Souris

Toutes tuées pour analyser l'infiltration inflammatoire de leur muscle cardiaque, 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 45 reçoivent des cellules tumorales implantées dans le pancréas au cours d'une intervention de vingt minutes, 45 autres des cellules de tumeur pulmonaire sous la peau du flanc, et 60 portent quinze jours une mini-pompe osmotique sous-cutanée qui diffuse l'hormone testée. Le porteur reconnaît que la croissance tumorale gêne les déplacements dans les derniers stades et réduit la prise alimentaire. Il justifie le recours à la souris par sa reproduction rapide et son nombre de naissances, et fixe les effectifs sur une bibliographie qui, écrit-il, suggère dix à quinze souris par procédure.

Objectifs

L'obestatine est une petite hormone produite principalement dans le tube digestif et distribuée dans divers organes et tissus. Cette hormone a des effets très bénéfiques sur le muscle squelettique, dont elle favorise la régénération. Cependant, le rôle de cette hormone dans le tissu musculaire cardiaque pathologique demeure peu clair de nos jours. Par conséquent, l'objectif principal de la présente étude est d'explorer la capacité de l'hormone en tant que traitement possible de la pathologie cardiaque associée à la perte musculaire consécutive au cancer. L'atrophie et la fonte musculaire sont des complications extrêmement graves du cancer et constituent la principale cause de décès chez de nombreux patients. L'atrophie et le dysfonctionnement du muscle cardiaque sont communs à pratiquement tous les types de tumeurs, réduisant la qualité de vie des patients. Au cours des dernières décennies, la réponse immunitaire s'est imposée comme une composante majeure de la pathologie cardiovasculaire et du muscle cardiaque. Pour cette raison, il nous semble intéressant de réaliser cette étude dans laquelle nous établirons : - Le profil des cellules inflammatoires qui atteignent le cœur en présence de différentes tumeurs. - Le rôle de l'hormone sur ces populations inflammatoires atteignant le cœur.

Bénéfices attendus

- Identification de nouvelles voies thérapeutiques ou de traitements liés aux cellules inflammatoires infiltrant le cœur. - Établissement de la petite hormone obestatine comme agent thérapeutique anti-inflammatoire potentiel.

Procédures

Au cours du développement de ce projet, les souris seront soumises à 4 interventions différentes : 1.- Echographie du cœur: Cette intervention sera réalisée sur toutes les souris du projet. L'acquisition a une durée de 10 minutes. Toutes les souris seront soumises à cette ntervention. 2.- Anesthésie : une anesthésie sera pratiquée pendant les échographies, pendant l'implantation des cellules tumorales et lors de la pose de mini-pompes osmotiques. La durée de l'anesthésie pendant l'échographie sera de 10 minutes. La durée de l'anesthésie pendant l'implantation des cellules tumorales sera de 20 minutes (pancréas) et 5 min (sous-cutanée). La durée de l'anesthésie pendant la pose de mini-pompes osmotiques sera de 10 minutes. Toutes les souris seront soumises à cette intervention. 3.- Induction de tumeur pancréatique: Des cellules tumorales pancréatiques seront implantées dans le pancréas sain de souris. Le développement de la tumeur dure trois semaines. A effectuer sur 45 souris. Intervention d'une durée de 20 minutes 4.- Induction tumorale sous-cutanée: Des cellules tumorales du pulmon seront implantées sur le flanc de la souris. Le développement de la tumeur dure quatre semaines. A effectuer sur 45 souris. Intervention d'une durée de 5 minutes 5.- Pose de mini-pompes osmotiques sous cutanées et infusion continue de l’hormone: les mini-pompes resteront implantées pendant 15 jours. A effectuer sur 60 souris. Intervention d'une durée de 10 minutes

Impact sur les animaux

- L'utilisation de l'anesthésie pour procéder à l'immobilisation de l'animal peut entraîner une baisse de la température de l'animal. - L'implantation de cellules tumorales dans le pancréas expose les animaux à un risque de blessure et peut provoquer une douleur modérée au niveau de l'incision. Les souris peuvent avoir une mobilité réduite. L'implantation de cellules tumorales sous-cutanées implique une petite piqûre, sans irritation observable. Les animaux peuvent simplement présenter des symptômes de stress. - Le développement de la tumeur dans les deux modèles peut entraîner une gêne pour les animaux, en particulier en ce qui concerne la mobilité dans les derniers stades du développement de la tumeur. Dans les deux modèles, les souris peuvent présenter une réduction de l'ingestion. - La mise en place de mini-pompes expose les animaux à un risque de blessure et stress.

Devenir

A l'issue de chacune des procédure les animaux seront mis à mort afin que l'infiltration inflammatoire du muscle cardiaque puisse être analysée.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux pour l'étude des pathologies est standardisée et largement utilisée. Cette étude serait irréalisable chez l'homme, et bien qu'il existe des modèles animaux peut-être plus proches de l'homme, des éléments tels que leur acceptation par la communauté scientifique, leur coût/bénéfice, et leur disponibilité (stabulation, protocoles expérimentaux, nombre d'animaux, etc.), explique l’utilisation de modèles murins, adaptés à ce type d'étude. Les modèles in vivo sont une étape essentielle dans la compréhension des mécanismes impliqués dans le développement des complications cardiaques. Il n'existe actuellement aucun modèle cellulaire ni aucune approche computationnelle permettant de visualiser le problème de l'acquexia.

Réduction

La bibliographie examinée suggère l'utilisation d'un nombre compris entre 10 et 15 souris pour les procedures signalées ci-avant. Ce nombre est décrit comme le plus approprié pour obtenir des données fiables et une analyse statistique robuste. On essaiera d'obtenir le maximum d'informations à partir d'un seul animal afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés

Raffinement

Les animaux seront logés dans des cages avec un maximum de 5 animaux par cage. L'air, l'humidité et la température doivent être contrôlés dans l'animalerie. Les animaux doivent avoir accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Afin de réduire les comportements nuisibles ou anormaux, les animaux doivent bénéficier de techniques d'enrichissement appropriées. Toutes ces techniques d'enrichissement permettent aux animaux de développer des capacités d'adaptation telles que la recherche de nourriture, la manipulation et les activités d'exploration. La surveillance des animaux s'effectue selon une grille de score de points limites.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. Grâce à ces modèles de souris, nous pouvons obtenir très rapidement des résultats pour la recherche, ce qui ne serait pas le cas avec une autre espèce dont la reproduction serait beaucoup plus longue et dont le nombre de naissances serait beaucoup plus faible. Les animaux adultes ont été choisis pour le projet car ils ont une réponse inflammatoire suffisamment élevée pour être surveillée.

Dépourvues de poils par sélection, les souris SKH-1 laissent voir et mesurer les tumeurs de la peau sans rien raser. 80 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois fois par semaine pendant deux, quatre ou six mois, elles sont exposées aux UVB, en continu aux radiofréquences 5G à 26 GHz, ou aux deux, jusqu'à ce qu'apparaissent vers la seizième semaine de multiples tumeurs cutanées sur le dos, que le porteur décrit comme pouvant gêner leurs déplacements et les empêcher d'atteindre la nourriture dans la mangeoire. Toutes sont tuées pour prélever les tumeurs et la peau du dos.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer l'effet d'une exposition à la fois aux ondes radiofréquences (RF) émises par les systèmes de communications sans fil et au rayonnement solaire ultraviolet (UV) sur le développement des tumeurs cutanées chez la souris. Au cours de sa vie, l'homme est quotidiennement exposé à ces 2 types de rayonnement, possiblement cancérogène ou cancérogène connu, ce qui peut avoir des effets néfastes sur sa santé. De ce fait, l'exposition combinée et consécutive à ces deux agents physiques omniprésents dans notre environnement pourrait jouer un rôle important dans l'apparition de cancers cutanés. Avec l’arrivée de la nouvelle technologie 5G et ses fréquences plus élevées comme 26 GHz, il est crucial de savoir comment cela pourrait affecter la santé humaine, en particulier la peau. Bien qu’il soit connu que l'exposition au soleil, en particulier aux rayons UVB, endommage l'ADN et produit des substances nocives telles que des radicaux libres, nous n'avons pas encore suffisamment d'informations sur l'impact des ondes de téléphones portables à 26 GHz. Notre idée est donc que l'exposition quotidienne à ces deux facteurs pourrait potentialiser l'apparition des cancers cutanés chez l'homme.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet est de déterminer l'impact des RF sur les cancers cutanés UVB induits. Grâce à ce projet, nous espérons obtenir une réponse claire sur les RF : i) elles n'ont pas d'effet ii) elles jouent un rôle protumoral ou au contraire iii) un rôle antitumoral. Les données obtenues permettront d’améliorer la prévention concernant la survenue des cancers cutanés et diminuer leur mortalité si les RF amplifient l’effet délétère des UV. Les cancers cutanés sont visibles, affligeants, induisant un stress psychologique important. Limiter l’apparition des cancers cutanés et leurs effets secondaires, améliorera la qualité de vie des personnes touchées et diminuera le coût en terme de santé publique.

Procédures

Les animaux sont exposés aux rayons UVB 3 fois par semaine pendant moins d'une minute et/ou aux radiofréquences (RF) en continu et cela pendant 2, 4 ou 6 mois. A l'apparition des premières tumeurs, le volume tumoral est mesuré 1 à 2 fois/semaine au pied à coulisse sur souris vigile et cela jusqu'à la fin de la phase expérimentale.

Impact sur les animaux

L'exposition répétée aux UVB provoque de multiples petites tumeurs cutanées sur le dos des souris qui vont apparaitre aux alentours de 16 semaines d'irradiation. Ces tumeurs peuvent devenir gênantes pour se déplacer ou se redresser pour attraper la nourriture dans la mangeoire. Il est également possible que la co-exposition aux RF accentue le niveau de nuisance, si comme nous le supposons les RF potentialisent les effets des UVB.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort afin de prélever les tumeurs et la peau du dos pour les différentes analyses biochimiques et histologiques.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires in vitro ainsi que des modèles d'épidermes pigmentés humains reconstruits in vitro pour répondre à ces questions. Cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que la formation d’une tumeur, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. De nombreux articles ont mis en évidence l'importance du microenvironnement dans le processus de carcinogènése cutanée et malheureusement, il est à ce jour, très difficile de reproduire ce microenvironnement tumoral in vitro. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire à la réalisation de ce projet a été scrupuleusement réduit au minimum en tenant compte de nos 10 ans d’expériences en matière de cancérogénèse UVB induite. En effet, les souris ne sont pas consanguines et par conséquent, nous avons toujours 2 ou 3 souris qui ne répondent pas aux irradiations ou peuvent avoir des réponses complétement atypiques par rapport au reste du groupe (croissance tumorale trop rapide ou trop lente), ce qui a été bien constaté au cours de nos précedentes expérimentations. Pour ces raisons, nous avons déterminé via des tests statistiques qu'un lot de 20 souris par condition était nécessaire pour avoir des données statistiquements exploitables à la fin de l'étude. Nous utiliserons également des lots témoins communs afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les animaux qui ne répondent pas favorablement seront néanmoins utilisés pour des prélèvements de peau et serviront de contrôle pour des analyses ultérieures.

Raffinement

Des études pilotes ont été réalisées pour raffiner l’ensemble de nos procédures expérimentales sur les animaux de manière à réduire au minimum les temps d’exposition, les temps de contention et d’isolement afin de prévenir toute douleur ou inconfort chez nos animaux. De plus, nous réalisons une surveillance quotidienne de nos animaux et nous avons mis en place des mesures conservatoires (ajout de croquettes dans les cages, biberons à longue pipette) et des points limites qui nous permettent d'agir rapidement en cas d'inconfort ou de douleur observés chez nos animaux.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle car c'est un animal de petite taille, facile à héberger et à manipuler. C'est un modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain. Les souris SKH-1 sont bien connues pour l'étude de la cancérogénèse UVB-induite. Elles sont immunocompétentes et totalement dépourvues de poils ce qui rend la mesure et l'observation des tumeurs cutanées bien plus facile que sur d'autres modèles de souris. Les souris seront inclues dans le protocole expérimental à l'âge de 6 à 8 semaines. Ages auxquels elles sont considérées comme de jeunes adultes ayant atteint un poids de 20-25g, une maturité hormonale et un état métabolique stable.

Une partie des souris part vers des séances de formation à des gestes techniques une fois l'expérience finie, 210 individus au total, les autres étant tuées pour prélever leurs tissus. 504 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Exposées au dioxyde de silicium alimentaire par leur mère dès la gestation puis pendant 130 jours, elles reçoivent des gavages trois fois par semaine, neuf prélèvements de sang à la queue, un poinçon dans l'oreille, des collectes de fèces en isolement deux fois par semaine, et pour la moitié d'entre elles une injection de toxine bactérienne dont les effets sont suivis jusqu'à six heures. Le porteur espère que ces données seront prises en compte par les instances réglementaires pour encadrer l'exposition humaine aux nanoparticules alimentaires, bénéfice renvoyé au conditionnel là où l'exposition des souris et l'injection de toxine sont, elles, programmées.

Objectifs

Les nanomatériaux (composés de particules < 100 nm) sont de plus en plus présents dans le secteur de l’agroalimentaire, notamment dans les aliments en tant qu’additifs. L’exposition à ces additifs est souvent chronique (jusqu’à 1-10 mg/kg/jour en Europe) et commence très tôt, via la consommation maternelle suivie d’un passage vers le fœtus (transplacentaire) ou dans le lait. Ce projet fait suite à des résultats qui montrent qu’une exposition à l'additif E551 provoque, une altération de la fonction de barrière intestinale (mesure de perméabilité), une mise en place de désordre métabolique et une modification du microbiote. Nous avons notamment mis en évidence une forte diminution de deux souches bactériennes chez des souris mâles exposés au E551 de la vie in utero jusqu'à l'âge adulte. Il s'agit de deux souches bactériennes probiotiques Akkermansia muciniphila et Bifidobacterium pseudolongum. L'objectif de ce projet sera d'étudier si une supplémentation avec ces deux souches probiotiques sera capable de modifier la mise en place des désordres provoqués par le E551 sur la fonction de barrière, sur le métabolisme et sur la réponse immunitaire. Pour ce projet, des souris femelles seront exposées 61 jours avant la mise bas et durant la lactation au E551 à 10mg/kg. L'additif sera incorporé dans l'aliment. La descendance continuera d’être exposée à l'additif via l'aliment et sera supplémentée ou non par voie orale avec les souches probiotiques seules ou associées pendant 130 jours.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mettre en évidence le role d'un microbiote modifié dans la mise en place d'altération de la fonction de barrière intestinale, de désordres métaboliques et immunitaires. Ce projet apportera des données utilisables pour l'évaluation des risques pour la santé humaine et animale dans l'utilisation des additifs. Cet impact pourra être pris en compte par les instances règlementaires afin d'émettre des préconisations dans l'exposition humaine aux nanoparticules alimentaires.

Procédures

Pour la supplémentation en probiotique les animaux recevront le solvant ou le probiotique (seul ou associé) par voie orale d'un geste rapide n'exédant pas 10 secondes à raison de 3 fois par semaine. Dans le cadre des mesures d'intolérance au glucose, de la glycémie, de l'insulinémie et de la perméabilité intestinale, les animaux recevront une administration orale de glucose ou d'un marqueur de perméabilité intestinale (geste rapide d'environ 10 secondes) et des prélèvements sanguins seront également réalisés au niveau de la queue (1 prélèvement pour la mesure de perméabilité, 8 prélèvements pour la glycémie-insulinémie), après application d'une crème anesthésiante locale (10 secondes/prélèvement). Des prélèvements de fécès seront aussi effectués deux fois par semaine tout au long de l’expérience. Les souris seront isolées pendant 5 minutes dans des cages sans sciure pour permettre de récolter les fèces. Enfin, la moitié des animaux seront exposés au maximum 6 h à une toxine bactérienne délivrée par injection unique nécessitant une contention de quelques secondes des animaux.

Impact sur les animaux

La mise en oeuvre de nos procédures pourra générer du stress. Après la période d'acclimatation, les animaux seront identifiés par poinçon avec contention qui entrainera inconfort et stress. Par la suite le stress sera attenué par des manipulations hebdomadaires lors du suivi de poids ou d'observations. Les administrations des probiotiques par voies orale pourra générer du stress lié à la contention et à l'introduction de la sonde. Après le gavage, les animaux seront observés pour s'assurer qu'il n'y ait pas de fausse route (vocalise, mobilité réduite), le cas échéant l'animal sera euthanasié. Ensuite la réalisation des mesures d'intolérance au glucose ou de mesure de perméabilité seront génératrices d'inconfort notamment lié à l'administration orale de glucose ou de dextran et aux prélèvements de sang après anesthésie locale. Ensuite, l'injection de LPS qui s'effectue après contention de l'individu, peut engendrer un stress lié à la manipulation de l'animal et à l'injection en elle-même. La toxine peut perturber l'état général des animaux qui seront sous surveillance constante jusqu'à la fin de l'expérimentation.

Devenir

A l'issue de toutes les procédures, tous les mâles de la descendance ainsi que les femelles reproductrices seront euthanasiés afin de récolter les échantillons tissulaires pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique du projet. Les mâles reproducteurs et les femelles de la descendances seront réutilisés pour des actions de formations à des gestes techniques.

Remplacement

Des expérimentations utilisant des méthodes cellulaires complexes tels que des organoïdes intestinaux de souris ont préalablement été réalisé au laboratoire dans une nécessité de mettre en place une approche alternative à l’expérimentation animale. Ces expérimentations ont permis d’évaluer les effets direct d’additifs alimentaires inorganiques sur l’épithélium intestinal. Par conséquent, cette approche nous permet d'avoir une réponse très ciblée uniquement au niveau tissulaire/cellulaire et non intégrée. Dans notre étude nous souhaitons étudier l’impact d’une exposition à des additifs alimentaires dès la période de périnatalité et ces conséquences sur le microbiote intestinal ainsi que sur la barrière intestinale, le système immunitaire et le métabolisme. Les modèles alternatifs tels que les organoïdes ne peuvent pas reproduire le passage transplacentaire, les échanges maternofœtals ainsi que les interactions le long des axes microbiote-intestin-système immunitaire et intestin-foie. Ce modèle alternatif n’est pas non plus adapté pour étudier la répartition des particules inorganique dans l’organisme entier après le passage de la barrière intestinale.

Réduction

Nous avons conçu nos expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux a été déterminé en se basant sur des résultats antérieurs d'études similaires. Chaque groupe expérimental sera donc constitué de 12 souris. Pour les analyses des données récoltées, des tests statistiques adaptés seront réalisés.

Raffinement

Durant l'étude les animaux seront en hébergement collectif (5 ou 3 par cage selon le stade de l'expérimentation, 1 femelle par cage avec leurs petits pendant la lactation) avec un enrichissement des cages (dispositifs de nidification en papier absorbant et maisonnette) afin de réduire l'angoisse des animaux. L'angoisse sera également attenuée par des manipulations hebdomadaires lors du suivi de poids ou d'observations. Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un anesthésique local sur la queue avant les prélèvements sanguins. L’identification des animaux par poinçon d’oreille permettra de réaliser un suivi individuel (observations, controles de prise de poids des animaux). Dans le cas où un animal présenterait des signes de souffrance, il sera retiré de l'étude et des soins adaptés pratiqués. Le cas échéant une euthanasie sera pratiquée. L'exposition à la toxine bactérienne peut perturber l'état général des animaux qui seront observés en continu jusqu'à leur euthanasie.

Choix des espèces

La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote, l’intestin et le système immunitaire. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte (8 semaines) afin qu'elles soient capables de procréer et les descendants seront utilisés au sevrage jusqu'à l’âge de 5 mois. Cela permettra d’étudier le rôle de nos deux souches probiotiques sur une exposition périnatale suivie d’une exposition post-sevrage sur le développement des fonctions intestinales et métaboliques.

3000 rongeurs, 1800 rats et 1200 souris, vont être utilisés, tous tués sous anesthésie sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur cautérise l'urètre sous anesthésie générale pour provoquer une incontinence, on leur implante des cathéters dans la vessie, la veine jugulaire ou l'estomac, puis on comprime leur abdomen par pressions croissantes jusqu'à ce qu'une goutte d'urine sorte, quatre fois de suite. Les molécules testées viennent de clients dont le porteur écrit ignorer la nature et les effets secondaires possibles. Il qualifie ce test de compression de "non invasive", n'indique pas le nombre de jours de traitement et reconnaît qu'aucun calcul statistique ne fonde l'effectif de dix animaux par groupe.

Objectifs

L’incontinence urinaire d’effort est un des problèmes majeurs du vieillissement. Cette pathologie est souvent sous-évaluée car tabou mais a un impact important dans la qualité de vie des patients. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet de candidats médicaments sur le mécanisme de fermeture de l’urètre et sur l’incontinence urinaire d’effort induite par cautérisation de l’urètre.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints d’incontinence urinaire.

Procédures

Les animaux vont subir des traitements de produits à tester. Chaque geste classique (type gavage, administration intrapéritonéale, sous-cutanée, intramusculaire…) étant réalisé par du personnel qualifié, ces derniers devraient durer environ 30 sec à 1 min par animal. Le nombre de jours de traitement étant dépendant de chaque protocole expérimental, nous ne pouvons pas indiquer le nombre d’intervention pour ces gestes. Les animaux vont subir une chirurgie (lésion de l’urètre) sous anesthésie générale qui devrait durer 30 min maximum. Pour les tests de Leak Point Pressure (LPP) ou test de point de fuite, des cathéters pourront être placés dans différents organes (vessies, veine jugulaire, intragastrique par exemple…). Ces chirurgies dureront environ 20 min et l’animal ne la subira qu’une fois. Le test de LPP se fait sous anesthésie générale (anesthésie sans réveil). Ce test consiste à appliquer des pressions croissantes sur l’abdomen de l’animal (principalement au niveau de la vessie) et d’arrêter ces pressions dès qu’une goutte d’urine apparaît. Chaque session de ce test dure environ 30 sec. Et un animal aura plusieurs sessions (environ 4) avec 10-15 min de repos entre chaque.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Cependant, certains clients nous informent de potentiels effets secondaires pouvant apparaître avec leurs molécules. Des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, des lésions et une légère douleur (douleur de l’aiguille). Le modèle physiologique de ce protocole mimant une incontinence urinaire, les animaux subiront les effets secondaires de cette pathologie (pertes fréquentes et incontrôlées d’urines).

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront mis à mort car anesthésies avec un anesthésiant irréversible (sans réveil).

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de l’incontinence urinaire. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Pour évaluer l’effets de candidats médicaments, la méthode du LPP (link point pressure ou pression du point de fuite) est une méthode non invasive qui consiste à appliquer des pressions croissantes au niveau de la vessie de l’animal et d’observer une fuite urinaire. Cette méthode se réalise sur des animaux anesthésiés (anesthésie sans réveil), ne provoquant pas de douleur aux animaux. Cette méthode sera réalisée par du personnel qualifié et validé pour cette technique, ce qui permettra d’obtenir des résultats significatifs avec un nombre minimum d’animaux. Aucun test statistique n’est réalisé pour définir le nombre d’animaux par groupe, mais avec notre recul et notre expérience, nous savons que n=10 animaux par groupe est le minimum nécessaire pour avoir des résultats significatifs. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre deux ou plusieurs groupes. Nous pensons réaliser 3 études par an chez le rat et 2 études par an chez la souris.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, nestlet…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de signes cliniques avant l’atteinte de points limites à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères. En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient. Des antalgiques seront utilisés pour les chirurgies afin de limiter la douleur. Les protocoles utilisés seront conformes aux recommandations des comités d'éthique et viseront à assurer le bien-être des animaux, en se référant aux "cinq libertés fondamentales" établies par l'Organisation mondiale de la santé animale. Cela implique : 1. que les animaux ont accès à une alimentation et à de l'eau en quantité et en qualité suffisantes 2. que nous prenons des mesures pour minimiser la douleur, les blessures et les maladies chez les animaux. 3. que nous veillons à ce que les conditions de logement et d'environnement des animaux soient adaptées 4. que nous permettons aux animaux d'exprimer leurs comportements naturels et essentiels à leur bien-être 5. que nous prenons des mesures pour minimiser la peur et la détresse chez les animaux grâce à un entrainement pour les rendre à l'aise avec les gestes techniques, les supports de contention ou les appareils utilisés pendant l'expérience.

Choix des espèces

Notre expertise chez le rongeur et en particulier chez le rat dans les études urologiques ainsi que les informations de la littérature sont les raisons qui nous ont fait choisir le rat en priorité. Toutefois, ces procédures peuvent très bien être extrapolées chez le souris, selon la demande de nos clients (expérimentations déjà réalisées dans notre laboratoire). Les animaux utilisés seront au moins âgés de 7 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.

Jusqu'à trois séances d'IRM de trois heures sous anesthésie, avec quatre prises de sang par séance et des bouchons de mousse enfoncés dans les conduits auditifs pour amortir le bruit de l'aimant : 228 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est soumise six semaines à un régime hyperlipidique qui provoque hyperlipidémie et résistance à l'insuline. L'objet est de suivre l'effet de la neuro-inflammation d'origine alimentaire sur l'activité cérébrale, le cerveau étant prélevé après la mise à mort. Le porteur qualifie pourtant ces procédures de "non-invasives" et estime que le régime n'altérera pas "drastiquement" la qualité de vie des souris.

Objectifs

L'un des plus grands défis dans un environnement obésogène tel que nos sociétés modernes est la gestion du poids à long terme, la plupart des tentatives de perte de poids se soldant par une reprise de poids ultérieure (effet "yo-yo"). Le système nerveux central joue un rôle clé dans le maintien de la balance énergétique en régulant les apports (comportement alimentaire, incluant les dimensions homéostatiques et hédoniques) et les dépenses énergétiques. La plupart des études se sont intéressées à la régulation homéostatique du comportement alimentaire. De nombreuses études ont ainsi montré chez la souris mais aussi chez l’Homme qu’une exposition chronique à un aliment riche en lipides (connue pour conduire à terme à une surchage pondéral voire une obésité) conduit à des modifications neuro-anatomiques, une neuro-inflammation, et ce particulièrement au niveau de l’hypothalamus. Malgré l'accumulation de preuves révélant les interactions entre les régulations homéostatiques et non-homéostatiques du comportement alimentaire, des données manquent sur l’effet d’une exposition chronique à une alimentation hypercalorique sur les réseaux cérébraux sous-jacents. De plus peu de données existent concernant l’effet de la neuro-inflammation induite par un régime riche en lipides sur l’activité cérébrale.

Bénéfices attendus

Les données issues de ce projet contribueront à une meilleure compréhension de l’effet de la neuro-inflammation induite par le régime hyperlipidique sur l’activité cérébrale et la connectivité fonctionnelle et éclaireront sur les mécanismes cérébraux qui sous-tendent les modifications du comportement alimentaire (y compris dans l’addiction à la nourriture, le « binge eating » ou l’anorexie). De plus, l’approche par imagerie dans le modèle animal est non seulement une méthode non-invasive mais également une approche facilement transférable à l’Homme.

Procédures

Les souris seront soumises à des anesthésies pour l'acquisition par IRM. Une session d'acquisition durera au maximum 3h et une souris réalisera au maximum 3 sessions d'acquisition. Dans la procédure 1, des prises de sang seront effectuées pour mesurer la glycémie. Elles dureront quelques secondes et seront au nombre de 4 par session d'acquisition IRM pour chaque animal. Dans la procédure 3, une partie des souris sera exposée à un régime hyperlipidique pendant 6 semaines.

Impact sur les animaux

La prise chronique sur des temps longs (>8 semaines) d’un aliment HFD conduit à une prise de poids, des perturbations métaboliques et des modifications de l’activité locomotrice et potentiellement de l’humeur. La période d’exposition au HFD de 6 semaines dans notre projet perturbera le métabolisme des animaux (hyperlipidémie, résistance à l’insuline) mais n’altérera pas drastiquement, à ce stade, la qualité de vie des animaux. Les nuisances liées à l'IRM étant de nature sonores, des protections auditives en mousse seront positionnées dans le conduit auditif des animaux afin d'éviter une dégradation de leur audition.

Devenir

A l'issue des procédures les animaux seront mis à mort selon la réglementation en vigueur. Le contrôle de l'intensité de l'inflammation par des approches de biologie moléculaire nécessite le prélèvement du cerveau et donc l'euthanasie des animaux. D'autres organes pourront être prélevés pour des analyses tissulaires post-mortem complémentaires (par ex: tractus digestif). Un entraînement et le raffinement des gestes techniques employés seront réalisés en amont des prélèvements décrits précédemment.

Remplacement

Cette étude de mesure de la neuroinflammation, de l’activité cérébrale et la de connectivité fonctionnelle entre des structures cérébrales ne peut être réalisée in vitro ni modélisée in silico. En effet, le nombre, la complexité des structures cérébrales mises en jeu, leur activité et leurs interactions dans un contexte intégré ne permet pas de réaliser cette étude sur des modèles cellulaires qui sont insuffisamment représentatifs à l'heure actuelle. De plus, dans la perspective de pouvoir transposer les données générées dans cette étude à l'Homme, l'utilisation d'animaux présentant une bonne analogie fonctionnelle ainsi qu'une bonne homologie anatomique, physiologique et génétique avec l'Homme est requise. Dans cette étude, les travaux seront menés sur la souris.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu a été déterminé grâce à des données publiées générées par les responsables du projet. Le nombre d’animaux prévu permet d’effectuer des analyses statistiques qui permettront de déterminer la pertinence de poursuite ou non de la méthode mise au point. Plus précisément, pour les différents paramètres d'imagerie considérés, des tests statistiques permettant une analyse temporelle et/ou de l'effet de traitements entre plusieurs groupes et/ou de l'effet sexe des animaux lors de mesures répétées en utilisant des tests paramétriques ou non paramétriques selon la distribution des données. Grâce à l'utilisation d'un suivi longitudinal (mesures répétées chez un même animal), le nombre total d'animaux inclus dans l'étude est réduit.

Raffinement

Les procédures expérimentales prévues sont non-invasives. Les prélèvements pour l’analyse histologique sont post-mortem. Le suivi du poids et une observation clinique quotidienne des souris permettront d’évaluer les points limites. La durée d’exposition à l’aliment HFD permet de limiter les conséquences négatives sur l’animal.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur le comportement alimentaire, notamment dans l’obésité en raison de ses réponses reproductibles permettant une robustesse des résultats générés. L’abondance des données dans la littérature sur les mécanismes de régulation de la prise alimentaire dans cette espèce permet d’autre part le raffinement des méthodes (outils analytiques disponibles évitant la mise au point de certaines méthodes sur des animaux supplémentaires). Enfin, nous disposons déjà de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons décidé de travailler sur individus « jeune adulte » âgées de 7-8 semaines pour éviter les effets liés au développement d’une part et au vieillissement d’autre part.

Maintenues éveillées dans un tube de contention, les 648 souris du projet reçoivent toutes une injection dans la veine de la queue, et 192 d'entre elles une injection dans l'abdomen, sans anesthésie elle aussi. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester une thérapie cellulaire destinée à accélérer la reconstitution du système immunitaire après une greffe de cellules souches. Selon les groupes, 48 sont irradiées éveillées, 128 reçoivent une injection dans le sinus orbital sous anesthésie générale et 48 sont gavées chaque jour pendant trois semaines, une chimiothérapie étant aussi prévue sans effectif précisé. Le porteur écrit pourtant que les injections peuvent provoquer un stress "nécessitant une anesthésie générale au préalable". Toutes sont tuées en fin d'expérience pour l'analyse de leurs organes, 192 après une prise de sang dans le sinus orbital sous anesthésie.

Objectifs

La greffe de cellules souches offre des perspectives de guérison aux patients atteints d’hémopathies malignes (cancer du sang) et à d'autres troubles hématologiques comme les déficits immunitaires. La transplantation avec des cellules souches peut être autologue (provenant des propres cellules du patient) ou allogénique (provenant d’un donneur sain et compatible avec le receveur). La greffe allogénique est limitée par le manque de donneurs compatibles. Lorsqu’un patient est atteint d’un cancer du sang, celui-ci subira des chimiothérapies et/ou irradiation réduisant à néant son système immunitaire avant d’être injecté par des cellules souche. Mais la durée de restauration d’un système immunitaire efficace et fonctionnel après la greffe peut aller jusqu’à deux ans. Durant cette période, le patient n’a pas d’immunité pleinement fonctionnelle et peut contracter de multiples infections représentant une des principales causes de mortalité. Nous proposons de réduire cette période de risque chez les patients en proposant une approche thérapeutique innovante pour accélérer la reconstitution d’un système immunitaire fonctionnel. De cette façon, le délai de reconstitution est réduit à 3 mois (au lieu de deux ans) permettant de réduire les durées d’hospitalisation et les risques d’infections opportunistes. Dans cette perspective, les résultats précliniques doivent être consolidés par des données pharmacologiques dans un modèle murin adulte mimant la condition clinique des patients. La souris représente un modèle pertinent pour l’étude. Ces souris nécessitent un conditionnement par chimiothérapie et/ou irradiation comparable à ceux utilisés chez les patients avant d’être greffés. Ces souris représentent un modèle indispensable afin de tester in vivo les stratégies thérapeutiques proposées dans des conditions similaires à celles utilisées chez les patients. Il s’agit d’une étape indispensable à l’application de nouvelles stratégies innovantes dans les protocoles cliniques.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de valider et de justifier la mise en place d'une stratégie thérapeutique utilisant l’injection de cellules immunitaires pour lutter contre les cancers du sang. L’acquisition de ces données est indispensable au développement de cette thérapie innovante, à fort potentiel translationnel. De plus, les études de régénération d’un thymus chez les souris âgées peuvent ouvrir la voie à une nouvelle perspective thérapeutique chez les patients souffrant de complications liées au processus de vieillissement, au SIDA, ou aux radiations dues à une catastrophe nucléaire. En effet, dans tous les cas cités, les personnes sont susceptibles de perdre leurs systèmes immunitaires et l’approche thérapeutique proposée permettrait de régénérer de façon rapide et efficace une défense immunitaire fonctionnelle.

Procédures

Les interventions se limiteront à : 1. Irradiation : L’irradiation durera moins de 5 minutes sur les animaux vigiles. 48 souris seront irradiées 1 fois. 2. Une seule injection intraveineuse dans le sinus orbitale gauche et/ou droit sous anesthésie générale. L’injection durera 1 minute / animal sur 128 souris 3. Une injection intraveineuse dans la veine caudale de la queue des souris vigiles maintenues dans un tube de contention. L’injection durera

Impact sur les animaux

De façon général, les médicaments de chimiothérapies et/ou irradiation peuvent occasionner chez l'animal des symptômes cliniques de type amaigrissement et anémie. Les injections peuvent provoquer une légère douleur localisée et un stress nécessitant une anesthésie générale au préalable. Le gavage peut provoquer un stress et une douleur au niveau de l’œsophage chez l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérience pour le prélèvement et l’analyse des organes nous permettant de conclure sur l'efficacité du traitement.

Remplacement

Des études de différenciation in vitro ont été réalisées afin d’optimiser les conditions de préparation des cellules à injecter et de s’assurer de leur potentiel à donner des cellules fonctionelles. Les expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus expérimental de mises au point. Les études précliniques de pharmacologie (mode d’administration, effet dose-réponse, efficacité de colonisation du thymus âgés) sont demandées par les autorités règlementaires avant les essais cliniques et ne peuvent pas être substituées ou mimés in vitro.

Réduction

La méthode de chimiothérapie et/ou irradiation la plus adaptée sera préalablement choisie avant les études de dose réponse. Ces études permettront de choisir une condition de greffe optimale et ainsi de diminuer les échecs de greffe. Le modèle animal choisi et le plan expérimental sont inspirés de plusieurs études similaires très bien documentées dans la littérature. Cela confirme la pertinence du modèle expérimental et renforce la validité de nos hypothèses évitant des étapes intermédiaires de mise au point chez l’animal. Le nombre d’animaux par groupe dans les différentes procédures a été calculé selon une méthode fiable et très utilisée dans la littérature permettant de fournir des données statistiquement exploitables. Les expérimentations seront regroupées au maximum et dans la mesure de la faisabilité technique, afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Une partie des animaux pourra ne pas être utilisée en fonction des résultats obtenus pour permettre l’ajustement de la dose des traitements (168 souris potentielles).

Raffinement

Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés dans des cages enrichies à l’aide de coton de nidification et de rouleaux en carton pour favoriser les cachettes et le jeu. Le nombre de souris sera limiter à 5 animaux par cage. Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de l'étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés. La mise à mort sera précédée par une anesthésie générale pour éviter le stress et la souffrance. Nous n’attendons aucun phénotype dommageable ou souffrance à l’issue de la greffe des cellules immunitaires au sinus retro-orbital chez les animaux greffés. Toute chimiothérapie et/ou irradiation sera suivie rapidement par une greffe de cellules et toute manifestation de signes de douleur sera scrutée selon les critères de définition des points limites de la présente étude. En cas de signe de souffrance et selon les résultats de la grille préétablie, le personnel qualifié et le responsable scientifique de l’étude pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement du systéme immunitaire. En effet, le système immuno-hématologique murin est très similaire au système humain dans sa fonctionnalité et son développement permettant une extrapolation des résultats obtenus. Cette espèce est facile à élever en animalerie et présente une grande homogénéité génotypique. Souris adultes de 6 à 12 semaines (et souris adultes âgées de plus de 9 mois) car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier son développement.