Souris

Les souris employées sont immunodéficientes, condition qui les rend vulnérables à la moindre infection et sans laquelle elles rejetteraient le muscle humain qu'on leur greffe. 390 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une greffe chirurgicale de trente minutes sous anesthésie, une semaine de récupération, un transport routier d'une heure vers un second établissement, puis jusqu'à seize séances de résonance magnétique sous anesthésie générale en un an, chacune pouvant durer deux heures. Toutes sont tuées en fin de projet pour que le muscle greffé et les autres organes soient analysés.

Objectifs

Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs. Nous nous intéressons aux dystrophies musculaires, un groupe hétérogène de maladies génétiques touchant le muscle squelettique. Dans ce projet nous allons greffer des fragments de muscle humain ou des muscles 3D générés in vitro à partir de cellules humaines pour étudier la régénération musculaire chez l’homme. Notre objectif est de comprendre comment elle se déroule et comment elle peut être perturbée dans le cas des maladies touchant le muscle squelettique. Un autre objectif de notre projet est de tester la régénération musculaire in vivo d’un muscle 3D d’origine humaine.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de comprendre comment la régénération musculaire se déroule dans le muscle squelettique humain, sain et malade (caractérisé par une dégénérescence et une faiblesse musculaire). Le bénéfice attendu est une meilleure compréhension de la régénération musculaire chez l’homme et le développement de nouvelles thérapies visant améliorer la régénération musculaire chez l’homme

Procédures

Les animaux sont immunodéficients et sont donc plus sensibles aux infections. Les animaux seront soumis à une greffe musculaire, une procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale et analgésie d’une durée de 30 minutes. Après une période de récupération d’une semaine, les animaux seront transférés en voite double emballage avec enrichissement, croquette et hydrogel dans un second établissement par un transport de 1h par un transporteur agréé en véhicule climatisé . Après un temps d'acclimatation de 7 jours, les animaux seront soumis à des analyses par résonance magnétique nucléaire (RMN) réalisées sous anesthésie générale d'une durée maximale de 120 minutes (16 répétitions sur 1 an). A l’issue de la période de maintien, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en vue des différents prélèvements et analyses.

Impact sur les animaux

Dans notre projet, nous greffons des biopsies musculaires humaines ou des muscles 3D générés avec des cellules humaines chez la souris. L'effet indésirable qui peut se produire sur les animaux est une inflammation/infection de la peau au site d’injection, l'animal pourrait alors ressentir une douleur locale au niveau du site d'injection. Lors des anesthésies effectuées pour l'ensemble des gestes techniques, les risques/contraintes peuvent être les suivants : effets sur le fonctionnement normal du corps pendant l'anesthésie (hypothermie, hypotension, hypoxie). Les analyses tissulaires réalisées par résonance magnétique nucléaire peuvent induire un stress de courte durée. Le phénotype dommageable de la lignée se traduit par une immunodéficience qui implique un risque accru aux infections. Le transport entre les différents établissement peuvent générer du stress.

Devenir

Ce projet implique 390 souris en total. Ces animaux seront euthanasiés en fin de projet pour l’analyse indispensable des muscles greffés et des autres organes (foie, etc) est indispensable.

Remplacement

Nous travaillons sur la régénération musculaire chez l’homme. Les études réalisées in vitro et en culture ne donnent qu’une vision partielle du comportement des cellules musculaires humaines lors de la régénération musculaire et elles ne peuvent pas recréer in vitro la complexité observée in vivo avec l’ensemble des acteurs cellulaires qui y participent.

Réduction

390 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft, bâtonnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).

Choix des espèces

La xénogreffe des muscles humain dans des animaux immunodéficients est indispensable pour pouvoir tester le comportement in vivo du tissu musculaire humain. Nous utiliserons des souris entre 2 et 3 mois d'âge. A ce stade, les souris sont déjà adultes (l’effet de la croissance pourrais affecter les résultats) et elles ont une taille facilitant la chirurgie)

Pour vérifier si l'obésité se transmet à la descendance par les ARN des spermatozoïdes, des ARN prélevés chez des hommes obèses sont microinjectés dans des œufs fécondés de souris, et la descendance est laissée grossir. 744 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À quatre mois elles subissent un test de tolérance au glucose, à quatre mois et demi un test de sensibilité à l'insuline, avec des prises de sang à la queue toutes les quinze minutes la première heure puis toutes les demi-heures. Une souris qui perd 10 % de son poids deux semaines de suite est tuée, et les autres le sont à cinq mois et demi pour prélever reins, tissus adipeux, cœur, pancréas, prostate, cerveau et foie.

Objectifs

L'obésité pose aujourd'hui un grave problème de santé publique. Bien que cette pathologie soit étroitement associée à une mauvaise hygiène de vie, de plus en plus de données épidémiologiques et expérimentales convergent vers la même idée : nos gènes se « souviennent » de l’hygiène de vie de nos parents ou en d’autres termes un phénotype nouvellement acquis ici l’obésité peut être transmis à la descendance via la lignée germinale paternelle et/ou maternelle. Ce type d’hérédité non darwinienne est un processus nouveau mettant en jeu des mécanismes dits « épigénétiques » qui font appel à des modifications qui ne sont pas codées par la séquence nucléotidique du gène. Contrairement aux modifications génétiques, les modifications épigénétiques induites par l’environnement sont instables et ne persistent que pendant 2 ou 3 générations. Les mécanismes moléculaires impliqués dans ce type d’hérédité sont encore très mal connus. On sait néanmoins que les petits ARNs présents dans le spermatozoïde de souris rendues obèses par une alimentation riche en graisse et en sucre sont les vecteurs de cette hérédité. L'objectif principal de notre projet est de valider le rôle des ARN des spermatozoïdes dans l’hérédité épigénétique de l’obésité chez l'homme. Pour cela, des ARN de spermatozoïdes d’hommes obèses et d’hommes non-obèses seront microinjectés dans des œufs fécondés de souris. Les caractères obèse et diabétique seront analysés sur les animaux obtenus. La présente demande correspond à l’analyse phénotypique des animaux obtenus après microinjection et de leurs descendants.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider le rôle des ARN de spermatozoïdes comme vecteurs de l'information épigénétique de l'obésité et du diabète chez l'homme. Sur le plan fondamental, ce projet conduira à mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans l’hérédité de l’obésité et du diabète chez l’homme. Sur le plan clinique, cette compréhension est une étape importante pour sinon stopper au moins ralentir l’épidémie mondiale de l’obésité. Cela conduira à identifier les parents, ici les pères, susceptibles de transmettre cette maladie à leurs descendants. Dans un premier temps, ce projet apportera des arguments aux cliniciens pour intégrer les parents et les descendants de parents obèses dans des programmes de prévention. Dans un deuxième temps, ce projet permettra de valider une méthode pour enlever ces marques épigénétiques délétères (marques non stables) soit via des voies interventionnelles (amaigrissement) soit par des voies moléculaires (éliminant des molécules inductrices).

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à 3 séries de prélèvements. A l'âge de 4 mois, les souris subissent un test de tolérance au glucose (Test GTT) et à l'âge de 4mois 1/2 un test pour mesurer leur sensibiltié à l'insuline (test ITT). Pour ces 2 tests, du sang sera prélevé au niveau de la queue . La glycémie est vérifiée toutes 15min la 1ère heure et toutes les 30 min la 2ème heure. A l'âge de 5 mois, les souris seront mises à mort et un prélèvement de sang sera effectué.

Impact sur les animaux

A notre connaissance, les animaux obtenues après microinjection d'ARN de spermatozoïdes ne développent pas de pathologies graves. Même si elles peuvent devenir obèses et diabétiques, la sévérité de ces pathologies reste modérée. L' Injection Intrapéritonéale de Glucose ou d'Insuline et le prélèvement à la queue, associés aux tests GTT et ITT, induisent une douleur légère de courte durée. Le prélèvement de sang en fin de procédure induit également une douleur légère de courte durée.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure expérimentale. Cela nous permettra de prélever plusieurs tissus (reins, tissus adipeux, coeur, pancreas, prostate, cerveau, foie). Certains seront directement congelés pour des analyses moléculaires et d'autres seront fixés pour analyses histologiques. Ce matériel biologique nous est indispensable pour réaliser les analyses moléculaires nécessaires à la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans l'hérédité épigénétique de l'obésité et du diabète.

Remplacement

Notre travail porte sur la transmission paternelle de caractères nouvellement acquis chez les mammifères et plus spécifiquement l'hérédité. L’hérédité épigénétique a été étudiée sur plusieurs modèles animaux vertébrés ou non-vertébrés. En utilisant des vers, il a été ainsi montré que les ARN étaient un vecteur de l’hérédité épigénétique pour des caractères sensorielles. Le rôle des ARN des spermatozoïdes comme vecteurs connus de cette hérédité a été montré chez la souris car il n’est pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou des modèles animaux non vertébrés pour étudier le rôle des ARN dans l’hérédité épigénétique de l’obésité. C'est pourquoi nous devons utiliser ce modèle expérimental animal pour valider l'hypothèse selon laquelle les ARN des spermatozoïdes sont des vecteurs de l'hérédité chez l'homme. Seul le modèle murin peut permettre de récapituler toutes les étapes de développement embryonnaire d’un organisme multicellulaire de mammifère. A l’heure actuelle, ce type de différenciation ne peut pas être réalisé in vitro. C’est pour cela que ce modèle a été utilisé jusqu’à présent et a permis démontrer que les ARN de spermatozoïdes de souris étaient un vecteur de l’hérédité épigénétique de l’obésité. Pour savoir si cela reste vrai chez l’homme, seul ce modèle expérimental est disponible. C’est pourquoi nous avons choisi de l’utiliser. Nous avons utilisé comme approches alternatives le vers pour étudier les mécanismes moléculaires de l’hérédité épigénétique. Néanmoins même si grâce à cette approche, nous avons pu identifier des mécanismes moléculaires associés, nous ne pouvons définir si ces mécanismes sont identiques dans des modèles animaux expérimentaux comme la souris et si ces mécanismes épigénétiques s’appliquent pour des maladies métaboliques comme l’obésité et le diabète de type II. Néanmoins les différences spécifiques entre les espèces et les tissus peuvent limiter la généralisation des résultats obtenus à partir de ce modèle non vertébré. Par conséquent, il est nécessaire d'utiliser ce modèle animal vertébré, la souris, pour obtenir une vision plus complète de la complexité de l'hérédité épigénétique de l'obésité et valider l'hypothèse selon laquelle les ARN des spermatozoïdes sont des vecteurs de l'hérédité chez l'homme.

Réduction

Avant ces expériences, nous avons utilisé, parallèlement à notre modèle murin et en collaboration, un modèle non-vertébré, Caenorhabditis elegans, un petit ver transparent et non parasitaire. Ce modèle nous a permis d’étudier certains aspects des mécanismes moléculaires de cette hérédité sans avoir recours au modèle animal vertébré. D’autre part afin de calculer la taille de l’échantillon nécessaire, nous avons réalisé un calcul de puissance basé sur nos précédentes expériences, test qui permet de minimiser le nombre d’échantillons et donc d'animaux nécessaires pour valider ou non notre hypothèse de départ. Enfin, grâce à nos analyses du transcriptome d'hommes obèses, nous avons sélectionné les hommes où les variations transcriptomiques étaient les plus fortes. Ce sont ces préparations qui seront utilisées dans ces expériences pour maximiser les potentiels effets des ARN sur la descendance.

Raffinement

Dans un souci de Raffinement, voici les dispositions que nous mettrons en place pour minimiser les souffrances éventuelles et le stress qui pourraient être générées par nos expériences : • Nous nous attendons à ce que nos souris deviennent obèses. Pour éviter de les séparer lorsqu’elles vieillissent (et ainsi de respecter le maximum de souris autorisées par cage) et de les stresser inutilement (en évitant de perturber la dominance déjà établie), les souris seront regroupées par 4 dans une cage dès leur arrivée à l’animalerie. Ces animaux seront observés hebdomadairement pour pouvoir détecter d’éventuels problèmes. Si un de nos animaux est gravement blessé (bagarre ou autres), et/ou perd 10% de son poids pendant 2 semaines consécutives, cet animal sera mis à mort et répertorié. • Un intervalle d’au moins une semaine sera respecté entre chaque test GTT et ITT et limite ainsi les manipulations des animaux. • Toutes les souris seront manipulées au moins une fois par semaine • Les souris seront identifiées par punch à leur arrivée. Cette identification est définitive et ne peut pas induire d’infection. D’autre part, elle permet une identification rapide des souris lors des tests GTT et ITT et limite ainsi les manipulations des animaux. • Afin de limiter le stress lors des tests GTT et ITT, chaque souris sera identifiée par 0, 1, 2 ou 3 traits au feutre au niveau de la queue pour accélérer leur identification (feutre inodore spécial et non toxique). Le premier test (GTT) sera réalisé lorsque la souris sera âgée de 4 mois, le second test (ITT) sera réalisé une à deux semaines après. Lors des tests de GTT et ITT, la glycémie sera vérifiée toutes les 15 min (1ère heure) toutes les 30 min (2ème heure) pendant une période de 2 heures. Si lors des tests ITT, la glycémie est faible (

Choix des espèces

Notre projet porte sur la transmission paternelle de caractères nouvellement acquis sur un mammifère. Nous avons choisi d’utiliser la souris car la technique de micro-injection d’ARN dans les œufs fécondés est solidement établie dans cette espèce ce qui n’est pas le cas chez le rat seul autre modèle expérimental de mammifère largement utilisé pour étudier l’obésité et le diabète. D’autre part, au cas où nous voudrions poursuivre ce projet en étudiant l’impact de gènes spécifiques dans ce mode d’hérédité, nous pourrions utiliser ou générer des souris génétiquement modifiées invalidées pour le gène d’intérêt. Les pesées seront réalisées une fois par semaine de l’âge de 1 à 5 mois 1/2. Cela nous permettra de suivre le possible développement de l’obésité. Les tests GTT et ITT seront effectués à l'âge de 4 mois et 4mois 1⁄2 respectivement. En effet, nos résultats ainsi que ceux publiés par d'autres groupes montrent que la micro-injection d'ARNs spermatiques dérivant de souris obèses induit le diabète seulement chez les animaux adultes. Les prélèvements de sang terminal et d’organes et tissus (reins, tissus adipeux, coeur, pancreas, prostate, cerveau, foie) seront réalisés à l’âge de 5 mois 1/2. La mise à mort aura lieu 2 semaines après le dernier test pour que les souris récupèrent d’un éventuel stress et que les analyses moléculaires ne soient pas altérées.

Une partie des souris utilisées est irradiée du corps entier pour éliminer ses défenses immunitaires, d'autres sont immunodéficientes de naissance et développeraient des maladies hors d'un hébergement protégé. 2 580 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit des cellules tumorales sous la peau, des injections sous-cutanées, intraveineuses ou dans l'abdomen sous anesthésie, et jusqu'à six séances d'imagerie d'une heure sous anesthésie, certaines étant transportées vers un autre établissement pour l'irradiation. Toutes sont tuées en fin d'étude pour que la radioactivité soit mesurée dans les organes prélevés.

Objectifs

Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. Dans ce contexte, l’objectif de nos recherches est le développement de nouvelles techniques d’imagerie pour évaluer l’état d’avancement de la pathologie et permettre d’adapter les traitements de façon la plus individualisée possible à chaque patient grâce à un examen indolore d’imagerie médicale. Nous travaillons également sur une nouvelle modalité de traitement appelée radiothérapie interne vectorisée (RIV) qui utilise la même chimie que les sondes d’imagerie. Nos développent donc des solutions pour mieux détecter et traiter le cancer en « attachant» une molécule radioactive à une molécule biologique qui joue le rôle de transporteur et va reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales. La différence réside dans le type de radioactivité utilisé : * pour la détection, on utilise de très faibles doses de radioactivité qui traverse le corps et est détectée par des caméras dédiées. * pour le traitement, on utilise de la radioactivité à très faible rayon d’action qui va détruire les cellules à proximité. Pour que le traitement par RIV soit efficace, il faut d’abord s’assurer qu’il se lie bien aux cellules tumorales, c’est pourquoi le développement de ces nouveaux traitements est souvent associé au développement d’un examen diagnostique. Il est également nécessaire de bien valider que le traitement ne va pas endommager les organes sains et qu’il exerce une action antitumorale. Nos objectifs sont donc triples : * Développer des outils diagnostiques qui serviront de socle pour déterminer si un traitement par RIV peut être développé sur une cible donnée (identifiée préalablement in vitro). * Evaluer l’efficacité antitumorale de traitements RIV visant la même cible. * En dernier lieu évaluer précisément les doses de radioactivité reçues à la tumeur mais également aux autres organes pour les extrapoler à l’homme afin de s’assurer que le traitement sera efficace sur la tumeur et sans danger sur les organes sains

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de caractériser précisément à la fois des traceurs diagnostiques d’imagerie nucléaire mais également des composés de thérapie. Il sera à terme ainsi possible de valider en amont du traitement si il se lie bien aux cellules tumorales du patient grâce à une imagerie non invasive afin de lui proposer un traitement parfaitement personnalisé par radiothérapie interne vectorisée, modalité thérapeutique actuellement en plein essor.

Procédures

* Pour certains animaux, une irradiation corps entier dans une autre EU avec transport agréé sans sortie de leur cage – une heure avec le transport. * Une injection sous-cutanée sous anesthésie – environ 5 minutes d’anesthésie et injection sur quelques secondes * Une injection intraveineuse sous anesthésie – environ 5 minutes d’anesthésie et injection sur quelques secondes * Au maximum 6 imageries sous anesthésie : au maximum 1 heure sous anesthésie pour une imagerie limitée à 55 minutes * Une injection intrapéritonéale sous anesthésie– environ 5 minutes

Impact sur les animaux

- L’irradiation corps entier chez certains animaux va éliminer les défenses immunitaires et fragiliser l’animal qui pourrait développer des infections s’il n’était pas maintenu sous des conditions sanitaires strictes. - le transport pour irradiation pourrait provoquer un certain stress. - l’implantation sous cutanée de cellules tumorales va mener à une masse sous cutanée qui pourrait si elle est menée trop loin, gêner l’animal dans ses mouvements et impacter son état général. - La contention des souris pour manipulation lors de la mesure de la taille des tumeurs et de la mise sous anesthésie pourrait provoquer un léger stress. - L’injection intraveineuse pourrait également provoquer un léger inconfort et des lésions locales si elle n’est pas maitrisée. - Les produits administrés pour le diagnostic ne devraient pas impacter l’état de santé des animaux car les doses sont très faibles. Pour la thérapie, les produits peuvent provoquer une perte de poids transitoire. - Certaines souris seront immunodéficientes et pourraient développer des pathologies du fait de leur manque de défenses immunitaires si elles n’étaient pas hébergées dans des conditions sanitaires protégées.

Devenir

Différentes mesures de radioactivité et analyses complémentaires réalisées sur les organes prélevés post-mortem sont nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques de nos études. La totalité des animaux seront donc euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

Pour étudier le devenir d’une molécule dans l’organisme et évaluer l’efficacité d’un traitement anticancéreux, il n’est pas possible de se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes et donc d’études sur animaux. Des études préliminaires réalisées in vitro nous permettrons néanmoins de valider que la molécule étudiée atteint bien sa cible pour les études de biodistribution et que le traitement envisagé est bien efficace sur la lignée étudiée pour les études d’efficacité.

Réduction

Une sélection des composés avec la meilleure activité sera réalisée in vitro en amont de toute utilisation in vivo et permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaire à son strict minimum. L’effectif d’animaux dans les groupes expérimentaux a été adapté pour chaque type d’étude afin de mener à des résultats scientifiquement pertinents tout en réduisant l’effectif à son maximum. Par expérience, les groupes de n=5 souris sont suffisamment robustes pour permettre d’identifier le métabolisme et la pharmacocinétique dans les études de biodistribution. L’imagerie sera répétée et permettra d’éviter d’euthanasier des animaux pour chaque point de temps examiné et ainsi de réduire l’effectif d’autant. Les effectifs devront être étoffés à n=10 pour les études d’efficacité pour prendre en compte les variabilités de réponse au traitement et de pousse tumorale sur le long terme. Enfin, les 1ères données obtenues sur les études dosimétriques permettent d’optimiser les groupes avec n=7 souris pour s’assurer l’obtention de résultats interprétables. Enfin, la bonne connaissance de la pousse tumorale pour chaque modèle, permet d’optimiser le nombre d’animaux pour chaque étude et d’implanter uniquement le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des groupes porteurs de tumeurs de tailles homogènes.

Raffinement

L’imagerie utilisée dans nos études est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures (injection intraveineuse, intratumorale, et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit / plaque chauffant(e) réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître tout signe de souffrance. La SBEA de l’établissement a mis en place une grille détaillée de suivi des animaux et identification des signes de douleur / souffrance permettant d’identifier au plus tôt les signes et de les prendre en charge. Les animaux seront hébergés par groupes de 3 à 10 individus en fonction de la taille des cages et du nombre d’animaux par groupes. L’eau et la nourriture seront données ad libitum. Au minimum une sorte d’enrichissement sera placé dans chaque cage (sizzle-dri ou tubes en polycarbonate).

Choix des espèces

Les souris constituent un modèle de choix en pharmacologie car leurs génomes sont connus et leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). Enfin, elles sont compatibles avec nos systèmes d’imagerie eux-mêmes très proches des appareillages humains, facilitant par là même le transfert à la clinique (recherche translationnelle). Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études d’oncologie. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant une assez bonne reproductibilité. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés chez les patients adultes. Il est donc justifié de travailler sur des animaux adultes possédant des fonctions physiologiques proches de la future cible humaine.

Ouverture de la cavité abdominale, implantation de cellules tumorales dans le pancréas ou le cæcum, ablation de la rate pour le modèle de métastases hépatiques, fermeture : trente minutes par souris. 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont ensuite transférées dans un second établissement, reçoivent une injection tous les sept jours sous anesthésie, passent une imagerie hebdomadaire, puis subissent une seconde ouverture de l'abdomen pour l'exérèse de la tumeur guidée par fluorescence, soit deux laparotomies par animal. Toutes sont tuées et autopsiées pour vérifier l'absence de reprise tumorale, au terme d'une démonstration que le porteur juge impossible autrement que sur des animaux porteurs de ces tumeurs.

Objectifs

Malgré l'émergence des thérapies personnalisées, la chirurgie joue toujours un rôle essentiel dans le traitement de nombreux cancers comme les cancers colorectaux et pancréatiques. Un problème majeur réside dans la difficulté de détecter les tumeurs et de visualiser les marges tumorales. La chirurgie guidée par fluorescence (FGS) permet aux chirurgiens une meilleure visualisation de la tumeur en temps réel. De plus, la FGS peut être améliorée en associant de l’imagerie nucléaire (SPECT) avant l’opération pour localiser avec précision les tumeurs. Dans le projet, nous proposons de faire la preuve de concept de l’intérêt d’utiliser des anticorps ciblant les tumeurs, conjugués à une sonde (Ac bimodaux) permettant de réaliser de l'imagerie bimodale (SPECT/fluorescence) afin d'améliorer l’analysé pré-opératoire de la tumeur (SPECT), la détection pendant l’opération des tumeurs et leur élimination (FGS) mais aussi d'améliorer le suivi post-opératoire (SPECT). L’utilisation de ces Ac bimodaux dans des modèles de tumeurs sous-cutanées a déjà été démontré, ils permettent la visualisation et l’élimination de cette tumeur facile d’accès. Pour prouver le potentiel thérapeutique de l’utilisation de ces Ac bimodaux en chirurgie par fluorescence, il nous faut maintenant démontrer l’intérêt de cette technologie dans des modèles précliniques mimant la pathologie humaine, tels que des modèles de cancer du côlon et du pancréas se développant sur ces organes, mais aussi des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales. Ces travaux sont en cours de réalisation dans des souris qui sont déficientes en système immunitaire et permettent de greffer des cellules cancéreuses d’origine humaine. Pour mimer encore plus ce que nous pouvons retrouver chez l’homme, nous utiliserons dans ce projet des souris présentant un système immunitaire pour vérifier que les résultats retrouvés seront similaires à ceux obtenus dans les souris immunodéficientes. Ce projet se déroule sur 2 établissements utilisateurs, le premier dans lequel sera développé les modèles tumoraux, le second dans lequel l’imagerie et la chirurgie assistée par fluorescence seront réalisées.

Bénéfices attendus

Le but de ce travail est de pouvoir mettre au point des modèles précliniques, chez la souris immunocompétentes, mimant la pathologie humaine des cancers coliques et pancréatiques avec des tumeurs se développant sur les organes et mimant ainsi des tumeurs primaires et des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales d’origine colique. Les bénéfices attendus par ce projet sont de pouvoir développer des modèles précliniques de modèles de cancers afin de pouvoir démontrer l’intérêt de l’utilisation de la chirurgie assistée par fluorescence après administration d’Ac bimodaux. Ce projet devrait permettre une meilleure prise en charge chirurgicale des patients atteints de cancers primaires ou métastatiques en permettant une meilleure détection des tumeurs, facilitant leur élimination en épargnant le tissu sain et évitant ainsi une récidive tumorale.

Procédures

Trois des modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (30 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules) la fermeture de la cavité abdominale. Dans le cas du modèle de métastases hépatiques, la rate de ces souris sera enlevée suite à l’injection des cellules tumorales. Pour le modèle de carcinomatose péritonéale, les cellules tumorales seront injectées en intrapéritonéale après anesthésie gazeuse des souris (1-2 min/souris). Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2. Les souris recevront 1 injection intrapéritonéale (1-2 min/souris) tous les 7 jours (sous anesthésie gazeuse) du composé permettant l’imagerie des tumeurs. Ces souris seront ensuite anesthésiées pour être imagées. Tous les animaux porteurs de tumeurs (orthotopiques ou métastases) subiront une chirurgie d’exérèse assistée par fluorescence après injection des Ac bimodaux (30 min/souris).

Impact sur les animaux

- L’acte chirurgical nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris, d’injecter des cellules tumorales dans le pancréas ou le caecum, ou d’enlever la rate. Ces interventions chirurgicales pourraient entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. - Le développement de grosses tumeurs mais également de métastases pourrait avoir des effets indésirables, la taille de ces tumeurs sera estimée 1 fois par semaine par imagerie. - L’acte chirurgical d’exérèse nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris. Ces interventions chirurgicales pourraient également entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de pouvoir vérifier par autopsie l’absence de reprise tumorale.

Remplacement

La preuve de concept de l’utilisation de ces Acs bimodaux pour de la chirurgie assistée par fluorescence nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’Homme et donc d’avoir les tumeurs primaires sur les organes d’origine et les métastases se disséminant chez des animaux pourvus d’un système immunitaire fonctionnel. Le but est de montrer que les tumeurs sont plus facilement détectables, qu’elles peuvent être éliminées plus finement et ainsi permettre une meilleure récupération post-chirurgie et enfin qu’il y a moins de récidive. Cette preuve de concept ne peut donc être faite que sur des animaux présentant ce type de tumeurs et sur lesquels sera fait la FGS. Tous les tests in vitro préalables ont déjà été faits, tout comme la preuve de concept sur des modèles plus artificiels d’animaux porteurs de tumeurs sous-cutanée, mais également dans des modèles de souris dépourvues de système immunitaire (en cours).

Réduction

Pour chaque Ac bimodal à tester (5), deux groupes de 5 souris (contrôle vs Ac bimodal) seront constitués afin de générer des groupes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer l’efficacité de la chirurgie tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. La visualisation de la récidive par imagerie SPECT après injection du même Ac bimodal permet de réduire le nombre d’animaux qui sont leur propre contrôle. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées (formation de niveau concepteur de projet avec soit une formation chirurgie du petit animal soit être chirurgien) afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les prises tumorales peuvent être différentes d’une chirurgie à l’autre, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes.

Raffinement

Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Les interventions chirurgicales seront précédées d’une antibiothérapie préventive. Tout au long de l’opération, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tous le long de l’expérimentation du soin pré au post-opératoire. Des antalgiques sous forme injectable et sous forme de gel seront utilisés lors de la chirurgie puis sous forme injectable les jours suivant l’opération. A la suite de l’opération, chaque animal sera examiné et pesé. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. De plus, de la nourriture gélifiée sera mise dans la cage. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Les injections intrapéritonéales seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour tester facilement les nouveaux outils permettant de faire de la chirurgie assistée par fluorescence. Nous utiliserons des souris immunocompétentes, nous permettant d’implanter des cellules tumorales murines. Ces souris sont largement utilisées pour l’implantation de cellules cancéreuses murines en sous-cutanée mais également dans les organes d’origine. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).

246 souris reçoivent une injection de cellules tumorales de mélanome puis un gavage quotidien pendant quinze à vingt semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur tumeur est mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine, et une partie d'entre elles reçoit en plus une injection tous les deux à quatre jours. Le porteur indique que le gavage quotidien peut irriter le larynx et gêner la déglutition, et que la tumeur peut finir par empêcher l'animal de se déplacer, de s'alimenter et de s'hydrater. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, au terme d'une étude qui vise à confirmer chez la souris un résultat déjà obtenu en culture cellulaire.

Objectifs

Les mélanomes avec mutations activatrices d’un gène particulier peuvent être traités par des thérapies ciblées entrainant une rémission rapide chez 65-70% des patients. Cependant, la majorité des cas développent des résistances au traitement, parfois au bout d’un an seulement. Certaines cellules de la tumeur,, appelées « cellules persistantes », auraient un rôle essentiel dans le développement de ces résistances. Les « cellules persistantes » sont en effet capables de survivre aux thérapies ciblées en engageant des changements qui leur permettent de s'adapter au traitement. Or, ces cellules constituent un réel problème clinique car elles peuvent évoluer en cellules qui résistent de façon permanente à la thérapie. Cette évolution vers des cellules résistantes implique l'introduction d'erreurs dans l'ADN, appelées mutations, qui leur permettent de proliférer et de survivre malgré le traitement. Une étude a mis en évidence que, pour survivre à la thérapie ciblée, les cellules persistantes de mélanome modifient le processus qui permet aux cellules de fabriquer des protéines à partir d'une copie de l'ADN, appelée ARN messager. En effet, lors de thérapie ciblée, il y a une augmentation de la production de certaines protéines, dont l’une d’elles peut potentiellement favoriser l’introduction des erreurs dans la séquence de l'ADN. Afin d'offrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour surmonter cette résistance chez les patients atteints de mélanome, ce projet a pour objectif de démontrer que l'inhibition de la production de cette protéine peut supprimer, ou au moins retarder, la résistance aux thérapies ciblées.

Bénéfices attendus

Environ 50 % des mélanomes présentent une mutation activatrice d’un oncogène (gène dont l’expression favorise la survenue de cancers) particulier. L'inhibition, par thérapie ciblée, de la protéine issue de cet oncogène, permet d'obtenir des réponses thérapeutiques efficaces. Cependant, ces réponses sont souvent limitées dans le temps et la moitié des patients rechutent après 12 à 15 mois. La compréhension des mécanismes à la base de cette résistance est nécessaire, et l'identification du déterminant moléculaire de cette résistance peut offrir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer le pronostic des patients. Les expériences in vitro dans les cellules de mélanome traitées par thérapie ciblée montrent un rôle de notre protéine clé dans l'augmentation de l'instabilité génétique, qui est la cause principale de la résistance aux thérapies. Ce projet a donc pour objectif de confirmer l’implication de notre protéine clé dans cette résistance dans un contexte in vivo. De plus, nos expériences in vitro ont permis d’identifier une molécule_actuellement utilisée dans des essais cliniques pour le traitement d'autres types de cancer_ qui peut empêcher les mutations lors de la réparation des dommages à l’ADN et donc limiter la résistance thérapeutique aux thérapies ciblées. Nous devons confirmer ces résultats dans un contexte in vivo. L'objectif à long terme est d'apporter des bénéfices aux patients atteints de mélanome en améliorant le taux de survie des patients .

Procédures

Dans une première procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience- durée du geste inf à 10 sec). Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois par jour pendant toute la durée de l'expérience (administration des traitements par gavage sur animaux vigiles pendant environ 15-20 semaines-durée du geste inf à 10sec)). Dans une seconde procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience durée du geste inf à 10sec). Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois par jour par gavage. Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois tous les 2 jours pendant 22 jours avec un second traitement (administration des traitements par injection aux animaux vigiles durée du geste inf à 10sec). Enfin, dans une troisième procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience durée du geste inf à 10sec). Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois par jour pendant toute la durée de l'expérience (administration des traitements par gavage sur animaux vigiles pendant environ 15-20 semaines durée du geste inf à 10sec). Les animaux seront aussi traités à raison d’une fois tous les quatre jours pendant 3 semaines (administration des traitements par injection i sur animaux vigiles durée du geste inf à 10sec). Pour tous ces animaux, la croissance tumorale sera mesurée trois fois par semaine sur animal vigile à l’aide d’un pied à coulisse (durée du geste inf à 15 sec).

Impact sur les animaux

La greffe sous-cutanée de cellules tumorales peut amener une gêne qui peut s’amplifier avec le développement de la tumeur, pouvant aller jusqu’à une modification de l’état physiologique de l’animal (manque de toilettage, prostration, difficulté à se déplacer, s’alimenter et à s’hydrater). Ces effets ne sont attendus qu’en fin d’expérience. Le gavage quotidien peut amener une irritation du larynx pouvant amener des difficultés à s’alimenter, à déglutir. L’injection des médicaments peut entrainer une gêne liée à la piqûre elle-même juste après l’injection.

Devenir

Mise à mort pour prélèvements post-mortem d'organes et de tissus aux fins d'analyses.

Remplacement

Notre étude in vitro utilisant différentes lignées cellulaires de mélanome a permis de déterminer l'implication du processus de production de notre protéine d’intérêt dans la résistance acquise du mélanome à la thérapie ciblée. De plus, nos résultats obtenus in vitro ont montré que l'inhibition de ce processus peut limiter la résistance acquise. La variété et la complexité des cancers, ainsi que leur incidence élevée, rendent l’utilisation de modèles animaux cruciale pour comprendre comment le cancer se développe et pour améliorer les stratégies préventives, de diagnostiques et thérapeutiques. De plus, Il n'existe, à ce jour, pas de modèle in vitro suffisamment robuste pour tester des synergies thérapeutiques. L'utilisation de modèles animaux comparables par de nombreux aspects au corps humain est donc indispensable pour l'évaluation des nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de résultats fiables et statistiquement significatifs, nous avons déterminé le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental à l’aide d'outils statistiques.

Raffinement

Pour limiter le stress des animaux, l’attention est portée sur leurs conditions d’hébergement. De plus, un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place de la procédure expérimentale pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Les animaux seront surveillés tous les jours lors de la procédure , qui est raffinée par l’établissement de points limites précoces, entrainant et la mise en place de soins (supplément alimentaire, administration de solutés) voire la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. La présence de souffrance sera recherchée en utilisant les critères habituels (état général, sous-alimentation, état du pelage, prostration). Les souris seront également surveillées quotidiennement afin de déceler le plus précocement possible l’apparition de points limites. Trois fois par semaine, les animaux seront pesés et les tumeurs mesurées.

Choix des espèces

Le génome de la souris a été séquencé et de nombreux outils ont été développés pour étudier ce modèle. La souris est le modèle de choix pour les études de cancérologie : les souches sont parfaitement définies et la production de souris immunodéficientes nous permet de travailler sur des modèles cellulaires d’origine humaine. De plus, on observe une croissance tumorale rapide chez ce modèle. La souris est donc le modèle de choix pour l'étude des cancers. Le projet nécessite des souris adultes (5-8 semaines) sans plus de contraintes sur l’âge. Ceci se justifie par l’âge de la population humaine touchée par le mélanome et ciblée par les éventuels traitements.

Une nécrose humide, creuse ou douloureuse à la palpation sur la tumeur d'une souris déclenche sa mise à mort, comme une tumeur qui atteint la taille limite. 2 112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous anesthésie une injection de cellules tumorales, puis jusqu'à trois semaines d'injections combinant chimiothérapie, immunothérapie et molécules ciblant les récepteurs TLR, avec un épisode fébrile possible. Le porteur cherche à retirer la chimiothérapie de ces combinaisons et écrit que l'avantage pour le bien-être des patients "serait alors énorme", à un stade où les résultats restent à établir chez la souris.

Objectifs

L’objectif de ce projet consiste à démontrer l’intérêt d’utiliser des agents qui ciblent des récepteurs de l’immunité (TLR) afin d’induire l’infiltration de cellules immunitaires dans les tumeurs, et ainsi favoriser les réponses aux thérapies anti-cancéreuses. Il est déjà connu que les agents ciblant les TLRs peuvent induire le recrutement de cellules immunitaires dans les tumeurs et ainsi favoriser une réponse immunitaire anti-tumorale. Certains agents ciblant ces TLR sont actuellement utilisés en clinique dans le traitement des cancers. Ces agents sont utilisés individuellement et associés à d’autres thérapies conventionnelles comme les chimiothérapies (drogues anti-cancéreuses) ou les immunothérapies (agents stimulant la réponse immunitaire). Dans ce projet, nous nous proposons d’utiliser ces agents ciblant les TLRs en association et de tester leur capacité à augmenter l’efficacité anti-tumorale des immunothérapies sans l’ajout de chimiothérapies qui sont connues pour induire des effets secondaires.

Bénéfices attendus

Grâce à cette étude nous pensons pouvoir proposer de nouvelles combinaisons thérapeutiques pour les patients atteints de cancer. L’association des agents ciblant les TLRs devrait permettre le recrutement d’un fort infiltrat immunitaire qui après stimulation pourra éliminer efficacement les tumeurs. L’étude de la composition de l’infiltrat immunitaire permettra une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeux dans l’élimination des tumeurs, ce qui est cruciale pour le développement et l’optimisation des thérapies anti-cancéreuses chez les patients. De plus, nous nous attendons à ce que l’association des deux ligands de TLR avec l’immunothérapie induise une efficacité anti-tumorale bien supérieure à celle pouvant être obtenue avec l’association des chimiothérapies à l’immunothérapie. L’avantage en terme de bien être des patients serait alors énorme.

Procédures

Les souris recevront une injection de cellules tumorales sous anesthésie générale. Les traitements reçus par les souris seront : - injection (30 secondes) de chimiothérapies au maximum 1 fois par semaine pendant 3 semaines. - injection (30 secondes) d’immunothérapies au maximum 2 fois par semaine pendant 3 semaines. - injection (30 secondes à 1 minute) de molécules ciblant les TLRs, 2 fois par semaine à raison de 5 injections maximum

Impact sur les animaux

- Les souris seront anesthésiées à l’isoflurane lors de l’injection des cellules tumorales en sous-cutanée - La contention des souris lors de la mesure de la taille des tumeurs et des traitements pourrait provoquer un léger stress. - Le développement de la tumeur peut générer une gêne au mouvement et donc impacter son état général. - Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. - Les injections intra-péritonéales et intraveineuses répétées pourraient provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les chimiothérapies et immunothérapies administrées sont largement utilisées en préclinique à ces doses et fréquences, et ne devraient pas beaucoup impacter l’état de santé des animaux, au maximum elles peuvent provoquer une perte de poids transitoire. - Les agents ciblant les TLRs sont également utilisés à des doses déjà bien établies dans les modèles murins. L’injection des agents ciblant les TLRs membranaires pourrait induire un léger épisode fébrile.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences et leur tumeur sera prélevée.

Remplacement

Une grande partie de nos démonstrations a été réalisée in vitro mais la capacité de nos associations d’agents ciblant les TLRs à pouvoir induire le recrutement des cellules immunitaires dans la tumeur et ainsi à promouvoir l’efficacité anti-tumorale des thérapies conventionnelles ne peut être démontrée que dans un organisme vivant entier.

Réduction

Les prises tumorales et la réponse aux traitements peuvent varier d’un individu à l’autre, les croissances tumorales seront réalisées sur des groupes de 8 souris. Nous répèterons l’expérience 1 fois de manière indépendante afin d’avoir suffisamment de puissance pour des analyses statistiques, comme nous avons déjà pu le déterminer dans des expériences antérieures. Pour l’analyse de l’infiltrat immunitaire intra-tumoral, les groupes seront alors réduits à 5 souris par groupe, l’expérience sera renouvelée 1 fois afin d’atteindre une puissance satisfaisante pour l’analyse statistique. L’analyse de l’infiltrat immunitaire sera réalisée sur 8 groupes uniquement, ceux associés aux immunothérapies ne seront pas ajoutés, leurs rôles étant déjà connus. La mise en évidence de l’importance du système immunitaire dans l’efficacité des associations thérapeutiques ne sera étudié que dans les 3 modèles où nous aurons déterminé les meilleures efficacités thérapeutiques et avec les 6 groupes les plus représentatifs.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. L’hébergement se fera en groupe pour éviter le stress. Du matériel d’enrichissement permettant la construction de nids sera fourni et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Pour tous les animaux, une semaine d’acclimatation sera respectée avant le début de l’expérimentation. Ces animaux seront habitués aux gestes techniques (contention, injections…) avant toute expérimentation. Les injections se feront au même moment de la journée, pour perturber au minimum le cycle des souris, l’injection des cellules tumorales se faisant sous anesthésie générale. Les souris immunodéficientes seront hébergées sous couvercle filtrant pour éviter les risques d’infection. Les animaux seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude, la fréquence de surveillance étant augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux tels qu’une perte de poids, des modifications du comportement, l’apparition de nécroses sur les tumeurs ou d’une période de fébrilité. En cas de changement de comportement ou d’apparence physique, une nourriture gélifiée pourra être rajoutées dans la cage et les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas d’apparition de nécrose non sèche, ou lorsque les nécroses sont sèches mais douloureuses à la palpation ou creuses, les souris seront euthanasiées. Si les nécroses sont sèches, non douloureuses et sans déformation ni signe d’inflammation, les souris seront surveillées quotidiennement et pourront être prise en charge avec l’utilisation d’un produit cicatrisant. En cas d’épisode fébrile de plus 24h post-injection du composé ciblant les récepteurs, les souris recevront 1 injection d’un analgésique toutes les 12h jusqu’à disparition des symptômes (le maximum retrouvé étant de 48h dans de très rares cas). Lorsque la tumeur atteint une taille limite, en cas de perte de poids ou d’autres signes mettant en évidence une souffrance, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles de choix utilisés pour une analyse de l’efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. De plus, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Dans un premier temps, nous utiliserons des souris immunocompétentes permettant l’implantation de cellules cancéreuses murines syngéniques. Afin de déterminer l’implication du système immunitaire dans l’effet anti-tumoral de nos combinaisons thérapeutiques, nous utiliserons alors des souris immunodéficientes. Les animaux devront avoir au moins 8 semaines pour que leur système immunitaire soit mature.

Sous anesthésie, des souris sont brûlées ou privées d'un fragment de peau pour créer une plaie, puis anesthésiées à nouveau tous les trois jours et demi pour recevoir crème ou pansement, mesurer la plaie et en prélever l'exsudat, avec trois prises de sang en deux semaines. 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, exposées selon le porteur à la douleur de l'inflammation, et possiblement à la déshydratation, à l'anémie et aux hématomes. Il parle de "génération des plaies" et d'"application de plaies", la brûlure n'apparaissant qu'une fois, entre parenthèses. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leurs organes, dans l'espoir de montrer que les actifs de l'équipe cicatrisent mieux que le Bepanthen.

Objectifs

Le but de la cicatrisation des plaies à la suite d’une blessure est de former un tissu régénéré dont la fonctionnalité et l’aspect visuel sont aussi proches que possible de la peau d’origine. La cicatrisation des plaies, en tant que processus biologique normal dans le corps humain, est obtenue par le biais de quatre phases précisément et hautement programmées. Pour qu’une plaie guérisse avec succès, les quatre phases doivent se dérouler dans le bon ordre et dans le bon délai. De nombreux facteurs peuvent interférer avec une ou plusieurs phases de ce processus, provoquant ainsi une altération de la cicatrisation des plaies. Pour remédier à l’altération du processus de cicatrisation, des dispositifs médicaux tels que l’application de crèmes cicatrisantes ou de pansements ont été développés. Ces dispositifs accélèrent la cicatrisation, soulagent la douleur induite par l’inflammation, aident à prévenir les infections et améliorent la régénération tissulaire. L’objectif de notre projet est de montrer l’efficacité accrue de nouveau composés, utilisable sous forme de crème ou en association avec un pansement, sur la cicatrisation cutanée suite à des blessures.

Bénéfices attendus

Au terme de cette étude nous espérons apporter la preuve d’une meilleure efficacité de nos actifs cicatrisants par rapport au contrôle positif (Bepanthen) largement utilisé pour améliorer la cicatrisation.

Procédures

Interventions sur animaux : 1) Génération des plaies : Chirurgie réalisée sous anesthésie générale et locale avec utilisation d’analgésiques. Une chirurgie de 10 minutes pour chaque souris. 2) Administration des dispositifs médicaux : Sous anesthésie générale et locale avec utilisation d’analgésiques. 4 fois car l’expérimentation dure 14 jours (Tous les 3,5 jours). Durée de l’administration des dispositifs médicaux, 10 minutes pour chaque souris. 3) Mesures des dimensions et de la température des plaies (Tous les 3,5 jours, soit 4 fois) : Sous anesthésie et analgésie, en même temps que l’application des dispositifs médicaux. Durée 2 minutes pour chaque souris. 4) Prélèvements des exsudats de plaies (Tous les 3,5 jours, soit 4 fois) : Sous anesthésie et analgésie. Durée 3 minutes pour chaque souris. 5) Prélèvements sanguins (Tous les 7 jours) : 3 fois, durée 2 min, pour chaque souris sous anesthésie générale. Toutes les souris (120) du projet sont concernés par cette procédure.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables de l’application de plaies est la douleur induite par l’inflammation. Ces plaies pourraient aussi induire une déshydratation des animaux. Enfin, les prélèvements sanguins répétés sur les souris (1 fois par semaine) lors de nos expérimentations pourraient engendrer des nuisances telles que l'anémie, l’apparition d’hématomes et une déshydratation des souris.

Devenir

À la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever leurs organes à des fins d'analyses d'immunohistochimie, de biochimie et de biologie moléculaire. Ces analyses approfondies sont essentielles pour élucider les mécanismes thérapeutiques de nos agents cicatrisants.

Remplacement

L’utilisation de l’animal est inévitable pour notre projet car nous cherchons à caractériser l’effet bénéfique d’actifs cicatrisants au niveau systémique. Actuellement, aucun modèle in vitro ne permet de mimer le phénomène étudié dans son ensemble et dans sa complexité.

Réduction

L’utilisation de l’animal est réduite au maximum. Dans cette optique, nous utiliserons des groupes de 10 souris par groupe expérimental afin de rendre nos résultats exploitables. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons autorisés réglementairement seront prélevés sur l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de tissus. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres cellulaires et moléculaires sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences in vivo.

Raffinement

Les souris seront logées en groupes de quatre dans des cages respectant les normes réglementaires, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Après l’intervention chirurgicale, des mesures seront prises pour éviter un isolement complet, telles que l'utilisation d'adhésifs pour protéger les plaies et maintenir les animaux en groupe. L'anesthésie et l'analgésie seront systématiquement administrées lors de la génération des plaies et tout au long de l'expérimentation. Nous accordons une attention particulière à la gestion de l'inflammation induite par les plaies. En cas de dépassement des critères définis, comme par exemple une perte de poids dépassant 10-15% de leur poids initial, des mesures seront prises pour restaurer leur santé et pour éviter toute souffrance inutile. Pour atténuer l'angoisse des animaux qui seraient isolés en post-opératoire, nous enrichirons leur environnement en leur fournissant davantage de coton, d'igloos et de roues d'exercice, et nous les nourrirons avec une gelée alimentaire enrichie en nutriments. Cette alimentation spécifique sera également distribuée après chaque prise de sang. Un suivi attentif des animaux sera effectué en conformité avec les recommandations du comité de suivi du bien-être animal de notre établissement.

Choix des espèces

L’utilisation d’animaux vivants est un jalon nécessaire dans la conception de nouveaux médicaments, en particulier pour obtenir la preuve de l’efficacité thérapeutique des produits que nous avons développés. Ce projet a pour but de démontrer que des actifs cicatrisants sont efficaces dans deux modèles de cicatrisation (Excision/Brûlure). Les rongeurs, et en particulier les souris, sont fréquemment utilisés pour modéliser les maladies humaines, ainsi des modèles de cicatrisation utilisant des souris ont été développés. Ces modèles induisent une plaie sur la peau de l’animal. Les souris présentent, dans ce cas, bon nombre des signes physiopathologiques caractéristiques des processus de cicatrisation observable chez l’humain (Inflammation, synthèse d’exsudats, ré-épithélialisation des lésions cutanées, etc…). Les animaux seront utilisés à l'âge adulte car nos actifs cicatrisants seront prescrits chez l'adulte et que ce stade de développement est plus stable d'un point de vue physiologique.