Souris
Evaluation thérapeutique d’un peptide médicament dans la lutte contre l’obésité chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Vingt injections et vingt prélèvements de sang à la queue en dix semaines : 75 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus et organes. Le peptide évalué contre l'obésité est déjà testé en phase III chez des patients pour une autre maladie inflammatoire, ce que le porteur retient comme gage de sécurité. Les souris appartiennent à une souche obèse que le porteur qualifie de "drastique sur le plan métabolique", et il écrit que la perte de poids ne pourra pas servir de point limite. Il fixe le "phénotype dommageable" à 40 grammes et prévoit d'interrompre le protocole pour toutes les souris si trois animaux par groupe dépassent les points limites.
Objectifs
Le surpoids et l’obésité se définissent comme une accumulation anormale ou excessive de graisses qui nuit à la santé de l'individu (définition de l'organisation mondiale de la santé). Une récente étude de 2023 montre qu'en 2022, 1 personne sur 8 dans le monde était obèse. L'obésité chez les adultes a plus que doublé à l'échelle mondiale depuis 1990 et l'obésité chez les adolescents a quadruplé. En 2022, 2,5 milliards d'adultes taient en surpoids. En France et plus particulierement en région Grand Est, pres d'une personne sur deux est obèse ou en surpoids. Cela représente près de 8,5 millions de français en situation d’obésité, soit une hausse de la prévalence de cette maladie chronique de 13 % depuis 2012, et même de 66 % pour les formes les plus sévères. La haute autorité de santé, dans son dernier communiqué recommande donc une amélioration de la prise en charge des patients. Ainsi la pierre angulaire de l’approche thérapeutique implique un changement profond du mode de vie et de l’alimentation, avec une réduction de poids obtenue grâce à la réduction des calories, à l’exercice et à une alimentation plus saine. Cependant, la mise en œuvre de ces changements dans la pratique quotidienne s’avère difficile et si elle n'est pas accompagnée, est vouée à l'échec. Quant aux traitements thérapeutiques, leur efficacité reste extrêmement limitée. Il n'existe aucun médicament capable de corriger l'obésité, seule la lourde chirurgie semble efficace. L'objectif est d'évaluer l'efficacité d'un peptide médicament innovant sur la réduction de l'obésité dans une étude préclinique incluant des souris obéses. Ce modèle, bien que drastique sur le plan métabolique se rapproche de la pathologie humaine. Enfin le peptide médicament que nous souhaitons évaluer, est aujourd'hui testé chez le patient (phase III) pour une autre pathologie inflammatoire. L'absence d'effets secondaires, observée dans ce dernier cadre tant chez l'homme que chez la souris, en fait une molécule sure pour notre étude sur l'obésité. Notre peptide devrait restaurer les fonctions perturbées du tissu adipeux chez les souris obèses et permettre aux individus de réduire leur poids. La perte de poids ne pourra donc pas etre considérée comme un point limite dans notre projet.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont importants. D’un point de vue scientifique, les données obtenues permettront de contribuer aux connaissances générales sur les mécanismes pathologiques et notamment inflammatoires dans l'obésité et leur potentiel résolution. D’un point de vu clinique, cette étude permettrait d’apporter des données majeurs et solides pour l’utilisation de cette thérapie chez les patients atteints d'obésité et pourrait s’avérer être une alternative efficace aux futurs traitements en cours de développement.
Procédures
Les 75 animaux impliqués dans le projet, seront soumis au traitement anti-obésité avec le peptide médicament ou avec du liquide physiologique sur une durée de 10 semaines à raison de 2 injections hebdomadaires. Avant chaque injection, un prélevement sanguin d'environ 10µl au niveau de la queue sera réalisé pour controler le niveau de sucre dans le sang.
Impact sur les animaux
Inconfort de la locomotion expliquée à la prise régulière de poids de la souris - Douleur légère de courte durée de la piqure d'une aiguille.
Devenir
A la fin de l'unique procédure les animaux seront anesthésiés avant d'être euthanasiés afin de prélever leurs tissus et organes à des fins d'histologie ou d'autres analyses moléculaires.
Remplacement
Préalablement aux futurs tests in vivo, nous avons réalisé des approches in vitro incluant la lignée cellulaire adipocytaire cultivées en milieu favorisant l'obésité qui ont mis en évidence un effet protecteur du peptide sur l'homéostasie adipocytaire, nous rendant confiant sur l'efficacité du peptide dans un modèle murin d'obèsité. L'utilisation de modèles murins est indispensable en raison de la complexité de cette maladie qui implique le système immunitaire et plusieurs organes comme la rate, le tissu adipeux, le tissu vasculaire... Ainsi les modèles in vitro ne sont pas adaptées en une telle étude intégrative. En effet, notre stratégie thérapeutique repose sur la modulation 1- du système immunitaire (i.e rate) pour atténuer la progression de l'obésité, 2- d’une réduction de l’accumulation de graisses dans le tissu adipeux, ce qui rend indispensable l'étude de ces interactions complexes. Les modèles murins permettent de reproduire de manière fidèle les conditions in vivo, offrant ainsi une compréhension plus complète de la maladie et de l'effet de la modulation immunitaire sur son évolution ce qui rend difficile de simplifier l'étude en utilisant des systèmes in vitro ou ex vivo, comme les modèles 3D par exemple. Les modèles murins permettent de prendre en compte cette complexité et d'analyser comment différents organes et tissus interagissent pour déterminer et faire progresser la maladie. Il n'existe actuellement aucune alternative non animale satisfaisante pour répondre à nos questions. Ainsi, les modèles murins restent la meilleure option pour générer des données pertinentes qui pourraient ultérieurement avoir un impact translationnel chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux dans le projet est estimé en considérant la nécessité de réduire l’utilisation d’animaux à un nombre minimum mais suffisant pour obtenir des résultats biologiquement, statistiquement valides et significatifs pour les objectifs de cette étude. La taille de chaque groupe d’animaux est de n = 15 souris. Elle a été calculée, en tenant en compte du risque de décès prématurés et en utilisant un logiciel statistique adapté. Une logique d’arrêt de la procédure est mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux pour chaque groupe des points limites, la procédure sera interrompue pour la totalité des animaux. Pour que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique, un nombre minimum d’animaux sera utilisé. L'expérimentation sera réalisée en 3 fois afin que scientifiquement nous ayons 3 expériences indépendantes (soit 5 animaux/groupe/ période expérimentale). Cette façon de procéder nous permettra de travailler avec des petits effectifs faisant 1- qu'en cas des points limites atteints, d'arreter la procedure, de la revoir (i.e. temps d'injection, quantité injectée du peptide, age des souris...) après discussion avec le comité d'éthique... voire de stopper définitivement la procedure; 2- qu'en cas d'obtention de résultats statistiquement significatifs apres le 1er et/ou le 2e essais, les essais suivants (2 et 3, respectivement) pourront alors ne pas avoir lieu. Les variables quantitatives seront analysées par des tests statistiques. Dans le but de renforcer les données statistiques, l’étude sera randomisée (tirage au sort de l’ordre groupes pour les injections et clause d’ignorance) et contrôlée. Enfin toujours dans le but de réduire le nombre d'animaux, les tissus issus de nos différents groupes seront prélevés pour être utilisés dans d'autres projets en cours ou futurs.
Raffinement
La litière sera changée deux fois par semaine, voire trois fois en cas de production d'urine excessive des souris obèses (valable surtout en fin de procédure pour les souris obèses non traitées). Au cours des phases de stabulation, plusieurs animaux du même sexe seront hébergés dans la même cage. En revanche, lors des phases d’expérimentation, les animaux seront isolés (une souris / boîte, 30 minutes maximum) afin de limiter la transmission du stress inter-individu. La manipulation se fera en dehors du champ de vision des animaux en attente d’expérimentation. Pour le bien-être de l’animal, les souris seront anesthésiées lors de certaines méthodologies (injections) ou habituées au moins une semaine à l’avance à la contention (prise de sang). Cela devrait réduire le stress au minimum. Toute modification du comportement de l’animal (prostration, anxiété, isolement, troubles de l’équilibre), d’une variation significative du poids (environ 20% de gain de la masse corporelle) ou d'un taux élevé de sucres dans le sang (> 6g/l ) seront des points limites clés afin de juger de la nécessité ou non de l'euthanasie de l’animal. Au cours de l’expérimentation et notamment juste avant les phases des injections, des anesthésiques généraux seront administrés. Une grille de score définie nous permettra d'évaluer l’état dans lequel se trouvent les individus. Afin de limiter les perturbations locomotrices, l'age de 2 mois post-natals des souris pour le début du traitement et la durée de 10 semaines (pour le traitement) ont été choisis afin que le phénotype dommageable ne soit pas atteint. Ainsi cette nuisance devrait être limitée dans la durée de la procédure (10 semaines). Au moment de l'euthanasie, de part l'expérience que nous avons de ce modèle nous estimons que les souris non traitées ne devraient pas atteindre le phénotype dommageable (e.i poids >40 g). Si c'est le cas avant la date d'euthanasie, initialement déterminée, alors nous interromprons l'ensemble du protocole pour la totalité des souris. Ces dernières seront alors euthanasiées pour l'analyse tissulaire.
Choix des espèces
Les souris ont un génome très proche de celui de l’Homme, et leur système physiologique récapitule assez bien les observations faites chez l’Homme. Aujourd’hui, la souris représente le meilleur modèle pour tester l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques et le meilleur compromis entre les besoins expérimentaux et le respect du critère de choix de l’espèce. Deux souches seront nécessaire à l'étude, les souris obèses qui subiront les traitements et des souris controles non diabétiques, non obéses, non traitées qui représenteront le témoin négatif et la référence de poids normal. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 2 mois à l’initiation de la procédure. Elles seront agées de 4.5 mois à la fin de la procédure, c'est à dire avant l'apparition du phénotype dommageable.
Développement de modèle murin de souffrance hépatocytaire et implication de FAT10/UBD
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
5 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 2 448 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, chacune pouvant subir plusieurs prélèvements de sang par incision de la queue espacés de quinze jours, puis un prélèvement rétro-orbitaire terminal. Un agent chimique administré de façon chronique installe une fibrose puis une cirrhose du foie, avant qu'une infection ne fasse basculer les animaux du stade compensé au stade décompensé, que le porteur décrit comme irréversible. Les régimes obésogènes utilisés peuvent faire apparaître des nodules du foie évoluant vers un carcinome, et il reconnaît que cela peut causer des douleurs, tout en écrivant que l'injection chronique de l'agent fibrosant, elle, n'en provoque pas. Les souris sont retirées du protocole et tuées lorsqu'elles perdent 15 % de leur poids ou présentent prostration, poil hirsute, vocalisation ou morsures.
Objectifs
Les maladies chroniques du foie comprennent un large spectre de maladies pour lesquelles il n’existe pas de thérapies pharmacologiques à l’heure actuelle. Ces maladies chroniques se caractérisent le plus souvent par un état inflammatoire chronique du foie qui entraîne une altération de la fonction et de l’identité des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, conduisant au développement d’un état fibrotique pouvant évoluer juqu’au stade de Cirrhose, voir d’hépatocarcinome (HCC). Les causes majeures de ces pathologies sont les MAFLD (Metabolic dysfunction Associated Fatty Liver Disease), les maladies du foies liés à l’alcool ou encore les hépatites virales et bactérienne. La cirrhose hépatique est un stade important du développement de la fibrose hépatique qui est retrouvée dans la majorité de ces pathologies hépatiques et qui représente le stade irréversible de la maladie. Un événement précipitant (infection, alcool) peut chez les patients cirrothiques entrainer une perte aigüe de la fonction hépatique défine comme ACLF (Acute on Chronic Liver Failure). L’absence de thérapies efficaces démontre l’importance de mieux comprendre et caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement de ces défaillances hépatocytaires. De nombreuses études de la littérature, ainsi que des données prélimiaires obtenues au laboratoire ont montré le rôle important de la protéine FAT10 dans le développement et l’installation de ces pathologies. En effet, il a été démontré que FAT10 était surexprimé dans le foie de patients atteints de ASH (Alcooholic steatohepatitis), de MASH (Metabolic dysfunction Associated to SteatoHepatitis) et d’hépatite virale. Des résultats d’études menées au laboratoire ont montré que FAT10 interagit avec le récepteur nucléaire, Pparα (, afin d’inhiber son action sur le métabolisme des lipides et l’inflammation et contrôlait également la senescence de l’hépatocyte au cours de la MASH. Ainsi, l’objectif de ce projet de recherche est de déterminer si la modulation d’expression de FAT10 module la souffrance hépatocytaire et la progression des maladies chroniques du foie, tels que la MASH, la ASH (Alcoholic SteatoHepatitis), l’ACLF ou encore la réponse hépatique à une infection bactérienne (Sepsis)
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à mettre en évidence le rôle de FAT10 dans la souffrance hépatocytaire et le développement et la progression de la MASH et l’ACLF. La compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlés par FAT10 dans ces pathologies pourrait permettre de déterminer FAT10 comme une cible thérapeutique intéressante pour soigner les pathologies hépatiques, où à l’heure actuelle, il n’existe aucune thérapie.
Procédures
Des prélévements sanguins seront réalisés avant le début des différents protocoles ou en fin de protocoles, soit après légère incision de la queue pour des prélévements au cours du protocole, alors que des prélévements en rétro-orbitaire seront réalisés en fin de protocoles avant l’euthanasie des animaux. L’ensemble de ces prévelements sera réalisé sur animal anesthésié par isoflurane, sauf au moment des différents tests métaboliques (GTT, ITT, PTT) car l’utilisation d’un anesthésique perturbe le métabolisme de l’animal. Sur un même protocole, les souris pourront subir plusieurs prélévements sanguins à la queue avec au moins 2 semaines de délai entre deux prélévements. Pour d’autres protocoles, des injections intra-péritonéales ou gavages seront réalisé sur animaux vigiles. Pour finir, les souris seront anesthésiées, suivi immédiatement d’une mise à mort pour des prélévements d’organes.
Impact sur les animaux
La lignée C57BL6/J utilisée dans nos différentes procédures ne présente aucun probléme physique ou physiologique. Ainsi, peu de nuisances ou d’effets indésirables sont attendus dans les procédures qui seront mises en œuvre pour la réalisation de ce projet de recherche. L’utilisation de régimes induisant la MASH chez l’animal peut conduire à l’apparition de nodules hépatiques pouvant évoluer vers un carcinome hépatique pouvant causer des douleurs à l’animal au cours du protocole. La mise en place de régimes obésogènes dans un modèle murin peut également entrainer des problèmes de prise alimentaire et donc le développement de faim et de malnutrition de l’animal. L’utilisation de modèles permettant le développement de la souffrance hépatocytaire et notamment les modèles qui permettent d’étudier l’ACLF nécessitent l’administration chronique d’un agent chimique qui permet d’induire la fibrose hépatique et la cirrhose, suivi d’un épisode infectieux qui va permettre de passer d’un stade compensé (asympotomatique) à un stade décompensé (stade irréversible). Il est bien établi que l’injection chronique de l’agent chimique n’induit pas de douleur à l’animal. L’épisode infectieux étant susceptible d’entrainer des réactions inflammatoires avec possibilités de fièvre et d’autres symptomes de souffrance de l’animal, elle sera effectuée le matin afin de pouvoir effectuer une observation accrue de l’animal le jour de l’infection. L’ensemble des procédures vont également nécessiter la prise des animaux en contention, pouvant provoquer un stress léger à l’animal. Ainsi, pendant l’ensemble de la durée de l’étude, le bien-être des animaux sera estimé quotidiennement et l’observation de signes de douleurs ou de mal-être entraînera la sortie du protocole de l’animal et sa mise à mort. Une attention particulière sera portée aux paramètres cliniques définissant les points limites de nos expériences : 1) perte de poids de 15% et 2) modification de l’apparence physique et du comportement (prostation, infection, poil hirsute, vocalisation et comportement agressif avec morsure).
Devenir
A l’issus des différentes procédures mise en place dans ce projet de recherche, l’ensemble des animaux seront mis à mort pour analyses.
Remplacement
Ce projet de recherche est mis en place à partir d’études préliminaires réalisée sur des lignées cellulaires. Ces études ont montré un rôle important de la protéine FAT10 dans les cellules du foie. Cependant, les maladies du foie associées à une dysfonction hépatique sont des pathologies complexes impliquant de nombreux organes autres que le foie. Ainsi, l’utilisation d’un modèle animal (modèle murin) nous permettra de reproduire au mieux la physiopathologie et de mieux comprendre le rôle clé joué par la protéine FAT10 dans la souffrance hépatocytaire, ainsi que le développement et la progression des maladies chroniques ou aïgue du foie.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum, sans toutefois compromettre l’analyse statistique des résultats. De plus, une analyse appronfondie de la littérature permet également d’éviter des répétitions d’expériences inutiles.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum lorsqu’ils ne sont pas nourris avec un régime alimentaire induisant un contexte physiopathologique. Si les animaux ne sont pas nourris ad libitum, une vigilance accrue sera accordée à la quantité de nourriture restante dans la cage. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de maisons. La définition précise des points limites précoces, ainsi qu’une surveillance quotidienne pendant tout le protocole permet de limiter l’apparition d’une souffrance ou d’une atteinte de l’état général de la souris. En cas d’atteinte de ces points limites, les animaux seront sortis de l’étude et mis à mort.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espéce que nous avons choisi car de nombreuses données de la littérature sont disponibles sur ce modèle d’étude. De plus, cette espéce est fréquemment utilisée pour étudier les pathologies telles que la MASH ou l’ACLF. Elle présente de nombreux avantages : facilité d’élevage, possibilités d’utiliser des modéles génétiquements modifiés et sont sensibles aux régimes alimentaires et aux traitements pharmacologiques induisant la MASH et l’ACLF. Les souris seront utilisées à l’âge adulte de 12 semaines car les souris adultes offrent une une meilleure homogénéité et une meilleure réponse aux inductions des pathologies métaboliques via un régime « spécial » ou des pathologies caractétisées par une souffrance hépatocytaire induite par des stimulations chimiques.
Recours à des animaux de laboratoire pour la production et le maintien de souches de parasites virulents du genre Leishmania (L.) L. major, L. amazonensis L. tropica, L. infantum et L. donovani et l’accès à des tissus parasités.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Hamsters dorés : 310
Les souris sont tuées quand la lésion de leur coussinet plantaire atteint 10 mm ou se nécrose, les hamsters avant qu'ils n'aient perdu 20 % de leur poids, seuil précédé de prostration et d'isolement dans la cage. 410 souris et 310 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Anesthésiés, ils reçoivent une inoculation de Leishmania, sous la peau du coussinet plantaire pour les souris, avec une lésion qui grossit pendant trois mois et réduit leur mobilité, dans l'abdomen pour les hamsters, chez qui le parasite colonise le foie et la rate. Aucune expérience n'est menée sur eux pour elle-même, ils sont infectés pour que le laboratoire dispose de parasites virulents et de tissus parasités pour ses autres projets, et le porteur écrit que cet effectif "n'exige aucune approche statistique".
Objectifs
Le développement des Leishmanies est complexe et très partiellement élucidé notamment chez les mammifères. Initialement deux populations morphologiquement distinctes ont été distinguées: Un stade de développement ne peut s’établir en dehors des cellules hôtes à l’exception de Leishmania donovani et Leishmania mexicana pour lesquelles il est possible de produire ce stade pouvant se développer en absence de cellules hôtes mammifères. Néanmoins ceux-ci présentent des caractéristiques très différentes de es stades lorsqu’ils sont isolés à partir d’un individu malade. Ce projet permettra de produire un stade de développement de Leishmania major, Leishmania amazonensis, Leishmania tropica, Leishmania infantum et Leishmania donovani et d’avoir accès à des tissus fortement parasités qui pourront être utilisés pour la réalisation des projets scientifiques du laboratoire. En effet ceux-ci sont axés sur la connaissance de la biologie des Leishmanies et de ses interactions avec ses hôtes pour l’identification à terme de nouvelles cibles thérapeutiques. De plus, ce projet propose de comparer différents modes d’administration des parasites ainsi que la faisabilité d’utiliser des mâles et non plus seulement des femelles. La réalisation de ce projet repose sur 4 procédures : (1) et (3) raffinement des modes d’administration des parasites et faisabilité quant à l’utilisation de souris et hamsters mâles pour la production de parasites (2) recours à des souris pour le prélèvement de tissus cutanés et/ou ganglions drainant le site d’inoculation (4) recours à des hamsters dorés pour le prélèvement de leur rate et de leur foie L’inoculation des parasites est réalisée sur animaux anesthésiés. Les animaux sont observés chaque semaine et cette observation est couplée à une mesure du poids des individus. Les animaux sont mis à mort aux points limites définis dans le projet selon les méthodes approuvées.
Bénéfices attendus
Deux bénéfices distincts sont attendus. L’un vise à faire évoluer, si possible, nos modèles expérimentaux pour une amélioration de la santé et du bien-être animal et un raffinement des techniques d’injection. L’autre concerne la connaissance de la biologie des Leishmania et les bénéfices qui en découlent pour la santé humaine et animale. Les parasites du genre Leishmania pathogènes pour l’homme se développent dans deux hôtes distincts, les insectes vecteurs et hôtes, et les mammifères. Le passage d’un hôte à l’autre entraîne une transformation des parasites d’un stade de développement dans l’insecte hématophage à un autre stade de développement dans les cellules des hôtes mammifères et réciproquement. Chez l’homme la multiplication d’un stade de développement au sein des cellules phagocytaires telles que les macrophages provoque à terme la maladie. Aujourd’hui il n’existe toujours pas de vaccination et les traitements actuels sont non seulement toxiques mais deviennent aussi de moins en moins efficaces en raison de l’apparition de parasites résistants au peu de médicaments disponibles. Or les espèces du complexe Leishmania donovani provoquent une leishmaniose viscérale mortelle en absence de traitement efficace tandis que les autres espèces provoquent des lésions cutanées souvent défigurantes à l’origine de stigmatisations sociales importantes notamment chez les femmes. Seule la compréhension du programme complexe de développement de Leishmania pourra nous permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour la génération de nouveaux médicaments et de vaccins, et, pour y parvenir il est primordial d’avoir accès à des parasites virulents purifiés à partir d’animaux infectés. A court terme ce projet nous permet donc de travailler avec des parasites biologiquement pertinents pour toutes nos recherches. A long terme les résultats de nos recherches pourront se traduire en avancées majeures dans la prévention et la chimiothérapie des différentes formes de leishmanioses.
Procédures
Pour les hamsters et les souris les animaux sont : 1) anesthésiés pour pratiquer l’inoculation des parasites. Durée de contention de l’animal pour l’injection intrapéritonélae de l’anesthésique inférieure à 30 secondes/animal et la durée de l’anesthésie varie de 15 à 30 minutes. Le temps d’inoculation sous-cutanée des parasites est de l’ordre de 30 secondes/animal. 2) suivis périodiquement (hebdomadaire, à minima à compter du 2ème mois post-injection des parasites) pour l’évolution de la pathologie. Pour les souris, l’animal est maintenu pendant la mesure puisqu’il doit être tenu immobilisé afin de pouvoir mesurer l’épaisseur du coussinet plantaire, lieu de l’injection des parasites et donc du développement de la lésion. Le temps de la contention/mesure est inférieur à 30 secondes/souris. Pour la procédure de raffinement des voies d’injection, les souris pourront être anesthésiées par voie gazeuse afin de permettre les mesures de taille des lésions. Dans ce cas la durée de l’anesthésie sera réduite à 5-10 minutes. Pour les hamsters, ceux-ci sont uniquement déplacés individuellement dans le pot à peser, la totalité de l’intervention étant également inférieure à 30 secondes/hamster. Pour la procédure de raffinement des voies d’injection, les hamsters seront anesthésiés par voie gazeuse et maintenus ainsi pendant la procédure d’imagerie in vivo qui comporte une injection intrapéritonéale. La totalité de cette procédure est évaluée à 45 minutes/individu.
Impact sur les animaux
Les effets attendus sur les animaux dépendent de l’espèce de Leishmania inoculée et du site d’injection. Les Leishmania responsables d’atteintes cutanées telles que L. amazonensis, L. major ou L. tropica lorsqu’elles sont injectées dans le coussinet plantaire des souris vont créer localement une réponse immune. Ceci permettra le recrutement des cellules de type macrophage dans lesquelles les parasites vont pouvoir se multiplier et conduire progressivement à la création d’une lésion non nécrosante quand les parasites sont inoculés à certaines souris. Au cours du temps les effets sur les animaux vont passer de silencieux (pas de signe visible) pendant un mois à progressivement symptomatique. Durant cette période la taille de la lésion va augmenter entraînant une réduction de la mobilité dans le cas d’une injection dans les coussinets plantaires mais sans impact sur l’alimentation et l’hydratation car l’expérimentation est arrêtée avant d’atteindre les points limites et donc ce stade (au plus trois mois après l’inoculation). Les espèces de Leishmania viscérales, L. infantum et L. donovani vont colonisées principalement le foie et la rate des hamsters. Dans ce cas aussi la première phase de la maladie est silencieuse et peut durer de 1 à 3 mois. Au-delà, le premier signe clinique de l’évolution de la pathologie est une stabilisation de la prise de poids suivi d’une perte progressive de poids. Cette perte de poids lorsqu’elle atteint 20% (point limite de l’expérimentation) s’accompagne souvent d’une réduction de la mobilité voire de prostration et d’isolement dans la cage.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Ils ne peuvent en effet être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car la fin de la procédure implique la mise à mort des animaux pour réaliser le prélèvement des lésions ou organes internes sources de parasites.
Remplacement
Quatre limitations majeures sont à noter quant à l’utilisation de parasites maintenus uniquement en culture : (1) il n’existe aucune méthode permettant de générer et cultiver in vitro certains stades de développement de L.major, L. tropica, L. infantum et de L. amazonensis, (2) à terme les subcultures in vitro des diverses espèces de Leishmania à certains stades de développement se traduisent par la perte rapide d’une mécanisme indispensable pour s’établir chez l’hôte mammifère, (3) il est présentement impossible d’obtenir un autre stade de développement à partir de L. donovani maintenues in vitro, (4) certaines formes de L. donovani sont différentes de celles provenant de tissus animaux, elles ne s’établissent pas chez les mammifères modèles – hamsters- auxquels ils sont inoculés.
Réduction
Ce projet est avant tout destiné à la production de Leishmania virulents ou de tissus colonisés par les parasites pour permettre la réalisation des différents projets scientifiques du laboratoire. De fait il n’exige aucune approche statistique pour définir le nombre d’animaux à utiliser. Ce nombre est donc estimé en fonction des projets du laboratoire en sachant que les parasites purifiés à partir de chaque animal sont utilisés pour plusieurs types d’expérience qui sont ainsi planifiées en conséquence. Les animaux infectés devant être mis à mort pour la production de parasites ou de tissus infectés, il est donc impossible de les réutiliser.
Raffinement
Les animaux sont placés dans des cages en portoir ventilés, la nourriture et l’eau de boisson sont stérilisées (irradiation ou autoclavage). Tout le matériel utilisé (seringues, aiguilles, instruments de mesure) est stérile ou décontaminé avant contact avec les animaux. L’infection parasitaire étant silencieuse en termes de signes cliniques pendant les 8 premières semaines, souris ou hamsters sont observés tous les jours par le personnel de l’animalerie au moment du changement des cages ou par l’expérimentateur. A partir du 2ème mois suivant l’injection des parasites, les animaux sont également examinés chaque semaine pour l’apparition et le suivi des signes cliniques de la maladie. Pour les souris inoculées avec les parasites qui cible le derme, l’évolution de la lésion au site d’injection est estimée par mesure de l’épaississement du coussinet plantaire ou bien du site d’injection chaque semaine par l’expérimentateur. Lorsque celle-ci atteint une taille moyenne maximale de 10 mm (point limite dans le cas d’une injection dans les coussinets plantaires) ou en cas de nécrose les souris sont mises à mort. En cas de détérioration de l’état général des souris celles-ci seront mises à mort. Dans le cas des hamsters, les animaux sont pesés chaque semaine pour mesurer l’évolution de la leishmaniose. Les animaux sont mis à mort selon la procédure validée avant d’atteindre le point limite (20% perte de poids). Pour ces deux espèces, l’injection des parasites est réalisée après anesthésie légère des animaux. Durant la procédure, en cas de prostration ou difficulté locomotrice un gel d’hydratation pourra être placé dans la cage tout comme les granulés alimentaires. De même, une litière douce à base de cellulose pourra être substituée à la litière traditionnelle. Dans ce projet plusieurs sites d’injection des parasites seront comparés quant à la production en nombre de parasites et la possibilité de travailler sur les tissus parasités. Dans la mesure où aucune différence liée au mode d’administration ne serait mise en évidence, la voie d’inoculation choisie pour toute la durée du projet serait celle respectant au mieux la santé et le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le choix des modèles souris et hamster est lié à la susceptibilité de certaines de ces espèces vis-à-vis des Leishmania. Certaines lignées de souris consanguines dites sensibles permettent le développement de L. major, L. tropica et L. amazonensis dans les lésions localisées au site d’inoculation. Certaines souris sont préférentiellement choisies pour la production de ces parasites car elles développent rapidement des lésions très riches en amastigotes et non nécrosantes. En revanche le modèle souris est peu adapté pour les espèces de Leishmania viscérales telles que L. donovani ou L. infantum, d’où le choix du hamster qui développe une pathologie proche de celle observée chez l’homme et rend possible la production en nombre des parasites à partir de la rate et le foie des animaux infectés. L. major, L. tropica et L. amazonensis seront inoculées à des souris âgées de 5 à 8semaines. L. donovani et L. infantum seront inoculées aux hamsters entre la 5ème et la 8ème semaine soit avant la stabilisation de la prise de poids pour un animal non traité. En effet, l’un des premiers marqueurs révélateurs de l’initiation des dommages systémiques est la stabilisation dans la courbe d’évolution du poids, le second révélateur de la progression des dommages étant une perte pondérale.
Etude de l’effet du microbiote sur le vieillissement du système immunitaire chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Sur dix mois, les souris privées de flore intestinale reçoivent treize gavages de deux minutes et cinq prélèvements de sang, tous pratiqués sur animaux éveillés, et sont identifiées par poinçonnage des oreilles. 220 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, pour étudier l'effet du microbiote sur le vieillissement du système immunitaire. Le porteur mentionne pourtant un "risque de douleur modérée" lié aux prélèvements de sang, un risque de fausse route lors du gavage et des troubles gastro-intestinaux à l'implantation de la flore, sans que ce classement en gravité légère en soit modifié. 140 souris sont tuées pour les prélèvements et les 80 qui n'ont subi qu'une seule prise de sang partent vers d'autres projets.
Objectifs
La flore intestinale est un ensemble très complexe et diversifié de bactéries qui interagissent étroitement avec les cellules de la paroi intestinale et les cellules immunitaires. Il a été montré qu’un déséquilibre dans la composition de la flore intestinale était associé à plusieurs maladies, notamment des maladies inflammatoires. Chez les personnes âgées plusieurs études ont mis en évidence qu’il existait un déséquilibre de la flore intestinale, un état inflammatoire chronique ainsi qu’un affaiblissement du système immunitaire mais la relation de causalité entre ces 3 phénomènes n’est pas clairement établie. Chez la souris, une inflammation chronique et une altération de la fonction d’une population de cellules composant le système immunitaire (les lymphocytes T) ont pu être observés au cours du vieillissement. Des modifications de la flore intestinale induites par le vieillissement pourraient être à l’origine de l’inflammation chronique et ainsi induire l’affaiblissement des lymphocytes T. C’est pourquoi nous souhaitons étudier l’influence de la composition de la flore intestinale sur les lymphocytes T et donc sur le vieillissement du système immunitaire. Par ailleurs, l’influence du sexe sur le vieillissement du système immunitaire et la composition de la flore intestinale n’a jamais été étudié. C’est pourquoi nous évaluerons séparément l’impact de la flore intestinale dans des souris mâles et femelles.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait de mieux comprendre l’impact de la flore intestinale sur le vieillissement du système immunitaire. Ces travaux pourraient ainsi ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour favoriser un vieillissement en bonne santé. Nous porterons également notre attention sur l’impact du sexe sur le vieillissement du système immunitaire qui n’a pas été étudié jusqu’ici.
Procédures
Les animaux sans flore intestinale en vieillissement subiront 13 gavages (2 min/gavage/animal) et 5 prélèvements de sang (1min/prélèvement/sur animal vigile) sur une durée de 10 mois. Les animaux contrôles mis en vieillissement subiront 5 prélèvements de sang (1min/prélèvement/sur animal vigile) sur une durée de 10 mois. L’ensemble de ces animaux sera identifié par poinçonnage aux oreilles. Les animaux contrôles âgés entre 2 et 3 mois subiront 1 seul prélèvement de sang (1min/prélèvement/sur animal vigile).
Impact sur les animaux
Les animaux pourraient subir un stress lié aux gavages et aux prélèvements de sang. Il existe un risque de douleur modérée liée aux prélèvements de sang. Un risque de fausse route lors du gavage est également à prendre en compte. Le changement d’alimentation ainsi que l’implantation de la flore intestinale dans les premières semaines pourraient entrainer des problèmes gastro-intestinaux.
Devenir
140 animaux seront mis à mort afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires à l’étude du vieillissement du système immunitaire. Les 80 animaux n’ayant subi qu’un seul prélèvement de sang seront réutilisés dans d’autres projets.
Remplacement
L’effet de la flore intestinale sur les cellules du système immunitaire est le résultat d’interactions complexes qui ne peuvent pas être reproduites in vitro nous obligeant ainsi à utiliser l’expérimentation animale.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Le milieu sera enrichi à l’aide de coton de nidification et de maisons en carton. Les animaux seront sous surveillance quotidienne de la part de l’équipe professionnelle de zootechnie et un suivi hebdomadaire de la part de l’équipe scientifique sera mis en place en prenant en compte les critères établis dans la grille de score. Si, au vu des critères, un animal est en mal-être, il sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle de référence dans l’étude du système immunitaire. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Les souris utilisées auront 8 semaines au début du gavage pour pouvoir implanter la flore intestinale une fois le système immunitaire mature.
Remodelage du système de Purkinje dans les arythmies ventriculaires chez la souris (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Des souris génétiquement modifiées développent une maladie du muscle cardiaque après une dose de tamoxifène, donnée par la bouche à leur mère gestante juste avant la naissance ou injectée dans leur abdomen au deuxième jour de vie. 444 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tatoués aux doigts à dix jours et biopsiés à la queue, les descendants passent ensuite sous anesthésie un ECG, une IRM et une stimulation du cœur qui vise à déclencher des arythmies, avec un risque de fibrillation ventriculaire et de mort pour certaines souris. Toutes sont tuées, les reproductrices en fin de fertilité, les autres pour des analyses ex vivo, et le porteur annonce que les souris subiront "le maximum de procédures possibles" pour limiter l'effectif.
Objectifs
La mort subite cardiaque due aux arythmies cardiaques représentent jusqu’à 85 % des cas de mortalité chez des patients atteints d’infarctus ou de maladies cardiaques (cardiomyopathies). Ces arythmies sont souvent déclenchées par des cellules cardiaques spécialisées appelés fibres de Purkinje. Ces fibres forment un réseau de conduction électrique rapide assurant la contraction coordonnée du cœur afin de pomper efficacement le sang. Bien que ces fibres ne représentent qu’une infime partie du cœur (2% de la masse du cœur), plusieurs études suggèrent que des dysfonctionnements au niveau de ces fibres jouent un rôle important dans les arythmies cardiaques et la mort subite chez l’Homme. L’objectif principal de ce projet est d’élucider comment ces dysfonctionnements peuvent provoquer des arythmies cardiaques. Notre hypothèse est que des perturbations de la structure ou de la fonction des fibres de Purkinje dans certaines formes de maladies cardiaques (cardiomyopathies) représentent un facteur de risque élevé de mort subite. Pour cela nous allons étudier la structure et l’activité électrique de fibres de Purkinje des modèles de cardiomyopathies chez la souris. Parmi les modèles de cardiomyopathies, nous travaillerons sur des souris modifiés génétiquement avec une dysfonction des fibres de Purkinje, identifiés chez des patients atteints de malformations cardiaques ou de cardiomyopathies très souvent associées à des arythmies.
Bénéfices attendus
La survenue de mort subite est très souvent liée à une arythmie ventriculaire imprévisible qui dans sa grande majorité provient d’un défaut du réseau de Purkinje. Malheureusement ce réseau ne représente qu’une infime partie du cœur et son étude chez l’Homme est limitée à des mesures invasives et indirectes. L’utilisation de souris transgéniques, chez lesquelles ce réseau est facilement identifiable, est un atout majeur pour comprendre l’origine des arythmies ventriculaires. Ce projet devrait nous permettre d’identifier des facteurs de prédisposition aux arythmies ventriculaires dans plusieurs modèles de cardiomyopathies.
Procédures
Dans la procédure 1, les souris gestantes seront traitées une fois, juste avant la naissance et par voie orale avec du tamoxifène (molécule induisant les cardiomyopathies chez la descendance) (Durée : moins d’un minute). Dans la procédure 2 (6-7 semaines), la descendance aura une injection dans l’abdomen de tamoxifène au 2ème jour après la naissance (durée : Moins d’un minute), une identification par tatouage digital à 10 jours (durée: moins d’un minute), une biopsie de la queue pour le génotypage (identification de la variation génétique) (duré : moins d’un minute). Ces animaux seront sous anesthésie générale pour les analyses de l’activité électrique (ECG, IRM et stimulation cardiaque).
Impact sur les animaux
Les animaux présentant les points limites suivants seront euthanasiés par dislocation cervicale : L’administration par voie orale du tamoxifène peut provoquer un stress à l’animal et provoquer la mise-bas des femelles gestantes. De plus, au moment du traitement par voie orale, le tamoxifène peut également suivre une fausse route. Chez les nouveau-nés, l’injection de tamoxifène peut provoquer un retard de croissance. L’anesthésie générale peut entraîner des difficultés respiratoires se manifestant par des spasmes abdominaux et ne devraient pas engendrer de nuisances ou d’effets indésirables particuliers sur les souris. L’induction d’arythmies ventriculaires par la stimulation cardiaque pourrait entrainer des effets indésirables sévères (fibrillation ventriculaire, tachycardie ventriculaire) et même conduire au décès de certains animaux.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans ce projet seront euthanasié suite à la fin de fertilité ou bien afin d’effectuer des analyses ex vivo.
Remplacement
Pour le moment, les études sur cellules, organes artificielles ou par modélisation informatique ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de la structure et fonction complexe des fibres de Purkinje. Cependant, les résultats obtenus pourront enrichir de futurs modèles mathématiques des fibres pour la réalisation de simulation virtuelle de la fonction cardiaque et des arythmies.
Réduction
Les animaux subiront le maximum de procédures possibles (sous anesthésie générale) afin d’obtenir le maximum de données sur un minimum de d’animaux. Dès que les résultats auront une puissance statistique minimale pour être exploités, la production de souris sera arrêtée.
Raffinement
Les mesures de raffinement sont mises en place à toutes les étapes du projet, notamment au cours de l’hébergement (cage collective, litière et enrichissement adaptés) et seront manipulés par des personnes compétentes et formées. L’état des animaux sera contrôlé quotidiennement afin d’éviter toute souffrance. Les animaux seront anesthésiés quand nécessaire et des points limites sont déterminés afin d’utiliser une méthode analgésique ou bien d’interrompre le protocole en cas d’apparition de signes de détresse.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : -animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner -modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), -6 à 15 souriceaux par portée -modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en termes de manipulation génétique. Les stades de développement utilisés dans ce projet sont les suivants : -Souris adultes : des souris génitrices qui permettront le maintien de la lignée de souris transgéniques (à partir 6-8 semaines jusqu’à 24 semaines) et la descendance à partir du 3ème jour jusqu’à 6 semaines.
Etude de la biocompatibilité d’échafaudages bicouches à base d’albumine et cellularisés implantés en sous-cutané chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système respiratoire
220 souris nude immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement. Chacune est opérée sous anesthésie pendant 30 minutes pour recevoir sous la peau deux patchs d'albumine bovine, avec douleur, inflammation et risque d'infection au site d'implantation, et le porteur écarte les anti-inflammatoires non stéroïdiens parce que l'inflammation locale fait partie de ce qui est étudié. Ces implants visent à terme la régénération du cartilage chez l'humain, après des "tests plus importants sur gros animal". Le porteur conclut à la "nécessité de continuer les expérimentations" chez les rongeurs, "sans remplacement possible", et fixe l'effectif de 220 sans aucun test statistique, en annonçant des "observations directes".
Objectifs
Le développement d’implants, composés uniquement à base d’albumine et associés à l’ingénierie tissulaire, s’apparente à une nouvelle voie de recherche potentielle pour la régénération du cartilage chez l’Homme. Les implants seront entièrement composés d’albumine bovine et seront construits en deux parties : une partie dite « poreuse » et une autre partie dite « lisse ». L’objectif, ici, est de proposer un matériau bicouche biomimétique, favorisant la regénération tissulaire. Nous souhaitons, dans un premier temps, tester la biocompatibilité de ces implants chez la souris, en vue de leur utilisation pré-clinique en observant l’intégration de l’implant celllulaire après une implantation en sous-cutanée chez des souris nude immunodéprimées. Les tests in vivo sur ces souris nude seront une première étape de validation avant des tests plus importants sur gros animal, puis des applications cliniques.
Bénéfices attendus
Les biomatériaux sont devenus un élément clé pour le développement de l’ingénierie tissulaire. Nous espérons, à terme, le développement d’un nouvel implant pour la régénération du cartilage chez l’Homme. Dans le contexte actuel, cet implant offrirait une nouvelle voie de recherche, permettant ainsi de surmonter les limites des traitements conventionnels : intégration tissulaire chez le patient de l'implant, et morbidité du site donneur dans les traitements actuels prélevant un greffon d'un site donneur implanté au niveau d'un site receveur à un autre endroit du corps. Cet implant sera innovant car il sera formulé à partir de matériau d’origine naturelle, et ensemencé de cellules saines du patient lui même. Il ne nécessitera donc pas de traitement immunosuppresseur et ne sera pas sujet au rejet immunitaire. Ce projet est en accord avec les nouvelles avancées en santé humaines, visant à réaliser des implants tout biologiques et personnalisés pour chaque patient.
Procédures
Procédures chirurgicales : 1 par animal, implantation sous cutanée de deux patchs d'albumine, sur animaux anesthésiés. 30 minutes d'intervention par animal.
Impact sur les animaux
La procédure de mise en place de l’implant est une procédure invasive. Les nuisances attendues sur les animaux concernent : la douleur liée à la chirurgie, l’inflammation post opératoire, l’infection au niveau du site d’implantation.
Devenir
Mise à mort pour prélèvement.
Remplacement
Des études in vitro antérieures ont démontré l’efficacité de ces échafaudages bicouches pour l’adhésion et la différenciation de chondrocytes. Pour une étude plus approfondie, ce projet contraint de mettre en place des études in vivo. En effet, la complexité de l'environnement physiologique sous-cutané, impossible à reproduire in vitro (vascularisation, cellules du système immunitaire, molécules inflammatoires…) atteste de la nécessité de continuer les expérimentations sur un modèle animal (rongeurs), sans remplacement possible. Seuls les échafaudages bicouches efficaces in vitro seront testés sur les animaux.
Réduction
Etant donné le nombre d’analyses nécessaires (études histologiques, immunohistologiques…) et afin de valider les résultats, le nombre maximum d’animaux nécessaires a été évalué à 220 souris pour 3 ans, nombre d'animaux nécessaire pour pallier la différence interindividuelle des cellules issues des donneurs, des aléas de la chirurgie, et des nombreuses analyses prévues qui nécessiteront chacune plusieurs échantillons. Il n'y aura pas de tests statistiques, nous effecturons des observations directes.
Raffinement
Afin de nous assurer du bien-être des animaux, nous porterons une attention particulière tout d’abord à l’anesthésie per-opératoire, en faisant en plus de l’anesthésie générale, une analgésie pré opératoire. L’analgésie post-opératoire sera réalisée en injection sous cutanée. Les anti-inflammatoires non stéroidiens seront évités car les phénomènes de cicatrisation et de régénération tissulaire étudiés sont liés aux phénomènes inflammatoires locaux qui se mettent en place. La chirurgie sera privilégiée le matin car les animaux seront isolés dans une cage en post-opératoire précoce le temps du réveil, et remis en groupe dans la soirée. Nous privilégierons également l’emploi de femelles car elles présentent un comportement plus calme lors de la réintroduction en groupe après une période d’isolement. Comme l’intervention pourrait avoir des retentissements sur le déplacement de l’animal durant les premières heures après la chirurgie, la nourriture sera mise dans la litière et le bec du biberon placé bas afin de faciliter l’alimentation. Nous mettrons en place également des éléments d’enrichissement de l’environnement (bâtonnets, nids, coton…) afin de permettre la fabrication de nids notamment. Le type d’animal utilisé présente un phénotype dommageable mais les animaux seront dans des cages fermées et sur un portoir ventilé dans un environnement stérile et des conditions de manipulation adaptée à l’entretien de tels animaux. Si les animaux implantés au cours de l'étude présentent des signes précoces de douleur, d’inconfort ou de détresse (changements de comportement : animal prostré et isolé du reste du groupe, perte de poids et d’appétit, variations de leur apparence physique : anomalie cicatricielle observée au niveau des points de sutures), l’expérimentation sera arrêtée. Ces potentiels signes de douleurs seront évalués et scorés à partir d'un tableau de référence, permettant de juger si l'animal devra être mis à mort si celui ci atteint un point limite.
Choix des espèces
Pour tester la biocompatibilité et l’intégration tissualire, nous utiliserons des souris immunodéficientes : souris pour les implants, ensemencés ou non de cellules. Seuls les implants validés in vitro seront implantés chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (après 8 semaines de vie minimum) pour présenter des systèmes physiologiques matures.
Formation et maintien des compétences du personnel pour la réalisation d’actes chirurgicaux chez le rat et la souris
- Formation professionnelle
Rats : 70
Tués à l'issue pour que la réussite du geste chirurgical puisse être évaluée, 140 souris et 70 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un anesthésique par voie intrapéritonéale, deux à trois injections sous-cutanées d'analgésique, puis subissent selon l'espèce la pose d'un cathéter dans la veine jugulaire ou la ligature d'un uretère, opérations d'une quinzaine de minutes. Le porteur indique que les premières séances se font sur des animaux morts et qu'il utilise en priorité des animaux surnuméraires d'autres études, mais affirme que l'animal vivant reste "indispensable" pour ressentir les différences anatomiques entre individus, leur force et leurs réactions. Le projet ne produit aucune connaissance, sept expérimentateurs d'une entreprise privée y entretenant deux gestes chirurgicaux, à raison de 20 souris ou 10 rats par compétence et par personne, pour satisfaire une exigence réglementaire de formation continue.
Objectifs
L’utilisation des animaux de laboratoire dans les procédures invasives est strictement encadrée par la loi. La bonne pratique d’expérimentation nécessite une bonne connaissance de la biologie des espèces utilisées et aussi la connaissance théorique et pratique des méthodes d’exploration sur le modèle animal. L’objectif de ce projet est de fournir des connaissances indispensables et d’enseigner les bonnes pratiques d’expérimentation animale. Dans notre entreprise, les techniciens doivent maitriser des techniques chirurgicales nécessaires à la réalisation de certains modèles, chez le rat et la souris. L’objectif de ce projet est de répondre à l’exigence règlementaire concernant la formation continue et le maintien des compétences du personnel. Ce projet vise à améliorer les pratiques expérimentales, à assurer la qualité scientifique et le bien-être des animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour bénéfice le maintien et l’amélioration continue du bien-être des animaux utilisés dans nos projets de recherche préclinique, grâce au maintien et au raffinement des compétences du personnel sur les gestes techniques chirurgicaux, chez le rat et la souris. L’apprentissage et le maintien des compétences dans de telles conditions donne l’assurance de fournir des résultats fiables et dont la qualité et l’exactitude ne peuvent être remis en cause. L’entraînement permet d’acquérir une maîtrise des gestes permettant de réduire le temps d’anesthésie générale, ceci limite le stress chez l’animal. De même l’ensemble des actes impliquant une incision sont réalisés sous couverture analgésique.
Procédures
Les gestes techniques traités dans ce projet se pratiquent sur rats et /ou souris : • Les administrations intrapéritonéales d’anesthésiques sont pratiquées sur animaux vigiles en contention manuelle, à raison d’une administration par animal. Cet acte concerne l’ensemble des animaux du projet et nécessite environ 10 sec de contention. • Les administrations sous cutanées d’analgésie sont pratiquées sur animaux vigiles en contention manuelle, à raison de deux à trois administrations par animal. Cet acte concerne l’ensemble des animaux du projet et nécessite environ 10 sec de contention. • Chirurgie avec pose de cathéter à la veine jugulaire chez le rat. Un protocole d’analgésie pré- et post-opératoire s’applique dans ces cas. Une seule chirurgie est réalisée tout au long de la vie de l’animal et dure 15 minutes environ. • Chirurgie avec ligature unilatérale de l’uretère. Un protocole d’analgésie pré- et post-opératoire s’applique dans ces cas. Une seule chirurgie est réalisée tout au long de la vie de l’animal et dure 15 minutes environ.
Impact sur les animaux
Les nuisances décrites ci-dessous représentent des cas rares qui sont évités par la réalisation d’un bon tutorat et d’un apprentissage progressif. De manière générale, quel que soit le type de chirurgie, les nuisances engendrées peuvent survenir durant les gestes péri-opératoires qui impliquent des administrations aux animaux, notamment par voie intrapéritonéale avec passage possible dans la vessie ou injection dans le caecum. La régulation de la température corporelle et l’hydratation des animaux peut, si elle est mal maîtrisée, engendrer des effets indésirables durant la phase de réveil et au-delà. Post-chirurgie, les nuisances pouvant être constatées sont de type perte de poids, piloérection et prostration. Ces effets sont quantifiés et constituent des points d’arrêt anticiper de l’expérimentation. Dans certains cas, il peut arriver que la chirurgie nécessite l’hébergement en individuel, cela peut engendrer un stress chez les animaux.
Devenir
La mise à mort des animaux à l’issue des procédures est indispensable afin de pouvoir évaluer la réussite des actes chirurgicaux.
Remplacement
Avant toute manipulation des animaux, le personnel concerné procède à la lecture des procédures descriptives des techniques pour lesquelles il doit être formé, s’appuie sur les descriptions présentes dans la littérature scientifique et suit des démonstrations réalisées par le personnel compétent pour le geste technique en question. Les premières séances d’apprentissage et d’entraînement à ce type d’acte sont réalisées sur animaux morts, au préalable du travail sur animaux vivants anesthésiés. Il existe peu de solution de remplacement permettant la formation et le maintien des compétences du personnel. L’utilisation de l’animal vivant est indispensable pour ressentir les différences anatomiques inter individu, la force et les réactions de celui-ci.
Réduction
Les premières étapes de formation sur ces techniques chirurgicales sont réalisées sur des animaux morts. Nous utilisons ensuite en priorité des animaux surnuméraires des études, des animaux issus de nos élevages non entrés en expérimentation plutôt que des animaux achetés à cette fin, chez des fournisseurs agréés. Le nombre d’animaux inclus est fonction du nombre de compétences à acquérir et à maintenir et du nombre de personnes concernées. A ce jour, ce projet concerne 7 expérimentateurs et englobe 2 techniques, l’une chez la souris et l’autre chez le rat, dont les compétences sont à acquérir et/ou maintenir. 20 souris et/ou 10 rats sont nécessaires pour acquérir et/ou maintenir une compétence pour une personne. Le nombre de souris nécessaires pour acquérir et/ou maintenir une compétence est plus important que le nombre de rat, du fait de sa plus petite taille.
Raffinement
Nous incluons exclusivement des animaux en bon état général, hébergés dans des conditions respectant le bien-être animal, sous atmosphère contrôlée (température, hygrométrie, fond sonore…), avec l’enrichissement du milieu adéquat (fibre pour nidification, rouleau carton…) et en groupe sociaux harmonieux. Une phase d’acclimatation de 5 jours minimum est appliquée avant toute manipulation des animaux. Dans un premier temps, les séances d’apprentissage à ce type d’acte sont réalisées sur animaux morts. Dans un second temps ou pour des séances de maintien de la compétence, ces actes sont réalisés sur des animaux analgésiés et anesthésiés, sans réveil post chirurgie. La réalisation de ces gestes avec réveil de l’animal n’est réalisée que lorsque leur maîtrise a été validée lors des étapes précédentes, par le tuteur et/ou le responsable des compétences. L’ensemble des gestes sont réalisés en condition de stérilité (matériel stérile, utilisation de stérilisateurs à bille, etc.) afin d’éviter tout risque d’infection. Une fois anesthésiés, les animaux sont installés sur des couvertures chauffantes pour assurer le maintien de leur température corporelle. Pour les mêmes raisons, des enrichissements de type coton sont ajoutés dans leur cage pour la phase de réveil, voire au-delà. Pour les chirurgies impliquant l’ouverture de la paroi abdominale, une réhydratation à l’aide de sérum physiologique est mise en place et des cubes d’eau gélifiée avec des granulés d’aliment sont ajoutés dans les cages. Pour les animaux devant être isolés, un enrichissement supplémentaire est apporté au sein de leur cage. Les consommables utilisés (aiguilles, cathéters, fils de suture) sont stériles et adaptés à la taille de l’animal et au type de tissu impliqué afin d’éviter toute douleur ou gêne inutile. L’état clinique des animaux est évalué plusieurs fois par jour par les personnes impliquées dans ces formations ou maintien des compétences (tuteurs, soignant, etc.). Un carnet de santé, traçant précisément tous les gestes réalisés, le cas échéant les signes cliniques observés ainsi que les soins apportés, est mis en place. L’atteinte des points limites conduit à la mise à mort des animaux concernés.
Choix des espèces
La souris et le rat sont les espèces utilisées pour mener à bien nos programmes de recherche précliniques. A ce jour, de par leurs similarités physiologiques avec l’homme, ces deux espèces de rongeurs sont les plus adaptées pour évaluer les propriétés pharmacologiques de molécules d’intérêt et d’en connaître les risques de toxicité avant les premiers essais chez l'homme. Les animaux utilisés seront des animaux adultes car les études réalisées au sein de notre établissement le sont sur des individus adultes.
Etude, par imagerie intravitale, du rôle des HEV (high endothelial venule) induit par le vaccin H107e sur la migration, le positionnement et l’expansion des cellules immunitaires chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système respiratoire
2 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 960 subissant une chirurgie du thorax suivie de cinq heures d'observation au microscope sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 640 d'entre elles, modéré pour 640 et sévère pour 960. 1 600 sont infectées par la tuberculose au moyen d'un nébuliseur, maintenues éveillées en contention pendant 40 à 45 minutes dont 17 minutes d'exposition à la bactérie. 1 600 reçoivent aussi deux injections vaccinales sous anesthésie générale à quatre semaines d'intervalle, l'anesthésie provoquant selon le porteur une hypothermie et une déshydratation. Ce qu'il attend du projet, comprendre comment se forment des vaisseaux qui recrutent des lymphocytes dans les lésions pulmonaires, reste une étape de connaissance fondamentale, l'optimisation de vaccins étant renvoyée au conditionnel.
Objectifs
Dans certaines maladies, des structures liées au système immunitaire appelées structures lymphoïdes tertiaires (TLS) apparaissent comme la conséquence d'agressions locales qui ne se résolvent pas, comme les infections chroniques, les maladies auto-immunes et certaines formes de cancer. Les TLS sont des structures qui ressemblent aux ganglions lymphatiques avec le même type d'organisation, des zones de lymphocytes B et des zones de lymphocytes T dans lesquelles on retrouve des veinules particulières appelées HEV . Ces dernières sont des portes d'entrées privilégiées pour les lymphocytes. Lors de l’infection par l’agent pathogène Mycobacterium tuberculosis (M. tb) chez l’Homme, des TLS pulmonaires se forment autour des lésions créées par la bactérie. Bien que les mécanismes soient encore méconnus, les TLS semblent posséder une capacité protectrice lors de l’infection par M. tb. L’hypothèse du projet présenté ici s'appuie sur cette observation et a pour but de comprendre comment les HEV se mettent en place lors de ces infections et si elles peuvent permettre une meilleure infiltration de lymphocytes dirigés contre la bactérie au sein des lésions afin d'améliorer la réponse immunitaire contre la bactérie. Enfin, la démonstration du caractère protecteur des TLS vis à vis des infections par M. tb permettrait d’optimiser le dévéloppement de vaccins favorisant la formation de ces structures au cours de l’infection.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de : (i) comprendre les mécanismes de formation et de fonctionnement des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) dans le contexte de l’infection par Mycobacterium tuberculosis (M. tb) ; (ii) identifier des voies d'induction de TLS dans des pathologies pulmonaires infectieuses afin d'améliorer la réponse immunitaire contre ces infections.
Procédures
Dans ce projet, 1600 souris seront vaccinées sous anesthésie générale. Le vaccin sera administré deux fois au total, espacé d’une durée de quatre semaines entre chaque injection. Chaque injection ne durera pas plus de 10 secondes. L’infection par aerosol de Mycobacterium tuberculosis concerne 1600 souris parmi lesquelles 960 auront aussi été vaccinées. L'infection est réalisée sur des animaux vigiles à l’aide d’un nébuliseur. Les souris seront mises en contention pour une durée maximale de 40 à 45 minutes, dont 17 minutes correspondent à l’infection par l’agent pathogène. Les 960 souris vaccinées et infectées seront soumises à une chirurgie pour effectuer de la microscopie sur les poumons ainsi qu'à 2 ou 3 injections intraveineuse sous anesthésie générale. Ces 960 souris seront aussi soumises toujours sous anesthésie générale à une injection de serum physiologique en intrapéritonéale pour un maintien de l'hydratation. Chaque injection ne durera pas plus de 10 secondes. La chirurgie ne durera pas plus de 20 minutes et l’acquisition au microscope ne dépassera pas une durée de cinq heures.
Impact sur les animaux
Les souris qui sont vaccinées et celles qui sont soumise à une chirurgie subissent du stress dû à l’injection et à l’anesthésie. Les lignées de souris démontrées comme étant susceptibles à l’infection par Mycobacterium tuberculosis (M. tb) subissent une perte de poids suite à l’infection. L’anesthésie nécessaire pour la chirurgie et la microscopie provoque une hypothermie et une déshydratation chez la souris.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure car ces derniers nécessitent le prélèvement de rate (procédure 2 et 3) ou sont classées comme des procédures sévères.
Remplacement
Nous nous intéressons dans ce travail au rôle de vaisseaux appelés HEV dans le recrutement de cellules du système immunitaire, les lymphocytes dans des lésions pulmonaire liées à des infections bactériennes. Cela ne peux pas être réduit à des modèles en culture cellulaires car ces études nécessitent l'organisme entier avec la circulation sanguine, le système respiratoire et le système immunitaire. Nous devons donc travailler sur des organismes vivants et suffisamment proche de l’homme.
Réduction
Dans ce projet, un nombre maximum de 2240 animaux sera utilisé. Afin de s’inscrire dans la logique de réduction, nous avons intégré des points de décisions d'aller ou non de l'avant dans notre projet. Ainsi certaines étapes pourront être suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des résultats obtenus. Le nombre d’animaux utilisé pour chaque groupe a été déterminé par nos études antérieures et celles de la littérature. Il est de 10 animaux dans chaque groupe étudié, un nombre d’individus suffisants pour obtenir des résultats statistiquement significatifs
Raffinement
La stratégie de raffinement est premièrement fondée sur l’utilisation de points limites précoces, prédictifs et adaptés. Le suivi des animaux est réalisé par les expérimentateurs ou l’équipe de zootechnie quotidiennement (aspect externe, comportement, pesée). Les procédures d'injections et de chirurgie ont été optimisées afin de générer le moins de stress et de douleurs aux animaux. Pour ces chirurgies, les animaux sont anesthésiés et un analgésique est administré pour gérer la douleur. Les conditions d’hébergement et les méthodes expérimentales utilisées sont les plus appropriées pour réduire au maximum toute angoisse ou dommage durable que pourraient subir les animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle largement utilisé pour étudier l’immunité anti-infectieuse de par son fort degré de convergence des paramètres de l'immunité et de la pathologie chez l'Homme, par rapport aux autres espèces envisageables. De plus, le recours au modèle murin dans la microscopie est très répandu grâce aux divers modèles permettant la visualisation, le suivi et l’identification des populations de cellules d’intérêt. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines au début des procédures. A ce stade de développement, les souris ont un système immunitaire suffisamment mature.
Étude du rôle du génome silencieux sur l’immunogénicité de lignées cancéreuses.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées est immunodéficiente, dépourvue des défenses qui lui permettraient de rejeter les cellules tumorales qu'on lui greffe. 8 172 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Éveillées, elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses sous la peau du flanc, puis des traitements deux fois par semaine jusqu'à l'atteinte du point limite, environ trois semaines pour les groupes non traités, et pour certaines quatre injections directement dans la tumeur dès qu'elle atteint 100 mm3. Leur mort permet les analyses post-mortem, le porteur revendiquant la nécessité de valider dans "un organisme dans son intégralité" des observations qu'il a d'abord obtenues sur lignées cellulaires.
Objectifs
Les immunothérapies anti-tumorales visent à détruire les cellules cancéreuses en stimulant ou en réorientant le système immunitaire (SI). Ces traitements sont prometteurs et permettent déjà de guérir des patients, mais certaines tumeurs échappent au SI et il est essentiel d’améliorer ces approches. Les lymphocytes T tueurs sont des cellules essentielles pour l’immunité anti-tumorale. Pour fonctionner, elles ont besoin de reconnaître un peptide (appelé néoantigène - néoAg), exprimé par les cellules cancéreuses. Identifier les mécanismes de production de néoAgs et des stratégies pour moduler leur expression est un enjeu central de la recherche en immunothérapie. Les chercheurs ont longtemps cherché des néoAgs provenant de gènes codants, dérivant de mutations acquises par les cellules tumorales pendant le développement du cancer. Mais ces mutations sont souvent spécifiques à chaque patient, et donc difficiles à cibler. Il faut donc trouver d’autres sources de néoAgs. On parle souvent du rôle des gènes dans le développement de pathologies humaines, mais ils représentent seulement 2% du génome. On a longtemps pensé que le reste du génome (dit silencieux) ne s’exprimait pas. Plusieurs études récentes ont montré que le génome silencieux peut s’exprimer dans les tumeurs et favoriser leur destruction par le système immunitaire. L’inactivation de gènes impliqués dans « la mise sous silence » du génome silencieux permet son expression et conduit à une meilleure reconnaissance des tumeurs par le SI. Ils sont donc des candidats prometteurs pour le développement de thérapies. Il reste cependant beaucoup à comprendre sur la nature exacte de la régulation de ce génome silencieux et c’est le but de ce projet. Le premier objectif est d’identifier des gènes participant à sa « mise sous silence ». Le deuxième est de cibler ces gènes pour améliorer la réponse immunitaire anti-tumorale. Le troisième est de déveloper un traitement pour spécifiquement réveiller une partie du génome silencieux codant pour un néoAg pour améliorer les réponses immunitaires anti-tumorales. L’objectif général du projet est de comprendre les mécanismes de régulation du génome silencieux pour mieux instruire l’établissement de protocoles d’immunothérapie.
Bénéfices attendus
Il est essentiel de noter que la très grande majorité des cancers développent des mécanismes très efficaces qui inhibent la réponse immunitaire. Un enjeu actuel de la recherche en immunothérapie est d’identifier des mécanismes de productions de néoantigènes (qui seraient des nouvelles cibles) par les cellules tumorales et d’établir des traitements ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses. C’est dans ce contexte que s’inscrit ce projet. Ces expériences vont permettre de mieux caractériser le ou les mécanismes de régulation du génome silencieux dans les cellules tumorales. En effet, certains éléments du génome permettent de produire des protéines spécifiques de la tumeur et capables d’augmenter la réponse immunitaire dirigée contre la tumeur et non les tissus sains. Par ailleurs, ce projet cherche à mettre en place un protocole permettant d’augmenter l’expression de ces néoantigènes afin de pouvoir les utiliser dans des stratégies thérapeutiques pour améliorer de manière large la réponse des cancers à l’immunothérapie.
Procédures
Dans une première procédure, des cellules tumorales seront injectées à des souris par voie sous-cutanée au niveau d’un des flancs, sur animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 10 sec). Un à deux prélèvements sanguins (2 semaines après injection) et/ou au moment de la mise à mort des animaux seront réalisés sur animaux vigiles (durée de chaque prélèvement inférieure à 10 sec). Dans une deuxième procédure, après l’injection de cellules tumorales (identique à la 1ère procédure), les animaux seront traités par injection sur animaux vigiles 2 fois par semaine (durée du geste inférieure à 10sec), jusqu’à l’atteinte du point limite (environ 3 semaines pour les souris recevant les tumeurs sans traitement) ou pour un maximum de 60 jours (si les tumeurs sont rejetées). Un à deux prélèvements sanguins (2 semaines après injection) et/ou au moment de la mise à mort des animaux seront réalisés sur animaux vigiles (durée de chaque prélèvement inférieure à 10 sec). Dans une troisième procédure, les animaux seront injectés par voie sous-cutanée au niveau du flanc (1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 10 sec). Dans une quatrième procédure, des cellules tumorales seront injectées sur les animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 10 sec). Dès que les tumeurs atteignent environ 100mm3, le traitement sera injecté dans la tumeur des animaux vigiles à raison de 4 injections tous les 4 jours ( durée du geste inférieure à 10 sec). Un des groupes d’animaux sera également injecté en intraveineuse 24h avant le début du traitement.
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Pour les expériences d’injections de cellules tumorales ou des traitements, il est attendu une douleur directe associée à l’utilisation d’une aiguille. Pour le prélèvement de sang, il est attendu une douleur légère liée à la réalisation (gène de courte durée). En ce qui concerne les injections intratumorales, nous utiliserons un format de traitement utilisé en routine pour traiter des patients par injections locales. Aucune inflammation n’est attendue après ce traitement, mais les souris peuvent ressentir de la douleur pour un temps limité après l’injection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour des analyses post-mortem
Remplacement
Les lignées tumorales ont d’abord été étudiées in vitro (marqueurs de surface, croissance). Dans le cas des traitements visant à manipuler spécifiquement l’expression de néoantigènes dérivant du génome silencieux, des expériences ont été réalisées in vitro dans les lignées cancéreuses, nous savons donc qu’elles réagissent à ce traitement. Le projet est aussi avancé que possible, cependant des tests in vivo sont maintenant nécessaires pour comprendre le rôle de ces lignées sur la réponse immunitaire dans un contexte physiologique entier. En effet, dans le cas des lignées cellulaires déficientes pour des gènes de régulation, nous allons analyser la présence de cellules immunitaires entre les conditions déficientes et contrôles grâce à un prélèvement de sang.
Réduction
Lorsque cela est possible, afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés, les études sont réalisées au préalable sur des lignées cellulaires in vitro, modifiées pour les gènes d'intérêt. Nous pouvons ainsi tester un nombre important de paramètres, puis passer aux modèles animaux uniquement quand le projet est aussi avancé que possible. Cela permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet. Néanmoins, il est nécessaire de valider ces observations dans le contexte d'un organisme dans son intégralité plus physiologique. Le nombre d'animaux par groupe est défini à l'aide d'un outil statistique.
Raffinement
Les animaux seront suivis régulièrement afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer de façon objective l’état des animaux. Les animaux seront mis à mort dès l’atteinte des points limites. Dans le cas des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés 2 à 3 fois par semaines pour leur état général et pour mesurer la taille de la tumeur.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins. D’autre part, la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris immunodéficientes. Enfin, il existe un grand nombre de modèles de tumeurs transplantables disponibles.
Etude du cervelet dans un modèle murin d’ataxie cérébelleuse pour trouver de nouvelles cibles thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris subissent une biopsie de la queue, puis une anesthésie de cinq minutes avant la mise à mort. 176 souris porteuses d'une mutation du gène de l'ataxine-1 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées au niveau de souffrance modéré, une partie à cinq semaines, l'autre à vingt semaines. Ce qu'elles subissent tient surtout à leur génotype, les mutantes grandissant moins vite que les témoins et portant une ataxie qui atteint chez les patients la marche, la coordination et l'équilibre. Le porteur annonce les tuer à vingt semaines "avant l'apparition des symptômes les plus sévères", sans nommer les symptômes moteurs qui apparaissent avant ce terme ni la manière dont il les mesure.
Objectifs
Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies génétiques rares qui affectent un groupe spécifique de neurones dans une partie du cerveau appelée le cervelet. Elles entraînent des problèmes de mouvement tels que des difficultés à marcher, à coordonner les mouvements et à maintenir l’équilibre. L’une de ces maladies est l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1), qui se développe généralement à un âge avancé et est causée par une mutation génétique. Cette mutation empêche une protéine appelée ataxine-1 de fonctionner correctement. Malgré les progrès, les causes précises de cette maladie et pourquoi seulement certains types de cellules du cervelet sont affectés restent encore inconnus. L’objectif de cette étude est d’utiliser un modèle de souris génétiquement modifié pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires. Le modèle souris utilisé porte une mutation du gène de l’ataxine-1 comparable aux mutations retrouvées chez les patients et développe des symptômes récapitulant fidèlement les caractéristiques de la maladie chez l'homme. Les objectifs détaillés de cette étude sont : - d’identifier le profil d’expression des gènes de chaque type de cellules du cervelet chez des souris mutantes en comparaison des souris contrôles afin de détecter les changements d’expression de gène induit par la mutation dans un ou plusieurs types de cellules du cervelet - réaliser cette étude de profil d’expression des gènes à deux moments du développement de la maladie : avant et au moment de l’apparition des symptômes Ces résultats permettront de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans l’apparition de la maladie SCA1.
Bénéfices attendus
Ce modèle murin présente les caractéristiques typiques de la maladie humaine SCA1, c’est pourquoi nous pensons qu’il est le bon modèle pour rechercher et étudier les voies moléculaires qui sont dérégulées. Trois bénéfices principaux sont attendus : -Identifier les voies moléculaires responsable pour le développement et la progression de la maladie qui nous permettra de mieux comprendre la maladie. -Identifier les régions du cervelet qui sont le plus touchés par cette mutation, ce qui nous permettra de mieux comprendre la maladie. -Identifier des défauts moléculaires précoces qui pourront être des nouvelles cibles thérapeutiques à long terme.
Procédures
Les animaux seront soumis aux procédures suivantes (toutes sont incluses dans la classe modérée) : - biopsie au niveau de la queue pour génotypage, 1x par souris. Cette procédure dure 1 seconde. - anesthésie avant la mise à mort. Cette procédure dure 5 minutes. - injection des analgésiques et anesthésie avant la mise à mort. Ces procédures durent 15 minutes.
Impact sur les animaux
Au cours de la période couverte par le plan expérimental, les souris présentant une mutation de l’ataxine 1 présentent une croissance ralentie par rapport aux souris témoins. De plus, une douleur légère et transitoire est attendue au moment de la biopsie au niveau de la queue ainsi que lors des injections d’analgésique et d’anesthésique.
Devenir
Pour les analyses moléculaires, biochimiques et histologiques, une mise à mort est nécessaire à la fin de la procédure, en respectant les points limites et la progression de la maladie.
Remplacement
L’objectif de cette étude est de caractériser la dérégulation moléculaire dans chaque type de cellules du cervelet. Pour ce faire, nous devons utiliser des modèles animaux car il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. Afin d’évaluer les modifications de transcription des gènes nous devons collecter des tissus (cervelet) de souris mutantes et sauvages.
Réduction
Pour mener à bien ce projet, nous prévoyons d'utiliser 176 souris sur une période de 5 ans, ce nombre comprenant la maintenance de la lignée et les procédures expérimentales. Toutes les procédures sont organisées de manière à réduire le nombre de souris, tout en tenant compte du nombre minimum d’animaux nécessaires pour appliquer des tests statistiques afin d'évaluer la robustesse des résultats finaux.
Raffinement
Les souris seront manipulées par contention douce (dans le creux de la main ou dans un tube en carton servant d’enrichissement). Les souris seront soumises à une anesthésie générale avant la mise à mort. De plus, pour la procédure chirurgicale nécessaires à la préparation du cerveau avant prélèvement pour analyse histologique, les souris recevront un traitement antalgique avant l'induction de l'anesthésie terminale. Les animaux seront mis mort à 20 semaines avant l’apparition des symptômes les plus sévères du phénotype. Néanmoins, en cas de difficulté d’accès à l’alimentation,de la nourriture gélifiée sera mise à disposition dans la cage.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous avons choisi d'utiliser les souris parce que ces présents des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. Nous prévoyons d'analyser les animaux à deux âges différents : à 5 semaines quand les souris n’ont aucun problème moteur mais avec des dérégulations moléculaires déjà présentes, et à 20 semaines quand les symptômes débutent. La comparaison des souris témoins et des souris mutantes à ces deux moments du développement des symptômes nous fournira des indications intéressantes sur les dérégulations moléculaires dans cette maladie, ainsi que sur les mécanismes impliqués dans la progression de la maladie.
Oestradiol et cachexie chez la souris Apc
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
300 souris Apc, qui développent une cachexie cancéreuse entre onze et quinze semaines, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour la moitié et sévère pour l'autre. Les femelles subissent une ablation des ovaires de quinze minutes, puis l'implantation sous la peau d'une pastille d'œstradiol, un prélèvement de sang et une mesure de force musculaire de trente minutes qui exige une incision de la peau. Le porteur indique que l'ablation des ovaires entraîne à elle seule une perte de poids et de masse musculaire de 2 à 5 %, celle-là même que le protocole cherche à mesurer. Il conclut que "seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en jeu", après avoir écarté tout système in vitro en une phrase.
Objectifs
Le déconditionnement musculaire désigne une perte de masse et de force musculaire qui peuvent être observées dans différentes situations pathologiques (cancer, myopathie, insuffisances cardiaque, rénale ou respiratoire). Dans le cas du cancer, ce déconditionnement musculaire est extrêmement marqué (on parle de cachexie associée au cancer) et constitue un facteur majeur contribuant à la réduction de l'état de santé et de la qualité de vie des patients. Connaitre les mécanismes responsables du déconditionnement musculaire associé au cancer et développer des stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce déconditionnement constituent un des enjeux actuels majeurs de la recherche en cancérologie. Nos données préliminaires obtenues dans un modèle murin de cachexie associée au cancer, la souris Apc, suggèrent l'existence d'un dimorphisme sexuel dans le développement de la cachexie, les souris âgées de 15 semaines ne faisant ni l'experience d'une perte de masse musculaire ni celle d'une perte de force musculaire. Par ailleurs, des données de la littérature indiquent que
Bénéfices attendus
En déterminant le rôle protecteur potentiel des oestrogènes face au développement de la cachexie associée au cancer, ce projet permettra de développer notre compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la cachexie, et de proposer des stratégies d'intervention basés sur l'utilisation de modulateurs de l'activité du récepteur aux estrogènes.
Procédures
Pour déterminer si l'oestradiol exerce un effet protecteur face au déconditionnement musculaire des souris femelles, les souris femelles seront soumises aux interventions suivantes sous anesthésie gazeuse : ovariectomie (durée totale 15 min), implantation sous-cutanée de pastilles contenant de l'oestradiol (durée totale 3 min), prélèvement sanguin (5 min), mesure de force musculaire (30 min). Les prélèvements tissulaires (15 min) sont réalisés sous anesthésie chimique. Pour déterminer si l'oestradiol exerce un effet protecteur face au déconditionnement musculaire des souris mâles, les souris mâles seront soumises aux interventions suivantes: implantation sous-cutanée de pastillescontenant de l'oestradiol (durée totale 3 min), prélèvement sanguin (5 min), mesure de force musculaire (30 min), prélèvements tissulaires (15 min).
Impact sur les animaux
La procédure d'ovariectomie ainsi que l'implantation de la pastille sont réalisées avec administration de brupénorphine pour limiter les suites douloureuses de l'intervention. Une observation des animaux sera réalisée toutes les 2 heures pendant 6H00 après l'ovariectomie, puis toutes les 24H00 afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Le cas échéant une ré-administration de buprénorphine pourra être effectuée. L'ovariectomie est étant elle-même à l'origine d'une légère perte de poids et de masse musculaire (de l'ordre de 2 à 5%), nous serons donc particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une courbe de suivi de masse corporelle sera effectuée en mesurant leur poids tous les 2 à 3 jours. Les mesures de forces musculaires impliquent une approche chirurgicale nécessitant une incision au niveau de la peau. Afin de limiter les souffrances des souris, une anesthésie profonde à l'isofurane sera effectuée depuis le début de l'approche chirurgicale jusqu'à l'injection d'un mélange d'anesthésique et analgésique pour réaliser les prélèvements tissulaires.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort de façon éthique au terme de chaque procédure afin de procéder à des prélèvements tissulaires.
Remplacement
La cachexie associée au cancer est un processus catabolique multifactoriel sollicitant de nombreux tissus, le muscle bien évidement, mais aussi le système neuroendocrinien (axe gonadotrope). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en jeu.
Réduction
Nous avons avons utilisé un teste statistique en ligne afin de déterminer la taille du groupe optimale pour obtenir des résultats ayant une force statistique suffisante robuste. Afin d'anticiper le cas rare où une interruption précoce de la procédure serait nécessaire pour certains animaux, nous prévoyons des lots de 15 animaux par groupe. Ces animaux supplémentaires ne seront inclus qu’en cas de besoin afin d’obtenir au final les 14 animaux par groupe nécessaire à la significativité des résultats. Cette stratégie expérimentale permet le meilleur respect possible de la règle des 3R.
Raffinement
Le bien-être animal est une préoccupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Dans ce projet, nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (paille, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés à 3 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12H00. Les souris auront libres accès à l'eau et à la nourriture. Afin de réduire le stress des animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids). Nous serons aussi particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Les animaux seront scorés sur 3 critères, le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement.
Choix des espèces
Les données dans le domaine de la cachexie associé au cancer ont largement été obtenue chez la souris. Par ailleurs, l'ensemble des techniques nécessaires à la réalisation de ce projet a été développé chez la souris. En travaillant chez la souris, nous pourrons donc interpréter nos données à la lumière des données publiées dans le domaine et nous éviterons toute étape de mise au point préalable qu'aurait nécéssité l'utilisation d'un autre modèle animal. Par ailleurs, la cachexie associée au cancer est un processus multifactoriel systémique mettant en jeu de nombreux tissus (muscle, tissus endocriniens, système nerveux central). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 11 semaines correspondant à un stade précachectique chez les souris mâlesApc. La fin de procédure aura lieu a l'âge de 15 semaines correspondant à une stade cachexie modérée chez les souris mâles Apc. La cachexie sé développent entre l'âge de 11 et 15 semaines, un traitement pendant cette période permettra de vérifier l'efficiacité de l'oestrogénothérapie.
Effet d’une nouvelle molécule satiétogène associée ou non à une molécule de référence sur le poids corporel et la prise alimentaire de souris C57BL6/J nourries avec un régime hyperlipidique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rendues obèses par seize semaines de régime hyperlipidique, 108 souris sont utilisées pour tester une molécule satiétogène, seule ou associée à une molécule de référence, en vue d'un futur essai clinique de phase 1. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, et leur sang, leur foie, leur cœur et leur tissu adipeux sont prélevés. Elles reçoivent une injection sous-cutanée tous les deux jours pendant quatre semaines, sont pesées chaque jour pendant vingt-huit jours, puis passent une IRM de trente à quarante minutes sous anesthésie avant un prélèvement sanguin terminal. Le porteur écrit être "malheureusement contraint" d'utiliser des animaux non-humains, tout en précisant dans la même rubrique que ses collaborateurs américains ont déjà validé l'efficacité de la molécule par une étude pilote in vitro et in vivo.
Objectifs
L'obésité est un problème de santé publique majeur et croissant qui est fréquemment associé à des complications métaboliques telles que le diabète de type 2, l'hypertension, des concentrations de lipides élevées dans le sang et les maladies hépatiques. Le développement de nouvelles molécules susceptibles de réguler la prise alimentaire est actuellement en plein essor. L’objectif de ce projet est de tester l'effet d’une nouvelle molécule pharmaceutique d’intérêt donnée seule ou en combinaison avec une molécule de référence.
Bénéfices attendus
Notre étude, en améliorant la connaissance sur les effets et le mode d’administration de nouvelles molécules satiétogènes nous permettra de préparer la mise en place d’une étude clinique de phase 1 et à terme une meilleure prise en charge des patients obèses.
Procédures
Les souris recevront une injection sous cutanée tous les 2 jours pendant 4 semaines. Les souris seront pesées chaque jour pendant 28 jours. A jour 28, une acquisition d’images d'une durée de 30 à 40 minutes sera réalisée sur animaux anesthésiés pour déterminer le pourcentage corporel en masse grasse et masse maigre. Un prélèvement sanguin terminal sera réalisé sous anesthésie avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
Le protocole est léger, il comporte que des injections sous-cutanées tous les 2 jours, des prises de poids et une analyse non invasive terminale par IRM. Nous n’attendons pas d’effets indésirables majeurs néanmoins une surveillance appuyée des sites d'injections sera réalisée pour s'assurer de la bonne tolérance de la molécule.
Devenir
A l'issu de la procédure tous les animaux seront mis à mort et des organes (sang, foie, coeur, tissu adipeux) seront prélevés.
Remplacement
Le métabolisme énergétique et le développement de l'obésité est un processus physiologique complexe, impliquant l’action combinée d’une multitude d’organes et de diverses voies métaboliques. Il est donc actuellement impossible d’étudier ce paramètre d’une façon intégrale ex vivo ou in vitro et nous sommes malheureusement contraints d’utiliser les modèles animaux. il est à noter que l'efficacité de la molécule a déja été validé par nos collaborateurs américains via une étude pilote réalisée in vitro et in vivo.
Réduction
Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en oeuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Le calcul d’effectif a été défini avec GPower.
Raffinement
Enfin, les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations. Les animaux seront hébergés dans un environnement sain et sans pathogène. Les cages seront enrichies par des frisottis et un dôme en carton.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser de manière intégré les mécanismes de régulation de l'homéostasie énergétique. Nous maitrisons un modèle de souris sauvages rendues obèses par un régime hyperlipidique. Ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de biochimie et/ou de biologie moléculaire qui nous permettront de découvrir de nouveaux déterminants moléculaires. Nous utiliserons des souris agées de 8 semaines au moment de la mise sous régime hyperlipidique et la fin de l'étude sera prévue 16 semaines plus tard. A cet age, les paramètres métaboliques sont stables et ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale.