Souris

Une greffe intracérébrale de quarante-cinq minutes, au moins dix injections pour l'imagerie de bioluminescence, dix séances de radiothérapie et douze administrations du composé testé. 164 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le projet évalue si la surexpression d'une protéine ralentit la croissance d'un glioblastome humain greffé dans leur cerveau et améliore la réponse aux traitements standards. Les souris sont choisies immunodéprimées pour qu'elles ne rejettent pas le greffon tumoral humain, et quarante-huit d'entre elles, dites "satellites", sont tuées plus tôt pour l'analyse de leurs tissus, les autres l'étant dès qu'un point limite est atteint, perte de poids et troubles de la motricité surtout.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment l'augmentation de la quantité d'une protéine affecte la croissance des tumeurs cérébrales chez les souris, et favorise leur réaction aux traitements anticancéreux habituels. L'objectif final est d'appliquer cette méthode aux patients. Des études précédentes sur des données de patients ont montré que plus cette protéine est présente, meilleure est la survie des patients, surtout chez les femmes. En laboratoire, nous avons aussi observé que lorsqu'on augmente la quantité de cette protéine, le nombre de cellules tumorales diminue de moitié. De plus, nous avons constaté qu'un activateur de cette protéine a un effet antitumoral sur des tumeurs greffées sous la peau de souris, qu'elles soient mâles ou femelles. Notre objectif est maintenant d'étudier comment une augmentation de la quantité de cette protéine combinée à son activation par une molécule spécifique affecte la croissance tumorale et la réponse aux traitements anticancéreux standards dans un modèle de tumeur intracérébrale chez la souris (qui se rapproche de la réalité chez l'humain). Ce projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet constitueront une base pour comprendre le rôle de la protéine étudiée dans l’augmentation de la survie des patients et éventuellement proposer l'utilisation de l'activateur de cette protéine pour le traitement des glioblastomes chez les patients dont la tumeur présente une forte quantité de cette protéine. Cette étape est indispensable pour soutenir le transfert clinique de nos travaux en lien avec une thèse de doctorat et les financements de la Ligue contre le cancer et du CNRS. En effet, ce projet innovant (très peu décrit dans la littérature) permettrait à terme de mieux comprendre les processus responsables des différences d'apparition des glioblastomes et de réponse au traitement entre les hommes et les femmes. En cas de résultats probants, cela permettrait d'apporter de nouvelles voies thérapeutiques pour la recherche clinique, notamment en employant des inducteurs (qui augmentent la quantité) et des activateurs (qui augmentent la fonctionnalité) de cette protéine dans le cas du traitement de tumeurs chimiorésistantes marquées par un échec thérapeutique (chimio-sensibilisation).

Procédures

- greffe intracérébrale (1 seule itération à J0) : durée=45 min (EU1) - Imagerie bioluminescence (au minimum 10 injections) : durée 15 min (EU2) - Traitement par radiothérapie (10 itérations) : durée 10 min pour chaque session (EU2) - Traitement par le composé d'intérêt (12 itérations) combiné ou nonà la chimiothérapie (10 itérations) : durée 1 min par traitement (EU1). - Test d'éviction d'obstacle (3 fois par semaine ) : durée 5 min (EU1)

Impact sur les animaux

La première nuisance attendue sur les animaux est liée à l'implantation même du glioblastome (apparition d'une tumeur cérébrale avec des effets délétères attendus non réversibles). Puis, le schéma de traitement par radiothérapie (itérations répétées) et l'imagerie par bioluminescence (2 ou 3 fois par semaine selon le timing dans le projet) nécessitent un transport et une anesthésie répétés des animaux. Lorsque les sessions de bioluminescence sont le même jour que la radiothérapie, une seule anesthésie sera réalisée, l'irradiation et l'imagerie se faisant sur le même site où est hébergé l'irradiateur. Une accoutumance liée à la répétition des anesthésies chimiques peut être observée, nécessitant une augmentation des volumes administrés : ce phénomène est maitrisé par le laboratoire. Une attention toute particulière sera portée aux animaux notamment en optimisant au maximum les conditions de transport des animaux. Les administrations quotidiennes de l'activateur de la protéine conduisent à un dérangement journalier des animaux, le cycle jour/nuit de l'animalerie étant inversé, la gêne occasionnée sera faible, les animaux étant ainsi manipulés durant leur phase d'activité. Le site d'injection dans le péritoine sera alterné chaque jour (gauche-droite) pour éviter les réactions liées à l'injection et des aiguilles très fines seront utilisées pour l'injection.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue des procédures. Ainsi 164 souris au maximum seront mises à mort dès lors de l'atteinte d'un point limite (étude efficacité/survie : 58 souris femelles et 58 souris mâles) ou plus précocement à l'issue du schéma de traitement de chaque groupe (48 souris "satellites" : 24 souris femelles et 24 souris mâles ). La mise à mort des souris "satellites" à la fin du schéma de traitement est justifiée de part la nécessité de réaliser une analyse des tissuss pour pouvoir caractériser l'impact de chaque modalité de traitement.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n'est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement et la réponse à un traitement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes. De plus, la mise en place d'une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires. En outre, la réponse d'une tumeur traitée par un médicament dépend de la quantité de médicament qui parvient à la tumeur. De plus, notre projet est directement associé à l'impact du statut hormonal engendré par le sexe des animaux. L'ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu'in vivo sur un modèle animal. Il est donc primordial de conforter ces résultats sur un modèle "in vivo" de façon à se rapprocher le plus possible de la réalité clinique.

Réduction

Chacune des 3 étapes sera d’abord réalisée chez des animaux femelles puisque la surexpression de la protéine d'intérêt est de bon pronostic essentiellement chez les femmes, puis éventuellement testée chez des animaux mâles pour évaluer la pertinence de cette modulation hormonale pour les hommes. Dans le cadre de ce projet, les expérimentations seront menées étape par étape, tout d’abord en réalisant l’étude sur les animaux "femelles" associés à l'étape 1 qui concerne la comparaison in vivo de la croissance tumorale de cellules avec une forte quantité de protéine par rapport à des cellules tumorales ayant une quantité modéré de la protéine étudiée. Nous implanterons d'abord la concentration habituelle de cellules : si cette dernière offre un bon taux de prise tumorale et une croissance tumorale acceptable cette concentration sera validée et les animaux du groupe suivant ne seront pas utilisés. A l'inverse, si cette concentration s'avère insuffisante, les souris du groupe 3 seront greffées avec une concentration double. La concentration "optimale" retenue sera celle utilisée dans le reste de l'étude. Notre démarche consistera à réaliser successivement plusieurs séries d’animaux. Concernant le nombre de souris satellites, il s’agira de comparer, indépendamment chez les mâles ou les femelles, l’effet des traitements par rapport au groupe contrôle par l’analyse de marqueurs dans les tissus prélevés : ces analyses sont fiables et ne nécessitent qu’un effectif réduit pour révéler un effet, s’il existe. Ainsi on estime -à priori- que même si l’effet des traitements est faible, un effectif de 6 souris / groupe sera suffisant pour assurer une puissance statistique suffisante (simulation par logiciel de calcul de puissance). Concernant le nombre de souris en suivi de croissance tumorale, la comparaison se fera aussi indépendamment chez les mâles et les femelles. Ainsi, sur la base de nos précédentes études, on estime que l’effet des traitements aura un effet faible sur la croissance tumorale. Au minimum 6 mesures d'imagerie seront réalisées en suivi de traitement. Le nombre minimum d’animaux nécessaires par groupe est ainsi trouvé 10 animaux par groupe pour assurer une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux, d'une part lors de l'implantation de la tumeur (réalisée sous anesthésie chimique, désinfection plaie, chirurgie aseptique, suivi post opératoire rigoureux) puis à la suite de la greffe (pesée 3 fois/semaine, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, suivi de la croissance tumorale). Une vigilance accrue sera également menée lors de l'administration des traitements (pesée quotidienne, vérification du comportement et de l'état sanitaire individuel des animaux, conditions de transport de façon à éviter au maximum stress des animaux). Un suivi quotidien garantissant le bien-être optimal des animaux sera mené (température d'hébergement optimale, eau de boisson et nourriture ad libitum, enrichissement sous forme de sopalin et de bâtonnets en bois à ronger). Quel que soit le groupe, nous réaliserons la mise à mort dès que les points limites définis apparaitront (perte de poids et problème de motricité essentiellement).

Choix des espèces

Dans les études menées pour comprendre le développement des cancers, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris immunodéprimées sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines, car du fait de leur immunodéficience, il n'y a pas de réaction de rejet du greffon tumoral implanté. Les souris mâles ou femelles seront âgées de 7 semaines au moment des greffes (20 à 26g), les animaux jeunes étant plus adaptés au développement de tumeurs cérébrales. L'intérêt lié au choix de cette tranche d'âge est également lié au fait que les animaux ont atteint leur maturité sexuelle et que leur système hormonal est fonctionnel.

La veille de la chirurgie, les 298 souris passent des tests comportementaux dont le porteur ne précise pas la nature, répétés chaque jour du premier au quinzième jour. À J0, le crâne est ouvert pour injecter du NMDA dans le striatum et déclencher une réaction excitotoxique, puis un cathéter posé dans la queue sert à administrer le traitement, toujours sous anesthésie. Le lendemain vient une IRM sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À la fin, chaque animal est ouvert du ventre au thorax pour une ponction de sang dans le cœur, puis tué par perfusion transcardiaque qui fixe le cerveau avant son prélèvement.

Objectifs

Cette étude vise à déterminer l’effet neuroprotecteur de thérapeutiques potentiels sur la mort neuronale induite par la stimulation de la voie excitotoxique par l’administration du traitement de référence face aux accidents vasculaires cérébraux ischémiques, l’activateur tissulaire du plasminogène, en utilisant un modèle de lésion cérébrale via l’injection de N-méthyl-D-aspartate au sein du striatum cérébral chez la souris.

Bénéfices attendus

Chez l’Homme, l’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Les animaux réaliseront différents test comportementaux (à J-1, J+1 jusqu’à J+15 post chirurgie) visant à quantifier et à observer des différences (et donc d’observer une récupération fonctionnelle ou pas) entre les différents groupes sur des déficits sensoti-moteurs induits par la lésion cérébrale générée par le modèle de chirurgie. A J0, ils seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir injecter du NMDA, provoquant ainsi une réaction excitotoxique au sein du striatum. Cette chirurgie sera suivie de l’administration d’un des différents traitements par voie intraveineuse après la pose d’un cathéther caudal, toujours sous anesthésie générale. A J+1, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au coeur. Un prélèvement de sang par ponction intracardiaque sera réalisé avant perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. Les procédures douloureuses (chirurgie, perfusion transcardiaque) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture analgésique.

Impact sur les animaux

Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse post chirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement de sang et du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales les plus étudiées dans le domaine de l’AVC ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. D’un point de vue statistique, nous avons déterminé que le nombre idéal d’animaux par groupe est de 15. En effet, ce nombre est reconnu pour réduire au maximum le nombre d’individus, tout en conservant la pertinence scientifique et la significativité statistique.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris seront 5 par cage avec plusieurs enrichissements (sizzle-dri kraft, alpha-dri et une bûchette de peuplier), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Les animaux sont réceptionnés au sein de l’animalerie 2 semaines avant la réalisation de l’acte chirurgical pour permettre leur habituation et la diminution de leur stress dû au transport et au changement d’environnement. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et un analgésique sera administré par voie intrapéritonéale avant incision ou pour l’étape de mise à mort par perfusion intracardiaque. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. La température corporelle de l’animal est maintenue grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée. Un gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux de l’animal pour éviter le déssèchement de la cornée. L’incision de la peau est précédée d’une tonte préalable du pelage, d’une désinfection ainsi que de l’application d’un analgésique local au niveau du site d’incision. Le choix de la technique de sutures se porte sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Lors de la phase de réveil, les gaz anesthésiques sont ramenés à zéro, et le débit d’O2 est élevé pour permettre une meilleure récupération post-opératoire. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivant l’opération.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la récupération fonctionnelle ainsi que le devenir des lésions cérébrales induites par le modèle excitotoxique. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines soit un poids d’environ 35g ou de 25g selon la souche utilisée. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles.

Pour vérifier, dans une étude qualifiée de pilote, si un AVC provoque des altérations dans des régions du cerveau non connectées à la zone lésée, 432 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une chirurgie d'environ quarante-cinq minutes pour déclencher l'infarctus cortical, puis une perfusion intracardiaque de vingt minutes sous anesthésie. Le porteur qualifie le modèle de peu invasif et annonce qu'il ne s'accompagne "typiquement" pas de symptômes majeurs, tout en prévoyant douleur et perte de poids après l'opération. La douleur est notée jusqu'au deuxième jour selon une grille à cinq critères, dont l'aspect de la plaie et les changements de poids, l'animal qui ne montre aucun signe passant ensuite à un suivi hebdomadaire.

Objectifs

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont une cause majeure de déficits moteurs à long-terme et de déficits cognitifs. Certains symptômes se manifestent tardivement et ne sont pas forcément liés à la région initialement lésée, suggérant qu’un AVC dans une région spécifique peut aussi causer des modifications dans d’autres régions du cerveau. Des altérations dans des régions directement connectées à la zone infarcie ont déjà été corrélées à l’apparition de troubles tardifs. Cependant, les régions associées aux fonctions impactées (les fonctions de mémoire par exemple) ne sont pas toujours directement connectées à la région lésée. Nous émettons donc l’hypothèse que des modifications pourraient donc ne pas se restreindre aux régions connectées à l’infarctus primaire mais s’étendre spatialement et temporellement dans le cerveau. Dans cette étude pilote, nous voulons induire un AVC limité à une région précise du cerveau d’un modèle murin afin d’étudier l’impact de la lésion dans d’autres régions du cerveau, pas directement connectées à la zone infarcie. Si notre hypothèse est confirmée, nous aurions identifié un des mécanismes qui pourraient sous-tendre la manifestation de symptômes fonctionnellement liés à des zones non connectées dans un modèle murin.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider notre observation préliminaire qui vise à mieux comprendre les mécanismes sous-tendant les troubles de mémoire qui se manifestent tardivement après un AVC, même quand la région initialement lésée n’est pas impliquée dans les fonctions mnésiques. Nous émettons l’hypothèse que l’altération d’un mécanisme cellulaire associé à la mémoire ainsi qu’un état inflammatoire pourraient être présents dans des régions non directement connectées à la zone infarcie. Si notre hypothèse est confirmée, nous effectuerons une étude complète qui pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux troubles cognitifs post-AVC.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie peu invasive pour induire l’AVC sous anesthésie générale (environ 45 minutes). Ils seront enfin soumis à une perfusion intracardiaque toujours sous anesthésie générale (20 minutes). Tous les animaux sont concernés.

Impact sur les animaux

La méthode utilisée induit un infarctus cortical limité et typiquement ne s’accompagne pas de symptômes majeurs, ce qui rend le modèle facilement utilisable et limite la souffrance animale. Cependant, suite à la procédure chirurgicale, une douleur ainsi qu’une perte de poids peuvent survenir. Les animaux seront observés quotidiennement pendant deux jours. La douleur sera évaluée jusqu’à J2 après chirurgie selon une grille d’évaluation, organisée selon 5 grands critères : apparence physique, comportement non provoqué, changements de poids corporel, la locomotion ou encore l’aspect de la plaie. Si après deux jours l’animal ne montre aucun signe de souffrance, il sera suivi ensuite une fois par semaine. En cas de détérioration ou de souffrance animale, l’animal sera pris en charge par l’utilisateur ou par la vétérinaire.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux ne seront pas gardés du fait des techniques/procédures subies et seront de ce fait mis à mort.

Remplacement

L’AVC sera induit par la méthode la moins invasive disponible actuellement pour reproduire certain aspects de la pathologie humaine. Aujourd’hui ils n’existent pas des modèles in vitro (cultures cellulaires, organoïdes) pour étudier des conséquences anatomiques et cellulaires induites par un AVC dans les régions non lésées initialement et donc pas de méthode alternative permettant de REMPLACER les animaux. En effet, cette étude nécessite la complexité et la connectivité du cerveau adulte.

Réduction

Le nombre de souris a été évalué sur la base de travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrions rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (problèmes au cours de la chirurgie, la perfusion,des expériences d’électrophysiologie et d’immunohistochimie), ainsi que de la variabilité des résultats. Le déroulement des expériences est organisé afin de limiter au maximum le nombre d’animaux. Nous adapterons d’abord le protocole afin d’avoir une lésion initiale reproductible, de taille maximale limitée au cortex, et seulement ensuite les autres expériences seront réalisées.

Raffinement

Des mesures de RAFFINEMENT seront mises en place durant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés au sein d'un établissement utilisateur agréé dans des conditions d’hébergement favorisant leur bien-être. Ils seront placés dans des cages enrichies, au nombre de 4-5 animaux par cage. Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie. L’accès à la nourriture et à l’eau sera ad libitum et un changement de litière sera effectué chaque semaine. Dans une étude précédente, le nombre d’animaux qui ont montré des signes de souffrance dû à l’induction de l’AVC était très limité (moins de 3%). Nous nous attendons à ce que la lésion soit plus petite avec un temps d’illumination plus court et donc que ce pourcentage se rapproche de zéro. Si l’animal présente des signes de douleur au cours de l’expérimentation, l’animal sera pris en charge par l’expérimentateur. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable.

Choix des espèces

Le modèle envisagé a déjà été induit chez la souris et il a été démontré que les AVC s’accompagnaient de modifications dans des structures du cerveau pas initialement lésées, mais connecté à la région infarcie. Ce modèle permet de produire des tranches de cerveau pour réaliser des études d’électrophysiologie et d’immunohistochimie afin d’explorer des modifications dans d’autres régions du cerveau pas encore étudiées. Nous utiliserons des souris âgées de 16-24 semaines. Cette tranche d’âge permet d’étudier les conséquences d’un AVC chez un animal adulte et correspond à un jeune adulte chez l’homme.

3 024 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules tumorales injectées sous la peau ou directement dans le pancréas par chirurgie, puis jusqu'à six prélèvements de sang sous anesthésie. Le porteur reconnaît une douleur modérée au réveil et pendant la croissance de l'adénocarcinome pancréatique, et justifie l'effectif par le "standard de la littérature internationale". Il écrit que les organoïdes remplaceront l'expérimentation animale "à moyen/long terme", tout en concluant que le recours aux animaux non-humains revêt ici "un caractère obligatoire".

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier l’impact de l’hétérogénéité des macrophages sur le développement tumoral, la réponse immunitaire et l’efficacité anti-tumorale d’immunothérapies déjà existantes. Le but ultime est l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de nouveaux traitements plus spécifiques et efficaces que ceux existants. Il a été établi depuis des décennies que l’abondance des macrophages dans les tumeurs était un marqueur de pronostic pour les patients atteints de cancer et ce quel que soit le cancer considéré. En clair, plus la tumeur contient de macrophages, plus le pronostic est mauvais. Mais ces observations cliniques restent en grande partie inexpliquées en raison de notre méconnaissance des fonctions des macrophages associés aux tumeurs (TAM). Récemment, des approches moléculaires ont révélé une très grande plasticité des macrophages dans les tissus sains mais également dans les tumeurs avec la co-existence de diverses sous-populations de TAM. L’objectif principal de ce projet est la caractérisation des phénotypes et fonctions de tous les TAM dans différents modèles murins de cancer. La cartographie des TAM murins sera ensuite utilisée pour analyser les données humaines existantes afin d’identifier ces différentes sous-populations et mettre en évidence de potentielles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’étudier l’impact de l’hétérogénéité des macrophages sur le développement tumoral, la réponse immunitaire et l’efficacité anti-tumorale d’immunothérapies déjà existantes. Le but ultime est l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de nouveaux traitements plus spécifiques et efficaces que ceux existants.

Procédures

Les animaux seront soumis à des chirurgies sous anesthésie générale pour l'injection orthotopique de cellules tumorales dans le pancréas. Cette injection durera moins de 15 minutes et sera faite une seule fois. Les injections sous la peau de cellules tumorales seront faites sous anesthésie, une seule fois et dureront moins de 5 minutes. Les animaux pourront avoir des prélèvements de sang sous anesthésie, durée moins d'une minute, nombre maximum: 6.

Impact sur les animaux

L'injection en sous-cutanée de tumeur entraînera une gêne légère et transitoire à l'injection puis modérée après croissance. L'injection dans le pancréas pourra entraîner une douleur modérée au réveil et lors de la croissance des tumeurs. Etant donné que la tumeur croit en orthotopique dans le pancréas, les conséquences seront modérées pour les animaux (adénocarcinome pancréatique), légère perte d'appétit possible avec perte de poids. Les prélèvements de sang entraîneront un inconfort léger et transitoire dû à la préhension et à l'anesthésie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour analyses des tumeurs et organes post-mortem.

Remplacement

Ce projet nécessite l’établissement de tumeurs dans des conditions réelles pour la mise en évidence de sous-populations d’intérêt. Nous travaillons d’ailleurs en parallèle sur une approche de type « organoïdes » avec laquelle des tumeurs sont re-créées en 3 dimensions dans des boites de Pétri pour créer des avatars de patients. Bien que ces approches soient très clairement vouéés à un développement exponentiel et remplaceront à n’en pas douter l’expérimentation animale à moyen/long terme, elles ne peuvent à l’heure actuelle s’y substituer et il est très difficile de résumer le microenvironnement tumoral naturel qui engendre la diversité de phénotypes cellulaires observés chez les patients. De plus, notre stratégie de suivi temporel de la différentiation de monocytes naïfs en macrophages associés aux tumeurs nécessite l’interaction de ces cellules avec les cellules tumorales tout au long du développement de la maladie. L’utilisation de modèles animaux pour ce projet revêt donc un caractère obligatoire.

Réduction

Le nombre d'animaux analysés dans les groupes expériementaux est réduit à son minimum pour pouvoir tirer des conclusions solides des expériences proposées. Il est conforme au standard de la littérature internationale. Même si cela nécessite l'utilisation de nombreux animaux, cela garantit la validité scientifique des résultats obtenus et justifie ce nombre. Les nombres minimuax ont été déterminés gra^ce à des tests statistiques.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans un environnement enrichi (sizzlenests + maisons en carton). Les souris seront sous surveillance quotidienne de la part de l’équipe de recherche pour une évaluation clinique adaptée. Toutes les injections seront faites sous anesthésie locale ou générale . Les souris auront un examen clinique et seront pesées quotidiennement. Les points limite seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

- Génétique proche de celle de l’Homme - Modèles de devenir des types cellulaires impliqués dans le cancer performants et originaux - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité et l’effet des traitements sur la réponse anti-tumorale dans leur globalité. Animaux à maturité sexuelle, entre 6 et 12 semaines du fait de la population de patients.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune recevant cinq injections intrapéritonéales en cinq jours, deux échocardiographies de trente minutes sous sédation et une ligature de l'artère coronaire gauche sous intubation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La chirurgie provoque un infarctus du myocarde, dont le projet veut suivre la réparation en inactivant un gène chez l'animal adulte. Les retombées annoncées pour les cœurs humains endommagés sont renvoyées au long terme. Le porteur écrit s'attendre à "une légère douleur en raison de l'incision de la peau et de la dissection d'un seul petit muscle intercostal".

Objectifs

La cardiopathie ischémique et l’infarctus du myocarde sont des causes majeures de mortalité dans nos sociétés. Nous proposons d’étudier l' impact du gène de notre intéret dans le processus de réparation tissulaire post infarctus du myocarde. La létalité embryonnaire des animaux deficients du gène a empêché la vérification de cette hypothèse. Nous allons développer plusieurs modèles de souris transgéniques permettant l’induction d’une inactivation spécifique du gène de notre interet chez les souris adultes, permettant ainsi de répondre à ces objectifs et de mener les études par: - un suivi clinique et échographique des animaux, - une étude des processus de régénération cellulaire, de néovascularisation, de régulation de l’inflammation par la définition des types cellulaires et des voies de signalisation moléculaires impliqués. Notre projet représente une analyse approfondie de la signalisation médiée par ce gène dans le processus de l’homéostasie du myocarde et la réparation du coeur. Nous étudierons le rôle du gène au cours de l’infarctus du myocarde par une multitude d’approches génétiques: en induisant une délétion conditionnelle du gène de notre interet dans 1) les cellules progénitrices myéloïdes et vasculaires, 2) les cellules vasculaires uniquement, et 3) les cardiomyocytes, en utilisant un système inductible pour le knock-out chez les animaux sains et adultes.

Bénéfices attendus

Dans l’ensemble, ces expériences permettront de déterminer les voies de signalisation dépendant du gène de notre interet après un infarctus du myocarde et impliquées dans la régénération et la réparation du coeur et d’identifier les processus moléculaires activés par ces voies de signalisation. A long terme, ces données permettront de développer de nouvelles approches pour le traitement des coeurs endommagés suite à un infarctus du myocarde.en

Procédures

Pour chaque souris: 1) 5 injections intra-péritonéales (30 secondes) pendant 5 jours consécutifs pour chaque souris. 2) 2 mesures échocardiographiques (30 minutes), realisées sous sédation (Isoflurane 2%) et en ventilation spontanée pour chaque souris. 3) 1 chirurgie de l'artère coronaire gauche sous anesthésié avec l’isoflurane et intubation (30min).

Impact sur les animaux

Pour chaque souris: 1) 5 injections intra-péritonéales (30 secondes) pendant 5 jours consécutifs pour chaque souris. Les injections intra-péritonéales sont des gestes n'impliquant qu'une contention de courte durée (30 secondes) et une douleur légère. 2) 2 mesures échocardiographiques (30 minutes), realisées sous sédation (Isoflurane 2%) et en ventilation spontanée pour chaque souris. Nous n'avons jamais constaté aucune nuisance grave du à ce examen. 3) 1 chirurgie de l'artère coronaire gauche sous anesthésié avec l’isoflurane et intubation (30min). Apparition possible de angoisse, du stress, et des douleurs suite à l'intervention chirurgicale. On peut s'attendre à une légère douleur en raison de l'incision de la peau et de la dissection d'un seul petit muscle intercostal.

Devenir

Au terme de l'examen final, les souris sont mises à mort , le coeur est prelevé, pésé puis conservé pour analyses (immuno)histochimiques et moleculaires ulterieures.

Remplacement

L’homéostasie et le remodelage cardiaque sont des processus complexes. Bien qu’il existe des modèles in vitro, l’interaction entre différentes populations cellulaires (cardiomyocytes, cellules endothéliales, cellules immunitaires) ne peut être mimée par une approche in vitro. Après avoir déclenché un infarctus, il est important de suivre le coeur dans son environnement, ses échanges avec d’autres organes. En outre, les lignées transgéniques utilisées nous permettent d’observer, après l’infarctus, l’activation immédiate de voies de signalisation, d’identifier les cellules répondant à ces voies de signalisation. L'emploi d’un modèle animal comme la souris récapitulant la physiopathologie du coeur chez le mammifère est donc essentiel, en raison de ses similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. En effet, nous essayons de comprendre la fonction de gènes spécifiques dans la réparation du coeur. Notre projet s'appuie fortement sur des organismes génétiquement modifiés. La communauté scientifique a déjà généré un grand nombre de souches génétiquement modifiées qui peuvent être utilisées en combinaison avec des lignées générées dans notre laboratoire pour répondre à ces questions scientifiques (analyse de tissus-spécifiques de la fonction des gènes par l'intermédiaire du système Cre-lox). Notre stratégie est bien conçue pour une prise en compte des objectifs de remplacement, car nous avons déjà validé toutes les analyses moléculaires dans des systèmes de culture cellulaire ou purement biochimiques.

Réduction

Dans un souci de réduction du nombre d'animaux utilisés, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire à la validation d'un effet significatif. Les mêmes animaux seront utilisés à la fois pour les études echocardiographiques et la réalisation des analyses histologiques et moléculaires.

Raffinement

Dans le sens du raffinement, l’anesthésie et l’analgésie seront utilisées comme premières méthodes pour limiter autant que possible la souffrance potentielle des animaux. Des points limites (PL) précises et adaptés seront évalués quotidiennement. Ils permettent l’arrêt de la procédure (mise à mort) dans tous les cas d’aggravation ou d’anomalies cités.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées comme modèle car leur physiologie et leurs mécanismes de réparation correspondent étroitement à ceux de l'homme. Les animaux adultes seront utilisés (25g, âgés de 24 à 30 semaines). Le choix de animaux adultes est justifie par le fait que les maladies cardiovasculaires concernent en majorité des adultes. L'autre raison pour le choix de souris adultes concerne la chirurgie d'un IDM laquelle est possible que avec des animaux adultes pour raison de leur plus grande taille.

Porteuses d'une mutation qui reproduit le syndrome NARP, ces souris présentent un déficit de poids d'environ 20 %, un défaut cardiaque et un défaut musculaire attendus. 313 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements terminaux de sang et d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang et d'urine à un, deux, quatre et six mois, des tests de force musculaire, de coordination et d'endurance sur tapis de course, rotarod et grip test, ainsi que des IRM et des échocardiographies sous anesthésie. Une grille de score commande la suite : entre 6 et 7, un antidouleur puis la mise à mort si rien ne s'améliore en vingt-quatre heures, entre 8 et 9, la mise à mort immédiate.

Objectifs

Le syndrome NARP (Neuropathie Ataxie Rétinite Pigmentaire) est une pathologie rare qui affecte majoritairement les fonctions cardiaques, musculaires, et neurologiques et pour laquelle il n'y a toujours pas de traitement. Au laboratoire nous avons identifié des candidats médicaments efficaces sur les cellules de patients atteints du syndrome NARP. Afin de pouvoir proposer le traitement à des patients il nous faut prouver leur efficité dans un animal entier (ici le modèle murin). Avant, il est nécessaire d'identifier des déficits clairs dans le modèle souris du syndrome de Barth. Ce projet vise donc à caractériser finement le modèle souris du Syndrome NARP d'un point de vue cardiaque, musculaire, comportementale etc.... Ceci permettra ensuite de tester si les candidats médicaments efficaces en cellules de patients sont capables de diminuer les défauts mis en évidence dans l'étape de caractérisation du modèle murin. Si tel est le cas, on aura la preuve de leur efficacité dans un animal entier. L'objectif ultime étant de proposer les candidats médicaments efficaces dans les cellules de patients et le modèle murin du syndrome NARP à des patients atteints du syndrome NARP.

Bénéfices attendus

Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome NARP, dans nos animaleries afin d'identifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. Seront analysés, le comportement, le poids, la fertilité, les portées, les avortements spontanés, la mortalité périnatale, l'acidose, la force musculaire, l'endurance, la coordination, les fonctions cardiaques, les fonctions mitochondriales sur tissus et des dosages sanguins et urinaires.

Procédures

Prélèvements sanguins et urinaires aux âges de 1 mois, 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excédera pas 10 minutes. Tests comportementaux (force musculaire, motricité, équilibre et endurance) aux âges de 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes. IRMs et echocardiographies aux âges de 2, 4 et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 30 minutes et les souris subiront des anesthésies.

Impact sur les animaux

Des nuisances liées aux souris présentant un phénotype dommageable peuvent être attendues. Comme d'autres modèles murins similaires (avec des déficits mitochondriaux) nous pouvons attendre, à l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents, un défaut cardiaque et un défaut musculaire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse par IRM et échocardographie nécesite une anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données IRM ou échocardiographiques. Le suivi des performances sur tapis de course, rotarod ou grip test teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de caractériser à différents niveaux le modèle murin.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome NARP, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également avant de procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes cités. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 20-25 pourcents d’animaux en plus, soit 10 souris par groupe.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 1 fois par semaine. Si l'animal perd entre 10 et 15 pourcents par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 25 pourcents l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Nous raffinons nos expérimentations en utilisant les animaux de chaque groupe pour recueillir plusieurs types de données. Sur chaque animal, l’ensemble des organes et tissus pouvant être recueillis sont prélevés afin d’anticiper les expérimentations futures. Pour toutes les procédures, les animaux seront observés quotidiennement, et les points limites seront évalués en détail: Plaie/Traumatisme, Comportement/Mouvement, Aspect général, Evolution pondérale. Un score sera attribué, qui déterminera les traitements/observations à suivre: Score 0-2 = aucune douleur => pas de traitement. Score 3-5 = Observation plus importante et gel diet et croquettes humides au fond de la cage. Score 6-7=douleur légère à modérée=>Nettoyer d'éventuelles plaies et injection en sous cutanée d'un anti douleur et euthanasie si pas d'amélioration sous 24H. Score 8-9 = euthanasie de l'animal pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. Les animaux seront transférés dans différentes animaleries selon les analyses. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquate et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des cages de transport adaptées contenant copeaux, cotons et nourritures. Les souris contrôles seront toujours séparées des souris modèle de la maladie. Les transferts seront effectués une semaine avant les analyses pour laisser un temps d'acclimatation dans la nouvelle animalerie.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. Les animaux seront suivis de leur naissance (mortalités, suivi des portées, génotypage, avortements spontanés) à l'âge de 2 ans. Les animaux seront caractérisés dès l'âge de 10 jours pour un suivi de poids hebdomadaire, aux âges de 2, 4 et 6 mois pour des tests d'endurance, de force musculaire, de coordination et de fonction cardiaque et aux âges de 1, 2 ,4 et 6 mois pour des dosages sanguins et urinaires, et des prélèvements d'organes.