Souris

Privées de leurs organes génitaux par une chirurgie avec réveil, puis exposées vingt et un jours à des manques d'oxygène répétés huit heures par jour, 288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie subit un infarctus du myocarde provoqué sous anesthésie générale pendant trois heures, une autre un jeûne de six heures suivi d'une injection d'insuline et de six prélèvements de sang à la queue en quatre-vingt-dix minutes. L'objet déclaré est de comprendre comment les hormones sexuelles modifient les effets cardiaques de l'apnée du sommeil. Le porteur indique que le manque d'oxygène provoque dyspnée, perte de poids, stress et baisse d'activité, tout en concluant que les souris "s'adaptent" au bout de trois jours, et il chiffre à 20 % la mortalité attendue pendant l'infarctus.

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil est une des maladies chroniques les plus répandues touchant près d'un milliard de personnes dans le monde, elle peut entrainer des maladies cardiaques. Cette maladie correspond à des apnées répétitives pendant le sommeil, entrainant un manque d’oxygène dans le sang, appelée hypoxie. Cette hypoxie est responsable de nombreux problèmes dans l’organisme dont des complications cardiaques. De plus les hormones sexuelles jouent dans le développement de cette maladie. En effet il y a plus d’hommes que de femmes qui en sont atteints (2 hommes pour 1 femme). Chez les femmes l’apparition de cette maladie augmente après la ménopause et chez les hommes cette maladie entraine une diminution de leurs sécrétions de testostérone. Les connaissances cliniques et fondamentales sur les interactions entre le sexe et le coeur en hypoxie sont très peu connues. Ainsi l’objectif de ce projet est de comprendre précisément le lien entre le sexe, le manque d’oxygène et la dysfonction cardiaque associés,à travers l’ 1) évaluation de l’ infarctus du coeur chez les souris mâles et femelles ne produisant plus hormones sexuelles, exposées à l’hypoxie, 2) évaluation des interactions entre les protéines activées pendant le manque d’oxygène en fonction des hormones sexuelles de la souris. En considérant le rôle des hormones sexuelles dans cette étude, nous aurons une contribution unique permettant de mettre en lumière des aspects qui n’ont pas été évalués dans les modèles précliniques d’une maladie qui se place aux plus hauts rangs des maladies mortelles selon l’Organisation Mondiale de la Santé.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de mieux comprendre le fonctionnement du syndrome d’apnées du sommeil qui est répandu et fortement associé aux maladies cardiovasculaires qui, selon l’Organisation Mondiale de la Santé, se place aux plus hauts rangs des maladies mortelles. En considérant le rôle des hormones sexuelles, nous aurons une contribution unique permettant de mettre en lumière des aspects qui n’ont pas encore été évalués dans les modèles précliniques.

Procédures

Pour répondre à la première partie du projet les souris seront opérés pour retirer leurs organes génitaux, afin de ne plus produire d’hormones sexuelles (15min). Ensuite les souris seront placées en hypoxie ou en normoxie pendant 21 jours. A la fin de leur exposition à l’hypoxie ou à la normoxie, elles subiront une infarctus du cœur sous anesthésie générale (3h). A la fin de cette procédure, sous anesthésie générale et sans réveil, elles seront mises à mort par prélèvement cardiaque. Pour répondre à la deuxième partie du projet, les souris seront opérés pour retirer leurs organes génitaux, afin de ne plus produire d’hormones sexuelles (15 min). Ensuite les souris seront placées en hypoxie ou en normoxie pendant 21 jours. Elles subiront un test de tolérance à l’insuline ou au glucose. Ce test consiste à injecter de l’insuline ou de glucose chez l’animal éveillé et à suivre l’évolution du taux de sucre dans le sang pendant 90 minutes. Les animaux sont mis à jeun 6 heures avant le test, et une 1 goutte de sang est prélevée à la queue à 0, 15, 30, 45, 60 et 90 minutes après l’injection (30 secondes par injection ou prélèvement). A la fin de leur exposition à l’hypoxie ou à la normoxie, elles seront mises à jeun pendant 6 h puis injectées ou non à l’insuline, puis mises à mort par prélèvement de sang sous anesthésie générale (mise à mort au bout de 30 secondes d’anesthésie générale), puis les organes d’intérêt seront prélevés pour réaliser les études mécanistiques associées au projet.

Impact sur les animaux

L’hébergement des souris dans l’animalerie conventionnelle de HP2 entraine une exposition à une nuisance sonore dû au fonctionnement de la machine permettant la mise en place de l’HI. L’ablation des organes génitaux des souris étant une chirurgie avec réveil peut être une source de stress et de douleurs pour l’animal. L’exposition à l’HI induit une dyspnée, une perte de poids, un stress et une diminution de l’activité chez la souris, qui interviennent exclusivement pendant la phase d’hypoxie (8h/j), qui correspond à la phase de sommeil des animaux. Ces atteintes sont transitoires, la perte de poids et la dyspnée sont observées au cours des 3 premiers jours d’exposition, puis les animaux s’adaptent et les courbes de prise de poids sont ensuite parallèles à celles des animaux exposés à la normoxie. Le test de tolérance à l’insuline et au glucose chez l’animal éveillé nécessite une mise à jeun de 6 heures et une injection intrapéritonéale d’insuline, suivie de plusieurs prélèvements sanguins à la queue (1 goutte de sang répété 6 fois) ce qui peut induire un stress à l’animal.

Devenir

A l'issue des procédures, les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements d'organes.

Remplacement

Sur des modèles cellulaires, il est possible d’avoir des modèles d’hypoxie ou d'infarctus. Cependant, ces deux modèles nécessitent le même stimulus (i.e. manque d’oxygène). Donc ils ne peuvent pas être étudiés simultanément sur un modèle in vitro. Pour notre projet nous ne pouvons donc pas « remplacer » ce modèle animal par un autre modèle cellulaire puisqu’il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant de comprendre l’effet de l’hypoxie et de l’infarctus du cœur sur les organes et l’organisme entier. Il s’agit d’une étude du corps animal entier, impliquant des modifications de l’organisme et une communication entre les organes. Il est donc impossible de la remplacer.

Réduction

Suite à des travaux antérieurs, nous avons « réduit » au maximum le nombre d’animaux par groupe pour observer des éventuelles différences significatives. Nous utiliserons un logiciel statistique pour réaliser des tests adaptés aux paramètres à évaluer. Le nombre d’animaux est calculé par connaissance du nombre de données finales nécessaire par technique pour réaliser des tests statistiques adéquats, et observer des différences significatives (p

Raffinement

Un hébergement selon les règles de bien-être animal dans une animalerie adaptée et autorisée, avec eau et nourriture à volonté, et enrichissements à leur disposition dans les cages. Les animaux seront toujours manipulés après une semaine minimum de repos dans l’animalerie. Les animaux s'adaptent rapidement à l'exposition à l'hypoxie. Ils seront observés quotidiennement dans leur cage pendant toute la durée de l’hébergement et du protocole d’hypoxie, pesés au moins une fois par semaine, pour veiller à leur bien-être, à leur état de santé et à l’atteinte des points limites ; les critères d’arrêt et la décision d’exclure un animal d’une procédure sera prise par le responsable du projet. Pour toutes les procédures qui le nécessitent, les animaux seront sous anesthésie générale avec des antalgiques et les animaux ne seront pas réveillés. Une fois endormies, elles seront transférées sur tapis chauffants pour maintenir leur température corporelle leur température. Du lacrygel sera mis sur les yeux des animaux pour empêcher le dessèchement oculaire L’anesthésie sera vérifiée tout au long de la chirurgie (pincement de la patte postérieure ou de la queue). Tous les gestes et soins effectués sur les animaux seront réalisés par des personnes formées et compétentes.

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l’Homme, notamment dans le cadre d’études systémiques, permettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques avant d’entreprendre des études cliniques chez l’humain. Enfin, la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparabilité des études scientifiques. En effet, c’est le modèle de référence dans les publications. Les souris auront 6-14 semaines, ceci correspond à l’âge adulte de l’animal, cela nous permet de minimaliser les variations possibles liées à l’âge de l’animal.

444 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon la procédure, le tamoxifène qui déclenche la maladie cardiaque des souriceaux génétiquement modifiés est donné par la bouche à la mère juste avant la naissance, au risque de provoquer la mise bas ou une fausse route, ou injecté aux petits au deuxième jour. Suivent un tatouage aux doigts, une biopsie de la queue, puis ECG, IRM et stimulation cardiaque sous anesthésie. Le porteur écrit que le projet "devrait" permettre d'identifier des "facteurs de prédisposition" aux arythmies, alors que la stimulation peut provoquer fibrillation ou tachycardie ventriculaire et la mort de certaines souris. Il écarte cellules, organes artificiels et simulation au nom de l'"organisme entier", et le même texte figure sous un second numéro de projet, avec 444 souris également.

Objectifs

La mort subite cardiaque due aux arythmies cardiaques représentent jusqu’à 85 % des cas de mortalité chez des patients atteints d’infarctus ou de maladies cardiaques (cardiomyopathies). Ces arythmies sont souvent déclenchées par des cellules cardiaques spécialisées appelés fibres de Purkinje. Ces fibres forment un réseau de conduction électrique rapide assurant la contraction coordonnée du cœur afin de pomper efficacement le sang. Bien que ces fibres ne représentent qu’une infime partie du cœur (2% de la masse du cœur), plusieurs études suggèrent que des dysfonctionnements au niveau de ces fibres jouent un rôle important dans les arythmies cardiaques et la mort subite chez l’Homme. L’objectif principal de ce projet est d’élucider comment ces dysfonctionnements peuvent provoquer des arythmies cardiaques. Notre hypothèse est que des perturbations de la structure ou de la fonction des fibres de Purkinje dans certaines formes de maladies cardiaques (cardiomyopathies) représentent un facteur de risque élevé de mort subite. Pour cela nous allons étudier la structure et l’activité électrique de fibres de Purkinje des modèles de cardiomyopathies chez la souris. Parmi les modèles de cardiomyopathies, nous travaillerons sur des souris modifiés génétiquement avec une dysfonction des fibres de Purkinje, identifiés chez des patients atteints de malformations cardiaques ou de cardiomyopathies très souvent associées à des arythmies.

Bénéfices attendus

La survenue de mort subite est très souvent liée à une arythmie ventriculaire imprévisible qui dans sa grande majorité provient d’un défaut du réseau de Purkinje. Malheureusement ce réseau ne représente qu’une infime partie du cœur et son étude chez l’Homme est limitée à des mesures invasives et indirectes. L’utilisation de souris transgéniques, chez lesquelles ce réseau est facilement identifiable, est un atout majeur pour comprendre l’origine des arythmies ventriculaires. Ce projet devrait nous permettre d’identifier des facteurs de prédisposition aux arythmies ventriculaires dans plusieurs modèles de cardiomyopathies.

Procédures

Dans la procédure 1, les souris gestantes seront traitées une fois, juste avant la naissance et par voie orale avec du tamoxifène (molécule induisant les cardiomyopathies chez la descendance) (Durée : moins d’un minute). Dans la procédure 2 (6-7 semaines), la descendance aura une injection dans l’abdomen de tamoxifène au 2ème jour après la naissance (durée : Moins d’un minute), une identification par tatouage digital à 10 jours (durée: moins d’un minute), une biopsie de la queue pour le génotypage (identification de la variation génétique) (duré : moins d’un minute). Ces animaux seront sous anesthésie générale pour les analyses de l’activité électrique (ECG, IRM et stimulation cardiaque).

Impact sur les animaux

Les animaux présentant les points limites suivants seront euthanasiés par dislocation cervicale : L’administration par voie orale du tamoxifène peut provoquer un stress à l’animal et provoquer la mise-bas des femelles gestantes. De plus, au moment du traitement par voie orale, le tamoxifène peut également suivre une fausse route. Chez les nouveau-nés, l’injection de tamoxifène peut provoquer un retard de croissance. L’anesthésie générale peut entraîner des difficultés respiratoires se manifestant par des spasmes abdominaux et ne devraient pas engendrer de nuisances ou d’effets indésirables particuliers sur les souris. L’induction d’arythmies ventriculaires par la stimulation cardiaque pourrait entrainer des effets indésirables sévères (fibrillation ventriculaire, tachycardie ventriculaire) et même conduire au décès de certains animaux.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront euthanasié suite à la fin de fertilité ou bien afin d’effectuer des analyses ex vivo.

Remplacement

Pour le moment, les études sur cellules, organes artificielles ou par modélisation informatique ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de la structure et fonction complexe des fibres de Purkinje. Cependant, les résultats obtenus pourront enrichir de futurs modèles mathématiques des fibres pour la réalisation de simulation virtuelle de la fonction cardiaque et des arythmies.

Réduction

Les animaux subiront le maximum de procédures possibles (sous anesthésie générale) afin d’obtenir le maximum de données sur un minimum de d’animaux. Dès que les résultats auront une puissance statistique minimale pour être exploités, la production de souris sera arrêtée.

Raffinement

Les mesures de raffinement sont mises en place à toutes les étapes du projet, notamment au cours de l’hébergement (cage collective, litière et enrichissement adaptés) et seront manipulés par des personnes compétentes et formées. L’état des animaux sera contrôlé quotidiennement afin d’éviter toute souffrance. Les animaux seront anesthésiés quand nécessaire et des points limites sont déterminés afin d’utiliser une méthode analgésique ou bien d’interrompre le protocole en cas d’apparition de signes de détresse.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : -animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner -modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), -6 à 15 souriceaux par portée -modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en termes de manipulation génétique. Les stades de développement utilisés dans ce projet sont les suivants : -Souris adultes : des souris génitrices qui permettront le maintien de la lignée de souris transgéniques (à partir 6-8 semaines jusqu’à 24 semaines) et la descendance à partir du 3ème jour jusqu’à 6 semaines.

Une injection sous la peau tous les deux à trois jours pendant huit semaines, trois mesures de tumeur par semaine, jusqu'à quatre prélèvements sanguins : 85 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit dans le flanc des cellules cancéreuses humaines, laisse croître une tumeur sous la peau, puis reçoit dans la veine de la queue des cellules immunitaires modifiées censées la détruire. La mise à mort sert à prélever le sang et la tumeur. Le porteur retient des souris NSG, incapables de combattre la moindre infection et maintenues en milieu protégé pour cette raison, et affirme qu'"aucune alternative non-animale n'est aujourd'hui disponible".

Objectifs

Les immunothérapies, stratégies privilégiées contre le cancer, visent à stimuler le système immunitaire du patient pour éliminer les cellules cancéreuses. Il est possible de récupérer et modifier les cellules immunitaires du patient, afin qu’elles reconnaissent les cellules cancéreuses, avant de les réinjecter au patient, avec une efficacité clinique démontrée. Nous avons généré des cellules immunitaires capables de reconnaître un sous-type de cancer du sein très agressif et d’autres cancers agressifs et capables d’éliminer des cellules cancéreuses in vitro. Cependant, il est nécessaire de vérifier le potentiel thérapeutique in vivo. Dans ce projet, nous utiliserons des souris permettant l’étude de la croissance des tumeurs en présence des cellules immunitaires spécifiques de la tumeur, avec pour objectif de valider la capacité de ces cellules immunitaires à éliminer les cellules tumorales in vivo. Différents traitements de soutien aux cellules immunitaires injectées seront administrés permettront de sélectionner la condition expérimentale la plus efficace.

Bénéfices attendus

En cas de résultats positifs, cette étude permettra de valider une nouvelle opportunité thérapeutique pour les patients atteints de cancer, du sein, de l’ovaire ou de sarcome. Ceci accélèrera la validation préclinique de cet outil thérapeutique afin d’entamer le transfert vers la clinique.

Procédures

Pour réaliser l'injection sous-cutanée de cellules cancéreuses humaines, la souris est maintenue environ 15 secondes. Une seule injection est effectuée par animal. A la suite de cette injection, la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine, l’animal est maintenu immobile environ 25 secondes. L’injection intraveineuse, se fera au niveau de la veine de la queue (1 min d’immobilisation). Injection sous cutanée de molécules de soutien des cellules lymphocytes ou sérum physiologique : tous les 2 à 3 jours pendant 8 semaines maximum (d'après ce qui est décrit en moyenne dans la littérature). Des prélèvements sanguins seront également réalisés sur animaux vigiles, l’animal est maintenu immobile environ 50 secondes (15 secondes pour l’application de l’anesthésique puis 45 secondes pour le prélèvement). Ces prélèvements seront réalisés 3 ou 4 fois en fonction des groupes. Les souris seront également pesées deux fois par semaine, la souris est maintenue environ 15 secondes.

Impact sur les animaux

Les cellules tumorales seront injectées en sous-cutané dans le flanc droit de la souris, sur animal vigile. Pour cela l’animal est tenu en contention. Le volume injecté est faibl. Une seule injection est réalisée par animal, d’une durée d’environ 15 secondes. Suite à cette injection la souris développera une tumeur. La croissance tumorale sera suivie par mesure au pied à coulisse (3x/sem, 15 sec) sur animal vigile. Le traitement consiste en une injection intraveineuse de cellules immunitaires modifiées. A ce jour, aucun effet indésirable associé au transfert de cellules immunitaires modifiées chez la souris n’a été rapporté dans la littérature. Nous n’envisageons donc pas d’effets indésirables liés à ce traitement. De même aucun effet indésirable n’a été reporté dans la littérature concernant l’injection en sous-cutanée de protéines solubles. Néanmoins, les animaux peuvent ressentir un désagrément voire une douleur modérée au moment des prélèvements sanguins qui est minorée par l’utilisation d’une anesthésie locale

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir analyser la composition du système immunitaire dans le sang et au sein de la tumeur.

Remplacement

Des expériences in vitro ont déjà été réalisées afin de confirmer la fonctionnalité des cellules immunitaires générées et leur capacité à éliminer des cellules tumorales. Les animaux sévèrement immunodéprimés (NSG) correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité des thérapies cellulaires puisqu’ils permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires murines. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible pour s’assurer de la fonctionnalité des cellules immunitaires génétiquement modifiées in vivo, ce qui est un des objectifs de cette étude.

Réduction

Cette procédure devrait nous permettre de sélectionner la condition expérimentale permettant d’observer le meilleur effet de notre traitement. Cette condition sera utilisée par la suite pour évaluer d’autres candidats de thérapie cellulaire. Nous avons utilisé un outil statistique (G-power) permettant de définir le nombre minimal d’animaux nécessaires et suffisants pour satisfaire la validité scientifique de l’étude. Par ailleurs, un nombre optimal d’échantillons et de données seront collectés pour chaque animal pour utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire pour répondre à l’ensemble des questions de l’étude.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet n’ont pas de système immunitaire, ils sont donc incapables de lutter contre des infections virales ou bactériennes. Ils doivent être hébergés dans un environnement protégé pour éviter toutes contaminations. Les analyses de croissance des tumeurs sont non-invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requièrent pas d'injection d'anesthésiant ou d'antalgique. L'effet des composés sur l'état physiologique des souris est suivi par l’observation quotidienne des animaux par des personnes compétentes, par la pesée des animaux et la mesure du développement tumoral. Des points limites adaptés sont définis de manière objective, incluant des critères d'arrêt de l'expérience en cas de souffrance. Aucun effet indésirable lié à l’injection des cellules immunitaires humaines dans le modèle de souris utilisé n’est attendu. Les prélèvements sanguins peuvent entrainer une douleur, pour pallier cela les animaux sont traités par un anesthésique local quelques min avant les prélèvements.

Choix des espèces

Les souris utilisées correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité des thérapies cellulaires utilisant des cellules immunitaires puisqu’elles permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires de souris. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible pour s’assurer de la fonctionnalité des cellules immunitaires transférées in vivo, ce qui est l’objectif de cette étude. Les animaux utilisés seront à l’âge de 6-8 semaines afin de pouvoir réaliser les greffes sous-cutanées et l’injection en intraveineuse des cellules immunitaires dans des conditions optimales.

1 260 souris vont être utilisées, chacune subissant au moins une chirurgie intracérébrale d'une heure, répétée pour certaines, puis jusqu'à huit tests comportementaux, tendance à la rotation, capacité motrice, anxiété, agilité, mémoire spatiale, coordination, force de saisie et force neuromusculaire. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour collecter leur cerveau. Le porteur reconnaît qu'un très faible pourcentage ne se réveillera pas après la chirurgie et que la multiplicité des tests provoque stress et fatigue. Sur le remplacement, il écrit que ces expériences ne peuvent être reproduites in vitro parce qu'elles dépendent d'un modèle murin de la maladie de Parkinson, argument qui prend le recours à la souris pour sa propre justification.

Objectifs

La maladie de Parkinson est caractérisée par une dégénérescence progressive de certains neurones cérébraux. Ce projet vise à évaluer l'impact de cette dégénérescence sur l'expression des gènes, les marques épigénétiques (modifications de l’ADN non génétique), et le statut de maturation des neurones impliqués. Nous utiliserons un modèle de souris pour la maladie de Parkinson qui induit la perte de neurones et des déficits moteurs. Les objectifs majeurs du projet sont d’analyser les changements moléculaires et physiologiques dans certains neurones suite aux lésions, de comparer les changements dû au sexe, et d'identifier des cibles thérapeutiques modifiables afin de restaurer une activité normale. Ce projet impliquera 1260 animaux et ne peux pas être remplacé par d’autres modèles. Plusieurs analyses seront effectuées sur chaque animale afin de réduire leur nombre, et des mesures spécifiques assureront le minimum de nuisances sur le bien-être des animaux. Ce projet permettra de mieux comprendre la maladie de Parkinson et d’ouvrir de nouvelles perspectives pour son traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet analysera les changements moléculaires et physiologiques dans les interneurones du cortex moteur primaire de la souris adulte en réponse d’une synucléinopathie dans la substantia nigra comme modèle de la maladie de Parkinson. Ce projet permettra d'identifier des cibles thérapeutiques modifiables dans ces interneurones pour restaurer une activité normale de neurones moteurs, et d’identifier les différences dû au sexe. Ce projet permettra de mieux comprendre la maladie de Parkinson et d’ouvrir de nouvelles perspectives pour le traitement de cette maladie.

Procédures

Une injection intracérébrale sera effectuée sur des animaux anesthésiés ; cette procédure chirurgicale dure environ 1 heure et sera effectuée au moins une fois sur tous les animaux, et deux fois sur certains animaux. Les animaux seront soumis 2 fois au test de tendance à la rotation qui durent 10 minutes. Les animaux seront soumis 2 fois à un test de capacité motrice qui durent 3 minutes par jour sur 5 jour. Certains animaux seront soumis à un seul test qui évalue le niveau d'anxiété et dure 30 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test d'agilité qui dure 2 minutes par jour sur 5 jour. Certains animaux seront soumis à un seul test de mémoire spatiale qui dure 30 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test de coordination motrice qui dure 5 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test de force de saisie qui dure 3 fois 1 minute. Certains animaux seront soumis à un seul test de force neuromusculaire qui dure 3 fois 1 minute.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, il est possible que les animaux soient stressés après réveil, sujets à des fluctuations de poids ainsi que de la douleur locale. Comme pour toute chirurgie, il se peut qu’un très faible % de souris ne se réveille pas après la chirurgie. Les tests de comportement et leur multiplicité peuvent provoquer du stress et de la fatigue chez les animaux.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort et leurs cerveaux sont collectés pour plusieurs analyses.

Remplacement

Nos recherches sur les effets de la dégénérescence des neurones dopaminergiques nécessitent des souris pour comprendre comment cela impact les circuits cérébraux impliquants notamment les interneurones du cortex moteur. Nous utilisons la souris comme modèle pour s'appuyer sur les résultats de recherches antérieures. Ces expériences ne peuvent être reproduites in vitro car elles dépendent d’un modèle murin de la maladie de Parkinson.

Réduction

Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections cérébrales suivies de plusieurs analyses comportementales nous ont permis de définir le nombre d’animaux par condition expérimentale afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante. Nous effectuerons plusieurs analyses sur chaque souris, ce qui nous permettra de réduire davantage le nombre d'animaux.

Raffinement

Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, associée à un traitement analgésique. Après la chirurgie, les animaux sont transférés dans une cage chauffée avec un tapis chauffant jusqu'à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leur groupe d'origine, pour éviter le stress de l'isolement, et sont observés et pesés quotidiennement pendant 2 jours avec alimentation plus riche. Pour évaluer les points limites, les animaux seront inspectés quotidiennement afin de détecter les signes d'infection et de douleur (changement de posture, de pelage, d'expression faciale), et des mesures de poids seront prises au moins deux fois par semaine. En cas d'infection ou de signes de douleur, les animaux recevront un traitement approprié. En cas de perte de poids, les animaux seront placés dans des cages chauffées et recevront une alimentation enrichie.

Choix des espèces

La génétique de la souris est très bien connue et proche de celle de l'homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour l'étude de la maladie de Parkinson. C'est un animal avec lequel nous avons l'habitude de travailler et pour lequel nous avons une bonne expertise pour réduire les conditions de stress, d'inconfort et de douleur. Il nous permet également de créer des modèles pour l'étude des pathologies humaines. Ce projet implique un modèle de la maladie de Parkinson qui nécessite des souris adultes. La pathologie sera initiée chez des souris âgées de 60 jours, considérées comme de jeunes adultes. Des analyses comportementales, histologiques et moléculaires seront effectuées entre 3 et 9 mois plus tard pour permettre à la pathologie de se développer.

Greffées d'une tumeur en sous-cutané, 2 500 souris passent des séances de radiothérapie de cinq à cinquante minutes sous anesthésie gazeuse, et reçoivent des médicaments par gavage, en intrapéritonéal, en intraveineux ou en sous-cutané, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit qu'aucun effet secondaire dû à la radiothérapie n'est attendu et qu'aucun analgésique ne sera donc employé, tout en prévoyant la mise à mort par dislocation cervicale des animaux prostrés, désorientés, amaigris ou présentant une nécrose au point d'injection. L'équipe dispose d'un appareil rare en France et traite à ce titre les souris de collaborateurs et de sociétés privées qui font appel à ses services. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur indiquant qu'ayant reçu un traitement et des cellules cancéreuses elles ne peuvent servir à une autre étude.

Objectifs

L’objectif des projets nécessitant de la radiothérapie préclinique est de développer l’association de la radiothérapie avec d’autres traitements anticancéreux de types chimiothérapie, thérapie ciblée, nano médicaments ou encore immunothérapie dans le but d’améliorer l’efficacité. Ces projets nécessitent d’optimiser les schémas d’association (traitement administrés en même temps ou en décalée et dans ce cas déterminer le laps de temps optimal entre l’administration du médicament et la radiothérapie) et les fractionnements (dose et nombre de séances) optimums de la radiothérapie afin de pouvoir proposer en essai clinique les combinaisons de traitements les plus efficaces. Notre équipe possède un appareil de radiothérapie tridimentionnelle guidée par l’image permettant de délivrer des traitements par radiothérapie similaires à ceux délivrés pour les patients. Ce type d’installation et de savoir-faire restent rares sur notre territoire Français et unique dans un rayon de 300km autour de notre site géographique. C’est pourquoi des collaborateurs ou sociétés privées, évaluant des combinaisons à base de radiothérapie, font appel à nos services pour délivrer des traitements de radiothérapie sur leur souris. Ce projet a été évalué et validé par le comité scientifique de notre établissement.

Bénéfices attendus

En cancérologie, les enjeux actuels sont d’améliorer l’efficacité des traitements en optimisant des combinaisons innovantes, en utilisant des médicaments de divers types et en déterminant les meilleurs schémas de combinaisons (administré en même temps ou en décalé, doses totales de Radiothérapie et le nombre de séance de radiothérapie…). Les études que nous mènerons dans le cadre de ce projet nous permettront de sélectionner les schémas de combinaisons les plus prometteurs en terme d’efficacité sans induire de toxicités chez les petits rongeurs. Ceux-ci pourront être sélectionnés pour le développement d’essais cliniques. Les autres candidats, moins prometteurs, seront écartés et ne seront pas utilisés dans de futures études.

Procédures

- Développement des tumeurs : Injection sous cutanée de la tumeur (une seule fois). Le développement de la tumeur prend environ 10 jours à partir de la date d'injection. -Les médicaments (chimiothérapie, immunothérapie, thérapie ciblée ou nanoparticules) seront administrés: par voie orale (utilisation d’une canule spécifique permettant l’administration du médicament directement dans l’estomac) ou en intrapéritonéale (injection) sur des animaux non anesthésié ; ou en intraveineuse ou sous cutanée sur des animaux sous anesthésie gazeuse (Isoflurane 2%)- Les animaux seront traités par Radiothérapie sous anesthésie gazeuse (Isoflurane 2%). Ces séances pourront durer entre 5 minutes et 50 minutes selon la technique utilisée. - Des animaux pourront avoir une imagerie IRM sous anesthésie gazeuse - Des prélèvements de sang pourront être réalisés (au niveau maxillaire) sous anesthésie gazeuse (volume maximum prélevé et fréquence selon les recommandations de l’annexe 1). - Après euthanasie des prélèvements d’organes/tumeurs pourront être réalisés.

Impact sur les animaux

Aucun effet secondaire ou nuisance dû à la Radiothérapie n’est attendu. Concernant les médicaments qui seront combinés à la radiothérapie, nous utiliserons des doses n’ayant pas induits de toxicités dans des études précédentes in vivo ou études préliminaires (in vitro, par essais de cytotoxicité). Cependant, une attention particulière sera donnée sur une potentielle apparition de nécrose au niveau du site d’injection en intraveineux ou en sous cutanée des molécules associées.

Devenir

Etant donné que les animaux auront reçu un traitement et une injection de cellules cancéreuses, ils ne pourront être utiliser pour une autre étude. Ainsi, tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’étude de l’efficacité des médicaments, utilisés en combinaison avec de la radiothérapie, ne peut se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes et donc d’étude sur animaux. De plus, pour l’étude d’association avec des médicaments modulant le système immunitaire (immunothérapies) nous sommes dans l’obligation de travailler avec des animaux immunocompétents. Enfin, il est largement décrit dans la littérature que l’effet de la radiothérapie dépend du niveau d’oxygénation de la tumeur (hétérogène uniquement en clinique et sur le modèle animal) et du microenvironnement tumoral qui est l’ensemble des cellules constituant la tumeur (cellules cancéreuses, cellules des vaisseaux sanguins, cellules immunitaires…). Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour ces études. Toutefois des études préalables des molécules d’intérêts sur culture cellulaire permettront de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT).

Réduction

Pour l’évaluation de l’efficacité d’une combinaison (un médicament et une radiothérapie), il sera nécessaire de traiter 4 groupes d’animaux (contrôle-véhicule ; médicament évalué (chimiothérapie, thérapie ciblée, immunothérapie, nanoparticule…) ; radiothérapie seule ; combinaison médicament +radiothérapie. Nous prévoyons d’évaluer ces efficacités avec 8 animaux par groupe pour les modèles de tumeurs d’origine humaine qui seront greffées sur des souris immunodéficiences et 10 animaux par groupes pour les modèles de tumeurs d’origines murines qui seront greffées à des souris immunocompétentes. Ces effectifs tiennent compte de notre expérience sur la variabilité observée pour ces différents modèles de cancers et permettent de pouvoir conclure à une potentielle supériorité des combinaisons en utilisant des tests statistiques validés.

Raffinement

Les séances de radiothérapie seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de maintenir les animaux immobile et de réduire leur niveau de stress. Après une séance de radiothérapie, les animaux sont réveillés sous lampe chauffante pour prévenir toute hypothermie puis replacés dans leur cage. La douleur associée à cette procédure ne nécessitera donc pas l’emploi d’analgésique. Aucune toxicité n’est attendue suite à la radiothérapie délivrée et les doses utilisées des médicaments associées seront celles utilisées usuellement en préclinique, n’ayant pas induit de toxicité dans des études précédentes réalisée sur souris, ou dans des études vitro (sur des cellules en culture) de cytotoxicités. Cependant, si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids …), ou si une nécrose est observées au niveau du site d’injection des médicaments, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse. Durant leur hébergement, les souris seront maintenues dans des cages ayant une surface adaptée pour accueillir 8 à 10 individus. L’hébergement individuel sera proscrit. L’eau et la nourriture seront données à volonté. Au minimum une sorte d’enrichissement sera mis dans chaque cage permettant la formation de nids.

Choix des espèces

Le modèle de souris est parfaitement approprié car les expérimentations sur culture cellulaire ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organisme complet, notamment dans les études impliquant l’activation du système immunitaire. En oncologie, la plupart des modèles expérimentaux de cancers humains sont développés chez la souris. Dans le cas d’étude avec de l’immunothérapie, la souris porteuse de tumeurs d’origine de souris reste le modèle de choix dans les études de l’activation du système immunitaire anti-tumoral. La formation de tumeurs dans des souris homogènes (même type de souris) permet de travailler avec un nombre d’animaux relativement réduit et de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Pour ce projet nous prévoyons de traiter 2500 souris porteuses de tumeurs pour une durée de 5 ans (500 souris par an). Les animaux seront utilisés à un âge minimum de 8 semaines de manière à avoir un système immunitaire mature pour les souris immunocompétentes et un poids corporel d’au moins 18-20 g afin d’avoir une pharmacocinétique des médicaments homogène.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une injection sous-cutanée de PACAP-38 pour déclencher une migraine, puis subit des tests de sensibilité de la face et des pattes toutes les trente minutes pendant quatre heures, avec des filaments de Von Frey et des jets d'air. Le porteur indique que le retrait de la face ou de la patte signe une douleur modérée, et souligne que l'animal, libre de ses mouvements, peut échapper à la stimulation. Les bénéfices annoncés, comprendre les différences entre mâles et femelles puis développer des molécules pour les patients qui ne répondent pas aux traitements actuels, sont renvoyés au moyen et au long terme, l'objectif immédiat étant de mettre au point le modèle de migraine lui-même.

Objectifs

L’objectif du projet est de développer un nouveau modèle de migraine en se basant sur les derniers résultats scientifiques et la clinique. Le PACAP, est une molécule qui est libérée lors des crises de migraine par les fibres nerveuses au niveau des méninges. Ainsi pour être au plus proche de la réalité clinique, nous souhaitons utiliser le PACAP pour provoquer l’activation des circuits de la douleur impliqués dans la migraine chez la souris. Pendant la phase « mal de tête », la douleur ne peut être générée qu’au niveau des méninges puisqu’il n’existe pas de récepteurs à la douleur dans le cerveau. Nous évaluerons les effets de cette molécule au niveau du comportement, mais également en utilisant des marqueurs d’activation neuronale, tels que Fos et pERK chez le mâle et la femelle. Nous souhaitons comparer d’une part l’activation des régions du système nerveux central chez les mâles et les femelles pour voir s’il y a des différences entre les mâles et les femelles, mais aussi en fonction des variations hormonales qui ont lieu pendant le cycle sexuel chez la femelle.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet nous permettra de développer un modèle animal plus proche de la clinique et des dernières études scientifiques. les mécanismes d’intégration de la douleur méningée au niveau du système nerveux périphérique et central chez les mâles et les femelles. En effet la migraine touche plus les femmes que les hommes, mais les études ont été majoritairement réalisées chez les mâles. Pourtant, il est connu qu’il existe des différences d’intégration inhérentes au sexe et au cycle hormonal. Ainsi à moyen terme, identifier les différences ainsi que le rôle des différentes régions cérébrales dans ce nouveau modèle murin de migraine nous permettra de mieux comprendre cette pathologie. A long terme, il serait intéressant de comprendre comment des molécules telles que le PACAP peuvent induire des migraines. Ceci permettrait de développer de nouvelles molécules pour offrir des alternatives aux patients qui ne répondent pas aux traitements proposés actuellement comme les triptans ou les anti-CGRP.

Procédures

Mesure de la sensibilité cutanée céphalique et extra-céphalique : les jours d’injection pendant 4h toutes les 30 minutes ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal et par l’envoi d’un jet d’air après l'injection des molécules en sous cutané (chaque application dure 3 secondes). Les jours entre les injections, la mesure se fait une fois.

Impact sur les animaux

Nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée de l’animal. Cette douleur est ressentie après les injections, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Enfin, les stimulations mécaniques avec les filaments de Von Frey ou les jets d’air avec l’AirPuff induisent un retrait de la face ou de la patte signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention. Cette stimulation dure au maximum 3 secondes.

Devenir

La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, elle se termine par des études immunohistochimiques qui nécessitent de prélever le cerveau ainsi que d'autres organes pouvant servir à d'autres études : les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément. Il est donc nécessaire de réaliser les observations chez l’animal in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Huit animaux par groupe est le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre eux. Par ailleurs pour rendre compte des mécanismes sans doute différents chez l'homme et la femme (hormones différentes), nous avons besoin de réaliser l'étude à la fois chez les mâles et les femelles. Une fois les animaux mis à mort, un maximum d'organes sera prélevé et stocké afin d'être utilisés pour ce projet ou pour d'autres études. Cela évitera de mettre à mort de nouveaux animaux pour ces autres études.

Raffinement

La nuisance identifiée sur le bien-être des animaux est la douleur engendrée dans le cadre du modèle. Concernant la douleur générée par l’application des stimulations mécaniques (à l'aide de filaments en plastique), nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum et l’animal a toujours la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Les stimulations mécaniques ne dépassent pas les point limite fixés. Pour améliorer le bien-être des animaux, les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher ainsi que de papier de nidification, élément important pour la souris. La mise à mort est réalisée par une overdose de ketamine /xylazine.

Choix des espèces

La souche C57BL6 est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Le choix de développer ce modèle chez la souris permettra d'utiliser des animaux génétiquement modifiés pour des cibles impliqués dans la migraine, ce qui est difficilement réalisable chez le rat. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature : les souris sont considérées comme adultes.

Soumises à une chirurgie crânienne de trois heures, 380 souris subissent ensuite des séances d'isolement pouvant atteindre quarante-huit heures et une privation de sommeil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour prélever leur tissu cérébral. Les tests portent sur le déplacement et le remplacement d'objets, dix minutes par séance avec trois heures d'isolement avant et après l'acquisition, et cherchent à savoir si la stimulation d'une petite structure, le Claustrum, restaure la consolidation des souvenirs chez des souris génétiquement modifiées modélisant la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique que des groupes de vingt animaux sont nécessaires pour en amener douze au bout du protocole, l'expression du virus et le placement de la fibre à 50 micromètres près échouant sur les autres.

Objectifs

Le Claustrum est une petite structure télencéphalique ayant la caractéristique de projeter à l’ensemble du cortex cérébral. Outre son rôle supposé dans la conscience, il est associé à diverses fonctions physiologiques, allant de la régulation du cycle veille-sommeil à la modulation des processus attentionnels. De manière intéressante, des études récentes suggèrent un rôle central du Claustrum dans les mécanismes de consolidation mnésique, i.e. le processus permettant le stockage à long terme des informations mnésiques nouvellement acquises. Cette perspective revêt une importance particulière étant donné que ces processus de consolidation sont altérés précocement dans la maladie d'Alzheimer, une pathologie caractérisée, entre autres, par des déficits mnésiques. Des données préliminaires sur un modèle murin pré-clinique de la maladie d'Alzheimer (génétiquement modifiée) ont révélé une altération précoce de l'activité claustrale. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre le fonctionnement du Claustrum en condition normale et pathologique, avec un accent particulier sur son rôle potentiel dans la modulation des processus de consolidation mnésique. Une approche novatrice consistera à restaurer une activité claustrale physiologique dans le but de récupérer un phénotype comportemental sain chez des souris génétiquement modifiées modélisant la phase pré-clinique de la maladie d'Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra donc de 1) caractériser pour la première fois l’activité physiologique du Claustrum au cours du cycle veille-sommeil et en fonction des différents états de vigilance ; 2) de déterminer par quels mécanismes le Claustrum sous-tend la consolidation mnésique et 3) de déterminer si la stimulation spécifique de ce noyau mimant son fonctionnement physiologique permet de restaurer une consolidation mnésique normale chez un modèle préclinique de la maladie d’Alzheimer. Cette étude permettra de mieux comprendre le réseau cérébral impliqué dans le processus de consolidation mnésique, tout en ouvrant de nouvelles perspectives pour restaurer cette consolidation dans le contexte pathologique de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Lors de la procédure 1, Les animaux seront soumis à une chirurgie (3h). Ils seront isolés le temps d’expériences de déplacement d’objet ainsi que de remplacement d’objet avec des jours d’habituation, d’acquisition et de test (10 minutes par séance). Ils seront également isolés pour des durées plus longues lors de l’aquisition (3h avant et après les 10 minutes) ainsi que lors de la privation de sommeil

Impact sur les animaux

La chirurgie peut induire de la douleur et une altération de l’état de santé des animaux. Un isolement de maximum 48h sera nécessaire après la chirurgie ainsi que pour l’expérience d’enregistrement de l’activité Claustrale en fonction des états de vigilance durant un nycthémère complet (procédure 1). Cet isolement pourra provoquer un stress. Les souris des groupes d’activation ou d’inhibition pharmacologique du claustrum et leur contrôle devront subir une contention avant l’injection en intra-péritonéal de l’agent pharmacologique ou véhicule. La contention ainsi que l’injection peuvent causer un état de stress chez l’animal.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever le tissu cérébral fixé

Remplacement

Notre projet vise à étudier le rôle du Claustrum dans la consolidation de la mémoire et ses possibles altérations chez un modèle murin de la maladie d’Alzheimer. A l'heure actuelle, ce projet ne peut ni être réalisé à l’aide de modèles cellulaires, ni être simulé par des techniques informatiques. En effet, la mémoire repose sur la présence d’interactions fonctionnelles dynamiques entre structures cérébrales et nécessite donc de travailler chez l’animal.

Réduction

Les calculs de puissance sont pris en compte dans la détermination du nombre d'animaux requis pour les expérimentations. Les expériences d’imagerie calciques associées à l’approche pharmacologique et celles d’optogénétique sont dépendantes : 1) de la bonne expression des virus et 2) d’une localisation exacte (à 50µm) de la fibre. Les expériences précédentes réalisées chez nos collaborateurs montrent que des groupes de 20 animaux sont nécessaires pour arriver à 12 animaux effectuant l’entièreté du protocole et pouvoir détecter des différences inter-groupes de l'ordre de 15-20%. Des tests statistiques paramétriques sont effectués.

Raffinement

La chirurgie sera opérée sous anesthésie gazeuse supplémentée par une couverture analgésique locale par injection sous-cutanée au niveau de la zone d’incision chirurgicale. Une pommade d’anesthésique local limitera les douleurs aux oreilles dues aux barres d’oreilles, l’ajout de pommade à base de vitamine A limitera le dessèchement oculaire. Pendant la chirurgie une injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroïdien assurera l’analgésie et il sera ajouté au biberon pendant 1 à 3 jours pour assurer l’analgésie post-opératoire. Enfin, la température corporelle sera maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté. La lutte contre l’hypothermie se poursuit jusqu’au réveil complet de l’animal en plaçant sa cage sous une lampe chauffante. Elle sera suivie d’un isolement de 48 heures maximum afin de ne pas provoquer de changement dans la hiérarchie dans la cage, en laissant le temps à la souris de bien se remettre de la chirurgie. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience par du personnel formé, plus particulièrement avec une observation détaillée la semaine suivant la chirurgie. En amont des expériences, les animaux seront familiarisés à la manipulation par l’expérimentateur afin de diminuer le stress. Ils seront également habitués à l’utilisation d’une boite (plutôt qu’un tunnel qui abimerait le dispositif électrophysiologique) pour le transport de l’animal depuis sa cage d’hébergement au dispositif expérimental et vice-versa. Un isolement temporaire sera nécessaire mais ne dépassera pas 12h pour réaliser les tâches comportementales et la privation de sommeil.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie est la souris. La question posée requiert un modèle animal possédant une structure neuroanatomique comparable à celle du cerveau humain. En particulier l’hippocampe, le cortex frontal sont des cibles majeures du Claustrum et sont affectées dans la maladie d’Alzheimer. Ces structures anatomiques sont conservéeschez la souris, mais pas chez des organismes plus simples tels que C. Elegans, drosophile ou poisson zèbre. Le modèle génétiquement modifié de la maladie d’Alzheimer (disponible au laboratoire) constitue un modèle de référence pour étudier l’impact de la pathologie amyloïde sur la dynamique cérébrale. L'ensemble des souris sera utilisé à un stade de développement correspondant à de "jeunes adultes". Les procédures débuteront entre 8 et 10 semaines. En effet, à cet âge, le système nerveux central est complètement développé (les interneurones hippocampiques sont matures à l’âge d’1 mois), et les souris présentent d’excellentes performances de mémoire spatiale.

Fortement immunodéprimées pour ne pas rejeter les tumeurs ovariennes humaines greffées sous la peau de leur flanc, 636 souris de cinq à six semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit trois injections intraveineuses d'anticorps conjugués dans la veine de la queue, et subit jusqu'à vingt-quatre pesées et vingt-quatre mesures de tumeur au pied à coulisse. Le porteur reconnaît que la croissance de la tumeur peut gêner la locomotion et que la contention pour ces mesures génère du stress et une douleur possible au niveau de la tumeur. Toutes sont tuées en fin de procédure pour prélever les tumeurs, l'effectif comptant 10 % d'animaux greffés en plus pour compenser les prises de greffe manquées.

Objectifs

Le cancer de l’ovaire est la 9ème cause de cancer chez la femme, le nombre de nouveaux cas diagnostiqués en 2020 en France est estimé à 5320, avec 200 000 nouveaux cas dans le monde entier. Cela en fait, en France, la 5ème cause de mortalité par cancer (CIRC, 2021). Le cancer de l’ovaire peut être asymptomatique pendant longtemps, c’est pourquoi il est malheureusement souvent diagnostiqué à un stade avancé, et le taux de survie des patientes n’est alors que de 17% à 5 ans. Malgré une efficacité initiale élevée, les types les plus courants de carcinomes ovariens rechutent fréquemment en formes résistantes aux chimiothérapies. Les anticorps conjugués à des drogues font partie d’une nouvelle classe de thérapie ciblée. Ils consistent à fixer la chimiothérapie sur un anticorps dirigé contre un récepteur exprimé à la surface des cellules cancéreuses pour la véhiculer au cœur de la tumeur. Ce projet vise à tester l’efficacité anti-cancéreuse de 9 anticorps conjugués dans 4 modèles de cancer de l’ovaire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra par la suite que la stratégie de traitement par les anticorps conjugués soit testée en clinique. En cas de succès, ce serait une réelle avancée en termes de prise en charge des patients atteints de cancer de l’ovaire. Les données issues de ce travail seront totalement innovantes puisqu’elles porteront sur des composés qui n’ont jusqu’à présent jamais été évalués dans une étude d’efficacité pré-clinique dans le contexte du cancer de l’ovaire, et qui contribueront potentiellement à un meilleur pronostic et survie chez les patients atteints de cette affection.

Procédures

- une injection sous cutanée au niveau du flanc gauche, 30 secondes maximum - 3 injections intraveineuses d’anticorps conjugués à raison d’un par semaine dans la veine de la queue, 30 secondes. Au maximum 24 pesées et 24 mesures de la taille de la tumeur (1 min) à raison de 3 par semaine.

Impact sur les animaux

Une perte de poids peut être envisagée (cumul de la pousse tumorale et des traitements). L’injection de cellules en sous cutané entrainant une croissance de tumeur peut entrainer une gêne à la locomotion. Les injections en intra-veineuse hebdomadaires vont entrainer du stress (contention) et une douleur à l’injection. Le suivi tumoral au pied à coulisse sera réalisé sur les animaux en contention et donc générera du stress et éventuellement une douleur au niveau de la tumeur. Le traitement avec chacun des anticorps conjugués n’a pas montré jusqu’à présent d’effets indésirables chez la souris aux doses choisies.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement des tumeurs et analyses.

Remplacement

Des tests in vitro ont été effectués au préalable et ont permis d’affiner le design de l’étude en identifiant les anticorps les plus prometteurs pour cette indication mais les interactions avec la tumeur sont complexes et impactées par différents paramètres (structure cellulaire, rigidité). Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans la tumeur et au sein de l’organisme nécessitent de travailler sur un organisme entier et complexe. Pour cette raison nous devons effectuer ces études d’efficacité chez la souris.

Réduction

L’effectif des groupes a été déterminé grâce à un test de puissance statistique qui nous a aidé à déterminer que nous aurions besoin de 8 animaux par groupe. Nous avons également besoin de 4 animaux par groupe pour les études d’histologie. Pour les 12 groupes, il faudra donc 144 animaux. Avec une prise de greffe d’environ 90%, 10% soit 15 animaux supplémentaires par modèle seront greffés. Les études sur les différents modèles tumoraux seront réalisées en séquentiel, les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation de 7 jours et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en pratiquant la contention une fois par jour pendant 5 jours. Les expérimentateurs possèdent l’expertise en termes de technicité quant à la mise en place et le suivi du modèle de cancer de l’ovaire ainsi que pour l’administration de traitements en intraveineuse. Par ailleurs, l'état des animaux sera évalué par une grille de scoring sur des critères comportementaux (activité, isolement…), physiques (poils hérissés, dos voûté…) qui permettent de détecter rapidement une souffrance ou l’atteinte d’un point limite. Les critères observables sont évalués quotidiennement, les critères mesurables (poids, taille des tumeurs) sont évalués trois fois par semaine. Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Si jugé nécessaire, un traitement antalgique sera mis en place.

Choix des espèces

Nous souhaitons travailler sur des tumeurs issues de cellules humaines afin d’être au plus près de la réalité clinique, nous avons donc besoin d’animaux présentant un système immunitaire fortement déprimé afin d’éviter le phénomène de rejet. La souris est l’espèce la plus adaptée pour cet objectif, cette souche étant un modèle qui permet une prise tumorale efficace avec de nombreuses lignées humaines. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

2 710 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à douze injections de traitement et douze injections d'un traceur luminescent, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour des prélèvements post-mortem. Greffées en sous-cutané ou en intraveineux avec des cellules tumorales de myélome, ces souris immunodéprimées subissent des séances d'imagerie sous anesthésie et des prélèvements sanguins, les tumeurs pouvant se nécroser, s'ulcérer au point d'injection ou gêner leurs mouvements. Les retombées annoncées, moins de toxicité pour les patients grâce à une meilleure pharmacocinétique, restent au futur, et le porteur affirme que l'animal reste "inévitable" à ce stade et que "l'animal entier" est "nécessaire".

Objectifs

Le myélome multiple (MM) est une tumeur maligne caractérisée par une infiltration de la moelle osseuse. La survie à 5 ans de patients atteints de MM est de 48,5 % et malgré l'introduction de médicaments immunomodulateurs et d'inhibiteurs du protéasome, de nombreux patients présentant des caractéristiques à haut risque ont toujours de faibles taux de survie. Malgré des avancées importantes dans les stratégies thérapeutiques ces dernières décennies, le myélome multiple reste incurable. La surveillance de la progression maligne et de la récidive de la maladie après le traitement est un défi central pour améliorer les résultats des patients atteints de MM. Les objectifs du projet sont de développer de nouveaux nanotransporteurs pour la délivrance de molécules d’intérêts à visés thérapeutiques dans le cadre de traitement anti-cancéreux notamment dans le myélome multiple. Ces nanotransporteurs auront également la capacité d’être couplées à des molécules pour le dépistage ou le suivi du développement tumoral par imagerie chez l’Homme. Nos expertises pluridisciplinaires à l’interface entre la chimie et la biologie, nous permettent de développer des nanotransporteurs aux caractéristiques physico-chimiques divers (polymérique, lipidique et inorganique de tailles variables). Ces molécules synthétiques pourront encapsuler des agents thérapeutiques tels que des peptides, des chimiothérapies, des protéines. Les nanotransporteurs seront couplés à des molécules thérapeutiques et fonctionnalisés pour le ciblage des cellules cancéreuses ou de son environnement direct afin d’améliorer l’efficacité et la spécificité du traitement. Ils pourront également être utilisés pour l’amélioration de la sensibilité, du suivi des tumeurs et du diagnostic. Cette première partie du projet consistera à identifier via des études pharmacocinétiques sur souris saines les nanotransporteurs proposant les meilleures propriétés cinétiques ainsi que la biodistribution la plus adéquates en fonction de l’utilisation souhaitée (traitement, imagerie). Dans un second temps, nous évaluerons précliniquement sur un modèle de tumoral de myélome murin l’efficacité thérapeutique de ces nouvelles molécules formulées en nanotransporteurs.

Bénéfices attendus

Menée à bien, cette étude devrait permettre de connaître la place des différentes nanotransporteurs dans l’arsenal thérapeutique et diagnostic actuel du myélome. La comparaison des différentes nanotransporteurs ciblées devrait permettre de mieux comprendre l’influence de la taille et de la composition des nanotransporteurs sur le ciblage actif, et de montrer leur intérêt d’un point de vue pharmacocinétique. Cela montrera l’intérêt des nanotransporteurs pour réduire les toxicités associées aux traitements du cancer chez l’Homme grâce à l’amélioration de la pharmacocinétique par rapport aux chimiothérapies classiques.

Procédures

Pour la mise en place des modèles tumoraux, les animaux seront soumis à une injection sous cutanée ou intra veineuse de cellules tumorales d'une durée

Impact sur les animaux

Certaines molécules envisagées sont en essais cliniques et leurs effets indésirables sont donc connus. Les nuisances dues à leurs utilisations peuvent être les suivantes : une perte de poids, un œdème, une tachycardie, une dyspnée, une hypotension, un syndrome de réponse respiratoire systémique (SIRS) ou une pneumonie (inflammation de la couche mince de tissu située entre les sacs alvéolaires). Les nuisances identifiées sur souris implantées avec des cellules tumorales sont l'apparation d'une tumeur dont la taille va augmenter si ce n'est dans les groupes traités avec les nouveaux médicaments qui s'ils sont efficaces devraient réduire la taille de ces tumeurs. En évoluant la tumeur pourrait présenter une apparence de nécrose ou s'ulcérer au lieu d’injection ou génêr l'animal dans ses mouvements. Les transporteurs de médicaments testés ont pour but d’améliorer la délivrance des traitement directement dans l’environnement tumoral par leur fonctionnalisation et de ce fait, d’en réduire les effets secondaires et en potentialisant leurs pouvoirs thérapeutiques.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement et analyses post-mortem.

Remplacement

Des études in vitro déterminant la spécificité de ciblage et la cytotoxicité des nanotransporteurs ont été préalablement réalisé afin de remplacer une partie des expérimentation in vivo. Cependant à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. Un modèle de greffe orthotopique est notamment important car même s’il demande un suivi tumoral par imagerie (sous anesthésie) il reste plus représentatif du microenvironnement du myélome (cancer du sang) ; l’animal entier est donc nécessaire. En effet, la pharmacocinétique des groupes de traitement cités ci-dessus et la toxicité systémique (toxicité qui affecte tout l’organisme) ne peut être déterminées que in vivo. Cette étude préclinique, visera à évaluer la pertinence clinique de l’utilisation des nanotransporteurs pour le traitement du myélome multiple et d’y intégrer les paramètres environnementaux inhérent à un organisme entier.

Réduction

Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus pour l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux a été calculé mathématiquement et les résultats entre les groupes d’animaux seront comparés avec des tests statistiques adaptés et robustes permettant de mettre en évidence l’effet des traitements testés sur la croissance des tumeurs. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales lorsque cela était possible. L’étude de toxicité sur souris saine ainsi que de biodistribution servent d’études pilotes avec un nombre restreint de groupes qui conditionnera la suite du projet, le nombre annoncé est donc un nombre maximum d’animaux pour l’étude complète de 5 nanotransporteurs.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en portoir ventilés en groupe sociaux selon les normes en vigueur avec des conditions d’hébergement et d’enrichissement de leur environnement conformes à la validation de la cellule bien-être (ex : bâton à ronger, coton pour faire un nid permettant à l’animal d’exprimer des comportements naturels). Les animaux observeront une période d’acclimatation après réception. Un tunnel dans la cage et/ou une habituation à la contention (2-3x par semaine sur au moins 1 semaine) sera réalisée avant chaque procédure afin de minimiser le stress due à la contention lors des injections ou à leur manipulation. Toutes les manipulations susceptibles de générer de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Chaque animal est étroitement suivi dès lors qu’il entre dans l’une des procédures (2 à 3 fois par semaine) afin d’identifier les signes de stress, de douleur le plus précocement possible. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin de soustraire l’animal à toute forme de souffrance en interrompant la procédure. Les données seront intégrées à l’aide d’une grille d’évaluation (état de stress, niveau de douleur, taille de tumeur, etc.) et l’animal pris en charge selon le score obtenu.

Choix des espèces

La raison la plus importante du choix des souris pour nos études est leur similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Dans le domaine de la cancérologie , la greffe de cellules tumorales ne peut être réalisée avec succès que sur des souris immunodéprimées adultes afin d'éviter tout phénomène de rejet de la greffe de cellules tumorales ce qui permet ensuite de suivre la croissance tumorale au cours diu temps et d'évaluer l'impact de candidats médicaments sur cette croissance.