Souris

Les souriceaux nouveau-nés sont endormis par le froid, dans un gant posé au contact indirect de la glace, puis tués. Sur les femelles gestantes, une ouverture de l'abdomen de 45 minutes sous anesthésie permet d'introduire du matériel génétique dans les embryons. 2 396 souris vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance léger pour 1 344 d'entre elles et modéré pour 1 052, alors que le porteur affirme que les points limites sont respectés "de manière à éviter toute souffrance des animaux" et annonce dans le même document que certaines lignées présenteront peut-être une difficulté à se nourrir ou une absence de poche de lait dès la naissance. Toutes sont tuées, les surnuméraires nées avec le mauvais génotype, les femelles ayant porté les embryons manipulés, les souris dont le cerveau est prélevé pour analyse, et les mâles isolés pour les accouplements contrôlés qui ne peuvent plus réintégrer un groupe.

Objectifs

Le syndrome des mouvements miroirs congénitaux (MMC) induit chez le sujet un mouvement incontrôlé d'une main qui mime le mouvement volontaire réalisé par la main opposée. Les personnes présentant des mouvements miroirs ne sont pas capables d'effectuer des tâches motrices unimanuelles pures, comme écrire et ont des difficultés pour les tâches bimanuelles nécessitant un contrôle indépendant des deux mains, comme ouvrir un pot de confiture. Il s'agit d'une maladie génétique rare dans laquelle les mouvements miroirs sont la seule manifestation clinique. Trois gènes sont connus à ce jour pour être impliqués dans cette maladie mais leur rôle n'est pas clairement identifié. L’objectif de ce projet sera d'identifier le mécanisme par lequel ils influent sur l'apparition de cette pathologie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra des avancées importantes dans la compréhension des mécanismes de mise en place des axones des neurones impliqués dans le contrôle des mouvements volontaires et des fonctions dans le système nerveux central d’une protéine impliquée dans la réparation de l’ADN (constitutant principal des chromosomes). A plus long terme et au-delà des connaissances fondamentales sur le développement du système permettant la réalisation des mouvements volontaires, nous espérons clarifier la pathogenèse des Mouvements en Miroir Congénitaux (MMC) et proposer de nouvelles hypothèses de travail pour la recherche clinique dans le champ des maladies du mouvement. En effet, l'étude de modèles animaux et cellulaires reproduisant les défauts génétiques impliqués dans les MMC clarifiera la pathogenèse de ce trouble. Cela est important car il n'existe actuellement aucun traitement, et certains patients ont une incapacité significative dans les activités de la vie quotidienne, des douleurs aux membres supérieurs, une inhibition psychosociale et une perte d'estime de soi en raison de la maladie. Enfin, l’étude des mutations Mouvements Mirroirs de la protéine connue pour son rôle dans la réparation de l’ADN pourrait également intéresser le domaine de la réparation de l'ADN et du cancer.

Procédures

Un prélèvement de l’extrémité de la queue sera réalisé sur animaux vigiles entre leur 7ème et leur 10ème jour de vie postnatale pour l'identification génétique. Ce geste sera réalisé une seule fois et n’excèdera pas 2 minutes par animal. Une chirurgie au niveau abdominale de femelles gestantes, suivie de l'introduction de matériel génétiques dans les embryons sera réalisée une seule fois. Cette procédure chirurgicale s'effectue sous analgésie et anesthésie gazeuse générale et n'exède pas 45 minutes. Les nouveau-nés recevront un antalgique avant d’être profondément endormis par hypothermie dans la glace (contact indirect) puis euthanasiés. Certains mâles seront isolés entre deux accouplements. Les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire.

Impact sur les animaux

Lors de la génération des animaux expérimentaux, l’isolement des mâles pour la réalisation des accouplements contrôlés pourra générer un stress. Le prélèvement de l’extrémité de la queue, pour connaitre le patrimoine génétique des animaux, peut générer une légère et brève douleur. L’anesthésie par le froid chez les jeunes même sous analgésie pourra générer un stress. Les procédures de chirurgie peuvent provoquer une hypothermie pendant l'anesthésie et une douleur pendant 24/48h. Certains animaux des nouvelles lignées présenteront peut-être un phénotype dommageable soit à la naissance (difficulté à se nourrir, absence de poche de lait), soit concernant leur locomotion.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet soit parce que ce sont : i) des animaux surnuméraires (génération de mauvais génotypes pour avoir les animaux avec les génotypes d’intérêt pour notre étude), des femelles ayant généré des animaux expérimentaux (E16 ou animaux électroporés), iii) des animaux expérimentaux pour l’analyse de leur cerveau, ou enfin des mâles qui ont été isolés et ne peuvent donc plus réintégrer un groupe de mâles.

Remplacement

Les neurones impliqués dans ce syndrome et qui contrôlent les mouvements volontaires ont leur corps cellulaire dans le cortex et leur axone va jusque dans la moelle épinière. Pendant le développement, ces axones traversent de nombreuses régions du cerveau. Il n’est pas possible d’étudier un faisceau qui traverse d’aussi nombreuses régions dans des modèles de culture cellulaire. Une fois les acteurs déterminés, nous étudierons les mécanismes moléculaires à l’aide de modèles de cultures cellulaires pour limiter le nombre d’animaux utilisés.

Réduction

Le projet impliquera un total de 2396 animaux. Des expériences préliminaires ont permis d’estimer à 10 le nombre d’animaux par génotype (calcul de puissance) pour obtenir des résultats statistiquement concluants. La composition des groupes d'animaux a été optimisée en restreignant leur effectif tout en garantissant l'obtention de résultats statistiquement concluants. Par exemple dès que nous aurons obtenus le nombre de 10 petits par génotype et par âge dans une condition, nous n’effectuerons plus de nouveaux accouplements contrôlés. Pour réduire le nombre d’animaux dont l’expression des gènes d’intérêt aura été modifié, nous utiliserons la technique d’électroporation (au lieu de générer de nouveaux modèles murins).

Raffinement

Les animaux sont sous la supervision de zootechniciens soigneurs et du vétérinaire désigné. L’hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010/63/UE. Dans le cas des mâles isolés pour les accouplements contrôlés, des bâtonnets à ronger seront ajoutés à l'enrichissement déjà présent. Les souris seront observées quotidiennement. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Les portées des 5 nouvelles lignées seront surveillées plus spécifiquement dans les premiers jours postnataux (présence de lait dans l’estomac) et au moment de la mise en place de la locomotion (P12-P15) pour détecter un éventuel phénotype dommageable. Les petits présentant des signes cliniques seront systématiquement euthanasiés. Les 2 manipulations pour l’identification et le prélèvement de l’extrémité de la queue des animaux sont réalisées au même moment pour limiter le nombre de manipulation. Concernant la procédure chirugicale, les femelles ne sont séparées que le temps de la procédure et de la récupération post-opératoire. Pendant la chirurgie, l’animal est sous anesthésie générale et placé sous un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. L’animal reçoit une injection d’un analgésique et d’un anesthésique local pour prévenir la douleur pendant et après la chirurgie. Pendant l’opération, les yeux sont protégés par un gel ophtalmique. Les animaux sont placés dans une cage de réveil posée sur un tapis chauffant. Lorsque l’animal a récupéré, il réintégre sa cage d’origine. Son comportement est surveillé. Il reçoit une nouvelle dose d'analgésique 6 à 8h après son réveil. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience, notamment le jour de la mise bas afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation. Les nouveaux nés seront surveillés. En cas de rejet par la mère, ils seront euthanasiés. Les souriceaux endormis par le froid ne seront pas en contact direct avec la glace, ils seront dans un gant et recevront au préalable une injection d’analgésique.

Choix des espèces

Les souris sont des rongeurs, et comme les écureuils, elles utilisent leurs deux pattes avant pour effectuer des tâches complexes, comme manipuler de la nourriture. Les neurones qui contrôlent les mouvements volontaires fins chez les souris sont similaires à ceux que nous avons chez les humains. L’étude de ces neurones chez la souris représente un bon modèle pour mieux comprendre le syndrome des mouvements en miroir. Chez les souris, nous pouvons créer des modèles génétiques spéciaux qui nous permettent de comprendre comment certains gènes influencent certaines parties de leur cerveau. Ces modèles sont utiles car ils nous aident à éviter des mutations génétiques trop graves, tout en nous permettant d'analyser précisément comment un gène particulier fonctionne dans une région spécifique du cerveau. Dans cette étude, nous réaliserons des expériences d'injection chez l'embryon, au moment où les neurones qui contrôlent les mouvements volontaires fins sont produits dans le cerveau. En parallèle, des souris femelles ou mâles seront étudiées à 3 stades. Pendant la période embryonnaire, moment où les premiers axones du faisceau que nous étudions traversent des régions importantes du cerveau pour leur développement. Juste après la naissance l’âge où ces premiers axones traversent la ligne médiane et arrivent dans la moelle épinière. A l’âge adulte entre 3-4 mois. Les animaux reproducteurs auront entre 3 et 12 mois (maximum).

Trop faibles pour atteindre la nourriture placée en hauteur dans leur cage, les souris mâles privées de myotubularine développent une faiblesse musculaire généralisée qui gêne leurs déplacements. 850 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 798 d'entre elles et modéré pour 52. Elles subissent l'ablation d'un bout de queue pour génotypage, deux à six prélèvements de sang sous anesthésie, puis une perfusion intracardiaque qui les tue en moins d'une minute, pour chercher des anomalies du foie que les patients atteints de myopathie myotubulaire présentent dans 91 % des cas. Deux lignées sont utilisées, l'une privée de la protéine dans tout le corps et dont l'espérance de vie ne dépasse pas six à huit semaines, l'autre seulement dans le foie, retenue parce qu'elle vit assez longtemps pour laisser à l'atteinte hépatique le temps de se développer.

Objectifs

La myopathie myotubulaire est une maladie congénitale liée au chromosome X, affectant les garçons et caractérisée par une faiblesse musculaire généralisée et une insuffisance respiratoire. Les patients meurent prématurément dans les premières années de vie, généralement suite à un arrêt respiratoire. Cette myopathie est due à des mutations dans un gène exprimant une protéine, la myotubularine qui est présente dans l’ensemble du corps humain. Des maladies du foie et des voies biliaires ont notamment été reportées pour 91% des patients. Un modèle murin de la myopathie myotubulaire a été créé avec une absence d’expression de la protéine dans l’ensemble des tissus. De prime abord, il ne montre pas de signe apparent d’une dysfonction au niveau de la structure du foie. Cependant, des analyses plus approfondies doivent être réalisées pour détecter certaines anomalies du foie. De plus, l’espérance de vie de ces souris ne dépassant pas 6 à 8 semaines, à cause de leur insuffisance respiratoire, il est possible que la pathologie hépatique ne se soit pas suffisamment développée pour être détectable au niveau structurel. Nous disposons d’un autre modèle murin n’exprimant pas la myotubularine spécifiquement dans le foie qui nous permettra de caractériser la fonction hépatique sur une période plus longue, à différents âges, puisque l’espérance de vie de ces animaux ne sera pas affectée. Dans ce projet, nous souhaitons donc étudier les problèmes qui peuvent survenir dans le foie sur les deux modèles de souris et ce, par des analyses d’enzymes hépatiques, des analyses de la structure du foie et des analyses biologiques.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’identifier et de caractériser des atteintes hépatiques dans un modèle existant de la myopathie myotubulaire ou dans un nouveau modèle spécifique pour mieux comprendre la pathologie hépatique observée chez les patients. Cela permettrait également d’identifier de nouveaux candidats thérapeutiques pour lesquels nous pourrions à l’avenir vérifier leur efficacité chez la souris, pour à terme apporter une solution thérapeutique adaptée aux patients.

Procédures

Prélèvements de sang sur animaux vivants anesthésiés : environ 5 min par souris, 2 à 6 fois en fonction de l’âge à l’euthanasie. Injection intrapéritonéale d’anesthésiques et injection sous-cutanée d’analgésique pour certains groupes avant perfusion intracardiaque : moins de 1min, 1 fois pour ces deux types d’injection. Perfusion intracardiaque pour fixation des tissus : moins d’une minute avant la mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un prélèvement d’un bout de queue associé au tatouage, pour identification et génotypage. Les nuisances que le modèle n’exprimant pas la myotubularine dans l’ensemble des tissus peut rencontrer sont liées à l’absence de la protéine dans les muscles squelettiques. Les mâles développeront une faiblesse musculaire généralisée, ce qui rendra difficile leur déplacement et l’accès à la nourriture située dans la partie supérieure des cages. Les injections intra-péritonéales, sous-cutanées ou les prélèvements sanguins provoquent une douleur légère liée à la piqûre.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir prélever le foie qui nous permettra de caractériser son état, sa fonction, sa structure, et des altérations biomoléculaires. Tous les animaux reproducteurs servant au maintien des lignées seront euthanasiés lorsque la reproduction ne sera plus efficace.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est indispensable pour caractériser l’atteinte hépatique observée chez les patients tels que les défauts de localisation de certaines molécules dans les différents compartiments du foie (canal biliaire par exemple), les défauts de structure de ces compartiments, ou encore les défauts de composition de la bile. Les organoïdes de foie que l’on pourrait développer ne possèdent pas à ce jour toutes les caractéristiques du foie : ils ne possèdent pas les structures anatomiques spécifiques comme les canaux biliaires, et par conséquent également il n’y a pas de flux biliaire. Les modèles animaux sont donc nécessaires pour cette étude.

Réduction

Le nombre minimal d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été défini à l’aide de calculs statistiques pour pouvoir observer des différences entre les animaux sains et mutés ou pour maintenir les lignées le long du projet. Pour la caractérisation des souris porteuses de la mutation uniquement dans le foie, trois âges d’euthanasie sont définis : 3 mois, 6 mois et 12 mois. Si dès 3 mois, l’atteinte hépatique s’est développée, nous étudierons l’évolution jusqu’à 6 mois.Les animaux à 12 mois ne seront peut-être pas utilisés si l’atteinte hépatique s’est développée à 3 et 6 mois.

Raffinement

Afin de raffiner nos études, les animaux seront hébergés tout au long de l’étude dans des cages enrichies à l’aide de coton et de bâtons à ronger dans un environnement exempt d’organismes pathogènes. En cours de protocole, pour prévenir la douleur provoquée par le prélèvement sanguin par voie rétro-orbitale ou mandibulaire, les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse. Concernant les souris porteuses de la mutation dans l’ensemble des tissus, des observations attentives et des mesures de poids seront effectuées 3 fois par semaine, en plus de l’observation quotidienne des animaux. Un aliment hydratant et nourrissant sera de plus placé au sol dans la cage pour faciliter l’accès aux souris malades. Afin de réduire la souffrance et le stress de ces animaux, des points limites ont été établis.

Choix des espèces

Les souris porteuses de mutation dans le gène exprimant la myotubularine ont été choisies comme animaux modèles car ces animaux ont pu être modifiés génétiquement afin de présenter la délétion du gène responsable de la myopathie myotubulaire, de façon ubiquitaire ou spécifiquement dans le foie, ce qui en font les plus petits modèles animaux à caractériser pour la fonction hépatique. Les mâles n’exprimant pas la protéine dans l’ensemble des tissus ainsi que les animaux contrôles seront utilisés après sevrage, à l’âge de 3 semaines et seront euthanasiés à l’âge de 6 semaines. A ce stade, la pathologie s’est suffisamment développée pour permettre la caractérisation d’une éventuelle atteinte hépatique. Les animaux qui n’expriment pas la protéine dans le foie et les animaux contrôles, seront utilisés à partir de 2 mois et jusqu’à 3, 6 ou 12 mois pour observer une évolution des enzymes hépatiques dans le sang et laisser le temps aux souris de développer une atteinte hépatique que l’on caractérisera à partir de prélèvements post-mortem. Les animaux à 12 mois ne seront peut-être pas utilisés dans l’étude si l’atteinte hépatique s’est développée à 3 et 6 mois.

5 500 souris vont être utilisées, chacune recevant de trois à plus de quinze injections, et 5 280 d'entre elles portant une tumeur greffée sous anesthésie. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré pour 4 300 animaux, avec perte de poids, dos voûté, réactions allergiques pouvant aller jusqu'à la léthargie, et pour les survivantes suivies au-delà de quatre mois une anémie liée à l'atteinte des reins par la molécule radioactive. Toutes sont tuées, 3 350 lors d'une prise de sang terminale sous anesthésie. Le porteur commande 10 à 20 % de souris en plus pour couvrir les pertes, et indique que les animaux écartés des études sont le plus souvent utilisés pour entraîner le personnel.

Objectifs

Dans ce projet de radioimmunothérapie préciblée (PRIT), deux anticorps modifiés dirigés contre les cellules tumorales sont utilisés pour les pré-cibler et servent donc de vecteurs de ciblage. Une petite molécule chélatrice, contenant un radionucléide émettant des particules alpha, est ensuite utilisée comme vecteur de destruction des cellules cancéreuses. Cette approche en deux temps, plus spécifique que la radioimmunothérapie classique, évite d’irradier et ainsi d’endommager les cellules saines, tout en gardant un fort pouvoir de destruction des cellules cancéreuses. L'objectif principal du projet est d'évaluer la tolérabilité, la biodistribution et l’efficacité thérapeutique de ce traitement de radioimmunothérapie pré-ciblé dans différents modèles tumoraux et murins. Cet objectif n’est envisageable qu’après une phase d’optimisation des paramètres du traitement, comme par exemple l’évaluation de la dose injectée d’anticorps, de l’activité injectée de la molécule radioactive ou du temps d’attente entre les deux injections. Deux objectifs secondaires sont également visés lors de ce projet, le premier est de trouver d’éventuels partenaires thérapeutiques afin d’améliorer l’efficacité de ce traitement. Le second consiste à évaluer le potentiel thérapeutique du PRIT sur d’autres cibles thérapeutiques surexprimées à la surface d’autres cellules tumorales afin d’élargir le nombre de patiients pouvant bénéficier de ce traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet consiste à développer un nouveau traitement de radioimmunothérapie pré-ciblé utilisant le 212Pb. L’objectif final est donc le passage de ce traitement en phase 1 d’un essai clinique en 2025. Concernant le projet de recherche appliquée, il vise différents objectifs à court et long terme. À court terme, la biodistribution des différents composés, l’efficacité thérapeutique et la tolérabilité de ce nouveau traitement sont à évaluer. Pour ce faire, différentes études utilisant des souris seront réalisées (incluant une première phase d’optimisation du schéma thérapeutique). Ensuite, l’étude des mécanismes d’action est également à réaliser pour permettre une meilleure compréhension des phénomènes mis en jeu (effet direct des rayonnements ionisants, activation du système immunitaire...). Ceci permettra le test de nouvelles opportunités de combinaison basées sur une analyse rationnelle des mécanismes d’action, afin de moduler les réponses au traitement pour augmenter son efficacité/tolérabilité. Enfin ce traitement de radioimmunothérapie pré-ciblé peut également être dirigé contre d’autres cibles thérapeutiques que celle choisie pour ce projet. Ainsi, une phase d’évaluation de nouvelles cibles thérapeutiques sera également réalisée afin d’élargir le nombre de patients pouvant bénéficier de ce traitement extrêmement prometteur. A long terme, toutes ces études ont pour objectif final d’appuyer les dossiers de demande d’essais cliniques.

Procédures

Les gestes techniques réalisés sur les souris sont : inoculation sous-cutanée de cellules tumorales, implantation de cellules tumorales par chirurgie ou injection intraveineuse ou intrapéritonéale, traitement par injection intrapéritonéale ou intraveineuse, gavage ou prise de sang. L‘inoculation des cellules tumorales est réalisée sous anesthésie générale. Cela concerne 5280 souris. Les 10% des animaux restant (soit 220 souris) subissent l’injection intraveineuse ou intrapéritonéale des cellules tumorales en vigile. N.B. Dans de très rare cas, des animaux ne sont pas greffées avec des cellules tumorales dans le but de simplement évaluer la tolérabilité d’un traitement. Un protocole d’analgésique, pour diminuer la gêne et la douleur des souris au maximum lors de l’implantation des cellules tumorales par chirurgie, est réalisé toutes les 12h en injection sous-cutanée pendant 48h et débutant entre 30 min et 3h avant l’intervention chirurgicale associée à une mise à disposition dans l’eau de boisson. Cela représente 540 souris. Les injections intraveineuses, intrapéritonéales ou par gavage en vigile sont réalisées sur 100% des souris. Les souris reçoivent en général entre 3 et 9 injections de traitement (ou de solutions véhicules pour les groupes non traités) pouvant aller jusqu’à plus de 15 injections si le nombre de cycles de traitement est augmenté. Les prises de sang sont réalisées sous anesthésie en terminal (sans réveil) sur 3350 souris. Des prélèvements de sang répétés peuvent également être réalisés, sous anesthésie générale (de 3 à 10 prélèvements espacés d’une semaine à plusieurs mois) en respectant les volumes prélevés et le temps de rétablissement recommandé. Cela concerne 1070 souris.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, nous sommes amenés à réaliser plusieurs injections aux souris (cellules, traitements…), ce qui entraine la nuisance aux souris la plus importante. De plus, des anesthésies peuvent également être réalisées, générant un stress chez l’animal. Un léger stress lié aux manipulations est également observable mais est fortement diminué grâce à l’habituation mise en place au préalable. Cette demande étant un renouvellement, nous avons un retour d’expérience important sur les nuisances générées après notre traitement. Ce traitement peut engendrer de façon très transitoire certains effets indésirables (perte de poids et fatigue passagère le plus souvent démontrée par le dos vouté, poil négligé, baisse d'activité). Ces effets secondaires sont légers à modérés et transitoires. Un complément alimentaire en gel est ajouté pendant les 7 jours suivant l’injection de la molécule radioactive pour une meilleure récupération. Ce complément est maintenu si les souris présentent une perte de poids supérieure à 10% de leur poids initial. Dans le cas d’un suivi à très long terme des souris guéries (> à 120 jours post traitement), certains symptômes peuvent apparaitre (ex : anémie ou surconsommation d'eau). Cela serait lié à une diminution des fonctions rénales due à la voie d’élimination de la molécule radioactive via les reins. L’injection répétée d’anticorps humains peut engendrer des réactions immunitaires (type réaction allergique) chez la souris si celle-ci est immunocompétente. La réaction peut-être plus au moins forte : démangeaison, vasodilatation, somnolence pouvant allez jusqu'à la léthargie, gonflement de la face, etc. Ces réactions ne sont que transitoires (entre 5 minutes à 2h). Une surveillance accrue des souris est faite jusqu’au rétablissement complet de la souris. La déplétion au préalable des lymphocytes B ou le choix d’un modèle murin humanisé, ou immunodéprimé lorsque cela est possible, permettent d'éviter ce type de réactions. Le choix des souris immunocompétentes est fait que lorsque l’objectif de l’étude est l’analyse des mécaniques d’action ou d’une combinaison mettant en jeu le système immunitaire mais n’est pas fait de manière systématique sur ce projet.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet sont euthanasiés à la fin des études. Ce choix est justifié car l’adoption est impossible. En effet, les souris sont transgéniques et/ou immunodéficientes. De plus, dans la majorité des cas, elles sont porteuses d’une tumeur et/ou ont été injectées avec notre traitement. Certaines souris sont exclues d’une étude au moment de la création des groupes (développement tumoral ou poids non conforme aux autres animaux, problème de comportement, etc.). Ces souris peuvent être utilisées pour le maintien des compétences du personnel ou pour l’analyse d’organes ex vivo pouvant servir pour des analyses futures.

Remplacement

Tous les tests de mise au point des anticorps ont été réalisés par des tests in vitro. De plus, chaque étude in vivo est murement réfléchie et une alternative in vitro est envisagée le cas échéant. Par exemple, des tests réguliers de vérification sont faits en amont des études pour garantir le bon fonctionnement des anticorps et de la non-contamination des cellules tumorales utilisées. Cependant, l’étude d’un organisme complexe avec l’organisation biologique mimant un patient est indispensable dans le développement d’un radiopharmaceutique. C’est pour cela que le modèle murin a été choisi. Malheureusement aucune méthode de substitution n’est connue à ce jour.

Réduction

Basé sur des analyses statistiques, la comparaison de deux moyennes observées nécessite 10 souris/groupe pour obtenir une puissance statistique de 0.8 associé à un α de 0.05 (paramètres utilisés : moyenne 1 = 1500 mm3, moyenne 2 = 800 mm3, écart-type = 600 mm3). De plus, notre retour d’expérience nous permet de savoir que 10 souris/groupe permet d’obtenir des résultats statistiquement analysables. Ainsi, pour mettre en place des nouveaux modèles tumoraux ou évaluer la croissance tumorale (en fonction des traitements), un minimum de n=10 souris est généralement utilisée. Pour évaluer la biodistribution in vivo de la molécule radiomarquée, les expériences sont conçues en utilisant un nombre compris entre 3 et 6 souris par groupe. Le choix est fait en fonction d’expériences antérieures dans des études similaires, des résultats attendus ainsi que de l’objectif final de l’étude afin d’utiliser le nombre juste de souris. Pour chaque expérimentation une analyse au préalable pour définir le nombre de souris par groupe est réalisée en fonction des résultats attendus et de la puissance statistique souhaitée. L’analyse statistique à posteriori des données est automatisée et est effectuée à l’aide des logiciels spécifiques. Pour pallier à tout problème de perte de souris avant ou pendant les études (ex : malocclusion, blessures, perte de poids…), ou aux problèmes d’hétérogénéité de prise de greffe, des souris supplémentaires sont incluses dans les commandes de souris. Ce nombre de souris supplémentaires est défini en fonction de l’objectif des études et du retour d’expérience sur la lignée tumorale utilisée et est généralement de 10% avec un maximum de 20% lors d’utilisation de lignées tumorales avec un faible taux de prise de greffe ou un geste technique plus risqué pour les souris (ex : chirurgie). Ceci dans le but d’empêcher de recommencer une étude non analysable par manque de souris, pour être en accord avec la règle des 3R. Les souris exclues des études sont utilisées le plus souvent pour le maintien des compétences du personnel réalisant les expérimentations in vivo. Cela permet de réduire le nombre d’animaux commandé pour la formation du personnel et permet d’utiliser l’ensemble des souris à des fins scientifiques. Les souris exclues peuvent également être utilisées pour des prélèvements d’organes qui seront eux-mêmes utilisés pour différents tests in vitro et/ou mis en banque histologique pour une utilisation ultérieure.

Raffinement

Un minimum de 5 jours d’acclimatation est réalisé. Les animaux sont habitués à la manipulation, à la pesée, etc. Le lapse de temps entre l’inoculation des cellules tumorales et l’obtention de tumeurs de tailles suffisantes avant le début des traitements est également utilisé pour continuer l’habituation. Nous mettons différents éléments, à disposition dans les cages, permettant aux souris d’exprimer des comportements spécifiques à leur espèce (coton, pièce de bois, tunnel, maisonnette). Ces enrichissements peuvent être amenés à évoluer dans une optique d’amélioration continue et en fonction des situations (conflit, souche de souris plus sensible au stress, etc.). Des enrichissements supplémentaires sont également utilisés afin d’améliorer leur bien-être (graine de tournesol ou encore mezzanine). Des gestes simples mais indispensables sont également réalisés afin d’optimiser le confort des souris et de réduire le stress tels que : l’utilisation d’un gel pour le confort des yeux lors des anesthésies, la diffusion de musique classique via une radio installée dans la salle d’hébergement pour masquer les bruits environnants, un filtre rouge placé sur la fenêtre de la porte cachant la vision des souris sur l’extérieur (va-et-vient du personnel devant la porte), la température corporelle des souris est maintenue (tapis et lampe chauffante). Lors des chirurgies, un analgésique est utilisé en pré et post opératoire pour supprimer la douleur. Une fiche de score pour le suivi de l’état physique et comportemental de chaque animal est utilisée quotidiennement. Cette fiche permet de ne pas aller au-delà de nos critères de terminaison prédéfinis au début de l’étude expérimentale.

Choix des espèces

L'utilisation de la souris est justifiée par le développement de la biologie moléculaire qui a abouti à la création de nombreux modèles murins génétiquement modifiés, et par l'existence de lignées immunodéficientes (SCID, Athymique nue, etc.) qui autorisent la greffe de cellules tumorales humaines. Le séquençage complet du génome de la souris a démontré la proximité phylogénétique des souris et des hommes : 90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Le remplacement dans le génome du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées et ainsi de travailler sur des modèles très proches de ce que l'on pourrait voir chez l'homme. Nous utilisons des souris adultes ou en fin de développement pour nos expérimentations afin que leur système immunitaire soit mature. De plus nous avons besoins qu'elles soient assez jeunes pour un suivi à long terme, c'est pourquoi les souris intégrées aux études ont généralement 8 semaines. Cependant, l’utilisation de souris transgéniques nous contraint parfois à utiliser des souris plus jeunes car le nombre limité de ces souris ne nous permet pas d’avoir un lot du même âge pour débuter l’étude. De plus, nous essayons de recevoir les animaux de 6 à 15 jours avant le début de leur utilisation dans un protocole expérimental afin de réaliser l’acclimatation et l'habituation des souris.

2 496 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 2 424 d'entre elles. Une toxine leur est injectée dans les muscles des deux pattes arrière sous anesthésie afin de détruire le tissu, précédée de cinq injections dans l'abdomen. Après la lésion, le porteur ajoute du paracétamol dans l'eau de boisson pendant quarante-huit heures, une mesure dont il dit lui-même avoir mesuré un "très léger bénéfice" sur l'activité volontaire des animaux. Il présente la culture cellulaire comme un préalable systématique, puis conclut que l'expérimentation reste "indispensable" pour replacer les mécanismes dans la physiologie du muscle entier.

Objectifs

Le muscle strié squelettique adulte régénère après un dommage grâce aux propriétés des cellules souches musculaires qui communiquent avec d'autres cellules comme les cellules de l'immunité, les fibroblastes et les cellules des vaisseaux. La coordination dans l'espace et dans le temps de ces interactions est essentielle pour une bonne régénération. Les mécanismes moléculaires contrôlant ces interactions sont encore mal connus. Le projet vise à étudier ces interactions cellulaires et moléculaires en induisant une lésion musculaire pour suivre la réparation du muscle chez la souris adulte.

Bénéfices attendus

Les bénéfices premiers du projet sont d'apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes de la régénération musculaire. Ces données seront utiles dans le futur pour comprendre les défaillances du processus de régénération dans des conditions physiologiques ou pathologiques particulières (vieillissement, myopathies, diabète, etc.)

Procédures

Les souris sont soumises à des injections intrapéritonéales (30 secondes) (5 fois) et à l’induction d’une lésion musculaire via une injection intramusculaire bilatérale de toxine (sous anesthésie) (procédure de 5 minutes) (1 fois)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues incluent: - un stress lors de la contention pour les injections intrapéritonéale - un stress lors du gavage - un stress lors du déplacement dans la boite d'anesthésie - Une diminution transitoire de l'activité spontanée après l'induction de la blessure musculaire

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement des organes

Remplacement

Le laboratoire a une longue expérience des essais in vitro par la culture cellulaire. Les questions scientifiques sont d'abord validées in vitro avant d'aborder l'expérimentation animale. Celle-ci est néanmoins indispensable pour d'une part observer les mécanismes cellulaires et moléculaires ex vivo et d'autre part les intégrer dans la physiologie du tissu musculaire dans l'organisme.

Réduction

- L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. - Les deux muscles des deux pattes arrière sont utilisées afin de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés - les tissus et cellules des animaux sont réutilisés grâce à un système de banking dans le laboratoire

Raffinement

Le raffinement inclut une procédure afin de définir la meilleure voie d'administration du tamoxifène tout en conservant l'efficacité permettant l'analyse génomique. Le raffinement à la suite de l'induction de la lésion bilatérale inclut l'addition de paracétamol dans l'eau de boisson pour 48h à la suite d'une étude que nous avons menée montrant un très léger bénéfice du paracétamol sur l'activité volontaire des animaux (roue d'activité). Une anesthésie générale est réalisée pour l’induction de la lésion musculaire.

Choix des espèces

La souris a un système musculaire et un processus de régénération musculaire proches de ceux de l'homme. Les animaux utilisés sont à l'âge adulte (8-12 semaines).