Souris

Anesthésiées le temps de recevoir dans le rectum du TNBS dissous dans l'éthanol, qui déclenche une inflammation de l'intestin, les souris reçoivent ensuite des composés par gavage, dans l'eau de boisson ou par injection, et subissent des prises de sang au fil de l'étude. Sur cinq ans et 50 études, 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont des souris immunodéficientes au système immunitaire humanisé. Le porteur annonce une diarrhée qui peut être sévère, une perte de poids, une déshydratation, des coliques ou une anémie, auxquelles s'ajoutent les effets toxiques possibles des composés, issus de laboratoires académiques, de sociétés de biotechnologie et de l'industrie pharmaceutique. Toutes les souris sont mises à mort en fin de procédure.

Objectifs

La maladie inflammatoire chronique des intestins (MICI) est une pathologie caractérisée par une inflammation de la paroi du tube digestif entrainant une dégradation significative de la qualité de vie des patients. Les MICI les plus courantes sont la colite ulcéreuse (ou rectocolite hémorragique) et la maladie de Crohn. A l’heure actuelle, les mécanismes d’apparition de cette pathologie sont peu connus et aucun traitement curatif n’est disponible sur le marché. L’objectif de ce projet est de développer un modèle d’étude fiable des MICI pour permettre d’en accroitre la compréhension et d’évaluer les propriétés immunitaires, thérapeutiques et toxicologiques de molécules issues de laboratoires académiques, biotechnologiques et pharmaceutiques.

Bénéfices attendus

Les MICI sont des maladies inflammatoires. En basant notre modèle sur des souris ayant un système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les MICI et des potentiels traitements avec davantage de spécificité pour l’espèce cible de ces recherches : l’Homme.

Procédures

Administration intra-rectale sous anesthésie générale, durée de l'intervention 4 à 5 minutes. Administration des composés à visées thérapeutiques par voie enterale (gavage ou incorporation dans l'eau de boisson) ou parentérale (intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire ou sous-cutanée). Leur nombre est à déterminer, leurs durées seront de 10 à 15 secondes chacune. Prélèvements sanguins pour le suivi de la pathologie et des effets des traitements selon un schéma établis par le vétérinaire d'établissement et le comité de bien-être. Chaque prélèvement aura une durée de 15 à 30 secondes, environ.

Impact sur les animaux

Les MICI se caractérisent par une diarrhée pouvant être sévère et entrainer une perte de poids, une déshydratation, des coliques ou une une anémie. Des nuisances peuvent également être induites par l'injection intra-rectale de TNBS solubilisé dans l'éthanol ainsi que par les prélèvements sanguins, l'administration des composés de recherche et les effets potentiellement toxiques de ces composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique. Ces nuisances et effets indésirables peuvent se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Il n’est à l’heure actuelle pas possible de recréer in vitro un modèle étudiant les interactions complexes qui peuvent exister entre le système immunitaire et un système digestif fonctionnel qui permettrait de reproduire les MICI tout en objectivant les effets thérapeutiques et toxicologiques de composés médicamenteux destinés à leurs traitements. Les modèles murins constituent donc une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et à la mise à disposition de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 1500 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet sur une durée de 5 ans, permettant de réaliser 50 études afin de mettre en place le modèle et de réaliser les premières études précliniques. Chaque étude comprendra un minimum de 4 groupes (contrôle négatif, contrôlé positif, plusieurs doses ou traitements à comparer) avec 5 à 10 animaux par groupe afin d’obtenir des résultats fiables malgré la variabilité intrinsèque liée au modèle. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus de la série.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 6 heures par semaine. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 5 jours et seront habituées à la présence humaine régulièrement. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire d’établissement aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est de 200µL en routine, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8mL/kg. De plus, les prélèvements RO sont interdits et remplacés par des prélèvements à la veine saphène. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction des scores cliniques et de la perte de poids. Les administrations intra-rectales seront réalisées sous anesthésie générale à l'isoflurane et le volume d'injection ne pourra dépasser 200 μL.

Choix des espèces

Le séquençage complet du génome de la souris a démontré la proximité phylogénétique des souris et des hommes : 90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes orthologues produisent des effets différents entre souris et homme, le remplacement dans le génome du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. Ainsi, les souris SCID (Severe Combined ImmunoDeficiency), leurs dérivées et leurs analogues, toutes immunodéficientes, ont permis le développement des modèles humanisés. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur système immunitaire. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.

Gavées tous les jours pendant un mois avec un glucocorticoïde de synthèse, une partie des 960 souris de ce projet développe la fonte musculaire que l'étude cherche à décrire. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et incluent aussi des injections répétées dans l'abdomen et un test d'agrippement, avec un risque de fausse route et d'irritation de la gorge lié au gavage. Le porteur affirme vouloir "anticiper toute souffrance inutile" et écrit dans la même rubrique n'avoir prévu ni anesthésie ni analgésique, tous les actes se faisant sur animal vigile. Toutes sont mises à mort à la fin de chaque procédure pour des analyses moléculaires et histologiques, les animaux perdant plus de 20 % de leur poids en une semaine étant retirés du lot et tués avant.

Objectifs

Les glucocorticoïdes (cortisol chez l'homme et corticostérone chez la souris) sont des hormones exerçant différents effets chez les mammifères. Elles contribuent en particulier au métabolisme, à la réaction immunitaire et à la réponse au stress. En raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes sont des traitements largement prescrits qui ont révolutionné le domaine de la médecine. En effet, les composés comme la prednisone et la dexaméthasone sont couramment utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, l'asthme et certaines myopathies. Néanmoins, leur utilisation prolongée peut entrainer d'importants effets secondaires, comme le diabète de type 2, l'ostéoporose ou l’atrophie musculaire. Les effets des glucocorticoïdes sont relayés par le récepteur des glucocorticoïdes appelé GR. Il est communément admis que GR une fois lié à son hormone est convoyé dans le noyau de la cellule, où il se lie à l’ADN pour activer ses gènes cibles. Il effectue cette tache en coopération avec d’autres protéines qui sont appelées des « corégulateurs ». L'objectif de ce projet est d'identifier le rôle de deux de ces corégulateurs dans l'atrophie musculaire dépendante des glucocorticoïdes en utilisant des souris dans lesquelles ils sont sélectivement supprimés (mutés) dans le muscle squelettique. Le projet sera mené sur deux établissements utilisateurs (ci-après EU1 et 2 par souci de simplicité). Les animaux seront produits et élevés dans l'EU1. La mutation sera induite dans l'EU1 ou dans l'EU2 s'il s'avère que le personnel de l'EU1 n'est pas disponible. Les autres traitements seront réalisés dans l'EU2 afin que nous puissions suivre l’évolution des animaux. En effet, notre équipe travaille sur ces modèles depuis de nombreuses années et peut ainsi anticiper les dommages occasionnés. Par ailleurs, les animaux seront déjà présents dans l'EU2, à laquelle les membres de l'équipe ont accès, afin d’effectuer des tests d'agrippement, évitant ainsi un nouveau stress généré par le transfert. S’il s’avère que les membres de l’équipe ne sont pas disponibles, les traitements pourront être réalisés dans l'EU1 afin de ne pas gâcher de groupe.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle de deux corégulateurs du récepteur des glucocorticoïdes dans le muscle au cours de l'atrophie musculaire provoquée par les glucocorticoïdes. Contrôler l'activité du récepteur des glucocorticoïdes en modulant celle des co-régulateurs ouvrirait de nouvelles perspectives thérapeutiques pour réduire les effets indésirables causés par les traitements prolongés avec ces hormones.

Procédures

Les animaux pour lesquels la mutation doit être induite (groupe 1 et 2) seront traités par le biais d’une nourriture spécifique pendant 3 semaines, puis par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec/ souris). Le groupe 1 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement aigü aux glucocorticoïdes sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours avec le composé ou un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement prolongé aux glucocorticoïdes sera traité avec le composé ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Le groupe 3 sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours avec le composé ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 4 sera traité avec le composé ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Un test d'agrippement sera réalisé une seule fois en triplicat sur l'ensemble des cohortes à la fin des traitements (30 sec/ souris) .

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont toutes maîtrisées par notre équipe et les expérimentateurs prévus sur ce projet. Par ailleurs, le nombre d’injection et la période prévues de traitement ont été définies car on sait qu’aucun effet secondaire majeur n’avait été observé auparavant lors d’études comparables. Néanmoins nous ne pouvons exclure le risque d’infection due au point d’injection qui sera surveillé. Les traitements aux glucocorticoïdes durant de longue période peuvent entrainer une fonte musculaire, c’est pourquoi nous prendrons soin d’exclure les animaux ayant perdu plus de 20% de leur poids corporel en une semaine. De plus, le gavage répété peut conduire à des fausses routes et une irritation de la gorge pouvant impacter la prise alimentaire que nos pesées régulières nous permettrons d’observer rapidement. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …).

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale pour des études moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes synthétiques (Dex et Prednisone) sur l'atrophie musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, même si des myotubes en culture peuvent être utilisés pour modéliser le muscle squelettique et connaitre les effets directs des glucocorticoïdes au niveau moléculaire, ils ne permettent pas de récapituler le microenvironnement musculaire ainsi que les nombreux facteurs et hormones intervenant dans l’homéostasie tissulaire. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant contribuer à ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence.

Réduction

De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle de mutation et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test statistique. De plus, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'analyse d'expression des gènes et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.

Raffinement

Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, l'animal sera sorti du lot et une euthanasie sera réalisée. L'injection de dexaméthasone n'est en général pas problématique pour l'animal. Néanmoins, si l'injection est mal effectuée et entraine des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l'animal vigile. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.

Choix des espèces

Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Le projet s’intéresse au rôle de GR et deux de ses co-régulateur dans l'atrophie musculaire de l’organisme adulte. Les animaux inductibles seront donc traités au tamoxifène entre 5 et 7 semaines d'âge et étudiés dans les semaines suivant l'injection.

360 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour que leur cerveau soit prélevé. 324 d'entre elles subissent une chirurgie crânienne destinée à léser le cortex moteur, 312 une seconde chirurgie pour la greffe de neurones issus de cellules souches humaines, et 54 une intervention de deux à quatre heures dont elles ne se réveillent pas. Trois cents animaux passent sept sessions de tests moteurs, préhension de nourriture, équilibre et marche, précédées chaque fois d'un jeûne de quinze heures destiné à les motiver à saisir les boulettes. Le porteur conclut qu'il n'est pas possible de modéliser un cerveau de mammifère in vitro ou in silico et que le recours à des animaux vivants et "intègres" reste "essentiel".

Objectifs

La médecine réparatrice a le potentiel de remplacer les tissus endommagés ou malades. Le cerveau est la cible de nombreuses pathologies dont les traumatismes crâniens. Selon les différentes sources disponibles, on dénombre en France annuellement environ 155 000 traumatismes crâniens, cependant les solutions thérapeutiques proposées demeurent limitées. Le cerveau adulte présente une faible capacité d’autoréparation, que ce soit dans la genèse de nouveaux neurones ou de nouvelles connexions projetant sur de longue distance. La transplantation cellulaire offrirait ainsi une stratégie thérapeutique viable pour les patients en apportant de nouvelles cellules en remplacement de celles perdues suite à une lésion. Malgré les progrès significatifs réalisés au cours des dernières années, la translation de la stratégie expérimentale vers une application clinique reste encore limitée. Nos travaux ont pour finalité de développer une méthodologie de thérapie cellulaire efficace et sûre, laquelle utiliserait des neurones provenant de cellules souches humaines, en combinaison avec de nouveaux biomatériaux, afin d’améliorer l'efficacité de la transplantation cellulaire à long terme. Nous pensons fortement que la combinaison de ces nouveaux neurones avec des biomatériaux est une étape cruciale dans la médecine réparatrice du cerveau. En effet, les biomatériaux devraient favoriser la survie des neurones greffés et donc soutenir la régénération tissulaire. Des tests de comportement permettront d'examiner l'effet sur la récupération motrice des animaux et de comparer l'effet du biomatériau sur la réparation du cerveau.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d'étudier l’effet d’un biomateriau sur la réparation des réseaux neuronaux après transplantation de nouveaux neurones chez le rongeur. Ce biomatériau peut être utilisés pour fournir un support structurel, libérer des facteurs de croissance, ou encore promouvoir la régénération tissulaire dans la zone lésée du cortex cérébral. Les objectifs incluent la réduction de l'inflammation, la promotion de la cicatrisation, la restauration des connexions neuronales et la récupération des fonctions altérées à la suite de lésions corticales. A plus long terme, les bénéfices attendus de ce projet sont le développement de thérapie clinique chez l'Homme autour de la transplantation cellulaire combinée à des biomateriaux, afin d’améliorer la qualité et la fiabilité des transplantations et ainsi améliorer la prise en charge des patients souffrants de lésions cérébrales suite à un traumatisme crânien ou un accident vasculaire cérébral.

Procédures

Sur animaux anesthésiés : -intervention 1 : chirurgie craniale pour induire une lésion : 1 fois (10 minutes par animal, 324 animaux); - intervention 2 : chirurgie craniale avec greffe de neurones : 1 fois (10 minutes par animal, 312 animaux); - intervention 3 : chirurgie craniale sans réveil avec enregistrement de l’activité des neurones : 1 fois (2-4 heures par animal, 54 animaux). Sur animaux vigiles : -en amont de chaque chirurgie, 1 injection sous cutané d'antalgique (360 animaux)- au maximum soixante dix pesées par animal, d'une durée d'environ 1 minute (une fois à 2 fois par semaine, sur toute la durée du projet, 360 animaux); -au maximum 7 sessions de 3 tests de comportement moteur (test de préhension de nourriture, test d'équilibre, test de marche,15 minutes par souris et par test, 300 animaux); - mise à jeun d'une durée inférieure à 16h (7 fois à 2 mois d'intervalle, 300 animaux)

Impact sur les animaux

Suite à l’anesthésie générale et la chirurgie cranienne, les effets indésirables attendus sont la douleur liée à la chirurgie minimisé par le traitement antalgique pendant et après la chirurgie, ainsi qu'une légère perte de poids transitoire. La lésion du cortex moteur entraine potentiellement une légère diminution de la capacité de préhension de la patte antérieure gauche. L’acte de pesée et les tests comportementaux sur animal vigile peuvent induire un léger stress transitoire. Un jeûne de 15 heures sera réalisé avant le test de préhension de nourriture afin que les animaux soient motivés à récupérer les boulettes de nourriture.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de récupérer le cerveau pour des études neuroanatomiques, électrophysiologiques ou transcriptomiques.

Remplacement

L’impact de la composition des biomatériaux utilisés dans cette étude aura été testé au préalable dans un modèle in vitro. Ceci permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Dans ce projet, nous souhaitons étudier la possibilité de la réparation du cerveau lésé sur le plan neuroanatomique et fonctionnel. Les symptômes cliniques des traumatismes crâniens qui nous intéressent concernent la motricité. De ce fait, la nécessité de modèles animaux apparait essentielle à l’étude de cette pathologie. Ces approches nécessitent la présence du réseau neuronal qui est uniquement accessible dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. De nos jours, il n’est pas encore possible de modéliser un cerveau de mammifère in-vitro ou in silico, qui nous permettrait d’étudier l’effet bénéfique de la transplantation sur la motricité.

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux nécessaires en expérimentation tout en s'assurant d'en avoir le nombre suffisant pour avoir une étude interprétable sur le plan statistique par l’utilisation d'un test statistique approprié. Ceci a permis de déterminer un nombre de 360 animaux avec la moitié de mâles et la moitié de femelles. Nous commencerons pas réaliser une étude pilote qui va consister à tester au maximum 10 biomatériaux pour sélectionner le meilleur candidat. Nous procéderons avec une démarche pas à pas (par groupe de 6 animaux) transplantés, répétés au maximum 10 fois, soit 60 animaux maximum au total. Si aucun biomatériau ne donnne de résultat satisfaisant, le projet sera arrêté.

Raffinement

Les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : matériel de nidification et tunnel). Avant le début des tests de comportement, une habituation à l'expérimentateur sera réalisée (3 fois/semaine sur 2 semaines). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale avec analgésie et contrôle de la température corporelle à l'aide d'un tapis chauffant. Un traitement antalgique sera poursuivi en postopératoire durant 72h. Durant toute la procédure, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (alimentation, apparence, comportement) et des actions seront mises en place en cas de problème(s) observé(s), avec la mise en place d’une grille de score, avec l’utilisation de points limites adaptés et gradés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée pour les modèles animaux dans le domaine des neurosciences. En effet, il est possible de mimer chez la souris les lésions du cortex moteur qui peuvent survenir chez l'Homme dans différentes situations (accident de la route, traumatisme crânien, accident vasculaire cérébral...). Nous utiliserons des souris âgées de 3 mois au début de cette étude. Nous souhaitons travailler avec des souris adultes matures ce qui correspond à l'âge où le développement biologique est passé, mais pas encore affecté par le vieillissement.

Un niveau de douleur jugé trop élevé déclenche la mise à mort anticipée, seuil que le porteur fixe au moyen d'une grille de score. 1 020 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue après un prélèvement sanguin intracardiaque. Une tumeur leur est greffée dans le rectum sous anesthésie générale, suivie de deux injections de chimiothérapie sur animal vigile, d'un gel immunostimulant administré par l'anus et d'un suivi par imagerie deux fois par semaine, la tumeur pouvant provoquer ulcères, douleurs et occlusion du côlon. Les groupes comptent vingt souris parce que le porteur anticipe 20 % d'échecs de greffe et jusqu'à 40 % de morts sous chimiothérapie seule, de sorte qu'il en reste dix à analyser.

Objectifs

La radiothérapie combinée à la chimiothérapie est chez le patient actuellement, le traitement de référence des cancers du rectum avant la chirurgie. Cependant, la radiothérapie est associée à d’importants effets secondaires (Incontinence urinaire, incontinence fécale...). Des travaux publiés récemment suggèrent que la chimiothérapie seule pourrait être une alternative à ce protocole de traitement. Cependant la guérison complète après traitement médical, qui permet alors d'éviter la chirurgie, est inférieure à 20%. La survie globale à 10 ans, liée à la récidive généralisée du cancer, est de 50%. En parallèle, il est démontré que l’immunothérapie améliorait la réponse du traitement sur des modèles de cancer colorectal. En effet, l’activation de l’immunité permettrait de majorer l’effet des traitements des cancers du rectum. C’est pourquoi nous souhaitons évaluer l’effet d’une immunothérapie locale associée à la chimiothérapie dans le cancer du rectum en remplacement de la radio-chimiotherapie. Pour valider notre hypothèse, nous souhaitons mettre en place un modèle de cancer du rectum chez la souris, et associer à la chimiothérapie une immunothérapie locale par administration intra rectale de notre immunogel. L'efficacité du traitement sera étudiée en suivant la croissance tumorale des tumeurs par imagerie optique et en échographie, en suivant la survie des souris, et en étudiant la réponse immunologique.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait permettre de définir et valider l’immunochimiothérapie pour améliorer le taux de guérison et diminuer le risque de développement de métastases du cancer du rectum. L’amélioration de cette guérison après traitement médical serait un argument en plus permettant d'avoir moins recours à la chirurgie. Le non recours à la chirurgie du rectum après une réponse complète aux traitements médicaux est au coeur des essais cliniques actuels sur les traitements du cancer du rectum, car elle permet de diminuer la morbidité et les séquelles liées à la chirurgie. Les résultats de cet essai préclinique pourront aboutir au design d’une étude clinique incluant l’immunothérapie locale aux standards de traitement du cancer du rectum chez l'Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure de greffe tumorale en début de chaque procédure, correspondant à une injection intra rectale de cellules tumorales. Cette injection se fera une fois par procédure et sera réalisée sous anesthésie générale. Pour le suivi de croissance tumorale par imagerie bioluminescente 2 fois par semaine, les souris seront anesthésiées par inhalation de gaz. Elles recevront également à ce moment une injection intrapéritonéale de luciférine. Les chimiothérapies administrées pendant le projet seront injectées vigile par voie intrapéritonéale. Les souris traitées recevront 2 injections de chimiothérapie. Les souris traitées par notre gel recevront une injection de gel par l'anus sous anesthésie générale. En cas d'échec de cette voie, le gel sera injecté directement dans la tumeur, par voie anale, sous anesthésie générale également. En cas de douleur au cours du projet, les souris recevront une analgésie par injection sous-cutané d'antalgique. Au moment de leur mise à mort, un prélèvement sanguin intracardiaque sera effectué. Ce prélèvement sera effectué sous sédation profonde par une injection intrapéritonéale de médicaments anesthésiants. Les souris seront par la suite mises à mort sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

La greffe de tumeur orthotopique pourrait être responsable de douleurs (ulcères, lésions) et de perte de poids. Les chimiothérapies incluent dans cette étude, peuvent entrainer chez l’Homme des mucites, des troubles du rythme cardiaque, des neuropathies périphériques. Les signes généraux de douleur, d’asthénie, de diarrhées ou de troubles de la mobilité seront particulièrement surveillés chez la souris après injection. De par sa localisation, on peut supposer que la tumeur pourrait-être responsable d’occlusion du côlon, malgré l’absence de description dans la littérature. Nous serons donc particulièrement attentifs à des signes de gonflement de l’abdomen, en plus des signes d’altération de l’état général.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mises à mort à l'issu de chaque procédure pour prélèvement et analyse anatomopathologique

Remplacement

Nous avons préalablement évalué par des expériences in vitro plusieurs formulations de gel pour ne tester chez l’animal que les formulations finales. A la suite de ces expériences in vitro, notre modèle doit maitenant être appliqué à l'animal pour tendre vers une approche clinique chez l'Homme. La modification de l'environnement de la tumeur, qui est particulièrement riche et complexe chez l'Homme et sur modèle animal, est la cible de notre traitement et ne pourrait être évalué uniquement in vitro.

Réduction

Le projet a été consciencieusement pensé et élaboré afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants. Le nombre d’animaux doit être de 12 souris par groupe pour les expériences qui présentent une faible variabilité. Cependant, pour l’étude de l’efficacité, nous nécessiterons l’utilisation de 20 souris par groupe car les expériences présentent une variabilité importante particulierement lié aux reponses à la chimiothérapie. Ce nombre est calculé selon notre expérience et la littérature et en tenant compte de la variabilité interindividuelle. En effet, il est nécessaire de prévoir 20 animaux par groupe pour avoir des données statistiquement analysables car d’après notre expérience la prise tumorale pour la tumeur primaire et secondaire est de 80% et sa mortalité de 8%. La mortalité à distance de la chimiothérapie seule est de 40% dans la littérature. Considérant cela, il restera, dans le pire des cas, 10 animaux par groupe ce qui permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. De plus, l'utilisation de l'imagerie optique et plus ou moins de l’échographie nous permet de réaliser en temps réel le suivi de l’évolution tumorale. Ces techniques non invasives nous permettront ainsi de réduire au maximum le nombre d'animaux.

Raffinement

Nous nous attacherons à réduire au maximum la souffrance des souris. Nous utiliserons l’imagerie optique, non invasive et non traumatisante, pour évaluer l’efficacité du traitement. L’implantation des tumeurs, ainsi que l’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale. Une grille d'évaluation de la douleur adaptée à ce projet a été élaborée pour surveiller l’état général de l’animal, son apparence, son comportement, révélateurs du niveau de douleur. Des antalgiques sont prévus en cas de nécessité et un niveau de douleur trop élevé entraînera la mise a mort anticipée de l'animal. Chez la souris anesthésiée, tout signe de douleur (mouvement soudain, vocalisation) induira un arrêt de la procédure, une analgésie et une nouvelle induction de l’anesthésie. Une surveillance du volume tumoral 2 fois par semaine et du poids tous les 2-3 jours sera assurée après les implantations de tumeurs. Après l’anesthésie, la souris sera placée dans une cage thermostatée le temps du réveil et de la récupération post interventionnelle et post examen d’imagerie. Plus généralement, un animal peut être isolé de ses congénères s’il y a présence de blessures. Les blessures seront le cas échéant désinfectées à la vetedine. Enfin, des points-limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé dans la littérature pour les études de vaccination antitumorales. De plus, une première preuve de concept a été réalisée avec cette espèce, cela est donc plus cohérent pour la poursuite de nos expériences. Nous utiliserons des souris adultes de 8 semaines car leur système immunitaire est adéquat et suffisamment développé à cet âge-là.

640 souris vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à trente-cinq injections dans l'abdomen sur animal vigile et passant jusqu'à quatre semaines isolée en cage calorimétrique. Une partie porte une mutation qui reproduit la progéria humaine, avec chute des poils, disparition de la graisse sous-cutanée et rides, ce que le porteur déclare sans effet sur leur bien-être. Les prises de sang se font également sur animal vigile, l'anesthésie modifiant la protéine étudiée, et toutes les souris sont tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Le bénéfice avancé, valider une piste thérapeutique contre une maladie qui tue les enfants atteints vers treize ans, reste au conditionnel, tandis que les injections et l'isolement sont, eux, programmés.

Objectifs

La progéria est une maladie qui reste indétectable à la naissance, mais elle commence à se manifester très tôt, souvent dès la première année de vie. Les enfants affectés présentent des signes qui évoquent un vieillissement prématuré et accéléré, tels que la rareté des cheveux (alopécie), une peau fine, ridée, dépourvue de graisse, ainsi que des ongles peu développés. Par ailleurs, ces enfants connaissent une croissance lente, des problèmes osseux et musculaires, et un retard dans la pousse des dents. Ils souffrent également de douleurs articulaires et font face à des problèmes cardiovasculaires, mais il est important de noter que leurs capacités intellectuelles ne sont généralement pas affectées. Malheureusement, le pronostic de cette maladie est très sombre. Le décès survient en général entre l'âge de 6 et 20 ans, principalement à cause de problèmes cardiovasculaires, comme l'athérosclérose, une dégénérescence des artères, des crises cardiaques ou des accidents vasculaires cérébraux. L'espérance de vie des enfants atteints de cette maladie se situe aux alentours de 13 ans. Nous souhaitions démontrer que, dans des modèles de souris appropriés, l'inhibition d’une protéine par différentes méthodes (neutralisation de la protéine par des anticorps monoclonaux de haute affinité ou par des auto-anticorps polyclonaux), pourrait retarder le vieillissement prématuré dans des modèles murins de la progéria de Hutchinson-Gilford.

Bénéfices attendus

La progéria provoque un vieillissement prématuré du patient. L'espérance de vie des enfants atteints de cette maladie se situe aux alentours de 13 ans. C’est pourquoi il est important de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet nous permettra de valider dans plusieurs modèles précliniques une nouvelle stratégie thérapeutique pour traiter la progéria.

Procédures

Un prélèvement de quelques millimètres à l’oreille sera effectué sur les animaux pour génotypage à raison de quelques secondes par animal effectuée sur animal vigile. Les souris transgéniques développant un syndrome de progéria de type Hutchinson-Gilford présentent un phénotype clinique très semblable à la progéria humaine comme par exemple l’alopécie (accélération de la chute des poils), la perte du gras sous-cutanée, ou encore les rides sans que cela n’affecte le bien-être des animaux ou implique de soin ou de suivi spécifique au modèle. Les symptômes n’apparaissent qu’aux alentours de la dixième semaine. Toutes les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales (injection au niveau de l’abdomen de quelques secondes) (entre 4 et 35 au maximum sur animal vigile) et à un isolement (pour un maximum de deux fois deux semaines soit un total de 4 semaines) en cage calorimétrique. Les prélèvements sanguins (quelques secondes par prélèvement, volume de prélèvement relativement faible pour analyse moléculaire) seront effectués sur animal vigile (anesthésie modifiant les paramètres de la protéine étudiée). A l’issue de la période de maintien ou en cas d’atteinte de points limites, les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses.

Impact sur les animaux

Les sites des injections ou des prélèvements sanguins pourraient s’infecter. Les manipulations ainsi que le passage en cage calorimétrique pourraient stresser les animaux. Toutes les souris seront soumises à un prélèvement de quelques millimètres à l’oreille, à des injections intrapéritonéales, à des prélèvements sanguins et à être isolées (pour un maximum de 2 fois deux semaines) en cage calorimétrique. Ces injections et ces prélèvements sanguins entrainent un stress lié à la contention et une douleur de courte durée au point d'injection ou de prélèvements. Les isolements peuvent être une source de stress. Les souris transgéniques développant un syndrome de progéria de type Hutchinson-Gilford présenteront un phénotype clinique très semblable à la progéria humaine comme par exemple l’alopécie (accélération de la chute des poils), la perte du gras sous-cutanée, ou encore les rides sans que cela n’affecte le bien-être des animaux ou implique de soin ou de suivi spécifique au modèle.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude macroscopique et systémique de la progéria.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 640 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de 20 souris (10 femelles et 10 males) pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de lampes chauffantes...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Le comportement général des animaux sera suivi. Le poids sera mesuré 1 fois par semaine. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces, seront appliqués afin de limiter la douleur des animaux à leur minimum. Il y aura une vigilance accrue si les animaux ont les mi-clos ou fermés ou s’ils sont isolés. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

Infectées par le paludisme puis exposées quarante-cinq minutes durant aux piqûres de moustiques, une partie des 860 souris de ce projet est utilisée pour faire circuler le parasite entre rongeur et insecte. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, avec un affaiblissement et une anémie liés à l'infection, et des prises de sang tous les un à deux jours sur animal vigile. Le porteur présente pourtant cette production de parasites comme "une solution de remplacement", au motif que les sporozoïtes ainsi obtenus alimentent des cultures cellulaires qui auraient sinon exigé davantage d'animaux. Toutes sont tuées, les unes sous anesthésie au moment du prélèvement terminal destiné aux stocks congelés, les autres pour éviter qu'elles n'atteignent les points limites de l'infection.

Objectifs

L'objectif du projet est de produire des sporozoïtes de Plasmodium, les formes transmises par le moustique de l'agent du paludisme, à l'aide de modèles murins d'infection par Plasmodium yoelii et Plasmodium berghei. Les sporozoïtes produits serviront à des études in vitro en modèles cellulaires des stades pré-érythrocytaires de ces parasites. Ces études in vitro sont nécessaires pour mieux comprendre la biologie de ces parasites et les mécanismes d'infection, et pour évaluer l’activité de nouvelles molécules antipaludiques ou optimiser l’activité de molécules existantes. Les modèles d’études in vitro reposent sur l’infection de cellules hépatiques par des sporozoïtes isolés à partir de moustiques Anopheles préalablement infectés à partir de souris infectées. Ces modèles d’infection in vitro de cellules hépatiques par les parasites de rongeur P. yoelii et P. berghei reproduisent de nombreux aspects de la biologie des espèces de Plasmodium infectant l'homme, et permettent d’étudier le rôle de facteurs parasitaires ou de l’hôte au cours de l’infection, notamment à l’aide de parasites génétiquement modifiés, ainsi que d’évaluer l’efficacité de molécules à visée antiplasmodiale.

Bénéfices attendus

Le paludisme, avec près de 250 millions de cas annuels et plus de 600 000 décès, pour la plupart des enfants de moins de cinq ans, reste un problème majeur de santé publique. Ce projet, nécessaire pour assurer la production régulière des lots de sporozoïtes requis pour les études in vitro menées dans le laboratoire, devrait permettre d'améliorer nos connaissance des mécanismes fondamentaux d'infection par Plasmodium, afin de définir des cibles thérapeutiques et vaccinales innovantes et de permettre l’évaluation de l’activité de molécules à visée antiplasmodiale dans le but d’élaborer ou d’optimiser de nouveaux traitements antipaludiques.

Procédures

Un premier groupe d'animaux est engagé dans des protocoles de production de parasites pour la congélation, destinés à l'infection standardisée d'autres souris. Ces animaux seront soumis à une injection intra-veineuse unique d’une suspension de sporozoïtes de Plasmodium (durée d'environ 15 secondes, sous anesthésie gazeuse), puis seront soumis à des prélèvement d'une goutte de sang tous les 1 à 2 jours à partir du 4ème jour post inoculation des parasites, pendant au maximum 7 jours (durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles). Ces animaux seront finalement soumis à un ultime prélèvement de sang, sous anesthésie et analgésie, pour la constitution des stocks de parasites cryopréservés (acte unique, durée 10 minutes), et euthanasiés avant leur réveil à l'issu de ce prélèvement. Un autre groupe d'animaux sera engagé dans des protocoles de transmission du parasite plasmodium aux moustiques. Ces animaux seront soumis une à injection intrapéritonéale de parasites (1 injection unique de parasites issus des stocks cryopréservés/standardisé, préparés à partir du premier groupe d'animaux ; durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), puis seront soumis à des prélèvement d'une goutte de sang par jour à partir du 3ème jour post inoculation des parasites, pendant au maximum 3 jours (durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles). Ces animaux seront finalement exposés à des piqûres de moustiques pour transmettre les parasites aux moustiques (acte unique réalisé sous anesthésie et analgésie, durée 45 minutes), puis euthanasiés avant leur réveil.

Impact sur les animaux

Stress lié à la préhension/contention, douleur de courte durée lors des injections intrapéritonéales sur animaux vigiles, douleur de courte durée lors des prélèvements sur animaux vigiles, risques associés à l'anesthésie (hypothermie, détresse respiratoire), contraintes liées à l'infection elle-même (affaiblissement, anémie).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures par des méthodes réglementaires, soit parce que des prélèvements sont nécessaires pour la constitution des cryostocks de parasites dans le cadre de ce projet, soit pour éviter d'atteindre des points limites chez les animaux infectés.

Remplacement

Ce projet vise à produire les parasites au stade sporozoïtes, nécessaires à des expérimentations in vitro pour étudier les stades préérythrocytaires du paludisme. Il s’agit d’une solution de remplacement puisque les expériences menées in vitro à partir de chaque lot de sporozoïte produit permettent de collecter de façon très robuste et reproductible de nombreuses données pour lesquelles il aurait été nécessaire d’utiliser un bien plus grand nombre d’animaux si l’on avait cherché à collecter ses données à partir d’expériences menées in vivo, chez la souris. En particulier, l’utilisation de systèmes de cultures cellulaires (lignées hépatocytaires et hépatocytes primaires) permet d‘analyser l'infection des cellules du foie par les parasites provenant des moustiques infectés. Si quelques protocoles décrivent la production axénique des sporozoïtes de Plasmodium, ils ne permettent malheureusement toujours pas de produire des sporozoïtes complètement matures et infectieux. Les protocoles décrivant la production des sporozoïtes de Plasmodium de rongeurs reposent de plus sur l’utilisation de gamétocytes (formes sexuées mâles et femelles), donc de stade sanguin, pour lesquels il n’existe pas de méthode de culture continue in vitro, et requièrent donc leur production chez l’animal.

Réduction

Au total ce projet utilisera 860 souris sur une durée de 5 ans. Ce nombre a été réduit au minimum pour permettre de réaliser les prélèvements nécessaires à la constitution des stocks de parasites et à l’infection des lots de moustiques nécessaires à la production des sporozoïtes destinés aux études in vitro sur 5 ans. Ces protocoles de production de parasites n'impliquent pas de tests statistiques. Le calcul des effectifs d'animaux nécessaires s'appuit sur une expérience de l'équipe acquise depuis plus de vingt ans dans la réalisation de ces protocoles.

Raffinement

Afin de contribuer au raffinement des procédures, les animaux sont hébergés avec leurs congénères (2 à 5 par cage) dans un milieu enrichi (lanières de papier Kraft ou équivalent). Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée avant le début des expérimentations. Certaines procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie pour prévenir la douleur ou le stress (inoculation de parasites par injection intraveineuse et expériences de transmission aux moustiques notamment). La présence de points limites définis permet d'éviter la souffrance liée aux complications de l'infection, en particulier lors de l’infection par le parasite de rongeur Plasmodium berghei, les souches de Plasmodium yoelii n’engendrant quant à elles que peu de symptômes. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent, pour vérifier l’apparence et l’état clinique des animaux, la prise alimentaire et hydrique ainsi que leur comportement, afin de détecter toute modification suggérant une douleur, une souffrance ou une détresse.

Choix des espèces

Le modèle d'infection chez la souris par les parasites de rongeur Plasmodium yoelii et P. berghei reproduit de multiples aspects de l'infection par les parasites du genre Plasmodium, responsables du paludisme chez l'Homme. Ce modèle permet l'infection du foie par les sporozoïtes (la forme infectieuse du parasite transmise lors de la piqure d'un moustique infecté), une croissance parasitaire sanguine et la transmission de ces parasites aux moustiques pour la production de sporozoïtes infectieux selon le même schéma que ce qui est décrit chez l'Homme. L’infection in vitro de cellules hépatiques par des sporozoïtes de ces espèces parasitaires représente un modèle pertinent pour étudier la biologie des stades précoces du paludisme dans le but d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et vaccinales, et d’évaluer l’activité de molécules à visée antipaludique dans le but de développer de nouveaux médicaments. Dans ce projet, des souris adultes, âgées de 6 à 10 semaines au début des procédures sont utilisées, conformément aux protocoles classiques utilisés dans ce type d'étude.

Pour vérifier si le microbiote intestinal de patientes anorexiques oriente les préférences alimentaires, 252 souris reçoivent par gavage des selles humaines transplantées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour l'étude de leurs tissus. Chaque animal subit six prélèvements sanguins sur animal vigile, un régime riche en fibres qui fait perdre du poids, un hébergement individuel et huit tests comportementaux, les 126 femelles recevant en plus trente-six frottis vaginaux. Le porteur signale un risque de traumatisme de l'œsophage lié au gavage et un risque d'anémie lié aux prises de sang, et renvoie à des points limites dont il ne dit pas lesquels.

Objectifs

L’anorexie mentale (AM) est un trouble des conduites alimentaires (TCA) qui touche jusqu’à 3.6% de la population féminine et dont le taux de mortalité est élevé. Il s’agit d’une maladie psychiatrique chronique qui se caractérise par une restriction alimentaire volontaire, une peur intense de devenir gros alors que le poids est faible et par une perturbation de l’image de son propre corps. La restriction alimentaire est qualitative et quantitative avec une aversion intense pour les lipides et les glucides et une alimentation très riche en fibre et pauvre en protide. Les causes exactes de l’anorexie mentale restent encore mal connues. Il a été mis en évidence la présence d’un déséquilibre du microbiote intestinal chez les patients AM. Ce déséquilibre pourrait être secondaire à la restriction alimentaire, mais aussi responsable de la préférence alimentaire et donc jouer un rôle majeur dans la persistance des symptômes chez les patientes souffrant d’une forme chronique de la maladie. Dans ce projet de recherche, nous émettons l’hypothèse que la préférence alimentaire particulière de l’anorexie mentale est déterminée par l’environnement microbiotique intestinal. L’objectif de l’étude est de mettre en évidence une différence de préférence alimentaire entre les groupes mimant l’anorexie mentale et les sujets sains pour répondre à la l’hypothèse que le microbiote dans patients atteints d’anorexie mentale les pousse à préférer manger des aliments végétaux. Cette étude permettra aussi de montrer le transfert de symptômes de l’anorexie mentale touchant de nombreux organes à travers le microbiote.

Bénéfices attendus

L’étude permettra la validation du modèle de l’anorexie mentale par transfert de microbiote fécal, d’améliorer la compréhension de la physiopathologie de l’anorexie mentale, de la compréhension des mécanismes d’influence microbiote/hôte.

Procédures

Tous les animaux vigiles seront gavés 4 fois soit au total. La contention et le gavage sont réalisés en moins de 10 secondes. Prélèvement de selles : 252 animaux 3 prélèvements par animal seront réalisés. Réalisé après émission naturelle. Durée 1 minute. Prélèvement sanguin : 252 animaux Les prélèvements seront réalisés sur animaux vigiles. Chaque prélèvement dure en moyenne 10 secondes, pour un nombre total de 6 prélèvements par animal soit au total 1 minute de prélèvement sanguin par animal. Prélèvement d’urine : 252 animaux Emis naturellement sur animal vigile. Durée du recueil : 10 secondes, 1 fois au cours du protocole. frottis vaginaux : 126 animaux Réalisation de frottis vaginaux chez les groupes d’animaux femelles. 36 prélèvements par animal durée du recueil 10 secondes. 252 animaux subiront 1 fois chaque test comportemental pour une durée totale de 40 min. Ceci porte le nombre de tests à 8 par animal. La durée cumulée d’épreuves comportementales sera de 145 min sur 6 semaines. Pour 252 souris. Injection sur animal vigil d’une durée de 5 secondes. Soit 1 injection par animal.

Impact sur les animaux

Gavage oral : Risque de traumatisme de l’œsophage lors de la manipulation. Hébergement individuel : Stress induit par l’isolement du fait des caractéristiques communautaires de l’espèce non satisfaites. Régime : perte de poids lié au régime riche en fibre. Prélèvements sanguins: douleurs et stress induit par la prise manuelle et la piqure et la coupure effectuée par la lancette. Les prélèvements seront tous espacés d’un minimum de 7 jours. Risque d’anémie lié aux prélèvements sanguins. Injections: Douleur liée à la piqure et l’injection de liquide Lavage vaginal : stress lié à la prise par la queue et le lavage. Tests comportementaux : induction d’un stress volontaire par la mise en conditions expérimentales. Mise a jeun une fois d’une durée de 4h et une fois d’une durée de 6h. Stress lié à la privation d’aliment dans l’environnement Prélèvement d’urine : émission naturelle, stress lié au placement en pot de recueil

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour l’étude scientifique des tissus

Remplacement

Notre projet nécessite l'utilisation d'animaux de laboratoire car il n'existe pas de techniques actuellement satisfaisantes et éthiques pour étudier le retentissement à un niveau physiologique du déséquilibre bactérien intestinal chez l’humain et ses effets sur la physiologie de l’intestin et le comportement alimentaire. Les techniques in vitro permettent des études à des échelles microscopiques (interactions au sein d’un tissu) mais non à l’échelle globale de l’organisme, ne permettent pas des études d’un point de vue comportemental. Les techniques d’études in silico ne sont pas applicables à l’échelles des interactions microbiote hôte d’un point de vue comportementale et physiologique car les connaissances ne sont actuellement pas assez développées pour créer des modèles informatiques prédictifs.

Réduction

Le nombre d’animaux destiné au projet a été estimé au regard d’une étude autorisée précédemment, et afin de garantir une puissance nécessaire et suffisante d’analyse statistique. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum. Les tests statistiques comportent des analyses descriptives et des analyses de comparaisons.

Raffinement

Les nuisances pour les animaux seront prévenues par une surveillance accrue dans les suites de la transplantation de microbiote fécal sur le plan du comportement, du stress, de la douleur et du poids. Afin de limiter le stress lié aux tests comportementaux, les animaux seront habitués aux procédures et au matériel de manière progressive. Afin de limiter le stress associé à l’hébergement individuel les cages sont transparentes, permettant un contact visuel et olfactif avec les congénères, et enrichies (papier à déchiqueter, matériel de nidification et bâton à ronger). Les points limites déterminés seront appliqués par les expérimentateurs en cas de constatation de leurs manifestations.

Choix des espèces

Nous utiliserons la souris qui est une espèce de référence et un modèle très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines. Cette espèce est bien référencée sur les études comportementales et la littérature existante permettra une analyse de qualité. Les souris seront des jeunes adultes âgés de 6 semaines au début de l'expérience. Ceci est nécessaire pour être au plus proche des conditions de maladie chez l’homme qui débute au jeune âge adulte.

De l'alcool est injecté sous la peau de souris gestantes, neuf fois entre le douzième et le vingtième jour de gestation, pour reproduire une alcoolisation fœtale. 1 921 souris, mères et petits confondus, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur note que les souris vacillent après l'injection, l'alcoolémie étant mesurée trente minutes plus tard, et affirme qu'elles ne montrent pas de signe de souffrance au moment de l'injection. Toutes sont tuées, les mères anesthésiées puis mises à mort pour prélever les embryons, les souriceaux pour prélever leur cervelet à neuf stades de développement.

Objectifs

Les Troubles Causés par l’Alcoolisation Fœtale ou TCAF sont des troubles du neurodéveloppement liés à des consommations modérées ou discontinues d'alcool pendant la grossesse. Cette pathologie, dont la prévalence est évaluée à 1% des naissances, se traduit par l’apparition d’atteintes neurologiques chez l'enfant avec des répercussions fonctionnelles qui se révèlent progressivement avec l’âge. Dès lors, de nombreuses études visant à caractériser les anomalies du neurodéveloppement chez les enfants TCAF se sont portées sur des structures intégratives telles que le néocortex ou encore l’hippocampe. Celles-ci ont notamment révélées une tortuosité significative des vaisseaux sanguins induisant un mauvais positionnement des cellules nerveuses. Pour autant, plusieurs déficits observés chez ces enfants, tels que les troubles orthoptiques ou des défauts de motricité fine, suggèrent que le cervelet pourrait également participer aux déficits induits par une alcoolisation in utero. Les objectifs de ce projet seront donc (i) de caractériser la vascularisation et les interactions neurovasculaires au cours du développement du cervelet, puis ii) d’évaluer l’impact de l’alcoolisation in utero sur la mise en place vasculo-associée des cellules du cortex cérébelleux. A terme, nous pourrons ainsi déterminer si le cervelet participe aux déficits observés chez les enfants TCAF afin d'optimiser leur prise en charge.

Bénéfices attendus

Le présent projet permettra tout d'abord d’identifier pour la première fois le mécanisme de mise en place de la vascularisation dans le cervelet murin en développement. Ainsi, nous pourrons déterminer si une migration vasculo-associée participe à la mise en place du cervelet au cours de l'embryognenèse ou lors de la période postnatale et si celle-ci est altérée en condition d'alcoolisation foetale comme déjà démontré dans le cortex cérébral et la rétine. De plus, l’implication d'un service de pédiatrie néonatale dans ce projet nous permettra d’envisager une transposition de nos résultats immunohistochimiques à l’enfant. Dès lors, une corrélation entre les altérations histologiques du cervelet et les atteintes neurodéveloppementales observées chez les enfants atteints de TCAF pourra être envisagée et la prise en charge de ces enfants pourra alors prendre en compte les déficits neurologiques de manière plus intégrée, i) en orientant la thérapeutique vers la cible vasculaire et ii) en incluant la participation du cervelet lors des traitements symptomatiques.

Procédures

Afin de mimer une alcoolisation foetale, de l’alcool sera administré par voie sous cutanée à des souris gestantes du 12ème au 20ème jour embryonnaire soit 9 injections au total Avant la procédure d'injection, les souris gestantes seront préalablement légèrement anesthésiées afin de limiter le stress. La manipulation dure environ 1 minute pour chaque injection. Ce protocole d'alcoolisation répétée par injection est décrit dans des cas d’alcoolisation maternelle. Lors des prélèvements des embyrons, les mères seront soumises à une anesthésie dans une chambre d'induction avant leur euthanasie. Lors des prélèvements des cervelets chez les souriceaux postnataux, les animaux sont également anesthésiés avant l'euthanasie.

Impact sur les animaux

A la suite de l’injection d’alcool chez les mères gestantes, les souris vacillent reflétant l’alcoolémie mesurée après 30 minutes comme observé chez l’humain après alcoolisation. Au cours de l’injection, les souris ne montrent pas de signe de souffrance. Les études déjà réalisées sur ce modèle murin TCAF n'ont pas démontré d'augmentation de fausses couches ou de mortalité précoce chez les embryons/souriceaux.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés dans cette étude sera euthanasié à la fin de l'expérimentation soit du fait du prélèvement d'organes ou d'embryons, soit du fait qu'ils auront reçu des injections journalières pendant 9 jours (de NaCl 0.9% ou d'alcool) et qu'ils ne pourront donc pas être réutilisés pour d'autres expérimentations (mères gestantes).

Remplacement

Certains déficits observés chez les enfants TCAF, tels que les troubles cognitifs, orthoptiques ou des défauts de contrôle de la motricité fine laissent penser que le cervelet pourrait participer aux déficits induits par une alcoolisation foetale. A l'appui de cette hypothèse, les images d'IRM montrent que ces enfants présentent un volume cérébelleux plus faible. De plus, plusieurs études réalisées sur des modèles animaux ont montré que les populations nerveuses du cervelet présentent une sensibilité importante à l'alcool. Cependant, au regard de ces travaux, il reste difficile d'évaluer l'impact d'une exposition prénatale à l'alcool sur le développement du cervelet. En effet, les modèles utilisés jusqu'alors sont soit des cultures cellulaires, ce qui ne permet pas d'obtenir un système intégré, soit des souris entre le 4ème et le 10ème jour postnatal, ce qui correspond au 3ème trimestre de gestation chez l'Homme, alors que les différents types cellulaires sont déjà présents au sein du cervelet, et ce qui implique d'étudier les effets directs de l'alcool et non l'effet d'une alcoolisation de la mère sur le développement du petit. De plus, il n'existe que peu voire pas de données sur la mise en place de la vascularisation et sur l'existence d'une migration vasculo-associée au cours du développement embryonnaire du cervelet, et, par voie de conséquence, l'impact de l'alcoolisation foetale sur ces événements précoces n'a jamais été étudié. Notre étude vise donc tout d'abord à décrire la vascularisation du cervelet chez des embryons de souris à différents âges pour déterminer si les cellules cérébelleuses utilisent les vaisseaux sanguins en tant que support de migration au cours de l'embyrogenèse. Puis, en utilisant un modèle animal TCAF, nous pourrons identifier les mécanismes impactés par une alcoolisation foetale afin de mieux appréhender la participation du cervelet aux déficits TCAF et d'adapter la prise en charge thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet et obtenir des résultats statistiquement interprétables à l'aide du test non paramétrique Mann-Whitney. 1. Pour la caractérisation de la vascularisation et de la migration vasculo-associée dans le cervelet au cours du développement, les âges d’intérêt ont été identifiés en s’appuyant sur la littérature afin qu'ils soient en corrélation avec les étapes clefs du neurodéveloppement cérébelleux humain. Ainsi 4 stades embryonnaires et 5 stades postnataux seront étudiés à raison de 4 animaux par stade pour obtenir une moyenne statistiquement interprétable des paramètres vasculaires et vasculo-associés. Ces 4 animaux devront être de portées différentes pour prendre en compte la variabilité inter-portée dans l'interprétation des résultats. Pour les marquages immunohistochimiques, 10 anticorps différents sont requis pour identifier l'ensemble des vaisseaux sanguins et des populations cellulaires cérébelleuses. En transparisation, les marquages immunohistochimiques sont obligatoirement réalisés sur des embryons ou cervelets postnataux entiers, ce qui nécessitera 4 animaux de portée différente par stade et par marquage. En revanche, pour l'immunohistochimie sur coupe, la taille du cervelet permettra de réaliser plusieurs marquages différents sur le même échantillon, permettant de réduire le nombre d'animaux. 2. Pour étudier l'impact d'une alcoolisation foetale sur la vascularisation et la migration vasculo-associée, il sera nécessaire de réitérer l'ensemble des marquages précédents sur des embryons « contrôle sham » dont la mère a reçu des injections de NaCl pour confronter les résultats obtenus avec les animaux « alcoolisés in utero » et éviter les biais expérimentaux liés à l'injection en elle-même. Pour les études de PCR et western blot, la taille du cervelet nécessitera un animal par condition et par technique jusqu'à l'âge de la naissance inclus. En revanche, pour les stades plus tardifs, ces 2 techniques pourront être réalisées en parallèle sur un même animal en divisant le cervelet en deux au moment du prélèvement. Enfin, pour la zymographie, un animal par condition sera nécessaire du fait de la préparation de l'échantillon.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation. Ils seront maintenus dans un environnement stabilisé (température 21 ± 1 °C, hygrométrie 55%, luminosité 100 lux avec photopériode régulée (cycle jour/nuit 12h/12h)). Ils auront libre accès à l’eau et à la nourriture, et un enrichissement sera mis en place (tunnel en carton, demi-sphère de cellulose et lanières de papier kraft). Ils seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et leur bien-être sera surveillé après les injections d’alcool/NaCl. En cas de dépassement des points limites identifiés (signe de douleurs extérieurs indexés sur Mouse Grimace Scale, manifestations de signe de détresse ou d’infection) ou de défauts significatifs de développement, les animaux seront mis à mort comme décrit précédemment. Lors de la procédure d'alcoolisation foetale, les mères seront conservées dans leur cage d’hébergement et amenées dans la pièce d’expérimentation 1h avant les injections pour limiter tout stress de l’animal. Cette pièce est calme et isolée d'autres animaux. Les mères ayant reçu l'injection seront surveillées en temps réel pendant 45 min avant leur retour dans leur hébergement. Lors des prélèvements, les animaux en attente de l'euthanasie sont placés à l'écart de la table d'expérimentation pour éviter tout stress environnant.

Choix des espèces

La Souris est un modèle de choix pour l’étude de nombreux systèmes physiologiques complexes dont les mécanismes sont similaires aux mammifères. C'est le cas du développement cérébral par exemple. Or le cervelet suit les mêmes étapes de développement que le reste du cerveau avec des séquences de prolifération, migraion, différenciation et apoptose. L'utilisation de ce modèle est donc tout à fait pertinent dans cette étude. De plus, la majorité des publications antérieures relatives aux TCAF a été réalisée chez la souris. Par souci de cohérence et de vision intégrée de l'effet de l'alcoolisation foetale sur le développement nerveux, il est donc nécessaire de poursuivre avec ce modèle murin avant la transposition clinique. Les stades de développement d’intérêt ont été déterminés sur la base des événements clefs de la neurogenèse du cervelet qui sont également bien identifiés chez l'Homme. Ainsi les stades embryonnaires choisis correspondent respectivement à la naissance des cellules de Purkinje, à l’émergence des précurseurs des cellules en grains puis des cellules de Golgi, et enfin à la mise en place de la couche granulaire externe. Puis, pour les études postnatales, les trois premières semaines postnatales représentent successivement une phase de prolifération des cellules en grains dans la couche granulaire externe, le développement de l'arbre dendritique des cellules de Purkinje, la mise en place du circuit cortical cérébelleux et enfin la fin du développement du cervelet chez le jeune adulte. L'alcoolisation sera réalisée uniquement chez la mère gestante mais pas directement sur le souriceau postnatal.