Souris
Évaluation des effets thérapeutiques cardiaques d’un nouveau virus adéno-associé
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Trente-deux souris sont cathétérisées jusque dans le cœur par la veine jugulaire, sous anesthésie générale, et ne sont pas réveillées. 126 souris au total vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 94 d'entre elles et modéré pour 32. Baguées et biopsiées à trois semaines pour vérifier leur statut génétique, elles reçoivent une injection de virus adéno-associé à sept semaines, puis de trois à cinq électrocardiogrammes et un examen échographique, certaines jusqu'à l'âge de soixante semaines. Le porteur justifie la mise à mort systématique après cathétérisme par l'impossibilité de suturer la veine jugulaire, qu'il faut donc ligaturer, et par le risque que le cathéter lèse les valves cardiaques et provoque une insuffisance cardiaque droite.
Objectifs
L'objectif général du projet est d'évaluer les effets thérapeutiques d'un virus adéno-associé sur un modèle de souris présentant des troubles de la conduction de l'influx électrique cardiaque liés à une perte de fonction d'un gène impliqué dans cette conduction. Chez les humains, les mutations conduisant à une perte de fonction de ce gène sont à l'origine de pathologies génétiques responsables de morts subites (syndrome de Brugada et troubles de la conduction cardiaque) pour lesquelles il n'existe pas de thérapie préventive. Le virus adéno-associé a été montré, dans un modèle cellulaire, comme étant susceptible d'avoir un intérêt thérapeutique. Les objectifs spécifiques du projet sont d'évaluer les effets du virus adéno-associé sur : 1. la vitesse de conduction de l'influx électrique cardiaque, à l'aide d'enregistrements de l'électrocardiogramme ; 2. la survenue d'arythmies ventriculaires ; 3. l'apparition de fibrose cardiaque secondaire à la perte de fonction du gène de la conduction au cours du vieillissement. Ces deux derniers objectifs ne seront réalisés que si le virus adéno-associé permet une amélioration de la vitesse de conduction de l'influx électrique cardiaque.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du virus adéno-associé sont une amélioration significative, voire une restauration complète de la vitesse de conduction de l'influx électrique cardiaque, et une disparition des arythmies ventriculaires et du remodelage fibrotique cardiaque.
Procédures
Trois semaines après la naissance, les souris seront baguées et biopsiées (afin de vérifier leur statut génétique) sous anesthésie générale. Dans une première étape du projet, 32 souris seront soumises à une injection du virus adéno-associé à l'âge de 7 semaines, à 3 enregistrements de l'électrocardiogramme à l'âge de 7 (durée de 3 min), 9 (3 min) puis 12 semaines (15 min), et un examen échocardiographique (15-20 min) à 12 semaines, réalisés sous anesthésie générale. En fonction des résultats obtenus dans la première étape, 32 autres souris seront soumises à une injection du virus adéno-associé à l'âge de 7 semaines et 2 enregistrements de l'électrocardiogramme (durée de 3 min) à l'âge de 7 puis 9 semaines, réalisés sous anesthésie générale, puis une exploration électrophysiologique par cathétérisme intracardiaque, d'une durée de 20-30 min, réalisée sous anesthésie générale et analgésie locale, sans réveil. Enfin, en fonction des résultats obtenus dans l'étape 1, 20 souris supplémentaires seront soumises à une injection du virus adéno-associé à l'âge de 7 semaines, à 5 enregistrements de l'électrocardiogramme (durée de 3 min) à l'âge de 7, 9, 30, 45 et 60 semaines et 1 examen échocardiographique (15-20 min) à 60 semaines, sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Le modèle de souris utilisé dans ce projet est étudié depuis de nombreuses années. Ces souris présentent un trouble de la conduction de l'influx électrique cardiaque qui augmente progressivement avec l'âge, comme les patients, mais qui ne conduisent pas à des blocs complets de la conduction comme observé chez certains patients ou à la survenue de tachycardies ventriculaires sévères et/ou fibrillation ventriculaire comme observé chez d'autres patients. Elles se développent normalement et ne présentent pas de signes notables de souffrance. L'injection des virus adéno-associés sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie locale au point d'injection afin d'éviter stress et douleur. Les examens réalisés pour étudier les effets cardiaques des virus adéno-associés (enregistrement de l'électrocardiogramme et échographie) ne sont pas des techniques générant de la douleur mais ils seront cependant réalisés sous anesthésie générale pour éviter tout stress des souris et les maintenir en position stable. Pour les mêmes raisons, l'exploration électrophysiologique par cathétérisme intracardiaque sera également réalisée sous anesthésie. Cette procédure entraine une douleur au niveau du point de ponction cutanée pour cathétériser la veine jugulaire, qui sera prévenue par une anesthésie locale, comme cela est fait chez les patients. En ce qui concerne le virus adéno-associé, une étude antérieure a montré qu'il n'entraine pas d'effet indésirable chez des souris sauvages aux doses conduisant à un effet bénéfique dans le modèle cellulaire.
Devenir
A l'issue de la procédure 2 (effets du virus adéno-associé sur la fonction cardiaque), les souris seront mises à mort à la fin de l'examen échographique afin de prélever leur cœur pour des examens immunohistochimiques. A l'issue de la procédure 3 (exploration fonctionnelle par cathétérisme intracardiaque), les souris sont systématiquement mises à mort parce que cette procédure peut avoir des conséquences néfastes sur la souris. En effet, il est possible, mais difficile de suturer la veine jugulaire après avoir retiré le cathéter, ce qui nous oblige à la ligaturer pour éviter les hémorragies, perturbant ainsi le retour veineux depuis la tête de l'animal. Par ailleurs, bien que les cathéters aient un diamètre très faible (1/3-1/2 mm), ils sont suffisamment gros pour léser les valves cardiaques, ce qui peut induire une insuffisance cardiaque droite à plus ou moins long terme. La mise à mort des souris permet en outre de prélever le cœur pour des études biochimiques. A l'issue de la procédure 4 (effets à long terme du virus adéno-associé), les souris seront mises à mort à la fin de l'examen échographique afin de prélever leur cœur pour des examens histologiques.
Remplacement
Cette étude fait suite à une étude in vitro réalisée avec un modèle cellulaire, puis une étude in vivo chez la souris sauvage qui montrent que la surexpression du virus adéno-associé entraine une augmentation de l'expression du gène cible. Ces études sont à la base de ce projet réalisé sur un modèle pertinent pour la pathologie humaine. Seule l'expérimentation réalisée sur des animaux vivants peut permettre de démontrer une efficacité du traitement sur la fonction cardiaque : l'observation d'un effet bénéfique sur un modèle cellulaire est un pré-requis mais ne préjuge en rien de l'efficacité in vivo. Très spécifiquement dans le cadre de ce projet, les effets protecteurs de ce traitement sur les anomalies structurales du myocarde (fibrose) apparaissant au cours du vieillissement ne peuvent être appréhendés que sur l'animal vivant.
Réduction
Plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux (électrocardiographie et échocardiographie), afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Le projet est organisé en deux étapes successives. La seconde étape ne sera réalisée que si la première démontre que les souris traitées avec le virus adéno-associé présentent une amélioration significative de leur conduction cardiaque. Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en conciliant une puissance statistique suffisante à une interprétation la plus juste des données obtenues. Leur taille a été déterminée à l'aide du logiciel de statistiques Sigmastat sur la base de notre expérience antérieure. Une analyse statistique des résultats sera réalisée avec le même logiciel.
Raffinement
Lors du sevrage, le prélèvement d'une biopsie pour déterminer le statut génétique des souris est réalisé sous anesthésie générale. Les souris sont hébergées en cages ventilées enrichies de tunnels ou de cabanes pour se camoufler et/ou de frisottis pour fabriquer des nids. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Lors des examens électrocardiographiques et échographiques, ainsi que lors de la mise à mort, les animaux sont sous anesthésie générale. L'exploration fonctionnelle par cathétérisme intracardiaque est réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Lors des anesthésies, la température corporelle est maintenue à l'aide d'un tapis chauffant rétrocontrôlé par une sonde rectale. A l'issue des procédures nécessitant une anesthésie, les souris sont placées dans des cages placées sur des tapis chauffants et surveillées de façon accrue jusqu'à leur réveil complet. Afin d’éviter toute douleur ou souffrance des souris, des signes cliniques (avec score de gravité) ont été définis pour chaque procédure et définissent les points limites au-delà desquels l’expérimentation est arrêtée et l’animal euthanasié sous anesthésie.
Choix des espèces
Le modèle de souris utilisé est le seul modèle murin de perte de fonction du gène de la conduction. Ce modèle est bien caractérisé et représente un bon modèle des pathologies humaines résultant des mutations "perte de fonction" de ce gène. Les souris seront injectées avec les virus adéno-associés à l'âge de 7 semaines, puis étudiées jusqu'à l'âge de 12 semaines dans la première étape, et de 60 semaines dans la seconde, parce que ces pathologies ne touchent que très rarement les enfants et les adolescents. Les souris utilisées seront des mâles et des femelles dans des proportions comparables parce que les pathologies d'intérêt chez l'humain touchent tous les genres. L'injection du virus à l'âge de 7 semaines permet, d'une part, de réduire la quantité d'AAV9 injectée et, d'autre part, d'obtenir une expression optimale de l'AAV9 avant d'en étudier les effets cardiaques chez les jeunes souris adultes (9, puis 12 semaines). Si le traitement s'avère efficace sur la conduction de l'influx électrique cardiaque, l'étude réalisée à l'âge de 60 semaines permettra de déterminer ses effets à long terme sur l'apparition de fibrose cardiaque observé normalement chez ces souris.
Evaluation de la réponse immunitaire de nanoparticules peptidiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Tuées pour qu'un volume de sérum jugé suffisant soit prélevé, 20 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent trois injections vaccinales, aux premier, quatorzième et vingt-huitième jours, un prélèvement sanguin précède la première dose, et leur sang est collecté après leur mise à mort. Le porteur indique n'avoir identifié, lors des essais antérieurs, aucun symptôme, ni rougeur, ni lésion cutanée, ni kyste au point d'injection. L'enjeu est industriel autant que scientifique, comparer ses nanoparticules peptidiques aux nanoparticules lipidiques déjà commercialisées, une formulation stable à 4 °C qui "simplifierait grandement" la préparation des doses et abaisserait les coûts de production.
Objectifs
Ce projet repose sur de nouvelles formulations permettant le transfert intracellulaire d’ARN messagers (ARNm). Jusqu’à présent, les ARNm sont exclusivement formulés avec des cocktails de lipides. Or ces complexes lipidiques présentent des stabilités limitées dans le temps, rendant nécessaire de les transporter et de les stocker à basses, voire très basses, températures (-20 à -80°C). Une fois une fiole décongelée et diluée dans les conditions adaptées à une injection intramusculaire, il est préconisé par Pfizer/BioNTech de ne pas utiliser ces préparations au-delà de 6 heures et de les éliminer. De notre côté, nous avons mis en évidence la très bonne stabilité des particules peptidiques que nous formons, sur plusieurs semaines après leur formulation et un simple stockage à 4°C. Récemment, nous avons réalisé une phase de vaccination sur des lapins et des souris et nous avons obtenu des évidences claires que les nanoparticules à base de peptides généraient une réponse immune. Cependant, nous n’avons pas pu établir une comparaison quantitative et qualitative de la réponse immunitaire chez l'animal entre nos nanoparticules peptidiques et les nanoparticules lipidiques actuellement sur le marché. Ainsi, nous souhaitons comparer la réponse immunitaire chez la souris avec ces deux types de formulations.
Bénéfices attendus
L’évaluation de l’efficacité des nanoparticules à générer une réponse immunitaire est un point crucial pour notre étude. Cependant, si nous avons des éléments expérimentaux démontrant une réponse immunitaire chez l’animal (souris et lapins), nous n’avons pas la possibilité expérimentale de savoir si cette réponse est aussi efficace que celle obtenue avec les ARNm commerciaux. Dans le cas d’une réponse immunitaire comparable selon les deux procédés, les perspectives pour le développement d’une formulation exclusivement réalisée avec un peptide seraient de nature à simplifier grandement les protocoles de préparations des doses vaccinales qui seraient alors basées sur un simple mélange entre ARNm et peptide, à température ambiante, et avec un transport et un stockage ultérieurs qui seraient grandement facilité. Ce nouveau type de formulation permettrait de réduire les couts de production des préparations vaccinales. Les résultats de ces études seront publiés et accessibles à la communauté scientifique et médicale.
Procédures
Le nombre d’intervention prévu chez les animaux sont au nombre de cinq. Une première intervention le premier jour permettra sur quelques minutes d’une part un prélèvement de sang chez l’animal non-traité, couplé à l’injection classique en intramusculaire d’une première dose vaccinale. Une deuxième injection vaccinale se déroulera au 14eme jour de l’expérimentation sur un processus global d’une minute. Une dernière injection sur une minute le 28eme jour assurera un « rappel vaccinal ». L’animal sera alors euthanasié (une minute) et son sang collecté pour réaliser de analyses ultérieures.
Impact sur les animaux
Les études expérimentales réalisées préalablement à cette phase n’ont pas permis d’identifier de symptômes de quelque nature que ce soit (rougeurs, lésions cutanées, kystes au point d’injection…).
Devenir
Afin d’obtenir des volumes de serum conséquents, les souris seront euthanasiées et le sang prélevé afin de procéder aux dosages d’anticorps correspondants aux types de vaccins utilisés.
Remplacement
Une réponse immunitaire globale est régie par une multitude de processus qu’il est impossible de mimer en milieu ex corpus. De fait, seules des injections selon des protocoles proches de ceux adoptés lors de stratégies vaccinales permettront d’évaluer tous ces paramètres.
Réduction
Nos procédures sont peu ou non-invasives, ce qui nous permet de maximiser le nombre d'expériences réalisées par la suite tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés au départ. Pour établir une signification précise de la réponse immunitaire obtenue, nous avons déterminé que des groupes de dix animaux était requis pour avoir une idée objective de la réaction des différents animaux aux types de vaccination reçue. Dix animaux par groupe sont ainsi nécessaires et suffisants.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement qui respectent leur bien-être (contrôle de la température et de l’hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence d’enrichissement, change régulier des litières, eau et nourriture à volonté, surveillance quotidienne des animaux). Toutes les procédures sont réalisées de façon à limiter le stress et la souffrance des animaux (anesthésie et antalgique en cas de douleur). Les souris seront surveillées quotidiennement par nos soins et du personnel qualifié pour détecter le moindre signe de souffrance de l’animal. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (grilles d’évaluations et points limites) sera strictement respecté, et effectué régulièrement en concertation avec l'équipe de zootechnie.
Choix des espèces
Il s’agit de souris tout à fait adaptées à des études générales incluant des analyses de toxicologie, de tératologie, de pharmacologie ou de physiologie. Nous souhaitons, dans le cadre de ce programme de recherche, mettre en évidence une méthodologie alternative de préparations vaccinales pour induire une réponse immunitaire. Nous recevrons donc des animaux âgés de 2 mois, un âge reconnu pour avoir un système immunitaire mature., Ces animaux seront suivis pour une durée de 5 semaines (injections de 3 préparations vaccinales à J0, J14 et J28, et prélèvement sanguin final à J35).
Rôle du ganglioside A2B5 dans la réponse immunitaire dans le glioblastome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
La mise à mort est déclenchée dès qu'une souris perd 20 % de son poids, convulse, se paralyse, se prostre ou n'arrive plus à se déplacer. 68 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit une greffe intracérébrale de cellules de glioblastome au cours d'une intervention chirurgicale d'environ trente minutes, et la tumeur provoque ensuite une perte d'appétit, une malnutrition puis une perte de poids, le porteur ne qualifiant de "douleur légère de courte durée" que les injections. Il vise à comprendre le rôle d'une molécule, A2B5, dans la réponse immunitaire, ce qui "permettrait" selon lui de nouvelles thérapies contre une tumeur cérébrale aujourd'hui sans traitement curatif.
Objectifs
A2B5 est une molécule exprimée par les cellules tumorales de glioblastome (tumeur cérébrale). L'objectif est d’analyser le rôle de la molécule A2B5 dans la réponse immunitaire. Pour cela, nous étudierons l'impact de l'expression de A2B5 dans l'activation du système immunitaire et dans le développement de la tumeur.
Bénéfices attendus
Le glioblastome est une tumeur cérébrale est une pathologie fatale (médiane de survie de 1 an) et pour laquelle il n’existe aucun traitement curatif. Une meilleure compréhension du rôle joué par la molécule A2B5 (exprimé par la tumeur) dans les mécanismes immunitaires permettrait la mise en place de nouvelles thérapies pour les patients atteints de glioblastome.
Procédures
Les animaux recevront une greffe intracérébrale de cellules tumorales de glioblastome (68 animaux, une seule intervention de 30 minutes environ). Les greffes intracérébrales sont des procédures chirurgicales.
Impact sur les animaux
La manipulation, contention des animaux, les injections d'anesthésiques pour la réalisation de la craniotomie sont générateurs de stress pour les animaux. Par ailleurs les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. La progression tumorale induite par la maladie (glioblastome) provoque à terme une perte d'appétit, donc une malnutrition et finalement une perte de poids.
Devenir
L'ensemble des souris impliquées dans ce projet feront l’objet d’une analyse du système immunitaire et de l'évolution tumorale, ce qui nécessitera leur mise à mort.
Remplacement
Les nombreux partenaires (cellulaires et moléculaires) des processus dynamiques immunitaires et tumoraux nécessitent une approche expérimentale in vivo car il n’existe pas à ce jour de système suffisamment fiable pour mimer cette complexité biologique.
Réduction
Le nombre d'animaux prévu dans chaque groupe est basé sur un calcul d'effectif permettant de prédire que nous avons 80% de chance d’obtenir un résultat statistiquement significatif.
Raffinement
La détection de toute souffrance de l’animal sera assurée et le niveau de souffrance évalué en fonction d’une grille de score. Les animaux seront euthanasiés dès l’apparition d’un signe de détresse (perte de poids supérieure ou égale à 20% du poids initial, convulsions, paralysie, prostration, difficulté à se déplacer). Pour le bien-être de l'animal, les souris seront logées selon les normes requises avec un enrichissement (copeaux de bois, dômes) et en groupes de 5 individus par cage afin d’éviter le stress de l’isolement.
Choix des espèces
Les données bibliographiques démontrent que le modèle murin est le plus adapté pour aborder les questions relatives aux tumeurs cérébrales et à l'immunité tumorale. Les tumeurs de glioblastome générées dans ce modèle animal précis sont particulièrement similaires aux tumeurs humaines. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 6 semaines et utilisées à l’âge de 7 semaines, en accord avec les protocoles décrits pour ce modèle physiopathologique classique.
Validation de l’immunisation contre des protéines membranaires impliquées dans le processus de carcinogenèse chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit cinq injections intramusculaires ou sous-cutanées et subit huit prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, avec un risque de plaie ou d'infection aux points de piqûre que le porteur mentionne. L'objet immédiat reste de vérifier que les souris fabriquent des anticorps contre des protéines repérées par criblage cellulaire, et que l'immunisation tient sur une année d'observation, l'effet anticancéreux n'étant abordé qu'ensuite. Le porteur écrit qu'il "apparaît nécessaire" de tester le rôle de ces protéines dans un modèle animal complexe, et renvoie la validation de leur intérêt thérapeutique à "d'autres projets déposés ultérieurement", donc à d'autres animaux.
Objectifs
Le vieillissement cellulaire est caractérisé par un arrêt de la prolifération cellulaire, qu’elle soit physiologique (vieillissement naturel) ou accéléré (stress oncogénique notamment). Considérée dans un premier temps comme bénéfique en permettant l’élimination de cellules anormales (cellules « âgées » ou présentant des mutations) ce vieillissement cellulaire est présenté actuellement comme pouvant avoir également une facette délétère. En effet une trop grande quantité de cellules vieillissantes peut induire la production de facteurs sécrétés qui vont jouer un rôle favorable dans le processus de carcinogenèse, aussi bien dans l’initiation que dans la propagation du Cancer. En combinant un criblage cellulaire et l’analyse de bases de données publiques des protéines membranaires impliquées dans le processus pro-tumoral ont pu être mise en évidence, afin de pouvoir développer de nouvelles approches thérapeutiques, soit prophylactique soit curative. Dans un premier temps chaque candidat identifié subira une étape de validation avec une approche in vitro. Ensuite il faut induire dans un modèle animal la production d’anticorps dirigés contre less candidats cibles. Pour chaque candidat cible 3 voies d'immunisation seront utilisées : une approche novatrice avec l’utilisation d’ARNm, une approche plus classique dite approche peptidique et une troisième approche combinant les deux. La production d’anticorps dirigés contre les protéines d’intérêt sera vérifiée ainsi que la durabilité de l’immunisation en observant sur une année les souris immunisées. Enfin si ce projet montre la capacité à « vacciner » sans effet secondaire les animaux contre ces protéines membranaires alors l’impact de cette vaccination comme thérapie anticancéreuse sera testé, soit dans une approche prophylaxique soit dans une approche curative.
Bénéfices attendus
Ce projet est un projet qui vise à démontrer la capacité à induire la production d’anticorps dirigés contre des protéines potentiellement impliquées dans le Cancer. Le but étant ensuite, au travers d’autres projets déposés ultérieurement, de valider l’impact de l’inhibition de ces protéines comme potentiel outil thérapeutique. La vaccination étant une voie novatrice explorée actuellement pour lutter de façon prophylaxique ou curative contre des maladies comme le Cancer.
Procédures
Lors de toutes les interventions décrites ci-après les animaux seront anesthésiés (anesthésie gazeuse) et un anesthésique local sera également appliqué (pommade, collyre). Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, 8 au total. Chaque prélèvement sanguin durera entre 3 et 5 minutes (de l'endormissement au réveil de l'animal). Pour immuniser les animaux ils recevront 5 injections qui pourront être intra-musculaires (ARNm), sous-cutanées (peptides), ou bien 2 intra-musculaires et 3 sous-cutanées. Chaque injection durera 5 à 6 minutes (endormissement, rasage, antalgique, injection, réveil).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir un stress modéré lors de la manipulation (pesée hebdomadaire, observation) et lors de l’initiation de l’anesthésie gazeuse. Les animaux pourront ressentir de la douleur lors de chaque prélèvement sanguin ainsi que lors de chaque injection, qu’elle soit réalisée en intra-musculaire ou en sous-cutanée. Risque de plaie ou d’infection au point d’injection ou au point de prélèvement.
Devenir
A l'issu de la procédure les animaux seront mis à mort. Du sang sera prélevé ainsi que les organes lymphoïdes (impliqués dans la réaction immunitaire) et un maximum d'organes afin d'étudier les modifications éventuelles liées à l'immunisation.
Remplacement
Des études montrent que les acteurs du vieillissement peuvent être impliqués dans le Cancer. Des analyses haut débits ont permis d'identifier certains de ces acteurs. Après avoir validé ces acteurs par des expériences in vitro, il appraît nécessaire de tester le rôle réel de ces acteurs dans un modèle animal complexe. Pour cela des animaux seront alors immunisés contre ces acteurs du vieillissement. Une fois que la production d'anticorps contre ces cibles aura été validé alors l'effet de cette "vaccination" pourra être testée dans des modèles de cancer.
Réduction
Ce protocole cherchera à réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. La capacité à immuniser des souris contre des protéines d’intérêt, qui sont produire à un faible niveau dans les conditions physiologiques, sera testée, après que les candidats cibles aient subi un maximum de test in vitro. Il n’y aura pas de tests statistiques dans ce protocole, le but étant pour chaque cible de voir quelle voie d’injection permet la production maximale d’anticorps, s’il y a bien production d’anticorps. Les deux sexes seront utilisés car, même si aucun effet sexe, nous ne pouvons l’exclure de façon définitive pour chaque cible. Enfin la collaboration pour ce projet avec une équipe qui a une très forte expertise concernant l'immunisation des souris permettra d'utiliser directement les concentrations optimales, ce qui permettra également de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Dès leur arrivée dans l’animalerie les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation aux expérimentateurs. Les animaux seront pesés une fois par semaine, et observés à la fois par le personnel animalier (une fois par semaine lors du change) et les expérimentateurs (une à deux fois par semaine, hors geste expérimental) dans le cadre du suivi de l’état général des souris. Une liste précise permettant de scorer les signes éventuels de souffrance sera alors utilisée afin d’évaluer si les animaux présentent des signes de souffrance ou d’atteinte d’un point limite qui entrainerait leur mise à mort. Afin de diminuer au maximum le stress et la douleur des animaux ils seront anesthésiés et recevront l'analgésie appropriée lors des injections et des prélèvements sanguins. Les animaux seront hébergés dans des cages présentant des enrichissements comme du coton de nidation, des batonnets de bois et éventuellement des tunnels.
Choix des espèces
Le modèle murin est un modèle de choix pour les études sur l’animal (1) de par son homologie avec le génome humain (plus de 90% d’homologie) et également (2) de par les différents modèles génétiques qui ont été développés chez la souris. Une fois que la production d'anticorps contre les cibles aura été validé, il sera nécessaire d'aller plus loin en testant l'impact de cette vaccination dans des modèles de cancer chez la souris (modèles génétiques de susceptibilité au Cancer). Les animaux seront utilisés à un stade jeune adulte car ce projet nécessite des animaux dont le système immunitaire est mature.
Evaluation in vivo de l’action antitumorale d’une surexpression de GPER sur la croissance et la réponse au traitement standard des glioblastomes dans un modèle de greffe orthotopique de glioblastome humain chez la souris immunodéprimée. (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
Une greffe de glioblastome humain dans le cerveau, au moins dix séances d'imagerie sous anesthésie, dix séances de radiothérapie, douze administrations du composé testé et un test d'éviction d'obstacle trois fois par semaine : 164 souris immunodéprimées vont subir ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tumeur cérébrale implantée provoque des effets délétères que le porteur qualifie lui-même de non réversibles, et la répétition des anesthésies peut entraîner une accoutumance obligeant à augmenter les doses administrées. L'objet du projet est de vérifier si l'augmentation d'une protéine, combinée à son activation par une molécule, ralentit la croissance tumorale et améliore la réponse aux traitements standards, les retombées annoncées pour les patientes et les patients restant renvoyées au conditionnel. 116 souris sont tuées dès l'atteinte d'un point limite, et 48 autres, dites "satellites", plus tôt encore, à la fin du schéma de traitement, pour analyser leurs tissus.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre comment l'augmentation de la quantité d'une protéine affecte la croissance des tumeurs cérébrales chez les souris, et favorise leur réaction aux traitements anticancéreux habituels. L'objectif final est d'appliquer cette méthode aux patients. Des études précédentes sur des données de patients ont montré que plus cette protéine est présente, meilleure est la survie des patients, surtout chez les femmes. En laboratoire, nous avons aussi observé que lorsqu'on augmente la quantité de cette protéine, le nombre de cellules tumorales diminue de moitié. De plus, nous avons constaté qu'un activateur de cette protéine a un effet antitumoral sur des tumeurs greffées sous la peau de souris, qu'elles soient mâles ou femelles. Notre objectif est maintenant d'étudier comment une augmentation de la quantité de cette protéine combinée à son activation par une molécule spécifique affecte la croissance tumorale et la réponse aux traitements anticancéreux standards dans un modèle de tumeur intracérébrale chez la souris (qui se rapproche de la réalité chez l'humain). Ce projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateurs différents.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de ce projet constitueront une base pour comprendre le rôle de la protéine étudiée dans l’augmentation de la survie des patients et éventuellement proposer l'utilisation de l'activateur de cette protéine pour le traitement des glioblastomes chez les patients dont la tumeur présente une forte quantité de cette protéine. Cette étape est indispensable pour soutenir le transfert clinique de nos travaux en lien avec une thèse de doctorat et les financements de la Ligue contre le cancer et du CNRS. En effet, ce projet innovant (très peu décrit dans la littérature) permettrait à terme de mieux comprendre les processus responsables des différences d'apparition des glioblastomes et de réponse au traitement entre les hommes et les femmes. En cas de résultats probants, cela permettrait d'apporter de nouvelles voies thérapeutiques pour la recherche clinique, notamment en employant des inducteurs (qui augmentent la quantité) et des activateurs (qui augmentent la fonctionnalité) de cette protéine dans le cas du traitement de tumeurs chimiorésistantes marquées par un échec thérapeutique (chimio-sensibilisation).
Procédures
- greffe intracérébrale (1 seule itération à J0) : durée=45 min (EU1) - Imagerie bioluminescence (au minimum 10 injections) : durée 15 min (EU2) - Traitement par radiothérapie (10 itérations) : durée 10 min pour chaque session (EU2) - Traitement par le composé d'intérêt (12 itérations) combiné ou nonà la chimiothérapie (10 itérations) : durée 1 min par traitement (EU1). - Test d'éviction d'obstacle (3 fois par semaine ) : durée 5 min (EU1)
Impact sur les animaux
La première nuisance attendue sur les animaux est liée à l'implantation même du glioblastome (apparition d'une tumeur cérébrale avec des effets délétères attendus non réversibles). Puis, le schéma de traitement par radiothérapie (itérations répétées) et l'imagerie par bioluminescence (2 ou 3 fois par semaine selon le timing dans le projet) nécessitent un transport et une anesthésie répétés des animaux. Lorsque les sessions de bioluminescence sont le même jour que la radiothérapie, une seule anesthésie sera réalisée, l'irradiation et l'imagerie se faisant sur le même site où est hébergé l'irradiateur. Une accoutumance liée à la répétition des anesthésies chimiques peut être observée, nécessitant une augmentation des volumes administrés : ce phénomène est maitrisé par le laboratoire. Une attention toute particulière sera portée aux animaux notamment en optimisant au maximum les conditions de transport des animaux. Les administrations quotidiennes de l'activateur de la protéine conduisent à un dérangement journalier des animaux, le cycle jour/nuit de l'animalerie étant inversé, la gêne occasionnée sera faible, les animaux étant ainsi manipulés durant leur phase d'activité. Le site d'injection dans le péritoine sera alterné chaque jour (gauche-droite) pour éviter les réactions liées à l'injection et des aiguilles très fines seront utilisées pour l'injection.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à l'issue des procédures. Ainsi 164 souris au maximum seront mises à mort dès lors de l'atteinte d'un point limite (étude efficacité/survie : 58 souris femelles et 58 souris mâles) ou plus précocement à l'issue du schéma de traitement de chaque groupe (48 souris "satellites" : 24 souris femelles et 24 souris mâles ). La mise à mort des souris "satellites" à la fin du schéma de traitement est justifiée de part la nécessité de réaliser une analyse des tissuss pour pouvoir caractériser l'impact de chaque modalité de traitement.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n'est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement et la réponse à un traitement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes. De plus, la mise en place d'une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires. En outre, la réponse d'une tumeur traitée par un médicament dépend de la quantité de médicament qui parvient à la tumeur. De plus, notre projet est directement associé à l'impact du statut hormonal engendré par le sexe des animaux. L'ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu'in vivo sur un modèle animal. Il est donc primordial de conforter ces résultats sur un modèle "in vivo" de façon à se rapprocher le plus possible de la réalité clinique.
Réduction
Chacune des 3 étapes sera d’abord réalisée chez des animaux femelles puisque la surexpression de la protéine d'intérêt est de bon pronostic essentiellement chez les femmes, puis éventuellement testée chez des animaux mâles pour évaluer la pertinence de cette modulation hormonale pour les hommes. Dans le cadre de ce projet, les expérimentations seront menées étape par étape, tout d’abord en réalisant l’étude sur les animaux "femelles" associés à l'étape 1 qui concerne la comparaison in vivo de la croissance tumorale de cellules avec une forte quantité de protéine par rapport à des cellules tumorales ayant une quantité modéré de la protéine étudiée. Nous implanterons d'abord la concentration habituelle de cellules : si cette dernière offre un bon taux de prise tumorale et une croissance tumorale acceptable cette concentration sera validée et les animaux du groupe suivant ne seront pas utilisés. A l'inverse, si cette concentration s'avère insuffisante, les souris du groupe 3 seront greffées avec une concentration double. La concentration "optimale" retenue sera celle utilisée dans le reste de l'étude. Notre démarche consistera à réaliser successivement plusieurs séries d’animaux. Concernant le nombre de souris satellites, il s’agira de comparer, indépendamment chez les mâles ou les femelles, l’effet des traitements par rapport au groupe contrôle par l’analyse de marqueurs dans les tissus prélevés : ces analyses sont fiables et ne nécessitent qu’un effectif réduit pour révéler un effet, s’il existe. Ainsi on estime -à priori- que même si l’effet des traitements est faible, un effectif de 6 souris / groupe sera suffisant pour assurer une puissance statistique suffisante (simulation par logiciel de calcul de puissance). Concernant le nombre de souris en suivi de croissance tumorale, la comparaison se fera aussi indépendamment chez les mâles et les femelles. Ainsi, sur la base de nos précédentes études, on estime que l’effet des traitements aura un effet faible sur la croissance tumorale. Au minimum 6 mesures d'imagerie seront réalisées en suivi de traitement. Le nombre minimum d’animaux nécessaires par groupe est ainsi trouvé 10 animaux par groupe pour assurer une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux, d'une part lors de l'implantation de la tumeur (réalisée sous anesthésie chimique, désinfection plaie, chirurgie aseptique, suivi post opératoire rigoureux) puis à la suite de la greffe (pesée 3 fois/semaine, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, suivi de la croissance tumorale). Une vigilance accrue sera également menée lors de l'administration des traitements (pesée quotidienne, vérification du comportement et de l'état sanitaire individuel des animaux, conditions de transport de façon à éviter au maximum stress des animaux). Un suivi quotidien garantissant le bien-être optimal des animaux sera mené (température d'hébergement optimale, eau de boisson et nourriture ad libitum, enrichissement sous forme de sopalin et de bâtonnets en bois à ronger). Quel que soit le groupe, nous réaliserons la mise à mort dès que les points limites définis apparaitront (perte de poids et problème de motricité essentiellement).
Choix des espèces
Dans les études menées pour comprendre le développement des cancers, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris immunodéprimées sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines, car du fait de leur immunodéficience, il n'y a pas de réaction de rejet du greffon tumoral implanté. Les souris mâles ou femelles seront âgées de 7 semaines au moment des greffes (20 à 26g), les animaux jeunes étant plus adaptés au développement de tumeurs cérébrales. L'intérêt lié au choix de cette tranche d'âge est également lié au fait que les animaux ont atteint leur maturité sexuelle et que leur système hormonal est fonctionnel.
IMPLICATION ET POLARISATION DES CELLULES MYELOIDES AU COURS DE L’ONCOGENESE
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Tatouées aux phalanges à trois semaines puis biopsiées à la queue pour génotypage, les souris reçoivent à l'âge adulte une injection intrapéritonéale de cellules tumorales qui déclenche un adénocarcinome ovarien, colorectal ou pancréatique. 2 493 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 2 448 d'entre elles, avec des traitements administrés par gavage, dans l'eau de boisson ou par voie intrapéritonéale tous les quatre jours pendant soixante jours. Le porteur décrit une accumulation de liquide d'ascite dans le péritoine aux stades tardifs et une altération de l'état général, tout en affirmant que des résultats antérieurs ont permis de vérifier que ces points limites ne sont pas atteints, le seuil de mise à mort étant fixé à 40 % de prise de poids. Toutes sont tuées à la fin pour prélever le sang et les organes.
Objectifs
Il est reconnu que les cellules du microenvironnement tumoral, et plus particulièrement les macrophages, sont des acteurs clé dans le contrôle de la progression tumorale et de la réponse aux traitements. Plus récemment, d’autres cellules de la lignée des cellules myéloïdes, dont font partie les macrophages, ont été décrites et seraient recrutées au niveau de la tumeur. Au cours de la carcinogénèse, les macrophages, cellules de la défense immunitaire, basculent d’un phénotype anti-tumoral vers un phénotype favorisant la croissance tumorale. Ainsi, trouver des cibles et des traitements permettant de moduler le recrutement et le phénotype des cellules myéloïdes pourraient faire avancer les stratégies thérapeutiques du cancer. Nous avons en partie défini le rôle des macrophages, au cours de la progression tumorale dans différents cancers (adénocarcinome ovarien, carcinose péritonéale d’origine colorectale, cancer du pancréas). Pour la suite de ce projet, nous souhaitons tester l’efficacité de différents traitements pharmacologiques. Nous disposons de souris délétées spécifiquement au niveau des cellules myéloïdes pour des facteurs clé de la polarisation (Récepteur nucléaire PPAR-γ, facteurs de transcription LRH-1). Ainsi nous pourrons identifier plus clairement les voies de signalisation impliquées dans l’effet de nos agents pharmacologiques sur le recrutement et la polarisation des cellules myéloïdes dans la progression tumorale. Ces agents pharmacologiques pourraient agir en synergie avec les traitements de chimiothérapie conventionnelle ou éviter une rechute due à l’acquisition d’une chimiorésistance. Ainsi, nous souhaitons en parallèle étudier l’association de ces agents pharmacologiques avec le traitement de référence. Nous utiliserons ensuite des modèles déplétés pour différentes populations immunitaires (macrophages, ou lymphocytes) afin d’évaluer la part respective des différents acteurs cellulaires dans l’effet des agents pharmacologiques testés. Une autre approche thérapeutique envisagée serait le transfert adoptif de cellules myéloïdes polarisées en vue de bloquer la progression tumorale.
Bénéfices attendus
La recherche des mécanismes modulant le recrutement et les caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques des cellules myéloïdes au cours de la progression tumorale dans des modèles expérimentaux de cancers chez la souris, nous permettra de définir des cibles thérapeutiques pertinentes. L’évaluation de l’effet de différents agents pharmacologiques dans différents modèles de cancers (ovarien, colorectal et pancréatique) de proposer des thérapies ciblées selon le type de cancers.
Procédures
Les souris seront identifiées au sevrage (à 3 semaines) par tatouage au niveau des phalanges afin de pouvoir suivre de manière individuelle chaque animal. Une biopsie de queue sera effectuée pour le génotypage. Lorsque les souris sont adultes, un adénocarcinome ovarien sera induit par une injection intra-péritonéale de cellules tumorales. les souris seront ensuite traitée à l’aide d’agents pharmacologiques avec un suivi sur 60 jours (observations, suivi du poids). Deux autres types de cancers seront étudiés, un adénocarcinome colorectal et cancer du pancréas induits par une injection intra-péritonéale de cellules tumorales avec un suivi de 15 jours. Les traitements seront administrés par voie orale (eau de boisson ou par gavage) ou par voie intrapéritonéale tous les 4 jours pendant 60 jours ou tous les jours pendant 15 jours selon le modèle. Les observations et suivi dupoids nous permettront de suivre l'évolution de la maladie. Au sacrifice, des prélèvements (sang, différents organes), nous permettront d'étudier le dévéloppement des cellues tumorales et l'effet des traitements.
Impact sur les animaux
Les modèles murins trangéniques dont nous disposons dans cette étudene présenta pas de phénotype dommageable. Des tests de cytotoxicité des agents pharmacologiques seront réalisés au préalable avant l’administration des traitements aux souris afin d’éviter toutes nuisances ou effets indésirables. Dans ces modèles murins de carcinose, un liquide d’ascite s’accumule dans le péritoine lors des stades tardifs de la progression tumorale. Le développement tumoral peut engendrer un gain de poids important des souris avec une altération de l’état général. Les animaux seront mis à mort si la prise de poids est supérieure à 40% du poids initial, si les animaux présentent des signes de mutilations, des difficultés respiratoires. La durée de l’étude est définie selon des résultats antérieurs qui ont permis de vérifier que ces points limites ne sont pas atteints. Pour le traitement par injection intrapéritonéale, le point d’injection sera désinfecté et surveillé journalièrement. Pour le traitement par gavage ou dans l’eau de boisson, la prise hydrique sera évaluée journalièrement.
Devenir
A la fin de la procédure les animaux seront euthanasiés ce qui permettra de réaliser différents prélèvements d’organes
Remplacement
Nous testerons plusieurs types de molécules (agents pharmacologiques) qui sont susceptibles de pouvoir moduler les caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques des cellules myéloïdes au cours de la progression tumorale. Ces molécules, auront été présélectionnées via des résultats préliminaires basés sur des tests in vitro qui permettent d’appréhender les effets potentiels d’une molécule sur les processus tumoraux. Des tests de cytotoxicité de ces molécules seront réalisés au préalable avant l’administration des traitements aux souris afin d’éviter toutes nuisances ou effets indésirables. Ces tests seront réalisés sur des cellules myéloïdes, population cible des molécules, et sur les lignées tumorales utilisées pour les modèles tumoraux chez la souris. Cette étape est essentielle pour éliminer les molécules pouvant induire la prolifération des cellules tumorales et pour estimer la concentration à administrer aux souris. Cette démarche permet de sélectionner les molécules et de limiter le nombre d’animaux utilisé.
Réduction
Les résultats actuels ont permis de valider, en fonction des différents et nombreux paramètres évalués, qu’un nombre de 6 souris par lot est nécessaire afin d’acquérir des données suffisantes et permettre d’effectuer des tests statistiques fiables. L’expérience et les données déjà acquises sur des souris contrôles nous permettrons de comparer la fiabilité de nos données et d’éviter l’utilisation inutile d’animaux (éviter le double emploi). Le projet sera conduit en progressant par étape afin de limiter le nombre d’animaux. Une étude pilote sera menée pour déterminer l’innocuité et le choix d’agents pharmacologiques et de la durée de traitement Le choix des modèles transgéniques sera également réduit en fonction des résultats obtenues dans les premières étapes de ce projet et les approches in vitro qui seront menées en parallèle.
Raffinement
L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée à l’expérience et aux potentiels effets indésirables des procédures sur l’état de santé global des animaux. Les conditions d’hébergement permettront de conserver le comportement social des souris et de limiter le stress par l’enrichissement (papier pour la nidification, tunnel). le développement tumoral des animaux sera surveillé ainsi que son état général. Un animal sera mis à mort s’il présente un des points limites d’arrêt de la procédure, définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Le prélèvement de sang sera effectué sous anesthésie générale et anesthésie locale. Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux en collectant le plus de données possibles. Les mécanismes impliqués dans le développement des cancers sont complexes. Ainsi, cette étude permettra d’étudier dans leur contexte physiopathologique les cellules myéloïdes, cibles thérapeutiques potentielles, et ne peut pas être mimée par une approche de culture cellulaire.
Choix des espèces
La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèle dans ce type de projet: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés qui nous permettront d’explorer l’implication de différentes voies de signalisation, cibles pertinentes pour des approches pharmacologiques dirigées. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc …) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Adultes, souris âgées de 8 à 20 semaines afin d'avoir des souris avec un système immunitaire mature.
Effet de la modulation du microbiote intestinal par antibiothérapie sur les cellules entéroendocrines de souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
800 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à cinq gavages, subir dix-huit prélèvements sanguins et cinq mises à jeun, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles boivent des mélanges d'antibiotiques pendant quelques jours à deux mois, pour que leur flore intestinale soit détruite, puis passent jusqu'à quatre tests métaboliques comportant chacun six heures de jeûne et quatre prises de sang. Le porteur écrit que ce protocole produit "a priori peu d'effets indésirables", tout en listant déshydratation, perte de poids et diarrhées. Toutes sont tuées pour que leurs cellules intestinales productrices d'hormones soient triées, au service d'une question posée en termes de santé humaine, l'obésité et les maladies inflammatoires de l'intestin.
Objectifs
Les intestins sont un organe majeur pour la santé car ils sont à l’interface entre alimentation, les bactéries intestinales et l’organisme. L’intestin permet notamment la digestion et l’absorption des aliments, tout en faisant barrière aux microbes et aux toxines. L’intestin produit également des hormones qui régulent les fonctions de différents organes, modulant ainsi par exemple le comportement alimentaire, la régulation énergétique ou les fonctions intestinales (transit intestinal, digestion…) elles-mêmes. Ces hormones sont produites par des cellules intestinales spécifiques, appelées cellules entéroendocrines (EECs). Ces cellules libèrent les hormones en réponse à des modifications de leur environnement. Des modifications des fonctions intestinales et notamment des hormones intestinales sont associées à différentes maladies telles l’obésité ou des maladies digestives. Ces maladies sont également associées à une modification des bactéries intestinales. Il a été montré que la déplétion complète du microbiote intestinal induit une modification importante des EECs et une augmentation des niveaux circulant de certaines hormones. Notre travail de recherche vise à mieux caractériser comment les bactéries de l’intestin influent sur les hormones intestinales et les cellules qui les produisent. Dans ce projet, nous modulerons le microbiote intestinal par l’action d’antibiotiques, mesurerons le niveau des hormones et analyserons précisément ces cellules grâce à l’utilisation de souris exprimant une fluorescence associée à ces cellules et permettant de les isoler. Nous chercherons notamment à identifier quelles sont les bactéries ou leurs produits responsables des modifications observées des EECs, ainsi qu’aux conséquences fonctionnelles des niveaux élevés de certaines hormones intestinales.
Bénéfices attendus
Le rôle de l’intestin et en particulier des hormones intestinales pour la santé de l’homme apparait comme étant très important, en particulier dans l’obésité ou les maladies inflammatoires de l’intestin, qui touchent plus de 650 millions d’individus à travers le monde. Un lien entre microbes et les cellules produisant les hormones intestinales a déjà été établi. Cette étude nous permettra d’identifier plus précisément comment certains produits microbiens ou certaines bactéries modulent les fonctions des EECs et quelles sont les conséquences sur la physiologie de l’hôte. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris permettant de trier cette population cellulaire rare, et mesurerons les niveaux d’hormones après différentes stimulations. Cela nous permettra d’identifier comment ces cellules sont régulées dans différents contextes microbiens et d’en déduire les produits microbiens qui régulent ces cellules. Compte tenu des fonctions importantes de ces hormones pour la santé, ce projet permettra de proposer de nouvelles voies modulant leurs niveaux et ainsi agir sur les fonctions quelles régulent, notamment dans le cas de maladies où ces fonctions sont altérées.
Procédures
Les 800 animaux recevront des mélanges d’antibiotiques dans leur eau de boisson pendant quelques jours à deux mois. Toutes les expérimentations seront réalisées sur animaux vigiles. Les animaux seront pesés deux fois par semaine, et leur consommation alimentaire mesurée en parallèle. Au maximum quatre tests métaboliques seront réalisés sur tous les animaux. Chaque test comporte une phase de jeûne (6h), quatre prélèvements sanguins au maximum, et un gavage ou une injection d’un stimulus d’intérêt Certains animaux recevront une injection préalable à l’administration du stimulus. La durée d’un test métabolique n’excède pas deux heures entre la première prise de sang et la dernière et chaque prélèvement de sang en lui-même n’excède pas trente secondes. Un gavage supplémentaire au moment de la mise à mort (entre 10 minutes et une heure avant l’euthanasie) sera également réalisé sur des animaux mis à jeun pendant 2 à 6 heures pour la mesure du transit intestinal. Des prélèvements de sang seront réalisés lors de la mise à mort, avant le gavage et au moment de la mise à mort. Lors des mesures de transit, certains animaux recevront également une injection préalable pour étudier le rôle des hormones. Au total, les 800 animaux pourront recevoir jusqu’à 5 gavages, être prélevés pour leur sang 18 fois et mis à jeun 5 fois, en recevant les traitements antibiotiques pendant un maximum de deux mois.
Impact sur les animaux
Ce protocole produit a priori peu d’effets indésirables sur les animaux : la consommation des antibiotiques dans l’eau de boisson a déjà été pratiquée à de nombreuses reprises sans impact sur la santé et le comportement des animaux. Les effets indésirables des antibiotiques peuvent être une déshydratation, une perte de poids ou l’apparition de diarrhées. Les injections, gavages et prélèvement de sang peuvent induire une légère douleur et un stress du fait de la contention. Les jeûnes peuvent conduire à une perte de poids réduite, rattrapée les jours suivants. Les stimuli administrés n’ont pas d’effet indésirable connu chez les animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de récolter leurs tissus pour l’isolement des cellules produisant les hormones intestinales par tri cellulaire. Les fonctions des cellules pourront alors être analysées par différentes techniques
Remplacement
L’utilisation de souris pour cette expérimentation est nécessaire par l’impossibilité d’étudier in vitro ou de modéliser l’interaction entre les bactéries et l’intestin du fait de l’absence de modèles pour cultiver un microbiote complexe en contact direct avec un épithélium intestinal dans des conditions physiologiques. De plus, il n’existe pas actuellement de modèle in vitro permettant d’étudier l’ensemble des EECs.
Réduction
Dans ce projet, nous utiliserons des groupes de 8 animaux de même sexe. Ce nombre a été évalué comme suffisant par l’analyse statistique des variations de chaque variable au sein d’un groupe lors de projets précédents La rareté des cellules entéroendocrines nécessitant l’utilisation de tissus entiers pour chaque application. Le projet sera réalisé sur des souris mâles et femelles car l’effet sexe est inconnu. Des analyses statistiques permettront d’étudier l’effet sexe sur la déplétion du microbiote.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter, d'un abri en propylène rouge, et d’un support suspendu et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum et seront hébergés à plusieurs par cage pour éviter l'isolement. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Une grille de décision (points limites) est établie.Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux. Les animaux seront habitués à être manipulés avant et pendant toute la durée de l’expérimentation afin de diminuer leur stress lors de la contention et les prélèvements.
Choix des espèces
Les souris utilisées sont issues d’une lignée génétiquement modifiée pour exprimer une protéine fluorescente dans toutes les cellules entéroendocrines. Cette lignée est un modèle particulièrement utile pour l’étude des cellules entéroendocrines, permettant de les trier ou de les distinguer facilement lors de l’analyse des tissus. L’étude portant sur les cellules entéroendocrines matures, des souris adultes (8 à 12 semaines au démarrage du protocole) seront utilisées. Les hormones intestinales et le système digestif de la souris étant très proche de celui de l’Humain, l’utilisation du modèle souris apporte des connaissances généralisables pour la santé humaine.
Compréhension de la relation entre le mucus intestinal et le système myentérique dans la prévention par les acides gras oméga3 de l’hyperperméabilité intestinale induite par l’obésité alimentaire
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Pour savoir si des souris génétiquement modifiées, dont les tissus sont riches en oméga 3, résistent mieux que les autres à l'obésité provoquée, 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles passent quatorze semaines sous un régime dont 45 à 60 % des calories viennent des graisses, sont pesées chaque semaine, isolées quelques minutes à trois reprises pour la récolte de crottes, et tuées à la fin par ponction dans le cœur. Le porteur reconnaît que l'excès de poids peut gêner leurs déplacements, leur toilettage et leur accès à l'eau. Il indique avoir défini "un point limite adapté en lien avec l'obésité attendue" sans dire lequel.
Objectifs
Au cours de l’installation de l’obésité alimentaire, la mise en place d’une altération du microbiote intestinal contribue à perturber la fonction barrière de l’intestin. Ces altérations conduisent au passage dans le plasma des lipopolysaccharides des bactéries à Gram négatif de la flore microbienne intestinale et donc à une inflammation chronique. En tant que molécules nutritionnelles thérapeutiques, les acides gras polyinsaturés (AGPI) oméga3 sont connus notamment pour améliorer la fonction barrière intestinale et diminuer la production de molécules pro-inflammatoires lors de l’hyperperméabilité intestinale. Dans ce contexte, nous avons montré que les AGPI oméga3 endogènes tissulaires, chez un modèle murin transgénique, préviennent de l’obésité alimentaire et maintiennent l’imperméabilité intestinale en conservant en autre l’intégrité de la couche de mucus qui tapisse l’intestin. Se faisant, ils protègent ainsi les animaux d’une inflammation chronique de bas grade, ce phénotype étant transférable par le microbiote intestinal. L’obésité alimentaire est également connue pour induire, au niveau intestinal, une altération de la motilité qui est régulée par le système nerveux entérique (SNE). La neuroplasticité induite par des régimes hyperlipidiques inclut ainsi des altérations structurales et fonctionnelles du SNE mais pourrait également affecter le volume, la viscosité et la porosité du mucus. Dans le contexte de lutte contre l’obésité, le SNE constitue ainsi une nouvelle cible d’étude, en particulier dans la compréhension des phénomènes contribuant à la mise en place des altérations de la perméabilité intestinale conduisant à une inflammation chronique. Ainsi, les objectifs de ce projet de thèse sont de décoder la contribution relative des fortes teneurs en AGPI oméga3 tissulaires endogènes chez un modèle de souris transgénique sur le SNE dans un contexte d’inflammation de bas grade induite par une obésité alimentaire en lien avec l’étude des différentes composantes de la perméabilité intestinale, en particulier au niveau de du mucus colique.
Bénéfices attendus
L’obésité est associée à une hyperperméabilité intestinale entrainant le passage des lipopolysaccharides bactériens dans la circulation sanguine, ce qui pourrait être en partie responsable d’une inflammation chronique de bas bruit. Le traitement de l’obésité et de ses désordres métaboliques est donc un enjeu majeur de santé publique ; l’impact de l’alimentation et en particulier des AGPI oméga3 étant une piste privilégiée. Cependant, les études nutritionnelles apportant des AGPI oméga3, tant chez l’homme que le rongeur, présentent de nombreux biais rendant les données existantes peu concluantes. Un modèle de souris transgénique présentant un enrichissement tissulaire endogène en AGPI oméga3 élevé représente donc une alternative de choix dans l’étude de l’impact de ces acides gras sur les désordres métaboliques associés à un régime hyperlipidique inducteur d’obésité. Nous avons montré ce bénéfice sur la prise de poids, l’insulinorésistance périphérique et le maintien de la fonction barrière de l’intestin via la préservation de la composante épithéliale et de la couche de mucus qui le tapisse. L’obésité alimentaire est également connue pour induire, toujours au niveau intestinal, une altération de la motilité qui est régulée par le système nerveux entérique (SNE). La neuroplasticité induite par des régimes hyperlipidiques inclut ainsi des altérations structurales et fonctionnelles du SNE mais pourrait également affecter le volume, la viscosité et la porosité du mucus. Dans le contexte de lutte contre l’obésité, le SNE constitue ainsi une nouvelle cible d’étude, en particulier dans la compréhension des phénomènes contribuant à la mise en place des altérations de la perméabilité intestinale conduisant à une inflammation chronique. Ainsi, dans un contexte d’inflammation de bas grade induite par une obésité alimentaire, décoder la contribution relative des AGPI oméga3 tissulaires endogènes sur le SNE lors des perturbations de la fonction barrière de l’intestin et le lien entre SNE et structuration du mucus qui en particulier hébergent des bactéries commensales d’intérêt pourrait émerger comme un facteur important pour de futures thérapies chez l’homme.
Procédures
Les animaux seront manipulés de façon hebdomadaire afin d’évaluer leur poids. Au départ de la mise sous régime puis aux semaines 8 et 13, des fèces seront collectés (3 à 4 crottes sur une durée d’une dizaine de minutes) Un prélèvement terminal sera effectué à la fin de la semaine 14 via une ponction intracardiaque nécessitant une à deux minutes par animal.
Impact sur les animaux
Le maintien des animaux sous un régime hyperlidique (45 ou 60% kcal de lipides) durant 14 semaines peut être considéré comme une nuisance car l’excès de poids peut provoquer des difficultés de mobilité, de toilettage ou un problème d’accès à l’eau de boisson. Un potentiel stress pourra subvenir lors de la contention des souris effectuée au moment de la pesée ou lors du bref isolement (quelques minutes) permettant la récolte de fèces.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue du projet afin de réaliser des prélèvements de différents tissus (sang, colon)
Remplacement
Un modèle de souris transgénique dont les tissus sont intrinsèquement riches en AGPI oméga3 est un modèle précieux car cette souris possède un niveau d’enrichissement qui n’existe dans aucun autre modèle murin et qui est non atteignable par des stratégies alimentaires. D’une part, l’ubiquitisme de l’enrichissement tissulaire en AGPI oméga3 et d’autre part les taux tissulaires obtenus rendent impossible le remplacement de ce modèle de souris par des modèles in vitro. De plus, le protocole décrit vise à étudier le SNE du côlon lors de l’altération de la fonction barrière de l’intestin et en particulier lors de la formation du mucus colique par deux niveaux de régimes hyperlipidiques (45 et 60 % kcal de lipides). Il est impossible de complètement modéliser ce processus et ces interactions à travers des approches in vitro. En effet, si la co-culture de cellules entériques gliales et de lignées cellulaires coliques secrétant de mucus pourrait être envisagée, un tel modèle ne permettrait pas de reproduire in vitro la complexité des interactions entre le SNE et ces cellules coliques qui secrètent le mucus, mucus qui apparait bicouche avec une structuration très organisée in vivo. Cette structuration très organisée représente un enjeu essentiel pour le maintien de la perméabilité intestinale et le dialogue entre le SNE, le mucus et le microbiote qui y vit. Enfin, cette étude est menée dans un contexte d’obésité alimentaire. Ce contexte est difficile à modéliser en raison de la complexité des impacts métaboliques observés et de la diversité des approches de régimes utilisés. Cet aspect ne peut donc également pas s’affranchir de l’utilisation d’animaux. Cette étude est donc unique dans l’approche de l’étude de l’impact des AGPI oméga3 sur le SNE et le mucus colique dans un contexte d’obésité alimentaire et de ses pathologies associées.
Réduction
Les effectifs ont été optimisés sur la base des coefficients de variabilité reportés dans la littérature et les différences attendues entre les différents groupes pour les paramètres clés de l’étude. Lors de la conception du protocole expérimental nous avons déterminé le nombre de 8 animaux par groupe nécessaire et suffisant à l'obtention de résultats statistiquement exploitables. De plus, les animaux sont élevés par génotype afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Notre expérience dans le domaine et notre retour statistique des études précédentes nous permettent de valider cette approche. Les statistiques seront réalisées au moyen d’un test statistique approprié.
Raffinement
Les animaux sont maintenus en groupe afin de réduire le stress dû à la captivité. Toutes les souris auront accès à des enrichissements de milieu dans chaque cage, constitués de carré de coton et/ou papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Une attention particulière sera également portée à la surveillance de la prise de nourriture et aux comportements liés au stress. Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée en secteur conventionnel et intégration dans le projet. Un point limite adapté en lien avec l’obésité attendue a été défini. Si ce point limite défini est atteint, un arrêt de la souffrance engendrée sera effectué par mise à mort de l’animal après anesthésie profonde puis dislocation cervicale.
Choix des espèces
La détermination de l’impact d’un régime obésogène sur la perméabilité intestinale et la relation entre le SNE et le mucus est primordiale dans notre étude. Cet aspect ne peut s’affranchir de l’utilisation d’animaux afin de mimer au mieux un contexte d’inflammation bas grade induit par l’obésité. Bien que relativement éloignée de l’Homme, l’espèce murine est l’espèce animale de référence dans ce domaine de recherche et la plus utilisée en recherche préclinique avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Le modèle de souris transgénique utilisé est un modèle précieux qui rend cette étude unique dans l’approche de l’impact des AGPI oméga3 sur la prévention de l’hyperperméabilité intestinale induite par un régime obésogène et le dialogue entre le SNE et le mucus colique. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 12 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids supérieur à 20g. En effet, nous nous intéressons à l’obésité et aux conséquences métaboliques associées développées par les jeunes adultes car il a été montré que l’augmentation de l’obésité touche toutes les tranches d’âge mais que la fréquence semble plus élevée dans les tranches 25-34 et 35-44 (de l’ordre de 8% par an). De telles données sur le jeune adulte ont été également confirmées aux Etats-Unis et récemment en France. De plus, les études précédentes au laboratoire mettant en évidence la transmission de la résistance partielle de l’induction de l’obésité alimentaire par le microbiote de souris fat-1 à des souris sauvages a porté sur l’animal jeune adulte. Nous souhaitons pouvoir inscrire ces nouvelles expérimentations dans notre objectif thématique plus global.
Contrôle de la régression tumorale à long terme par les cellules humaines CAR-VST anti-CD19
- Recherche appliquée
- Cancers
Aucune souris n'est gardée plus de vingt-huit jours après l'injection des cellules leucémiques, ni au-delà du point limite si elle l'atteint avant. 32 souris NSG, dépourvues de système immunitaire, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent la leucémie dans la veine de la queue, puis un traitement cellulaire une semaine plus tard, trois prises de sang caudales et des séances d'imagerie sous anesthésie après injection d'un produit dans le ventre. Le porteur décrit la maladie qu'il leur donne, poils hérissés, baisse d'activité, perte de poids et parfois début de paralysie des pattes arrière, pour comparer deux thérapies cellulaires dont l'une pourrait, à terme, persister plus longtemps chez les patients.
Objectifs
La thérapie anti-cancéreuse appelée CAR-T cells, est produite à partir des cellules du patient. Ces cellules sont modifiées génétiquement pour les armer contre les cellules cancéreuses, ce qui permet de traiter la leucémie. Bien qu’elles soient efficaces et arrivent à tuer les cellules cancéreuses, leur efficacité disparait à court terme. De plus, leur préparation est complexe, longue et présente un risque potentiel de contamination par des cellules malades. En conséquence, la production de ces cellules à partir de donneurs sains se développe, pour les rendre immédiatement opérationnelles. De plus, nous souhaitons utiliser une nouvelle source de cellules provenant de donneurs sains et qui sont anti-virales (VST) : celles-ci sont capables de persister à long terme chez les patients. Aussi, nous souhaitons fabriquer des cellules anti-cancéreuses à partir de ces VST. Nous obtiendrons des CAR-VST qui permettraient d’apporter un bénéfice majeur par rapport au traitement de référence par CAR-T car persistant plus longtemps dans l’organisme. Nous devons donc d’abord vérifier qu’elles sont aussi efficaces que les cellules thérapeutiques CAR-T classiques. Pour cela, nous souhaitons étudier ce nouveau traitement en comparaison au traitement actuel par CAR-T cells et montrer premièrement qu’elles sont aussi efficaces que le traitement actuel.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de déterminer si les CAR-VST possèdent un effet anti-leucémique et s’il est comparable au traitement de référence par CAR-T cells. Nous souhaitons voir un effet comparable dans cette expérimentation et valider l’acquisition de cette fonctionnalité anti-tumorale. Puis, dans une prochaine saisine, nous souhaiterions montrer que nos cellules persistent plus longuement dans un modèle de leucémie.
Procédures
-Une injection de cellules leucémiques à la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce à J0 (1min) -Une injection de cellules « traitement » à la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce à J7 (1min) -Un prélèvement de sang au niveau de la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce à J14, J21 et J28 (1min) Imagerie des souris par signal lumineux des cellules tumorales : -contention manuelle et injection ventrale d’un produit d’imagerie permettant de suivre les cellules leucémiques, -pendant le temps où la substance agit (10min), induction de l'anesthésie pour que l’animal reste immobile pendant l’imagerie (30min max)
Impact sur les animaux
- L’injection intraveineuse est douloureuse mais de courte durée et elle peut induire un saignement léger après retrait de l’aiguille au point de ponction (arrêté par compression avec une compresse stérile). - Dans les jours suivants l’injection des cellules cancéreuses, les souris présenteront une maladie type leucémie avec des poils hérissés, moins d'activité et une perte de poids, et en cas extrême, un début de paralysie des pattes arrière. - Les animaux seront modérément stressés lors de l’injection dans l’abdomen du produit d’imagerie. Pendant la prise d'images, les souris seront endormies et ne ressentiront aucune douleur. - Le prélèvement sanguin au niveau de la veine caudale sera réalisé avant l’imagerie, avec contention douce.
Devenir
Les souris étant totalement dépourvues de système immunitaire et ayant reçu une injection des cellules leucémiques, une progression tumorale va se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animal, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 28 jours post injections ou en cas de point limite atteint.
Remplacement
Nous continuons à réaliser des expériences sur cellules pour générer des résultats sur le ciblage des cellules tumorales et valider leur potentiel anti-leucémique de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. La culture cellulaire à partir de cellules humaines est donc la base de notre projet pour produire des cellules traitement. Cependant, les cultures cellulaires ne permettent pas reproduire la complexité des interactions entre les cellules leucémiques et leur environnement développé dans un organisme. Cette saisine permet de vérifier l’efficacité d’un nouveau traitement cellulaire par rapport à un traitement de référence.
Réduction
Nous utilisons un nombre de souris permettant de générer des résultats fiables et de sécuriser la mise en œuvre si des souris sont à exclure de l’étude du fait de la complexité des gestes techniques. Un effectif de 3 souris par groupe est suffisant selon la simulation d’un outil statistique (G-Power), mais nous souhaitons ajouter 2 souris supplémentaires dans les groupes traités, afin d’avoir une meilleure représentativité des échantillons et pouvoir mieux les caractériser. Nous aurons besoin de 16 souris pour cette saisine. Si les résultats ne sont pas probants, nous souhaitons répéter cette expérience une seconde fois. Cette saisine comprendra 32 souris au maximum.
Raffinement
Les souris seront logées dans une grande cage avec des jouets et des matériaux, avec 3 ou 5 souris par cage, pour qu'elles aient suffisamment d'espace. La pièce où les souris seront logées sera bien aérée, dans une zone spéciale pour les souris nécessitant un suivi quotidien, avec un contrôle de la température, de l'humidité et de la lumière pour qu'elles se sentent bien. Leur nourriture est préparée de manière à être ultra propre pour éviter les problèmes de contamination microbienne, et leur eau est stérilisée pour éviter les maladies. Chaque jour, une personne qualifiée vérifiera leur état de santé et détectera d’éventuels signes de souffrance. Si elles ne se sentent pas bien, une grille de score permet de savoir la conduite à suivre pour réduire ou stopper le mal être.
Choix des espèces
La souris NSG ne possédant pas de système immunitaire, accepte les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire dans les hémopathies malignes. Les souris sont expérimentées à partir de 8 à 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe humaine est meilleure dans cette période de vie.
Etudes fondamentales et appliquées des interactions entre bactériophages et bactéries chez l’animal
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire
Instillations dans le nez ou la trachée sous anesthésie, gavages jusqu'à six fois dans la même journée, injections dans le ventre ou dans la veine, infections bactériennes du poumon ou de l'intestin : 14 416 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées, sans possibilité d'être réutilisées ni adoptées, parce qu'elles ont été infectées par une bactérie pathogène qu'elles pourraient porter et transmettre. Le projet vise à comprendre comment les bactériophages, virus qui n'infectent que des bactéries, se comportent chez un hôte vivant, en vue d'élargir leur usage thérapeutique face à l'antibiorésistance. Le porteur annonce des groupes de six souris au maximum et trois répétitions par expérience, sans expliquer comment on arrive à 14 416 souris.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de faire avancer les connaissances sur l’utilisation thérapeutique des bactériophages. Les bactériophages sont des virus qui infectent uniquement les bactéries. Ils peuvent donc être utilisés pour tuer les bactéries résistantes aux antibiotiques. Ils présentent l’intérêt d’être très spécifiques des bactéries ciblées. D’autre part, les bactériophages font partie de la flore naturelle au même titre que les bactéries. Très abondants dans le tube digestif des animaux ils jouent un rôle important dans le maintien de la santé de l’appareil digestif. Leur utilisation (transplantation virale) pour rétablir une homéostasie intestinale est soutenue par des données cliniques préliminaires encourageantes. Ainsi, nous étudierons les interactions dynamiques entre les bactériophages et les bactéries dans deux organes cibles : les poumons et les intestins. Les connaissances qui seront acquises au cours de ce projet permettront de mieux appréhender le potentiel thérapeutique des bactériophages dans le but de permettre leur utilisation plus large en clinique.
Bénéfices attendus
Les avantages escomptés sont la compréhension des mécanismes mis en jeu lors d’une phagothérapie. Ces mécanismes recouvrent non seulement les interactions entre les bactériophages et les bactéries mais aussi celles avec l’hôte et notamment son système immunitaire. La meilleure compréhension de l’utilisation thérapeutique des bactériophages permettra d’augmenter le nombre de patients traités dans des conditions optimales d’efficacité. Permettre à des patients d’accéder à ce type de traitement alors que les antibiotiques ne sont plus efficaces permettra de réduire le nombre d’impasses thérapeutiques et le coût des frais hospitaliers mais surtout d’améliorer les conditions de vie de ces patients.
Procédures
Les prélèvements sur animaux vigiles seront limités à un seul prélèvement sanguin (quelques secondes), ou des prélèvements fécaux (chaque animal est placé dans une boite pendant quelques minutes et jusqu’à 2 fois par jour). Les administrations par gavage (quelques secondes) seront limitées à 2 par jour.
Impact sur les animaux
Nous veillerons dans nos expériences à impacter le moins possible le bien-être des souris. Les expériences consistent essentiellement à - des injections intrapéritonéales ou intraveineuses une fois ou sur quelques jours. La piqure d'aiguille pour effectuer ces injections entraine une douleur légère de courte durée. - des gavages intragastriques jusqu’à six fois sur une journée qui nécessitent une contention brève - des installations intranasales ou intratrachéales sur animaux anesthésiés - des protocoles infectieux qui entraineront un inconfort et une douleur de sévérité modérée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été infectés par une bactérie pathogène. Cela implique que 1) leur défense immunitaire sera différente d’autres animaux non exposés à ce même pathogène et 2) ils sont potentiellement devenus porteurs asymptomatiques de cette bactérie pathogène et seraient donc susceptible de la transmettre s’ils étaient réutilisés. De plus, la plupart d’entre eux seront mis à mort pour analyser des organes vitaux.
Remplacement
L’évaluation des différents points évoqués dans le résumé du projet ne peut malheureusement pas s’envisager dans des systèmes in vitro, qui sont inappropriés pour reproduire la complexité d’un organisme entier et sa réponse à l’infection (système immunitaire). Par ailleurs, s’agissant de bactériophages, l’évaluation pharmacocinétique ne peut s’appuyer sur l’existence de modèles mathématiques. De même, l’étude in vitro des communautés microbienne d’un tube digestif prenant en compte la structuration spatiale des organes n’est pas encore disponible.
Réduction
D’une part, en amont des expériences conduites chez l’animal nous effectuons de nombreuses expériences in vitro afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires. D’autre part, autant que possible, le nombre maximal de paramètres sera collecté pour chaque animal de façon à limiter le nombre total d’animaux utilisé. Un maximum de 6 souris par groupe sera utilisé afin d’assurer une représentativité statistique minimale. Au maximum 3 répétitions seront réalisées de façon indépendante pour valider les résultats expérimentaux et augmenter la puissance des analyses statistiques. Pour les données quantitatives, la distribution normale des variables sera vérifiée et les tests statistiques appropriés seront alors choisis. Pour les variables qualitatives d’autres tests seront effectués. Les éventuels effets confondants (sexe et cage par exemple) seront pris en compte au moment de l’analyse en utilisant des modèles linéaires à effets mixtes. L’outil de bioluminescence sera utilisé pour évaluer l’évolution de l’infection in situ, pour suivre le même animal au cours du temps, limiter les variations inter-individuelles et ainsi diminuer le nombre d’animaux requis.
Raffinement
Les animaux infectés seront observés 2 à 5 fois au cours du premier jour puis au moins une fois par 24h durant les 2 jours suivants puis ensuite une fois par période de 48h. Ils seront pesés au moins une fois par période de 48h dès le début du protocole. Une grille d’évaluation à 3 niveaux (0, 1, 2) permettra de suivre l’état de santé de chaque animal. Le score de 1 déclenchera l’ajout d’un diet gel pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Le score 2 sera attribué aux animaux ne bougeant plus et ayant une posture prostrée, ou présentant une perte de poids supérieur à 20%, ou présentant de signes de diarrhée pendant plus de 48h. Tout animal présentant un score de 2 pour l’un des critères sera mis à mort. Au cours des expériences, toute modification des procédures visant à réduire la douleur des animaux (par exemple, réhydratation sous-cutanée, chauffage des cages) sera évaluée avant d’être mise en place.
Choix des espèces
A ce stade expérimental du développement de la phagothérapie, la souris représente l’espèce la plus pertinente pour l’évaluation des paramètres pharmacocinétiques et l’innocuité du traitement. Il s’agit d’un mammifère dont le système immunitaire est bien connu et comporte de très grandes analogies avec celui de l’homme. L’utilisation d’autres animaux plus proches de l’homme (primates) ou de références en pharmacocinétique (porc Yucutan) ne peuvent représenter des animaux de première intention à ce stade de nos travaux. De même, la disponibilité d’élevages de souris gnotobiotiques est un outil de choix qui n’est pas encore disponible pour d’autres espèces. Dans tous les cas, seuls des animaux adultes seront utilisés (>= à 7 semaines) car leur système immunitaire est arrivé à maturité au contraire d’animaux plus jeunes.
Evaluation des potentiels effets secondaires d’une molécule et de sa concentration plasmatique chez les rongeurs
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 1000
Le protocole revient à faire passer à des rongeurs l'équivalent préclinique des essais de phase 1 menés sur des volontaires humains sains, pour établir la dose à laquelle une molécule en développement devient toxique. 1 000 souris et 1 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les uns pour des prélèvements, les autres parce qu'ils ont reçu des substances dont le porteur ignore les effets à long terme. En douze semaines, un même animal peut recevoir jusqu'à 336 administrations, subir 64 prélèvements sanguins et passer 60 tests comportementaux, censés mesurer la motricité, la cognition, la douleur, l'anxiété et la dépression, sans qu'aucun de ces tests soit nommé. Le porteur affirme que ces modèles ont une "prédictivité reconnue", au motif qu'ils "répondent favorablement aux médicaments déjà sur le marché".
Objectifs
La nécessité d’évaluer la sécurité des médicaments et des molécules en cours de développement est apparue suite aux accidents thérapeutiques du début du XXème siècle voire aux tragédies comme ce fut le cas pour la thalidomide. Dans ce cadre, l’étude de l’index thérapeutique et de l’innocuité d’une molécule est primordiale. Il s’agit de déterminer les doses à administrer afin d’obtenir la concentration sanguine permettant l’effet recherché mais également d’évaluer la dose à laquelle les premiers effets secondaires apparaissent. Ces études sont fréquemment réalisées sur des rongeurs et pourraient être également considérées comme l’équivalent préclinique des études de phase 1 en développement clinique impliquant des volontaires sains. Dans ce projet, nous proposons d’administrer des composés en cours de développement à des rongeurs puis d’adresser jusqu’à 3 questions interdépendantes : - La première interrogation est de savoir comment le composé se comporte vis-à-vis de l’organisme - Ce projet permet également d’évaluer les éventuels effets secondaires d’une molécule lors de son administration aux doses que l’on souhaite utiliser pour traiter la maladie. Pour cela, des animaux sains sont traités par le composé à tester et leur comportement est observé pour détecter des effets non souhaités. - Finalement, ce projet permet de déterminer la dose d’apparition des effets indésirables. Ceci est réalisé en administrant un composé à une dose supérieure à la dose thérapeutique et à étudier leur comportement pour détecter des effets non souhaités.
Bénéfices attendus
Avec ce projet nous espérons participer à la connaissance des effet secondaires des nouveaux médicaments et à la sélection de nouveaux traitements ayant une balance bénéfice/risque la meilleure possible.
Procédures
Les animaux de ce projet subiront sur une période de 12 semaines un maximum de 336 administrations, de 64 prélèvements sanguins ( en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire) et de 60 tests de comportements, ces tests de comportements permettront de mesurer l’impact de la molécule sur le système moteur, cognitif, nociceptif mais aussi sur le niveau d’anxiété ou de dépression des animaux. Les administrations durent moins de 30 secondes en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. Une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Concernant les prélèvements de sang, ils durent de 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée. Les tests de comportement sont généralement courts (entre 30 sec et 5 min) et ne dépasse pas 30 min pour le plus long.
Impact sur les animaux
LLes administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun cela peut induire un stress chez l’animal. Les tests de comportement peuvent induire un inconfort thermique, un stress, une légère désorientation ou des douleurs de courte durée.
Devenir
L'ensemble des animaux est mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est mise à mort pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.
Remplacement
Bien qu’il soit possible de disséquer les mécanismes d’action des nouveaux médicaments in vitro, les réponses globales des animaux suite aux traitements sont des évènements difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi, vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, les analyses du présent projet nécessitent des observations uniquement possibles chez l’animal vivant. De plus, les effets secondaires sont par nature imprévisibles. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques ou biochimiques. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous associons plusieurs tests de comportement sur les mêmes animaux afin de ne pas multiplier les cohortes Après analyse de puissance statistique, nous envisageons d’utiliser 10 animaux par groupe. Des analyses statistiques finales sont réalisées. Les animaux incluent dans ce projet vont nous permettre de mener 50 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation. Les animaux inclus dans ce projet vont nous permettre de mener 25 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.
Raffinement
Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi, un certain nombre de mesures sont mises en oeuvre, avec notamment l’intégration d’une phase d’acclimatation à l’arrivée des animaux sur site (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Nous portons une attention particulière à fournir aux animaux des conditions optimales d’hébergement afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Les animaux sont hébergés en cohorte pour respecter leurs besoins sociaux. Comme il est important que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres, nous fournissons un enrichissement important du milieu. Pour les souris, l’enrichissement du milieu comporte du matériel de nidification, un dôme pour se cacher et un tunnel suspendu. Pour les rats, l’enrichissement du milieu comporte un tunnel en carton pour permettre aux animaux de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Les animaux sont observés tous les jours et leur comportement est suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Une grille de score permet de surveiller les points limites préalablement défini et le devenir de l’animal est évaluer à l’aide d’un arbre décisionnel permettant d’éviter les souffrances inutiles.Les animaux sont pesés au minimum une fois par semaine, mais dès les premières administrations, ils sont pesés les jours d’injection ainsi que tous les jours d’expérience. Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Chaque fois que les animaux sont soumis à divers tests, le choix des tests, la fréquence de leur mise en oeuvre et leur ordre d’exécution est établi afin d’impacter le moins possible le bien-être des animaux. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Des raffinements spécifiques pour chaque procédure seront mis en place.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris ou des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. C’est le cas pour la souris et le rat. De plus, tous nos modèles répondent favorablement aux médicaments déjà sur le marché ce qui prouve leur prédictivité et permettent aux industriels d’étudier l’apport de leurs nouvelles recherches par rapport aux traitements déjà existants. De plus, ces espèces disposent d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Dans ce projet, nous utilisons des jeunes adultes (souris de 4 à 5 semaines et des rats de 6-7 semaines au début du projet). Il s’agit de s’adresser à des animaux dont l’activité spontanée est suffisante pour réaliser les tests proposés.
Etude du rôle de deux protéines et des défenses immunitaires dans la guérison de la leucémie.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3 402 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles reçoivent des cellules leucémiques dans la veine de la queue, parfois après une irradiation de cinq minutes sans anesthésie destinée à détruire une partie de leurs défenses, puis une injection quotidienne dans l'abdomen pendant vingt et un jours, une capsule implantée sous la peau du dos et des ponctions de moelle osseuse dans le fémur. Une partie d'entre elles est laissée aller jusqu'au point limite terminal pour mesurer la durée de survie. Le porteur justifie le choix de la souris par le fait qu'elle partage 99 % de ses gènes avec l'être humain et que sa génétique et son comportement sont "parfaitement connus", ce qui permettrait selon lui de "mesurer très facilement" leur bien-être, leur souffrance et leur angoisse.
Objectifs
Notre projet s’intéresse à un sous-type de cancer du sang appelé leucémie. Cette maladie est causée par une modification des molécules d’ADN présentes dans les cellules à l’origine des globules rouges et blancs. On observe chez les patients atteints d’une leucémie un blocage de la production de globules blancs fonctionnels, qui s’accumulent dans la moelle osseuse. Les études menées sur des modèles souris de leucémie ont permis d’identifier le rôle essentiel de deux éléments cellulaires (on parle de protéines) dans la réponse au traitement. En effet, en absence de traitement, ces protéines sont déréglées dans les cellules leucémiques et ne contrôlent donc plus leur survie et leurs fonctions. Les précédents travaux ont identifié deux médicaments qui permettent l’élimination des cellules leucémiques notamment en redonnant à ces protéines leur rôle de régulateur de la survie des cellules. Nous cherchons maintenant à déterminer le rôle respectif de chacune de ces protéines et aussi quelle partie de l’une de ces protéines permet d’éliminer les cellules leucémiques en réponse au traitement. Nous disposons au laboratoire d’un modèle de souris qui possède la même modification d’ADN que les patients et développe spontanément une leucémie. Lorsque ces souris tombent malades, nous pouvons récupérer les cellules leucémiques et les injecter dans de nouvelles souris pour obtenir un modèle fiable, répétable, que nous pouvons analyser en profondeur. Dans ce projet, nous produiront de nouvelles cellules leucémiques qui présentent différentes variations des protéines pour tester leur réponse au traitement. Des traitements allant de 3 heures à 21 jours seront administrés aux souris malades. Nous utiliserons également des souris ne possédant pas de système de défense immunitaire pour déterminer si ces défenses sont importantes pour guérir de la leucémie. Enfin, nous analyserons directement les cellules leucémiques pour comprendre comment elles réagissent au traitement. Nous mettrons également en place un système utilisant des souris afin d'obtenir un grand nombre de cellules à l'origine des cellules sanguines. Ce système permettra de faire des analyses approfondies au niveau de la cellule en utilisant un nombre réduit de souris.
Bénéfices attendus
Ces nouveaux travaux permettront de mieux comprendre le rôle de ces protéines dans la guérison de la leucémie ainsi que le rôle que joue le système immunitaire dans la réponse au traitement. A plus long-terme, comprendre les mécanismes qui permettent l’initiation de la leucémie mais également l’élimination des cellules cancéreuses après thérapie pourra amener à de nouveaux traitements dans les autres types de leucémie qui présentent un très mauvais pronostic.
Procédures
Les cellules leucémiques récupérées des souris développant spontanément la leucémie seront injectées par voie intra-veineuse (dans la veine caudale sur souris éveillée, durée de l'injection : 1 min) dans des souris ayant ou non un système immunitaire (cela permettant de déterminer le rôle du système de défense dans l'effet des traitements). Dans le cas des injections à des souris possédant un système immunitaire, une étape d'irradiation (permettant de détruire partiellement ces cellules de défense; durée 5 minutes sans anesthésie) sera parfois utilisée afin de faciliter la prise de greffe des cellules cancéreuses. Cette injection permettra le développement de la leucémie dans ces souris. Nous mettrons en place la stratégie thérapeutique en utilisant une combinaison de médicaments couramment utilisés pour traiter ce type de cancer. Cela correspond en l'administration quotidienne d'une molécule thérapeutique par injection intra-péritonéale (dans l'abdomen de la souris éveillée, durée de l'injection : 10 s) pendant 21 jours, pouvant être combiné à la mise en place sous la peau du dos de la souris d'une capsule permettant la libération continue du second médicament (implantation réalisée sous analgésie et anesthésie générale, l’opération dure une dizaine de minutes). Dans certaines expériences, d’autres traitements seront évalués en parallèle. Ils seront administrés soit dans l'eau de boisson, soit par injection intra-péritonéale quotidienne (2 à 6 jours max), pendant toute la durée de l'expérience. Le suivi du développement du cancer sera suivi par un prélèvement de la moelle osseuse au niveau du fémur. Il ne sera pas réalisé systématiquement, puisque le développement de la maladie peut être également détecté par une palpation de l'abdomen de la souris (détection d'une masse témoignant d'une prolifération importante des cellules cancéreuses dans la rate). Néanmoins, nous souhaiterons, sur quelques souris, vérifier la présence des cellules cancéreuses avant de détecter cette masse abdominale ou vérifier l'efficacité de nos traitements. Pour cela les souris seront anesthésiées et recevront un traitement anti-douleur préventif. Le prélèvement sera réalisé 2 fois maximum durant la vie des animaux (avant et après traitement) avec un intervalle de 2 semaines (durée 3 min). Pour le modèle permettant la production d'un grand nombre de cellules à l'origine des cellules sanguines, les souris recevront une unique injection en intraveineuse (durée 30 s, sans anesthésie).
Impact sur les animaux
Dans les modèles leucémiques, des signes cliniques de la maladie peuvent apparaître durant sa progression. Ces signes incluent des modifications de l’apparence (manque de toilettage, yeux clos…) ou du comportement (mobilité, agitation) et une augmentation de la taille de la rate. Les prélèvements de la moelle osseuse avant et après traitement pourraient induire une douleur pendant quelques heures après l’intervention. Les traitements utilisés dans ce projet peuvent induire des nuisances. Tout d’abord, l’implantation de la capsule sous la peau du dos peut entraîner une gêne dans le déplacement. Dans les jours qui suivent l'implantation, une irritation et une rougeur au niveau des points de suture peuvent être observées. Ensuite, les injections dans l'abdomen sont réalisées quotidiennement jusqu’à 21 jours consécutifs, pouvant générer une douleur localisée au site d'injection et un stress lié à la manipulation quotidienne des souris. Enfin, les différents traitements peuvent conduire à une perte de poids des animaux, poids regagné aussitôt le traitement terminé pour les souris dont la survie est étudiée après la fin du traitement. Le condition des souris avant l'injection des cellules cancéreuses peut entrainer un affaiblissement de la souris (perte de poids, diarrhée).
Devenir
La majorité des animaux seront euthanasiés à la fin du traitement afin de prélever un maximum d’organes et ainsi évaluer les mécanismes d'action de ces molécules thérapeutiques dans le cas des cancers du sang. Certains des animaux seront utilisés pour déterminer la survie des animaux traités jusqu’à l’atteinte des points limites terminaux (euthanasie dès l'atteinte d'un point limite terminal).
Remplacement
Un grand nombre de tests a déjà été effectué sur des cultures de cellules (in vitro). Mais ces modèles sont limités car ils ne reproduisent pas la complexité d'un organisme vivant (absence d'interaction entre cellules saines et cancéreuses). De plus la distribution des traitements dans l’organisme joue un rôle important dans l’effet thérapeutique d’une molécule et cela est impossible à reproduire sans l’utilisation d’animaux. Enfin, les souris disposent d’un système immunitaire proche de celui de l’humain qui permet d’étudier les interactions entre les cellules immunitaires et la leucémie. Toutefois, le développement de modèle cellulaire ex vivo pour certains aspects de notre projet devrait nous permettre, à terme, de diminuer le nombre d’animaux engagés dans des procédures expérimentales.
Réduction
Grâce à une analyse statistique et à notre expertise sur ce type d’expériences, nous avons réduit le nombre de souris utilisés au maximum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures.).
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi (présence de papier kraft pour la création de nid et de buchette en bois à ronger). Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Une fois par semaine, nous réaliserons un suivi clinique des animaux à l'aide d'une grille de score permettant de déterminer des points limites précoces qui conduiront à l'euthanasie des animaux. Un traitement anti-douleur sera administré avant chaque geste pouvant générer une douleur (implantation de la capsule sous la peau du dos, prélèvement de la moelle osseuse dans le fémur) ainsi que lorsque des signes de douleur sont observé lors de l'examen clinique. En absence d'amélioration, l'animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris est un mammifère de petite taille dont la génétique et le comportement sont parfaitement connus. Cela permet de mesurer très facilement le bien-être, la souffrance et l’angoisse des animaux et de pouvoir y remédier le cas échéant. De plus, la souris et l’homme partagent 99 % de leurs gènes. Ainsi, les résultats des expériences réalisées chez la souris pourront être facilement transposables à l'être humain et donc améliorer l'étude des pathologies humaines et leurs traitements. Les souris utilisées dans le cadre de ce projet seront des souris adultes afin de reproduire le plus fidèlement possible la pathologie humaine et l'effet des traitements ainsi que d’étudier le rôle d’un système immunitaire mature.