des animaux est suivi tout au long des procédures. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum et une température et hygrométrie constantes. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés à plusieurs et le milieu est enrichi. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l'espèce concernée dans les 2 établissements utilisateurs. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée et le poids des animaux sera mesuré régulièrement. Les points limites seront évalués selon une grille de suivi. Après infection, les souris seront observées quotidiennement et pesées tous les jours pendant 1 semaine, puis toutes les semaines. La douleur sera soulagée par l’administration d’analgésique systémique au cours de la procédure finale. Si le comportement d'un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20 pour cent de perte de poids. Une perte de sang importante, des signes de souffrance (prostration, poil hérissé, yeux fermés) qui se maintiennent, une prostration, une incapacité à se déplacer, des yeux larmoyants et exorbités constituent également des points limites. Les infections éventuelles seront traitées localement par application de crème antibiotique.
Choix des espèces
Nous effectuons des expériences avec des souris modifiées par transgénèse afin d’humaniser les souris pour en faire un modèle d’étude de l’infection au SARS-Cov2 dont la pertinence a été démontrée comme modèle pour étudier les effets liés au Covid19. Ces modèles de souris sont plus connus et plus facilement utilisables pour des études in vivo et pour les analyses d’organes que les autres modèles animaux existants (e.g. furet). Les études sur les effets de l’infection au SARS-Cov2 seront effectuées au stade adulte, lorsque le développement pulmonaire, vasculaire et cardiaque est fini, après l'âge de 8 semaines. Les études sont débutées sur des animaux à l’état adulte (2-5 mois) mais pas âgé permettant une étude au long cours sur plusieurs mois afin d'éviter d’avoir des effets liés à l’âge en fin d’étude.
Investigation de l’activité antibactérienne d’anticorps polyclonaux dans un modèle murin de sepsis
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Infectées par Pseudomonas jusqu'au sepsis, les souris traversent quarante-huit heures que le porteur décrit comme les plus critiques en douleur et en mortalité, le modèle conduisant à la mort de l'animal en l'absence de traitement. 560 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'objet est de tester l'activité antibactérienne d'anticorps polyclonaux contre une bactérie responsable de près de 10 % des infections nosocomiales et souvent résistante aux antibiotiques. Le porteur annonce une analgésie et une surveillance trois fois par jour pendant les deux premiers jours, sans préciser la dose bactérienne administrée, le nombre de groupes, ni le calcul qui aboutit à 560 souris, dont il écrit seulement que l'effectif "doit permettre de faire des analyses statistiques robustes".
Objectifs
Pseudomonas est une bactérie responsable de près de 10% des infections nosocomiales. Les infections à pseudomonas sont en augmentation et sont généralement associées à des résistances aux antibiotiques. Elles représentent ainsi une réélle menace pour la santé publique. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'activité antibactérienne d'anticorps polyclonaux dans un modèle murin de sepsis (réponse inflammatoire généralisée associée à une infection grave).
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de valider l'activité antibactérienne des anticorps polyclonaux et de proposer une alternative thérapeutique dans un domaine ou le besoin médical est important. Ce projet pourrait aussi ouvrir la voie à de nouvelles stratégies de lutte contre les infections bactériennes.
Procédures
Les traitements se feront par voie intrapéritonéale ou sous-cutanée. Une contention légère sera faite par du personnel qualifié sur les souris pour l'administration des traitements, afin de ne pas engendrer de stress sur les souris. Ces manipulations ainsi que les piqures ne dureront que quelques secondes et la souris sera rapidement remise avec ses congénères.
Impact sur les animaux
Le modèle utilisé ici conduit à la mort de l’animal en l'absence de traitement. Il s'accompagne d'une l’inflammation locale et systémique, source de douleur et d’inconfort. Il est donc classé comme procédure sévère. Les premières 48 heures qui suivent le challenge bactérien sont les plus critiques en termes de douleur et de mortalité. A partir de 48h, l’état des souris s’améliore avec une chute des nuisances et de la mortalité.
Devenir
Après chaque expérimentation, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêt pourront être récupérés pour compléter les analyses.
Remplacement
Si des tests in vitro permettent d'évaluer l'activité des nouvelles thérapies, les études chez l'animal restent indispensables pour valider leur potentiel thérapeutique dans un environnement physiologique. Ces études permettent aussi de repérer une éventuelle toxicité des traitements et éclairent sur les modes d'action engagés.
Réduction
Le nombre d'animaux prend en compte le besoin de réduction (règle des 3R) et les contraintes statistiques liées au modèle et aux analyses qui seront réalisées. Le nombre d’individus par cohorte doit permettre de faire des analyses statistiques robustes.
Raffinement
Une étape d’acclimatation de 12 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des frisottis sont placés dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. Des signes cliniques et points limites ont été définis afin de monitorer objectivement la souffrance des animaux au cours du modèle. La douleur sera évitée par injection d'analgésiques en fonction des signes cliniques observés ou en euthanasiant les animaux. Les premières 48h qui suivent le challenge bactérien sont les plus critiques en termes de douleur et de mortalité. Une attention particulière sera donc apportée durant cette période avec une surveillance des souris 3 fois par jour. Cette surveillance pourra être renforcée avec augmentation de la fréquence des passages si besoin. Une analgésie sera aussi appliquée 3 fois par jour durant les 48 premières heures du modèle (la première injection sera réalisée 15 minutes avant le challenge bactérien). A partir de 48h environ, l’état des souris traitées doit s’améliorer. L'analgésie sera alors décidée en fonction de l'état des animaux en prenant en compte les éléments suivants: morphologie générale, poids, paupières, aspect des larmes, aspect de la zone urogénitale, apathie, comportement en groupe, activité de la respiration.
Choix des espèces
Le modèle de sepsis décrit dans ce projet a été validé et caractérisé dans des publications. Nous travaillerons avec des souris femelles (les souris femelles étant plus légères elles permettent d'utiliser moins d'anticorps).
Evaluation par imagerie IRM de la fonction cérébrale d’un modèle murin du syndrome Cornelia de Lange
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rendues haplo-insuffisantes pour le gène Nipbl, les souris de ce modèle reproduisent selon le porteur les symptômes du syndrome de Cornelia de Lange, dont des comportements auto-agressifs. 18 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien pendant trois semaines, à partir du sevrage, d'une molécule déjà en essai clinique en cancérologie, puis passent deux heures sous anesthésie gazeuse pour une imagerie cérébrale, à l'issue de laquelle elles sont tuées pour prélever leur cerveau. Le porteur affirme réduire le nombre d'animaux "au minimum permettant de répondre à la question scientifique" tout en reconnaissant l'absence de données préliminaires sur la taille d'effet attendue, et présente un éventuel effet du traitement comme la première piste thérapeutique pour des enfants qui n'en ont aucune.
Objectifs
Le syndrome de Cornelia de Lange est une maladie rare du développement qui affecte plus de 9000 enfants en Europe, 30 000 aux Etats Unis. Il s’agit d’un retard de développement de la croissance accompagné de défaut de formation du cerveau, du système auditif, du cœur et d’une partie du système digestif. la cause génétique de ce syndrome est une insuffisance du gène nommé Nipbl. Il en résulte des problèmes d'expression de nombreux gènes. Les enfants souffrant de ce syndrome sont de plus petite taille que la normale, marchent très tardivement , doivent subir des interventions chirurgicales réparatrices, ne parlent pas ou parfois très tardivement, et ont des comportements auto-agressifs. Il n’y a aucune piste thérapeutique à ce jour. Avec un modèle de souris haplo-insuffisant pour le gène Nipbl, qui récapitule les symptomes des patients, nous avons trouvé que le syndrome induisait un arrêt de la prolifération cellulaire embryonnaire prématurée. Des cellules sénescentes ( en arrêt de prolifération) ont été identifiées dans tous les organes au cours du développement y compris dans le cerveau des nouveaux nés. Le traitement des souris gestantes par une molécule en essai clinique en oncologie permet la naissance de souriceaux de taille normale sans malformation cardiaque sans cellule sénéscente y compris dans le cerveau. Notre projet va étudier si le traitement des souris au sevrage et au cours de la maturation du cerveau peut prevenir ou limiter la sénéscence dans le cerveau et les effets fonctionnels tels que l 'agressivité .
Bénéfices attendus
Un effet positif du traitement sur le fonctionnement neuronal serait un atout majeur et permettrait d’apporter pour la première fois une piste thérapeutique pour les patients qui n’en ont aucune jusqu ‘aujourdh’ui. ce projet ouvrirait les discussions avec les cliniciens qui s 'ocupent des enfants affectés par le syndrome afin d'évaluer l 'utilisation du médicament.
Procédures
Les souris seront traitées avec le médicament pendant 3 semaines par un gavage quotidien durant 15 secondes . Elles seront ensuite anesthésiées pour un examen d'imagerie cérébrale de 2 heures . elles seront mises à mort à la fin de l 'examen
Impact sur les animaux
La prise du médicament par gavage est une nuisance bien que courte lorsque pratiquée par un expérimentateur très habitué. Le processus ne prend que 30s . Examen clinique par IRM sous anesthésie gazeuse : la seule nuisance ou effet indésirable possible pour ces animaux est la défaillance cardiorespiratoire sous anesthésie, un évènement rare lorsque le vetflurane est administré à faible dose. L’utilisation d’un monitoring physiologique pendant l'IRM permet de détecter les premiers signes d’alerte et d’interrompre immédiatement l’anesthésie ce qui permet le réveil rapide des animaux.
Devenir
Les souris seront mise à mort à la fin du protocole d'imagerie pour collecter les cerveaux à des fins d'histologie
Remplacement
Ce projet sera conduit dans le strict respect de la règle des 3R. L’étude de l’impact de la délétion de Nipbl sur le développement cérébral et l’éventuelle correction de ces anomalies par le traitement nécessite de recourir à l’animal car il n’existe aucune alternative. Il n’est pas possible d’obtenir ces informations par les organoides qui ne peuvent rendre compte du développement, de la maturation et du fonctionnement d’un organe aussi complexe que le cerveau. Il n’existe pas non plus de modèle informatique de la maladie.
Réduction
Le recours à l’animal étant incontournable, nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum grâce à l’utilisation de méthodes non-invasives d’Imagerie à Résonnance Magnétique (IRM) et de Spectroscopie à Résonnance Magnétique (SRM). Ces méthodes avancées permettent de réaliser des explorations couvrant la totalité du cerveau et d’obtenir un grand nombre d’informations quantitatives dans le cadre d’un examen clinique sous anesthésie générale. Le caractère non invasif de l’exploration rend possible la réalisation d’examens répétées sans dommage pour l’animal. En l’absence de données préliminaires permettant de connaitre la "taille d'effet" attendue et compte-tenu de notre expérience en IRM préclinique, nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum permettant de répondre à la question scientifique
Raffinement
Le raffinement concernera la diminution du stress par l’utilisation d’une anesthésie légère lors de l’IRM. Les animaux étant hébergé dans le même bâtiment que celui où sera réalisé l’imagerie, le délai d’acclimatation ne sera que de 2 à 3 jours, une habituation à l'expérimentateur sera assurée lors de l’arrivée des animaux. Pendant les sessions d’imagerie, les animaux seront plongés sous anesthésie gazeuse afin d’éviter tout stress. Ils bénéficieront d’un monitorage physiologique continu (t° rectale, respiration) avec un système dédié au rongeur permettant d’adapter immédiatement l’anesthésie afin d’éviter toute situation de détresse cardio-respiratoire. Les conditions d’hébergement seront optimisées afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels (animaux hébergés en groupes sociaux dans de grandes cages, boisson et nourriture ad libitum, enrichissement avec nid végétal, tubes en plexiglas, cartons à ronger, fast-track, balançoires). Des points limites adaptés et précoces seront mis en place pour la procédure . Les souris sont visitées chaque jour incluant le week end par l’expérimentateur et sont conditionnées à la contention avant le gavage.
Choix des espèces
la souris peut être facilement modifiée génétiquement. Notre modèle murin récapitule parfaitement le phenotype des patients. elle est un bon modèle de biologie du développement, un avantage pour une pathologie du développement . Les souris seront traitées post-sevrage (3 semaines) lors de la maturation du cerveau qui persiste jusque 3 mois chez les rongeurs.
Prélèvement des tissus pour la caractérisation génétique (génotypage) et gestion des mutations entrainant des nuisances chez des modèles animaux génétiquement modifiés.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
Poissons zèbres : 12500
162 500 animaux non-humains vont être utilisés pour un seul geste chacun, trois millimètres de queue ou d'oreille coupés en cinq secondes chez 150 000 souris vigiles, quatre millimètres carrés de nageoire caudale prélevés sous anesthésie chez 12 500 poissons zèbres. Les procédures sont déclarées légères pour 156 750 d'entre eux et modérées pour 5 750, ce dernier niveau correspondant aux lignées dont les mutations provoquent, selon le porteur, "des douleurs, de l'inconfort, des difficultés à se déplacer et pour certaines des mortalités". Le projet relève de la gestion d'élevage, identifier génétiquement les animaux produits et repérer les lignées dont les mutations nuisent, pour constituer les lots destinés à d'autres projets. Le porteur écarte la pommade anesthésiante, qui allongerait l'intervention et pourrait gêner le génotypage, ainsi que l'analgésie par injection, et estime à 60 000 les animaux gardés vivants sur cinq ans pour renouveler les reproducteurs ou partir en expérimentation, les autres étant tués quand leur combinaison de gènes ne sert ni à l'élevage ni aux expériences.
Objectifs
L'établissement utilisateur est constitué de deux instituts de recherche qui s’intéressent à différents domaines (neuroscience, cardiologie, génétique, physiologie, cancérologie,...). Dans le cadre des projets utilisant des animaux à fins scientifiques (soumis indépendamment à des demandes d’autorisation de projet), des modèles animaux précliniques génétiquement modifiés sont développés et élevés. Dans ce but, il est important de détecter et gérer les pathologies induites par les mutations dans les élevages (appelé phénotypes dommageables) de ces modèles et de bien caractériser génétiquement les animaux produits (appelé : le génotypage). L’ensemble permet un élevage adapté pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et optimisée aux besoins des scientifiques de ces instituts.
Bénéfices attendus
Pour le bénéfice direct, ce projet permet d'optimiser la gestion et l’élevage des modèles animaux génétiquement modifiés qui seront mis à disposition des chercheurs pour les expérimentations qui seront faites à l'issue de ce projet. Il permet également de prendre en charge rapidement et donc de minimiser les souffrances qui pourraient être induites par les mutations des modèles animaux. Il y a également un bénéfice indirect, car les modèles précliniques génétiquement modifiés permettent de reproduire chez l’animal des pathologies humaines. Ce projet permet la caractérisation génétique ces modèles qui sont ensuite utilisés sur des projets dont l’objectif est la compréhension ou le traitement de ces pathologies et pour notre établissement dans de nombreux domaines (neuroscience, cardiologie, génétique, physiologie, cancérologie, …)
Procédures
Les souris vigiles seront prélevées d’un petit bout de tissu à l’oreille ou à la queue (3mm maximum de tissu), l’intervention dure 5 secondes et se fait une seule fois par animal. Les poissons subiront une anesthésie par balnéation suivie d’un prélèvement d’une portion de 4mm² (5% maximum) de la partie cartilagineuse de la nageoire caudale, capable de régénération complète en 20 jours. Des mutations chez des souris génétiquement modifiées peuvent entrainer des nuisances (phénotype dommageable) durant l’élevage chez l’animal. Elles apparaissent à différents temps de la vie de l’animal et sont directement pris en charge. Il y a également une procédure spécifique pour évaluer le bien-être des animaux lors de la création d'une lignée génétiquement altérée. Elle est non invasive et est basé sur l’observation de paramètres zootechniques et physiologiques en élevage.
Impact sur les animaux
Les nuisances lors d'un prélèvement de tissu pour le génotypage sont essentiellement du stress léger lors de la contention, de la pêche par épuisette ou de la sédation (poisson) et de la douleur légère lors de la coupe du tissu. En fonction du modèle de pathologie, les mutations entrainant un phénotype dommageable, induisent en général et à des degrés divers, des douleurs, de l’inconfort, des difficultés à se déplacer et pour certaines des mortalités selon le génotype. La procédure d'évaluation du bien-être des animaux est sans douleur sauf si un phénotype s'avère dommageable par cette évaluation. Cette demande de projet traite ces nuisances pour en minimiser aux maximum les souffrances animales.
Devenir
Les procédures d'évaluation et de gestion des phénotypes dommageables s'appliquent durant toute la vie des animaux. Les animaux pourront être mis à mort en élevage pour la gestion de la colonie ou bien partir en utilisation continue en expérimentation. Pour les procédures de prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique des animaux le devenir peut-être soit la mise à mort car la combinaison de gènes n’est pas utilisable pour les expérimentations et l’élevage, soit les animaux sont gardés en vie pour renouveler les reproducteurs en élevage ou sont utilisés sur des projets expérimentaux prévus pour ces animaux (estimé à 60000 animaux sur 5 ans).
Remplacement
Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement altérés pour des projets scientifiques . Les modèles animaux sont justifiés par la nécessité de caractériser des mécanismes ou pathologies complexes qui font intervenir plusieurs grands systèmes biologiques entre eux (en neuroscience, cardiologie, oncologie par exemple). Les chercheurs des instituts développent ces modèles le plus souvent après avoir testé leurs hypothèses sur des systèmes moléculaires et cellulaires et justifié le remplacement dans leurs demandes d’autorisation de projet expérimentaux. Dans l’institut nous encourageons l’utilisation de modèles alternatifs. Par exemple une équipe a mis en place des organoïdes intestinaux qui leurs a permis de développer et consolider leurs hypothèses avant le passage sur leurs modèles de souris génétiquement modifiées. Des modèles cellulaires sont également utilisés. Enfin les projets des instituts explorent les mécanismes de pathologies complexes faisant intervenir de nombreux tissus et interactions cellulaires, le recours à l’animal dans son ensemble est indispensable.
Réduction
Les animaux produits, issus de ce projet, et utilisés en expérimentation font tous l’objet d’une analyse statistique pour permettre la détermination des lots expérimentaux et l’analyse des résultats. Chaque chercheur a défini ses outils et échantillons pour ses expérimentations qui sont évalués indépendamment. L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consistent à optimiser les élevages et à limiter la surproduction d’animaux non utilisés dans les projets scientifiques. Pour cela, les chercheurs définissent et mettent en place les accouplements avec les zootechniciens pour des objectifs de production adaptés aux projets scientifiques. La production est suivie avec des rapports trimestriels avec des indicateurs de productivité adaptés. Chaque trimestre, la production peut donc être revue et réajustée. Elle sera réduite au strict besoin, limitant le nombre de prélèvements de tissus pour génotypage. Nous cherchons au maximum à optimiser les schémas d’accouplements (mutations portées par les parents) pour réduire le génotypage ou éviter l’apparition d’un phénotype dommageable. Nous favorisons les élevages qui fournissent 100% d’animaux utiles ce qui permet de réduire le nombre d’animaux à produire d’une part et d’autre part permet de ne pas génotyper tous les individus. Pour le génotypage en gestion de colonie, nous recherchons systématiquement les lignées non ou peu utilisées. La production de ces lignées est soit fortement réduite, soit arrêtée. Elles sont en parallèle sécurisées par cryoconservation des gamètes ou des embryons. Il est compliqué d’apprécier l’impact de ces mesures sur la réduction mais il est aisé de comprendre qu’elles concourent toutes à l’optimisation de la production aux seuls animaux qui seront utilisés dans les projets scientifiques ou en gestion de colonies et donc de réduire le nombre d’animaux à génotyper ou exprimant le phénotype dommageable. Enfin, nous cherchons à améliorer nos pratiques. Tout d’abord, si le prélèvement invasif est indispensable, nous nous orienterons vers la coupe à l’oreille par rapport à la coupe de queue plus douloureuse et nous sommes en cours de mise au point de la technique de prélèvement de follicule de poil considérée sans douleur que nous espérons pouvoir mettre progressivement en place dans les années à venir. La procédure d'évaluation du bien-être des animaux est basée sur les recommandations du guide Européen sur les animaux génétiquement altérés soit 14 animaux sur 2 générations.
Raffinement
Les techniques de prélèvement de tissus pour le génotypage sont effectuées en routine et le geste est très court et précis. La douleur est légère. Le raffinement est de s’assurer d'un process cadré et éprouvé, appliqué par des zootechniciens expérimentés pour réduire le stress des animaux, l’intensité et la durée de la douleur induite. L’utilisation de pommade anesthésiante n’est pas envisagée pour éviter une intervention plus longue et le produit pourrait interférer avec la technique de génotypage. L’analgésie par injection n’est aussi pas recommandée car la piqûre augmente la nuisance sur l’animal. Toutefois, les éléments suivants sont mis en place : manipulation par un zootechnicien expérimenté, le poste de prélèvement est codifié et préparé en amont pour éviter les gestes parasites pendant le prélèvement pour réduire le stress des animaux. L’animal est pris en contention et la biopsie est rapidement et précisément effectuée avec un matériel désinfecté et aiguisé pour réduire le temps et intensité de douleur. L’animal, remis dans sa cage est observé. En cas de mauvaise reprise de l’activité ce qui constitue le principal point limite, il sera pris en charge. Les observations quotidiennes permettent de s’assurer de la bonne cicatrisation. En cas de mauvaise cicatrisation (point limite) des pommades cicatrisantes peuvent être utilisées. Chez le poisson un raffinement particulier est apporté aux conditions d’isolement maintenues dans le système d’hébergement en circulation, maintenant des paramètres d’eau stables. Le point limite est de s’assurer de la bonne nage des poissons. Pour le raffinement des phénotypes dommageables, les lignées sont aujourd’hui bien connues et le phénotype bien caractérisé. La stratégie de raffinement est de mettre en place le plus tôt possible une procédure de surveillance de l’apparition des nuisances (le caractère spécifique du phénotype ne nécessite pas l’utilisation d’une grille pour la détermination du point limite). Il peut s’agir également d’avoir une procédure d’hébergement adapté avec l’ajout d’un enrichissement ou des manipulations très douces pour les lignées modèles d’épilepsie par exemple. La procédure d’évaluation du bien-être animal est non invasive et sans douleur basée sur l’utilisation d’une grille de paramètres zootechniques et physiologiques. Le risque est la détection d‘un phénotype dommageable qui sera immédiatement pris en charge et classifié selon la procédure sur la gestion des phénotypes dommageables.
Choix des espèces
La création de modèles pour comprendre des pathologies humaines est très développée chez la souris car les outils pour générer ces modèles génétiquement modifiés sont très efficaces. D’autre part, la souris est un mammifère avec de nombreuses similitudes dans les processus biologiques avec l’homme. Son temps de génération est considéré court (3 mois) et son élevage simple en laboratoire. Le poisson-zèbre est un modèle incontournable pour la recherche : une fécondation et un développement embryonnaire externe rapide et transparent, la facilité d’accès au matériel génétique permettant le développement des techniques d’ingénierie génétique. Son génome présente 70% d’homologie avec celui de l’homme (85% pour les gènes impliqués dans des pathologies humaines), il présente également des capacités originales de régénération des tissus (système nerveux, rétine, cœur, etc.) qui en font un modèle idéal pour la compréhension de ces mécanismes, pouvant aboutir à l’identification de pistes thérapeutiques majeures transposables chez l’homme. Pour les biopsies : souris à partir de 14 jours jusqu'à 4 semaines maximum. L'essentiel des lignées sont génotypées à 14 jours pour permettre d'avoir le résultat de génotypage au sevrage et de sélectionner uniquement les animaux d'intérêt à l’âge adulte. La biopsie de nageoire : majoritairement jeune adulte entre 1 et 3 mois avant maturité sexuelle afin de ne conserver que les animaux de génotype d'intérêt à l'âge adulte, des animaux plus vieux peuvent être concernés en cas de doute ou erreur sur le génotype.
Utilisation de sondes fluorescentes chez la souris pour une meilleure compréhension des mécanismes de distribution et d’internalisation des récepteurs
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une chirurgie du cou pour cathétériser l'artère carotide, avec un risque d'atteinte du nerf vague et de rupture de vaisseau, précède une perfusion de cinq minutes de sondes fluorescentes. 24 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Le porteur écrit que l'exposition aux sondes "sera rapidement suivie de la mise à mort des animaux ce qui devrait limiter toute nuisance potentielle", présentant ainsi la mise à mort comme une mesure de protection. Cinq des 24 souris sont affectées au "réapprentissage des gestes de chirurgie" et ne rejoignent le projet que si l'opération réussit, quatre servent à fixer la dose, et les quinze dernières aux trois sondes à tester.
Objectifs
L'accident vasculaire cérébral (AVC) est la deuxième cause de décès et la troisième cause d'invalidité dans le monde. Lorsqu'une personne subit un AVC, une hormone appelée angiotensine II est produite en plus grande quantité. En se fixant sur son récepteur, cette hormone va induire une contraction des vaisseaux sanguins ce qui va réduire l’apport de sang au cerveau et donc augmenter la gravité de l'AVC. Certains nouveaux candidats médicaments sont capables de faire rentrer ces récepteurs hormonaux à l’intérieur des cellules, les rendant donc inaccessibles pour l’angiotensine II. Ceci permettrait de prévenir la contraction des vaisseaux sanguins cérébraux. Cette internalisation des récepteurs pourrait donc participer à une protection cérébrovasculaire en cas d’AVC. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons développé et testé sur cellules, des outils fluorescents spécifiques permettant de localiser avec précision ces récepteurs. L’objectif de ce projet est de tester ces outils fluorescents pour visualiser in vivo la distribution et l’internalisation des récepteurs dans les vaisseaux cérébraux notamment en définissant les doses des outils fluorescents à utiliser in vivo.
Bénéfices attendus
Ce projet préliminaire nous permettra de fixer la dose des sondes à utiliser in vivo puis de valider la méthodologie d’évaluation de la distribution des récepteurs. L’étude de cette distribution des récepteurs est importante pour comprendre et caractériser les mécanismes et les effets de certains traitements de l’accident vasculaire cérébral.
Procédures
Les souris subiront une chirurgie carotidienne pour cathétérisation de l’artère carotide puis une infusion de 5 minutes via ce cathéter sera effectuée. L’expérimentation n’excédra pas 1h.
Impact sur les animaux
risques d’atteintes du nerf vague lors du cathétérisme de l’artère carotide L’exposition à ces sondes (durée de perfusion de 5 minutes) sera rapidement suivie de la mise à mort des animaux ce qui devrait limiter toute nuisance potentielle dues à ces molécules.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de récupérer le cerveau et le sang pour des analyses.
Remplacement
Pas de remplacement possible car l’objectif est de visualiser et étudier la distribution des récepteurs de l'angiotensine II directement au niveau du tissu cérébral et cérébrovasculaire. Les outils fluorescents spécifiques que nous souhaitons tester ont été synthétisées et purifiées par des laboratoires partenaires. Leur caractérisation pharmacologique complète a été réalisée sur des modèles cellulaires et ex vivo (artère cérébrale isolée perfusée) qui permettent d’estimer les doses nécessaires à notre objectif.
Réduction
Afin de réduire au maximum l’utilisation d’animaux, la détermination de la dose à administrer sera déterminée dans un premier temps pour un seul outil fluorescent. La dose à utiliser pour les 2 autres outils fluorescents sera basée sur l’utilisation de la première car nos études préliminaires montrent une affinité équivalente pour nos 3 outils fluorescents. Le nombre total d’animaux pour ce projet sera de 24 : 5 souris dédiées au réapprentissage des gestes de chirurgie (si succès de la chirurgie, ces souris seront incluses dans le projet), 4 souris afin déterminer la dose des sondes à utiliser (2 souris pour 2 doses différentes) et enfin 15 souris (5 souris pour chacune des 3 sondes à tester). Ce projet étant un test préliminaire, aucun test statistique n’a été utilisé.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en portoir avec des cages ventilées et filtrées, à 5 souris par cage. Ces cages seront enrichies (tunnel en polycarbonate, buchette de peuplier…) – période d’acclimataion minimale de 1 semaine. Pendant toute la durée de la chirugie et jusqu’à la mise à mort de l’animal, la profondeur de l’anesthésie sera régulièrement contrôlée par l’absence de reflexe de retrait de la patte aux pincements interdigitaux et absence du réflexe cornéen ; un anti-douleur sera administré 1 h avant le début de la chirurgie ; la température corporelle sera contrôlée via une sonde rectale et maintenue à 37°C; la cornée sera protégée par un gel ophtalmique ; la durée d’utilisation des animaux sera limitée à 1h sous anesthésie, avec contrôles des paramètres vitaux à des valeurs physiologiques. Les animaux seront mis à mort par surdose d’anesthésie en cas de lésion du nerf vague ou d’une rupture d’un vaisseau avec hémorragie trop importante lors de la chirurgie.
Choix des espèces
Les souris utlisées seront des C57Bl/6j mâles agées de 10 semaines, poids entre 20 et 30g). C’est ce même modèle de souris qui a été utilisé pour les études cérebrovasculaires et cardiovasculaires précedentes, afin de permettre la comparaison. Cet âge correspond à un stage adulte jeune chez qui la pose d’un cathéter dans l’artère carotide est facilitée par rapport à des animaux plus jeunes.
Elevage de lignées murines génétiquement modifiées pour l’étude du développement des cellules hématopoïétiques.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Immunodéficientes par construction génétique, les souris de ces lignées développent des tumeurs à partir de deux mois et succombent entre trois et six mois à l'envahissement de la cage thoracique. 412 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 300 d'entre elles et sévère pour 112, l'objet du projet étant d'élever ces lignées pour étudier le développement des cellules souches du sang. Les actes déclarés se limitent à une biopsie de phalange entre le septième et le dixième jour après la naissance, sur des nouveau-nés, et à une surveillance quotidienne des doubles mutants pour repérer les signes d'anémie sévère, alimentation et mobilité réduites, croissance altérée, blancheur des pattes. Toutes les souris à phénotype dommageable sont tuées avant deux mois, avant l'apparition des tumeurs, et leurs cellules hématopoïétiques sont analysées, y compris chez des fœtus prélevés à partir du treizième jour de gestation.
Objectifs
Les cellules du sang assurant l’oxygénation des tissus et la défense immunitaire se développent à partir d’un petit nombre de cellules appelées : cellules souches hématopoïétiques (CSH). L’ensemble des mécanismes biologiques qui contrôlent le pool de CSH au cours de la vie ainsi que la différenciation de ces CSH en cellules du sang ne sont pas totalement élucidés. D’autre part la perturbation de ces mécanismes participe au développement de maladies auto-immunes et de leucémies chez l’homme. Aussi une meilleure compréhension de la biologie de ces cellules permettra de développer des cibles et des stratégies thérapeutiques pour les pathologies humaines. Nous nous intéressons plus particulièrement à une famille de protéines responsable de pathologies hématopoïétiques humaines notamment dans certaines leucémies. Ce projet vise à déterminer le rôle de ces protéines dans le développement précoce des cellules souches hématopoïétiques en utilisant des souris génétiquement invalidées pour ces protéines. Ce projet consiste à l'élever des lignées de souris génétiquement modifiées qui présentent un phénotype dommageable avec une baisse de l'immunité et le développement de tumeur.
Bénéfices attendus
L'étude de souris déficientes pour des protéines impliquées dans l'immunité et le développement de tumeurs thymiques, nous permettra de définir les rôles de ces protéines durant la mise en place du système sanguin, ce qui à notre connaissance n’est pas été élucidé. La compréhension du développement des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques est importante pour élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans les pathologies du sang (telles que l’anémie, les maladies auto-immunes et les leucémies) et pour améliorer les techniques d’expansion de ces cellules lors de greffe de cellules hématopoïétiques dans le cadre de thérapies anti-cancéreuses.
Procédures
Les souris déficientes pour les protéines étudiées dans cet élevage ont une immunité réduite (immunodéficientes) et développent des tumeurs après l'âge de 2 mois.La biopsie de phalange se fait entre 7 et 10 jours.
Impact sur les animaux
Les souris immunodéficientes sont plus suceptibles aux infections d'opportunistes pour prévenir de cela ces animaux seront élevés dans des conditions les plus aspetiques possibles. Les souris développant des tumeurs susccombent entre 3 et 6 mois suite à l'envahissement de la cage thoraxique par la tumeur. Ces animaux seront euthanasiés bien avant le développement de ces tumeurs à l'âge de 2 mois. L’effet indésirable est la nuisance du prélèvement des phalanges entre le 7ieme et le 10ieme jours postpartum qui génère une douleur légère de courte durée.
Devenir
Toutes les souris à phénotype dommageable produites seront mises à mort avant le développement de tumeurs et utilisées pour l'analyse des cellules hématopoïétiques.
Remplacement
La mise en place du système sanguin nécessitent des interactions cellulaires ainsi que des migrations de cellules hématopoïétiques dans l'organisme, ces mouvements cellulaires ne peuvent pas être remplacés par des systèmes ex-vivo. L'utilisation d'organismes vivants est donc nécessaire.
Réduction
Nous allons réduire le nombre d’animaux avec un phénotype dommageable en adaptant les croissements de souris et en limitant les croissements qui produisent ces souris. Les foetus possèdent un nombre réduit de cellules hématopoïétiques réduisant ainsi le nombre de cellules pouvant être analysées par individu, pour cela nous envisageons d’utiliser 12 fœtus /génotype et par stade de développement. Autour de la naissance, le nombre de cellules hématopoïétiques est déjà plus important et à ces stades de développement 10 animaux /génotypes seront suffisant pour les analyses de tissus et de populations hématopoïétiques. Les animaux de 30 jours ont une taille proche de l’adulte et les cellules hématopoïétiques sont présentes en plus grand nombre, les expériences seront réalisées sur 6 animaux à phénotypes dommageables. Les cellules et tissus hématopoïétiques issus des foetus et des animaux seront comparés à des animaux contrôles sauvages et hétérozygotes de phénotype non dommageable.
Raffinement
Pour réduire au minimum les nuisances liées à l’immunodéficience des souris, nous allons héberger ces animaux dans un environnement le plus aseptique possible (cages ventilées et filtrées et manipulation des animaux sous hotte). Et pour éviter les souffrances des animaux développant des tumeurs thymiques, nous euthanasierons ces animaux avant l’apparition des tumeurs et des douleurs liées à celles-ci à l’âge de 2 mois. Dans ces conditions d’élevages et d’après les utilisations décrites pour ces animaux ne souffrent pas de surinfection ou de douleurs tumorales. Les animaux doubles mutants feront l'objet d'une observation accrue par observation quotidienne jusqu'a 10 jours puis tous les 2 jours pour détecter des signes de souffrances liés à une anémie sévère (alimentation et mobilité réduite, croissance des nouveau-nés altéré, blancheur des pattes) et en cas de souffrance les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux modèles de choix facilement modifiables génétiquement et pour lesquels nous disposons d’un grand nombre d’outils moléculaires ( ex : Anticorps, cytokines…) permettant l’étude des cellules hématopoïétiques. Le développement des cellules hématopoïétiques murines débute chez l’embryon à partir de l’émergence des cellules sanguines au stade embryonnaire (E) 9,5 jusqu’au stade de jeune adulte (2 mois). Les stades de développement utilisés dans ce projet sont les stades embryonnaires 13,5 ; 14,5; 15,5; 16,5 et 18,5 jours post-coïtum, les nouveau-nés à la naissance (P0) et à 1 jour (P1) ainsi que les jeunes à 10, 30 et 60 jours après la naissance.