Souris
MSU-péritonite: Modèle murin de péritonite induit par injection de cristaux d’urate monosodique (MSU)
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Des cristaux d'urate monosodique sont injectés dans l'abdomen de 600 souris pour y déclencher une péritonite en moins de vingt-quatre heures. Les procédures sont classées en souffrance sévère. Le porteur annonce pourtant des douleurs aiguës limitées à moins de deux heures après l'injection, après quoi les animaux ne présenteraient plus aucun signe de douleur, et il recopie son paragraphe sur la réduction à la place de tout argument sur le remplacement. Toutes les souris sont tuées à l'issue pour récupérer le liquide péritonéal et différents organes, à raison de dix études de soixante animaux sur trois ans.
Objectifs
La goutte est une maladie inflammatoire particulièrement prévalente causée par la formation de dépôts articulaires et péri-articulaires de cristaux d’urate monosodique (UMS ou MSU). La goutte représente le rhumatisme inflammatoire chronique le plus fréquent en France. L’objectif de ce projet est d’utiliser un modèle murin permettant de reproduire les phénomènes de la goutte le plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie et de pouvoir évaluer des nouveaux traitements. Le modèle consiste en l’injection intra-péritonéale de cristaux d’urate monosodique (MSU) chez des souris. Un lavage péritonéal est ensuite réalisé pour analyse des cellules recrutées. Les principales caractéristiques du modèle sont son délai de réalisation court (≤ 24h).
Bénéfices attendus
Ce projet a pour finalité la mise au point d’un modèle d’inflammatoire chez la souris qui récapitule les aspects clés de la goutte chez l’homme. Ce modèle permettra par la suite de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à un modèle préclinique prédictif permettant de transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. II sera possible d’étudier les mécanismes inflammatoires de la goutte dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre.
Procédures
Les animaux seront pesés avant induction et l’étude durera au maximum 24h. La péritonite est induite par un seul traitement en intrapéritonéale. Des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par voie : intramusculaire et intradermique (anesthésie (5-10 minutes), avec analgésie, maximum 2 sites/jours), orale sur animaux vigiles (1 minute) maximum 4 fois par jour espacé de 6h, sous cutanée (anesthésié, 1 heure, ou vigile, 1 minute) maximum 3 sites par jours, intrapéritonéale (anesthésié, 1 heure, ou vigile, 1 minute) maximum 4 fois par jour, intraveineuse vigile ou anesthésié (anesthésié, 5-10 minutes, ou vigile, 1-2 minutes) maximum 2 fois par jour. Le nombre, le volume et la fréquence d’administration suivront les recommandations de SBEA (Structure du bien-être animale). Des prélèvements de sang, d’urine ou de fèces pourront être réalisés (3 minutes sur animal vigile, 1 heure si anesthésie. Le nombre et la fréquence des prélèvements seront adaptés à la durée de la procédure(24h) et suivront les recommandations du comité d’éthique.
Impact sur les animaux
Dans ce modèle d’inflammatoire, des douleurs aigues transitoires (< 2 heures), après administration du MSU sont attendues ensuite les animaux ne présentent plus de signe de douleurs Les animaux recevront un traitement par voie intrapéritonéale (MSU) et pourront subir des prélèvements de sang à l’aiguille, ce qui pourrait induire une douleur et un stress léger. La douleur générée sera limitée à la piqure d’une aiguille. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress de 1-2j.
Devenir
Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération du liquide péritonéale et différents organes, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.
Remplacement
Le nombre minimum suffisant permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt est systématiquement utilisé. En pratique, ces nombres ont été déterminés sur la base de la littérature sur le sujet et d’expériences préalables dans nos laboratoires. En moyenne, une étude comprendra 60 animaux. Nous estimons effectuer environ 10 études sur 3 ans. Dans le modèle, il a été démontré que 6 à 10 animaux sont nécessaires en fonction des paramètres d’intérêt, afin d’observer des différences sur ces paramètres. Le nombre élevé d’animaux prévu est lié au nombre d’études élevé prévues pour tester un grand nombre de composés et de schémas d’administration et au nombre d’animaux par étude. Dans la mesure du possible, le maximum d’analyses compatibles sera effectué sur les mêmes tissus afin d’éviter de multiplier les animaux nécessaires. Afin d’éviter de multiplier les groupes contrôles, dans la mesure du possible si plusieurs composés doivent être testés ils le seront au cours de la même étude.
Réduction
Le nombre minimum suffisant permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt est systématiquement utilisé. En pratique, ces nombres ont été déterminés sur la base de la littérature sur le sujet et d’expériences préalables dans nos laboratoires. En moyenne, une étude comprendra 60 animaux. Nous estimons effectuer environ 10 études sur 3 ans. Dans le modèle, il a été démontré que 6 à 10 animaux sont nécessaires en fonction des paramètres d’intérêt, afin d’observer des différences sur ces paramètres. Le nombre élevé d’animaux prévu est lié au nombre d’études élevé prévues pour tester un grand nombre de composés et de schémas d’administration et au nombre d’animaux par étude. Dans la mesure du possible, le maximum d’analyses compatibles sera effectué sur les mêmes tissus afin d’éviter de multiplier les animaux nécessaires. Afin d’éviter de multiplier les groupes contrôles, dans la mesure du possible si plusieurs composés doivent être testés ils le seront au cours de la même étude.
Raffinement
Les actes douloureux seront réalisés avec analgésie. Les actes moins stressants (autres administrations et prélèvements) seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité de la procédure est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans la procédure. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction des maladies et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux.
Choix des espèces
- L’administration du MSU en intrapéritoneale chez des souris est bien documentée dans la littérature. - Pour ce modèle inflammatoire, il faut utiliser des souris immunocompétentes. - De plus, diverses souches de souris immunocompétente sont disponibles pour l’établissement de ce modèle. Les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’induction de la maladie. Les animaux adultes pourront mieux supporter le traitement ainsi que les éventuels effets secondaires des composés testés.
Etude de l’effet de composés sur la régénérescence des fibres nerveuses lésées consécutivement à l’écrasement du nerf sciatique chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Jusqu'à 364 administrations et 57 prélèvements sanguins en 91 jours pour un même animal, 1 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Le nerf sciatique de chaque souris est écrasé au cours d'une chirurgie de trente minutes, puis la récupération est mesurée par un test de répartition du poids répété jusqu'à treize fois et une mesure de conduction nerveuse sous anesthésie répétée jusqu'à quatorze fois. Il s'agit d'évaluer des molécules censées favoriser la réparation nerveuse après un accident, dont les effets secondaires restent inconnus. Le porteur retient de jeunes souris de huit semaines, capables selon lui de supporter la chirurgie sans altération de leur état général, et concède que l'écrasement du nerf peut provoquer des douleurs.
Objectifs
La neuropathie périphérique désigne l'ensemble des maladies des nerfs périphériques issus de la moelle épinière. Ces pathologies peuvent avoir des causes variées comme du diabète, une carence en vitamines, des phénomènes inflammatoires, des traitements anti-cancéreux ou des traumatismes. Au vu de l’incidence de ces pathologies et de leurs impacts sur la qualité de vie des patients, de nombreuses recherches sont menées pour prévenir les neuropathies, ou favoriser la réparation des nerfs périphériques. Dans ce projet, nous nous intéressons aux neuropathies induites par un traumatisme mécanique. Chez l’homme, ce phénomène se produit lorsqu’un accident provoque la section ou l’écrasement d’un nerf. L’objectif de ce projet est d’évaluer, chez la souris, les effets de traitements qui amélioreraient la récupération du nerf lésé. Nous utiliserons pour cela plusieurs tests évaluant l’état clinique des animaux afin de déterminer si les nouveaux traitements en cours de développement peuvent être bénéfiques ou non pour les patients.
Bénéfices attendus
Il est attendu que ce projet permette de mettre en évidence le potentiel de nouvelles molécules pour la régénération nerveuse. Cela serait une grande avancée pour les patients ayant subi des dommages invalidants lors d’accident par exemple.
Procédures
Tous les animaux subissent une chirurgie (30minutes maximum) sous anesthésie. Les douleurs peri-opératoires sont prises en charge par un traitement antalgique et anti-inflammatoire. Après la chirurgie, les animaux peuvent être traités par le composé à étudier (4 administrations par jour maximum incluant les traitements antidouleurs) ce qui donne un maximum de 364 administrations et de 1 à 57 prélèvements sanguins sur 91 jours en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire. Puis ils sont évalués dans deux tests différents : un test de répartition pondérale lors de déplacement libre réalisé jusqu’à 13 fois (durée 7 min) et une mesure de conduction nerveuse sous anesthésie gazeuse réalisée jusqu’à 14 fois (durée 10 min). A la fin de l’expérience, un prélèvement sanguin peut être effectué juste avant la mise à mort de l’animal.
Impact sur les animaux
Ce projet faisant appel à une chirurgie, les douleurs péri-opératoires sont probables. Il n’est pas exclu que l’écrasement du nerf engendre des douleurs. Comme nous administrons des composés qui sont en phase d’études pré-clinique, leurs effets secondaires potentiels ne sont pas connus et peuvent apparaitre au cours de l’étude. Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun cela peut induire un stress chez l’animal.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est mis à mort pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.
Remplacement
Ce projet met en œuvre une neurodégénérescence nerveuse dans l’objectif d’étudier les possibilités de réparation au niveau de l’organisme. Notre veille bibliographique laisse à penser que les processus d’écrasement du nerf sciatique dans ce projet ne peuvent être modélisés qu’à travers l’étude de l’animal vivant. Les cultures cellulaires, de même que les modèles in-silico disponibles à l’heure actuelle, sont utiles afin de sélectionner les molécules présentant le meilleur potentiel mais ne fournissent qu’une réponse limitée à nos questions. En l’état actuel des connaissances, ils ne peuvent remplacer le système complexe qu’est l’organisme vivant. Ainsi, le présent projet ne pourrait être complètement réalisé sans le recours aux animaux.
Réduction
Après analyse de puissance statistique, nous envisageons d’utiliser 10 animaux par groupe. De plus, nous cherchons toujours un compromis expérimental permettant de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Par exemple, nous favorisons le test de plusieurs conditions expérimentales en parallèle afin de ne pas multiplier les groupes témoins. De plus, nous réalisons aussi des prélèvements post mortem associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques. Lorsque c’est possible, nous utiliserons la patte contra-latéral de chaque animal comme contrôle de la patte lésée. Les animaux incluent dans ce projet vont nous permettre de mener 20 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.
Raffinement
Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi, un certain nombre de mesures sont mises en œuvre, avec notamment l’intégration d’une phase d’acclimatation à l’arrivée des animaux sur site (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Nous portons une attention particulière à fournir aux animaux des conditions optimales d’hébergement afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Les animaux sont hébergés en cohorte pour respecter leurs besoins sociaux. Comme il est important que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres, nous fournissons un enrichissement important du milieu : un tunnel en carton accroché à la grille de la cage afin d’en augmenter le volume utile, une maisonnette en carton afin de permettre aux animaux de se cacher, et de la frisure pouvant servir de matériel de nidification, de jeu et de matériel à grignoter. Les animaux sont observés tous les jours et leur comportement est suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. A partir du début de l’expérimentation, les animaux sont pesés au minimum 2 fois par semaine. Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Le prélèvement de sang trans-thoracique est réalisé sous anesthésie générale, tout comme les mesures de l’activité électrique musculaire par électromyographie (EMG), afin d’éviter que l’animal ne bouge. La chirurgie est effectuée sous anesthésie générale, en présence de traitements antalgiques et anti-inflammatoire, avec une aide au maintien de la température corporelle de l’animal et en garantissant la stérilité de l’intervention. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé, les animaux recevront le soir et le lendemain matin de la chirurgie un antalgique pour prendre en charge leur douleur. Chaque fois que les animaux sont soumis à divers tests, le choix des tests, la fréquence de mise en œuvre et leur ordre d’exécution est établi afin d’impacter le moins possible le bien-être des animaux. De plus, nous avons établis des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui serait inattendue. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre SBEA sera réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques, permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Dans ce projet, nous utilisons des jeunes adultes (début des procédures à 8 semaines) car les pathologies modélisées dans ce projet ne sont pas des pathologies liées au vieillissement. De plus, les animaux doivent pouvoir supporter une intervention chirurgicale sans altération de leur état générale.
Modèle de rétinopathie diabétique induit par injection de produits avancés de glycation
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 1600
Lapins : 1600
Environ 10 % des animaux n'ayant pas suivi la procédure entière seront gardés en vie et réutilisés ailleurs, tous les autres seront tués pour analyse des yeux. 1 600 souris, 1 600 rats et 1 600 lapins vont être utilisés dans des procédures classées en souffrance légère, pour installer une rétinopathie diabétique par injection de produits de glycation. Selon les cas, l'injection se fait dans l'abdomen, dans la veine ou directement dans l'œil, avec jusqu'à huit instillations oculaires par jour et des examens ophtalmologiques hebdomadaires sous anesthésie légère. Le porteur écrit que les maladies de la rétine ne sont pas douloureuses chez l'être humain et transpose cette conclusion à l'animal, tout en annonçant une altération permanente de la vision de l'œil traité.
Objectifs
La rétinopathie diabétique est une complication du diabète qui atteint l'œil au niveau de la rétine et serait la première cause de cécité avant 65 ans. L'objectif de ce projet est d’obtenir un modèle de rétinopathie diabétique afin de tester des traitements potentiels qui pourraient améliorer la pris en charge de cette pathologie. Une étape clé dans l’installation de cette maladie et la détérioration des parois des capillaires sanguins de la rétine. Les capillaires sanguins perdent leur étanchéité ce qui induit une augmentation de la perméabilité vasculaire et une rupture de la barrière hématorétinienne, des hémorragies et des exsudats qui lèsent la rétine et altèrent son fonctionnement neuronal. La maladie peut évoluer vers une rétinopathie proliférative avec une production anormale de nouveaux vaisseaux peu fonctionnels, des décollements de la rétine et des saignements dans le vitré. Un oedème au niveau de la macula, zone de la rétine essentielle pour la bonne acuité visuelle, peut survenir à tout moment et entrainer la perte de la vision. L'excès de sucre dans le sang (l’hyperglicémie) génère des produits dérivés appelés les produits avancés de glycation : les AGEs. Ces AGEs sont impliqués dans le développement des complications du diabète. Une stratégie pour reproduire l’atteinte vasculaire de la rétinopathie diabétique consiste en l’injection de AGEs exogènes chez les rongeurs et le lapin. Selon les protocoles disponibles dans les publications scientifiques, l’injection peut se faire par différentes voies : injection intra veineuse, intra vitréenne, intrapéritonéale. Dans un premier temps nous souhaitons induire le modèle par injection intrapéritonéale de AGEs chez les rongeurs, en cas d'échec, s'il n'y a pas eu d'induction et que les signes cliniques ne sont pas présents, les injections intraveineuses seront envisagées ou encore l'injection intravitréenne (à l'intérieur de l'œil) chez les 3 espèces. Les durées des études peuvent être différentes selon le mode d'administration : 1 à 2 semaines pour les injections quotidiennes intrapéritonéales et intraveineuses et quelques heures à quelques jours pour les injections uniques intravitréennes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de participer à la recherche de nouveaux traitements agissants sur la composante vasculaire de la rétinopathie ou neuroprotecteurs de la rétine chez les diabétiques.
Procédures
Le déclenchement du modèle est dû à une injection par piqûre intrapéritonéale, ou intraveineuse ou une injection intravitréenne, un seul mode d'induction par animal. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques (imagerie, observations au biomicroscope, électrorétinogramme) réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes et se produit une fois par semaine. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois par jour (on estime un maximum de 8 fois). Les injections (intrapéritonéale, sous cutanées...) peuvent être quotidiennes pendant une durée d’une semaine. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, avec une procédure qui dure cinq minutes tout au plus, leur fréquence est limitée, une à deux fois par semaine sur maximum deux semaines. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt (durée de moins d'une minute pour le prélèvement). De manière générale, les études auront une durée variable qui pourra aller d'1 jour à deux semaines.
Impact sur les animaux
Les maladies vasculaires ou neurodégénératives de la rétine ne sont pas douloureuses chez l'homme, et par transposition chez l’animal. Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, la pathologie devrait entrainer une altération permanente de la vision sur l'œil ayant reçu l'injection. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant, de lampe chauffante ou d’armoire de réveil chauffée en fonction des espèces.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale, seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Les animaux n’ayant pas reçu la totalité de la procédure expérimentale (estimé à environ 10%) pourront être gardés en vie et réutilisés dans une autre procédure, après avis du vétérinaire si besoin.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse ...) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux intéractions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques avec possibilité d'effectuer des comparaisons multiples; chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. La possibilité d'induire les deux yeux sera étudiée pour limiter le nombre d'animaux en étude si cela est compatible avec le mode de traitement. L'induction de la pathologie dans l'œil entraine une altération partielle et permanente de la vision, nous avons déjà expérimenté ce modèle dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés par deux au minimum en première intention, avec différents enrichissements adaptés à l'espèce. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction de la quantité et des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux. Ils observeront ensuite une période d’acclimatation de 3 jours minimum avant leur entrée dans les procédures expérimentales.
Etude chez la souris mâle d’une protéine régulatrice de la thrombose
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour explorer les premières heures qui suivent la formation d'un caillot, 66 souris mâles subissent une chirurgie d'une heure trente à une heure quarante-cinq destinée à provoquer une thrombose de la veine cave. Une partie est opérée sous anesthésie et tuée sans reprise de conscience, l'autre passe par des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur indique que les 48 heures suivant l'opération peuvent s'accompagner de douleur, d'un durcissement de la zone opérée et d'une occlusion intestinale, et prévoit une à deux échographies sous anesthésie. Toutes finissent par un prélèvement de sang puis une perfusion de fixateur directement dans le cœur, pour analyser les tissus.
Objectifs
La maladie thromboembolique est une maladie des veines qui se manifeste sous forme de thrombose veineuse (caillot dans une veine) ou d’embolie pulmonaire (caillot dans une artère des poumons). Cette pathologie constitue un problème de santé publique majeur en raison de sa fréquence, de sa gravité et de la difficulté à identifier une cause chez plus de la moitié des patients. Les traitements de la maladie thromboembolique reposent sur des anticoagulants qui sont associés à un risque d’hémorragie important et qui ne protègent pas contre les possibles séquelles ou récidives de la maladie. Les travaux menés au sein de notre équipe visent à identifier de nouvelles cibles responsables de la formation d’un thrombus et/ou de la récidive de la maladie. Nous avons démontré le rôle important une protéine impliquée dans la modification de la paroi de la veine. L’utilisation d’un modèle de thrombose veineuse chez la souris a permis de démontrer que cette protéine a un effet néfaste dans la formation d’un tissu cicatriciel de la veine. Cette cicatrisation inappropriée favoriserait la formation d’un second thrombus. Cependant, nous ne connaissons pas les mécanismes mis en jeu juste après la formation du premier thrombus qui expliquerait l’activation de cette protéine. Nous souhaitons donc explorer la phase précoce suivant la formation d’un premier thrombus dans cette demande d’autorisation de projet. La thrombose sera induite chez la souris par une chirurgie et l’activité de notre protéine d’intérêt sera inactivée à l’aide d’un inhibiteur. Nous évaluerons les propriétés de la paroi veineuse dans le temps (30 minutes jusqu’à 48h). Le traitement avec cet inhibiteur permettra de proposer une alternative aux thérapeutiques habituelles de la thrombose veineuse.
Bénéfices attendus
Le traitement de la maladie veineuse thromboembolique repose sur les anticoagulants qui présentent un risque hémorragique important et que les patients doivent le plus souvent prendre à vie. Le but de ce projet est de mettre en évidence de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires qui permettront à moyen terme le développement de traitements adjuvants aux anticoagulants et donc une prise en charge plus personnalisée des patients.
Procédures
Afin d’induire une thrombose veineuse, les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie (durée 1h30 à 1h45). Les animaux recevront 1 à 6 administration(s) (durée 1 minute par administration), ils seront anesthésiés pour ce geste. Nous injecterons à ces animaux un analgésique et certains d’entre eux recevront également un inhibiteur de notre molécule d’intérêt. Le suivi de la formation du thrombus sera assuré par échographie doppler. Cet acte sera réalisé sous anesthésie (durée 15 minutes), 1 à 2 fois selon les groupes (intervalle 24h). Tous les animaux préalablement anesthésiés et analgésiés, auront un prélèvement sanguin unique (durée 1 minute) suivi d’une perfusion intracardiaque de fixateurs (durée 12 minutes) en vue d’analyse des tissus.
Impact sur les animaux
Dans les 48h après la chirurgie, les conséquences de la chirurgie peuvent être : (1) Douleur, durcissement de la zone de chirurgie, sensation de chaleur au niveau de la veine cave inférieure, (2) Occlusion intestinale, (3) Douleur au niveau de la zone suturée.
Devenir
Afin de réaliser des analyses biologiques et histologiques, des prélèvements d’organes vitaux et de sang seront effectués sur les souris. C’est pourquoi, les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure.
Remplacement
La maladie veineuse thromboembolique est une maladie multifactorielle impliquant le système vasculaire, les cellules circulantes (plaquettes, globules rouges et globules blancs) et les organes lymphoïdes secondaires (ganglions, rate). Les modèles in vitro ou ex silico sont encore incomplets et ne permettent pas de prendre en compte la complexité de cette pathologie.
Réduction
Concernant les groupes contrôles sans chirurgie un lot de 6 animaux est nécessaire. Concernant les groupes subissant uniquement une chirurgie et qui seront mis à mort à J0 (T= 30 min, 4h ou 6h), des lots de 10 animaux seront suffisants. Nous réaliserons des prélèvements d’organes et de sang chez ces animaux en vue d’analyses biologiques et histologiques. Concernant les groupes subissant une chirurgie et un traitement avec un inhibiteur de notre molécule d'intérêt, des groupes de 15 animaux seront nécessaire. En effet, 80% des souris subissant une chirurgie vont thromboser, nous avons réalisé une étude statistique concluant qu’un échantillon de départ d’au moins n = 15 souris est nécessaire. Les animaux seront réceptionnés sur plusieurs commandes, nous ajusterons ces commandes en fonction de nos besoins. L’utilisation de l’échographie doppler nous permettra de déterminer s’il existe une différence significative de la taille du thrombus à J2 entre les souris contrôles et celles traitées avec un inhibiteur de notre molécule d'intérêt. A mi-projet, nous ferons un point et nous stopperons l’inclusion des animaux si les analyses s’avèrent concluantes. Concrètement, nous n’achèterons plus d’animaux pour ce projet.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, nous avons mis en place des mesures de raffinement adaptées à notre modèle expérimental. Concernant les conditions d’hébergement, les animaux sont maintenus en groupes sociaux et les cages sont enrichies avec un igloo et des lanières de papier pour la nidification. Au cours de la chirurgie, nous préviendrons : - la survenue d’une infection (travail en condition aseptique) - la douleur (analgésie et anesthésie) - l’hypothermie (tapis chauffant) - la déshydratation (administration de sérum physiologique) - le desséchement oculaire (gel ophtalmique). En post-opératoire, nous utiliserons de façon systématique un gel d’hydratation qui sera supplémenté en analgésique la nuit suivant la chirurgie.
Choix des espèces
Le modèle murin de thrombose veineuse que nous souhaitons utiliser est le modèle de référence pour l’étude de la maladie veineuse thromboembolique. Il est très bien caractérisé dans la littérature, fiable, reproductible et reconnu par nos pairs. L’implication de notre molécule d'intérêt dans la survenue de la fibrose est étudiée par nos pairs à l’aide de modèle murin. L’efficacité des traitements inhibiteurs de cette molécule est couramment testée chez la souris, la posologie de ces traitement est bien caractérisée pour cette espèce. La maladie thromboembolique veineuse touche les adultes, tous les animaux que nous utiliserons serons âgés de 7 à 11 semaines. L'utilisation de jeunes adultes, dont le poids variera entre 20-30g, facilitera la chirurgie.
Cibler un corégulateur transcriptionel stéroïdien dans le tissu adipeux pour lutter contre l’obésité et les maladies métaboliques associés
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Soumises pendant seize semaines à un régime riche en graisses destiné à les rendre obèses, 752 souris subissent aussi sept injections quotidiennes d'un agoniste adrénergique, sept prélèvements sanguins à la queue en deux heures et soixante-douze heures d'isolement en cage métabolique. Toutes sont tuées à l'issue pour récupérer leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet cherche à savoir si la suppression d'un corégulateur transcriptionnel provoque l'obésité et le diabète de type 2, en comparant femelles et mâles. La liste des nuisances déclarées retient les injections, les prises de sang et l'isolement, sans compter l'obésité ni l'intolérance au glucose que le protocole vise pourtant à installer.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de déterminer le rôle d'un corégulateur transcriptionel stéroïdien dans la fonction et le développement des adipocytes (blancs et bruns), selon le sexe, et d'évaluer si la délétion génétique de ce facteur de transcription conduit au développement de l'obésité et de ses complications métaboliques, en particulier la résistance à l’insuline et le diabète de type 2. Pour répondre aux objectifs de ce projet, nous allons utiliser des souris femelles et mâles invalidés pour ce facteur protéique (KO) et leur contrôles (WT). Ce modèle de souris ne présente pas de phénotype dommageable dans les premiers mois de vie et ce jusqu’à 8-10 mois. Ensuite, les souris présentent une différence selon le sexe puisque les femelles KO comparées aux WT, contrairement aux mâles, développent progressivement un surpoids (+ 15 à 20%), associé à une augmentation de leur masse grasse, et à 12 mois, une intolérance au glucose sans apparition de diabète de type 2.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet de recherche est d'identifier de nouveaux acteurs moléculaires contrôlant l'activité dissipatrice d'énergie des adipocytes selon le sexe. Etant donnée que les adipocytes blancs et bruns activés sont capables de brûler efficacement les lipides et les glucides, molécules en excés dans de multiples désordres métaboliques, ce projet devrait fournir de nouvelles voies thérapeutiques pour combattre les maladies complexes telles que l'obésité et le diabète de type 2.
Procédures
Mesures non invasive de la masse grasse/maigre et de la température corporelle (deux fois, pendant
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux seront les suivantes: - Des injections intrapéritonéales (ip) d'un agoniste aux récepteurs beta3-adrénergique - Des prélèvements sanguins à l'extrémité de la queue (série de 7 prélèvements (
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récuperer les organes.
Remplacement
Remplacement : Il est nécessaire maintenant de réaliser des études sur l’animal pour valider l’importance de facteur dans un contexte in vivo puisqu’aucune autre méthode alternative n’existe pour mimer in vitro la véritable complexité biologique des interactions entre organes participant au développement de l'obésité et de ses complications comme les maladies cardiovasculaires
Réduction
Réduction : Tous les protocoles utilisés sont bien maitrisés par les participants au projet. Cette expertise permet de définir pour chaque procédure un nombre d’animaux minimum pour obtenir des résultats reproductibles et permettant des études statistiques pertinentes.
Raffinement
Raffinement : L'environnement dans chaque cage est significativement amélioré pour minimiser le stress (un igloo par cage, plusieurs tiges de papiers). Le suivi sanitaire est réalisé selon les procédures établies par le service animalerie par les zootechniciens du centre permettant d'identifier des souris souffrantes. Des points limites stricts ont été prédéfinis afin de rapidement prendre les mesures recquises au bien-être des animaux. Enfin, l’isolement de souris sera évité hormis pour un temps limité pour les études en cage métabolique.
Choix des espèces
L'utilisation de souris se justifie par un élevage à coût modéré, un cycle de vie court, et une natalité importante. Cette espèce est majoritairement utilisée dans les études sur le développement de l'obésité et de ses complications métaboliques puisque les souris deviennent rapidement obèses (12-16 semaines) lorsqu'elles sont nourries avec un régime riche en lipide. De plus, l'obésité des souris est similaire à celle de l'homme permettant de tirer des informations pertinentes pour l'obésité humaine. Enfin, la souris est l'espèce de mammifère de choix pour réaliser des modifications génétiques (surexpression ou invalidation d'une protéine, globale ou ciblée dans un tissu). Ainsi, l’utilisation de souris (KO et WT) pour le corégulateur transcriptionel étudié va permettre de déterminer l’implication de ce facteur in vivo dans les désordres métaboliques complexes. Les animaux seront étudiés à l’âge adulte dans toutes les procédures du projet.
Caractérisation de modèles physiopathologiques chez la souris dans le cadre de la recherche sur les maladies neurologiques rares
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
4 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des composés par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, orale ou intraveineuse jusqu'à une fois par semaine pendant quinze mois, subissent jusqu'à deux injections intracérébrales sous anesthésie, des prélèvements sanguins toutes les trois semaines pendant trente semaines et une privation totale d'eau pouvant atteindre vingt-quatre heures. L'objectif déclaré est de fabriquer puis de valider des modèles de maladies neurologiques rares, en vérifiant que les souris développent bien tremblements, incoordination motrice, dermatites et perte de poids. Celles qui se dégradent sont tuées en cours d'étude, les autres à la fin, pour prélever fluides et tissus. Le porteur affirme que le recours à l'animal est "indispensable", une majorité des aspects d'une maladie ne pouvant selon lui être reproduits in silico ou in vitro.
Objectifs
En France, le nombre de personnes atteintes de maladies rares est estimé actuellement à 3.5 millions. Une maladie est dite rare lorsqu’elle affecte moins d’une personne sur 2000. Plus de 7000 maladies rares, dont environ 800 neurologiques, sont décrites, et de nouvelles sont identifiées chaque semaine. Les maladies rares, et en particulier les maladies rares neurologiques, sont généralement sévères, chroniques et handicapantes. L’atteinte peut être visible dès la naissance ou l’enfance, comme par exemple dans l’amyotrophie spinale infantile ou l’épilepsie infantile. Cependant, plus de 50% des maladies rares apparaissent à l’âge adulte, comme la maladie de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique ou les ataxies spinocérébelleuses. La moitié des personnes atteintes présentent des déficits moteurs, sensitifs ou intellectuels et dans 9 % des cas, une perte totale d’autonomie. II est possible de reproduire en partie les symptômes de la pathologie chez la souris à la suite d’une altération de son génome, d’une modification de son environnement (mise à jeun hydrique) ou encore en lui administrant des agents ou préparations biologiques destinées à modifier le fonctionnement du système nerveux central. La souris présente une forte homologie génétique, physiologique et comportementale avec l’homme et apporte ainsi une forte valeur translationnelle. En effet, 90% des gènes humains ont un équivalent chez la souris saine, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque l’homologie homme/souris n’est pas possible, l’ajout du gène humain dans le génome de la souris permet la création de lignées génétiquement modifiées. Ces souris génétiquement modifiées permettent de mettre en évidence un phénotype pathologique (tremblements, altération du poids…) ainsi que l’identification de nouveaux bio-marqueurs et de nouvelles cibles qui contribuent au développement de meilleurs traitements des maladies neurologiques rares. C’est dans ce contexte que notre équipe tente aujourd’hui de générer des nouveaux modèles de pathologies humaines chez le rongeur et de les caractériser afin de déterminer s’ils peuvent ou non devenir des modèles pertinents pour évaluer des composés issus de notre recherche sur leur capacité à ralentir ou arrêter la progression de ces maladies, dans le but de proposer aux patients des traitements adaptés et personnalisés.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le cadre de la stratégie de recherche en neurosciences. Les bénéfices attendus de ce projet sont d’identifier et de sélectionner le meilleur modèle transgénique ou la meilleure méthode d’induction conduisant aux modèles de neuro-physiopathologies les plus pertinents sur une cible donnée dans le cadre de la recherche contre les maladies rares neurologiques.
Procédures
•Administration des médicaments vétérinaires analgésiques et anesthésiques par voie sous cutanée ou intra-péritonéale (contention d’une durée maximale de 30s) •Administration de composés de référence ou véhicule par voie intra-péritonéale, sous-cutanée, per os ou intra-veineuse (chez la souris vigile en simple contention d’une durée maximale de 30s – 1 fois par semaine pendant 15 mois maximum) OU sous anesthésie générale gazeuse et couverture analgésique par voie intra-cérébrale (durée maximale de 25 minutes – 2 fois maximum espacé de 14 jours) •Administration de substrat de bioluminescence selon la procédure expérimentale mise en oeuvre par voir intra-péritonéale (chez la souris vigile par contention d’une durée maximale de 30s – 1 fois par mois pendant 15 mois maximum) •Prélèvement de sang répété sur animal vigile (1 fois toutes les 3 semaines pendant 30 semaines maximum) : oContention d’une durée maximale de 2min oPiqûre de la veine marginale de la patte d’une durée maximale de quelques secondes oPrélèvement de sang d’une durée maximale de 15 secondes
Impact sur les animaux
Une potentielle source de stress ou douleur peut provenir lors : -Des injections d’analgésiques et/ou d’anesthésiques réalisées en Sous cutanée, Intra péritonéal. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress. -De l’administration d’agents inducteurs ou de composés de référence réalisées chez la souris vigile en Sous cutanée, Intra péritonéale, Intraveineux et Per Os. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress. -OU selon la procédure mise en oeuvre, de la phase chirurgicale (2 chirurgies maximum séparées de 14 jours minimum d’une durée d’environ 20 minutes chacune) et du suivi post-opératoire. -Des prélèvements de sang au niveau de la veine marginale ou saphène de la patte. La contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress. -D’une perte de poids potentielle limitée à 20% du poids de l’animal. -Des signes cliniques observables associés à l’injection des agents inducteurs (troubles du comportement, altération de l’état général). La mise à jeun hydrique complète d’une durée maximale de 24h. Au-delà de 12h de jeun hydrique, les animaux peuvent présenter une perte de poids (
Devenir
Toutes les souris sont soit euthanasiées en cours d’étude si des points limites éthiques sont atteints, soit euthanasiées en fin d’études afin de réaliser des prélèvements de fluides et/ou de tissus qui permettront d’effectuer des analyses biochimiques.
Remplacement
La recherche de nouveaux médicaments dans le domaine des maladies neurologiques rares repose sur une première étape d’identification de molécules efficaces sur leur cible au moyen de tests in vitro (cultures de neurones primaires, IPS…) et in silico. Toutefois l’efficacité thérapeutique d’une molécule ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal mimant la physiologie de la pathologie humaine. Il est donc nécessaire de valider les modèles physiopathologiques avant que les molécules les plus abouties dans leur développement soient administrées in vivo. Plus spécifiquement pour ce projet, seul l’animal (sain ou génétiquement modifié) possède de façon intégrée un répertoire comportemental et des caractéristiques neurophysiologiques permettant de tester l’efficacité des agents inducteurs aboutissant à la mise en place des modèles physiopathologiques plus relevant que les modèles in vitro existants, pour le traitement de maladies neurologiques rares. L’identification de modèles physiopathologiques qui récapitulent précisément les symptômes retrouvés chez les patients est critique afin de tester l’efficacité des nouvelles thérapies sur ces mêmes altérations. Le recours à l’animal est indispensable étant donné qu’une majorité des aspects physiopathologiques d’une maladie ne peuvent être récapitulés in silico ou in vitro.
Réduction
Les phases de caractérisation et de validation des modèles permettent d’appréhender le nombre d’animaux qui sera nécessaire pour les études d’efficacité de traitements pharmacologiques. Aucun animal ne sera utilisé pour des études d’efficacité si le modèle d’induction n’est pas validé préalablement. Au cas par cas, en fonction du projet de recherche concerné et des questions posées, un accompagnement par le service des Biostatistiques sera assuré dans le but d’affiner le design expérimental. Pour les procédures dans lesquelles plusieurs paramètres seront testés (temps de traitement, durée de la modification environnementale...), les conditions les moins invasives seront testées en priorité pour conclure sur la validité du modèle établi dans ces conditions et éviter l’utilisation de cohortes supplémentaires. Les conditions expérimentales sont basées sur l’expérience et les données disponibles dans la littérature. Le prélèvement de sang répété, peu invasif et rapide, permet de prélever des échantillons de sang plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés dans le projet, tout en respectant les limites de volémies physiologiques. Lors des prélèvements effectués à la fin des études, un maximum de tissus et de fluides seront collectés sur un même animal. Chaque tissu, cérébral ou périphérique, sera séparé en plusieurs échantillons permettant différentes analyses biochimiques et/histologiques. Ce process nous permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés pour chaque modèle étudié.
Raffinement
Dans les modèles dont l’induction le nécessite ou lors de l’administration de certains composés de référence, les injections intracérébrales seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse et avec analgésie pré, péri et post-opératoire. Les souris seront hébergées en groupe dès l’arrivage et pendant toute la durée de l’étude, sauf si les caractéristiques liées à la souche ne le permettent pas (agressivité entre congénère…) et en accord avec les recommandations de la Structure de Bien-Être Animal. Toute la phase chirurgicale, d’une durée d’environ 20 minutes, se fera sur couverture chauffante et/ou dans des enceintes chauffées réduisant ainsi significativement le risque d’hypothermie. Lors des injections de vecteurs viraux, il sera possible de suivre l’expression des protéines d’intérêt grâce à l’appareil IVIS Lumina. Il permet de réaliser une lecture de bioluminescence et de vérifier la qualité de l’injection intracérébrale. Les éventuelles recommandations en termes de limite d’âge ou de conditions de maintien émises par la Structure de Bien-Être Animal seront appliquées aux souris âgées ou génétiquement modifiées qui peuvent développer des signes pathologiques avec le temps. Des prélèvements de sang à la veine marginale ou saphène de la patte peuvent être mis en œuvre afin d’obtenir des informations sur de possibles biomarqueurs. Si des prélèvements sanguins répétés sont prévus, le volume maximal prélevé n’excèdera pas 15% de volume de sang total sur 28 jours. Tous les animaux font l’objet d’un suivi quotidien qui est accru lors des périodes post-chirurgicales (7 jours consécutifs) et pour les souris génétiquement altérées, réalisé par les expérimentateurs et le personnel assurant leur soin. Les recueils d’urine pour les examens biologiques seront réalisés sur litière hydrophobe en remplacement des cages à métabolisme, maintenant ainsi les animaux dans de meilleures conditions de stabulation. Le volume de recueils sera régulièrement contrôlé pour arrêter la diurèse si le volume nécessaire est obtenu et sans dépasser une durée maximale de 4h pour limiter le stress des animaux. Ce projet bénéficie d’une expérience interne et de données déjà existantes sur de nombreux modèles, tels que les « seeds » et les vecteurs viraux, mis en œuvre dans le cadre de plusieurs projets. Ainsi, cela constitue un socle de connaissance solide sur lequel nous nous appuyons afin de définir des mesures de raffinement cohérentes.
Choix des espèces
- La souris présente comme le rat une forte homologie génétique, physiologique et comportementale avec l’homme et ainsi une forte valeur translationnelle. En particulier, sur le plan comportemental, de nombreux modèles d’induction et de tests ont été développés chez la souris, en miroir des fonctions cognitives, sensori-motrices, et des états émotionnels de l’Homme. - Les procédures d’induction et d’évaluations décrites dans ce projet s’appuient sur une littérature scientifique et une expertise interne robustes. Les modèles d'induction par agents biologiques chez la souris sont plus largement décrits dans la littérature que les modèles rat et notre expertise actuelle pour la souris est plus avancée que pour le rat. - La souris est génétiquement modifiable et ce avec des techniques de plus en plus performantes (ex : édition du génome), offrant une large palette de modèles pertinents pour l’identification de nouveaux biomarqueurs et cibles des maladies neurodégénératives. Les souris seront utilisées du stade « jeune adulte sevré » au stade « animal âgé ». L’âge des souris au moment des études effectuées dépendra du modèle utilisé : -Si l’étude concerne des injections de composés par voie cérébrale/orale ou périphérique, les souris utilisées sont de jeunes adultes sevrés ou adultes au moment de l’administration. L’âge d’utilisation dépendra des éventuelles recommandations en termes de limite d’âge qui pourront être émises par la Structure de Bien-Etre Animal.
Impact d’une inflammation persistante de faible intensité sur le dysfonctionnement métabolique lié à l’obésité dans un modèle de souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Issues de couples reproducteurs eux-mêmes tués à l'issue, les souris de ce projet sont ensuite utilisées dans la procédure principale puis tuées pour le prélèvement de leurs organes. 4 500 souris au total vont être utilisées, dans des procédures allant d'un niveau de souffrance léger à modéré. 1 080 d'entre elles suivent seize semaines de régime obésogène, avec sept prélèvements de sang en deux heures répétés à trois reprises, des injections de glucose et d'insuline dans le péritoine, et deux minutes d'immobilisation vigile dans un tube de contention pour mesurer leur masse grasse. Le porteur affirme que l'utilisation d'un modèle animal est "indispensable" à des fins exploratoires et qu'"aucune autre espèce n'est aussi adaptée", en signalant par ailleurs que les lignées de souris voulues sont déjà disponibles dans son laboratoire.
Objectifs
De plus en plus de preuves relient l'inflammation aux changements métaboliques associés à l'obésité et au diabète de type 2. L'obésité est associée à une inflammation tissulaire, un facteur de risque majeur de prédiabète et de diabète de type 2, car elle entraîne à la fois une baisse de la production d’insuline et une résistance à l'insuline. Le rôle émergent de l’inflammation dans la physiopathologie du diabète de type 2 et des troubles métaboliques associés a suscité un intérêt croissant pour le ciblage de l’inflammation afin d’améliorer la prévention et le contrôle de la maladie. NLRP3 est une protéine contrôlant une voie majeure de l’inflammation. Le potentiel de NLRP3 en tant que cible thérapeutique dans le traitement de la résistance à l’insuline induite par l’obésité a été signalé dans la littérature. En effet, il a été démontré que l'obésité active le NLRP3 et que les souris déficientes en NLRP3 sont protégées contre l'obésité et la progression du diabète. Néanmoins, le rôle d’une inflammation de bas grade dans l’apparition de l’obésité n’a pas été directement étudié. Afin de déterminer l'impact direct d'une inflammation de bas grade à long terme sur l'apparition de l'obésité et la dérégulation métabolique, nous utiliserons des groupes de souris invalidées pour les composants ou activateurs de NLRP3.
Bénéfices attendus
A court terme, le projet vise à décrire de manière exhaustive le rôle de l’inflammation de faible intensité, caractérisée par une sécrétion légèrement augmentée mais persistante des cytokines inflammatoires, dans l'apparition des maladies métaboliques, dont le diabète. Pour cela, le projet vise à étudier les caractéristiques observables chez les souris conduisant à une inflammation constitutive de faible intensité afin d'explorer l'effet d'une telle inflammation sur les troubles métaboliques, notamment le diabète. À plus long terme, ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes du diabète, notamment le rôle de l’inflammation, et à contribuer à trouver de nouveaux traitements potentiels, en envisageant notamment des stratégies anti-inflammatoires.
Procédures
À l'âge de 7 à 11 semaines, 1 080 animaux seront soumis à des régimes où aucune douleur n’est anticipée, pour une durée de 16 semaines. Avant, au milieu et à la fin du régime, 1 080 souris resteront vigiles dans un tube à contention pendant 2 minutes une fois afin de mesurer la répartition de la masse maigre et de la masse grasse. Aucune anesthésie ne sera nécessaire pour cette procédure. Pour mesurer la glycémie et l’insulinémie une goutte de sang sera prélevée 7 fois sur une période de 2 heures avant, au milieu et à la fin du régime. Pour effectuer les analyses sanguines, un prélèvement de sang sera réalisé une fois avant, au milieu et à la fin du régime sur les 1 080 souris. Le génotypage sera fait grâce à de l'ADN génomique purifié extrait à partir de tissus d'animaux au servage (3 semaines). Lors de la mise à mort, un prélèvement de grande quantité de sang sera effectué afin d'étudier les marqueurs métaboliques.
Impact sur les animaux
Obésité, douleur aux sites d'injection lors des injections intra-péritonéales de glucose et d'insuline, douleur aux sites de prélèvement lors des biopsies réalisées pour le génotypage et les prélèvements sanguins.
Devenir
Les animaux utilisés comme couple reproducteur seront euthanasiés. Les animaux issus de ces reproductions seront ensuite utilisés pour la procédure 2, où ils seront euthanasiés pour récupérer des organes vitaux.
Remplacement
Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe. De plus, les études in vitro ne prennent pas en compte l'environnement nutritionnel et métabolique. Les effets chroniques du diabète ne peuvent pas être reflétés in vitro car d'autres variables physiologiques telles que les réponses hormonales et inflammatoires sont impliquées. L'utilisation d'un modèle animale est indispensable à des fins exploratoires.
Réduction
Les expériences sont conçues pour utiliser un nombre minimum d'animaux, tout en assurant qu'il soit suffisant pour permettre la réalisation des tests statistiques appropriés sur les souris mâles et femelles. L'utilisation de mâles et de femelles permet de limiter la perte d'animaux. De plus, afin de réduire le nombre de souris nécessaires, chaque animal sera soumis à un maximum d'analyses possibles.
Raffinement
Les procédures expérimentales ont été optimisées afin de minimiser l'inconfort et le stress des animaux. Leur bien-être est une priorité absolue et est pris en compte de manière scrupuleuse à toutes les étapes, notamment en ce qui concerne leurs conditions de logement. Les souris seront hébergées dans des installations appropriées avec un enrichissement systématique, et elles seront logées en groupe pour favoriser leur bien-être social. Les personnes effectuant les procédures respecteront strictement les normes éthiques lors de la manipulation et de l'euthanasie des animaux. Des critères bien définis sont établis pour limiter au minimum la souffrance animale. Pour éviter les bagarres entre mâles de portées différentes, le seul mâle né d'une même portée sera isolé dans une seule cage. Dans ce cas, des mesures d’enrichissement environnemental seront mises en place, telles que l'ajout de maisons en carton, de nids ou de bâtons de bois.
Choix des espèces
L'utilisation du modèle souris est essentielle pour éviter la duplication d'expériences inutiles en tirant parti des connaissances existantes dans la littérature et en permettant une comparaison facile des résultats pour une progression plus rapide. La souris est couramment utilisée dans les études fondamentales, notamment dans l'étude des maladies métaboliques et de l'inflammation de faible intensité dans le diabète, ce qui en fait un choix idéal pour ce projet. Les données in vivo disponibles dans la littérature sont principalement obtenues à partir d'études sur des souris, et cette espèce offre une abondance de matériel biologique pour des analyses approfondies, notamment des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce n'est aussi adaptée pour répondre aux objectifs de cette étude. De plus, des modèles murins pertinents sont déjà disponibles dans notre laboratoire, ce qui facilite la mise en œuvre de ce projet. Pour le stade de développement, il s’agit de jeunes adultes âgés de 7 à 11 semaines, ce qui correspond aux standards utilisés pour ce type d’étude métabolique.
Neurobiologie de la balance énergétique entre l’activité physique et la prise alimentaire
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à la fin des expériences comportementales pour des analyses histologiques de leurs tissus, 1 368 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est isolée en cage individuelle dès huit semaines, pour six à sept semaines dans le cas de 1 224 d'entre elles, et 1 176 subissent trois jours de restriction alimentaire les maintenant à 90 % de leur poids. 576 souris reçoivent en plus une chirurgie d'injection intracérébrale d'environ quatre-vingt-dix minutes. Le porteur reconnaît que l'absence d'interaction sociale peut être une source de stress, tout en présentant l'isolement comme la condition pour mesurer la prise alimentaire individuelle et pour éviter les bagarres "fréquentes chez les souris mutantes", et conclut que ses études comportementales ne sont pas aversives.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’apporter de nouvelles données concernant les mécanismes qui régulent la balance énergétique ainsi que les processus motivationnels pour des récompenses naturelles. Ce projet permettra de disséquer les circuits impliqués dans la motivation pour l'exercice physique et d’étudier des cibles potentielles dans le traitement des troubles alimentaires (obésité, anorexie).
Bénéfices attendus
Ce projet vise une meilleure compréhension de la régulation de la balance énergétique d’un point de vue motivationnel et des circuits jouant un rôle dans ce mécanisme. L’utilisation de notre modèle comportemental permettra d’approfondir les connaissances au sujet de la neurobiologie des troubles alimentaires (anorexie, obésité). A long terme, ces données pourront être utilisées pour investiguer les cibles potentielles dans le traitement de ces troubles alimentaires.
Procédures
Les animaux seront soumis à : (1)Hébergement individuel : cette condition concernera tous les animaux (1368). La durée de l’isolement sera de 6 à 7 semaines pour 1224 animaux et de 1,5 semaines pour 144 animaux. (2)Chirurgie pour injection intracérébrale : cette intervention concernera les animaux des procédures 1 et 3 : 576 animaux. La durée de ces chirurgies sera d’environ 90 min. (3)Injection sous cutanée : Les animaux ayant reçu des chirurgies pour injection intracérébrale (576 animaux) recevront 2 injections sous cutanée (analgésique et anesthésique local au niveau du crâne). Dans la procédure 4, 144 animaux recevront 1 injection (injection de micropuces permettant d’identifier les différents animaux). (4)Injection intra-péritonéale : ce geste concernera tous les animaux ayant reçu une chirurgie, soit 576 animaux. Les animaux recevront 4 injections d’analgésique (1 durant la chirurgie et 3 en post-opératoire). 192 animaux parmi ces animaux recevront aussi 2 injections durant l’étude comportementale. (5)Test comportemental : tous les animaux de cette étude seront concernés, soit 1368 animaux. Cette étude va durer 2 semaines pour les 192 animaux de la procédure 1 et 3,5 semaines pour les 1176 animaux des autres procédures. (6)Restriction alimentaire : Cette restriction sera de 3 jours et correspond au maintien à 90% de leur poids initial. Elle concernera les animaux des procédures 2, 3 et 4, soit 1176 animaux.
Impact sur les animaux
Les différents tests utilisés dans ce projet nécessitent de pouvoir étudier la prise alimentaire individuelle des souris. Celles-ci seront donc hébergées de manière individuelle dès l'âge de 8 semaines et ce jusqu'à la fin des procédures. Cette absence d’interaction sociale peut être une source de stress pour les animaux. Les injections avant les tests comportementaux peut également entrainer une douleur. Afin de diminuer la gêne engendrée par ces injections, le côté de l'animal qui sera injecté sera interverti chaque jour. La restriction alimentaire, permettant de faciliter l’apprentissage des animaux, pourrait entrainer une perte de poids supérieure à 15%. Dans ce cas, la restriction serait immédiatement arrêtée. Cependant, cette restriction ne devrait théoriquement pas entrainer cet effet indésirable parce qu’elle sera limitée à 3 jours. L'opération ne présente pas de risques majeurs et la douleur associée sera contrôlée par une anesthésie et des analgésiques adéquats. Si ces mesures sont prises correctement, il n'y a pas de signes de douleur après l'opération ou pendant la convalescence. Les traitements médicamenteux, les injections intrapéritonéales, et produits utilisés (et les doses) sont bien contrôlés en laboratoire et tolérés par les animaux.
Devenir
Les animaux de toutes les procédures seront mis à mort à la fin des expériences comportementales et des tissus seront récupérés pour procéder à des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico. De plus l'utilisation d'invertébrés, serait incompatible avec l'étude de la motivation pour une récompense telle que l'activité physique ou la prise alimentaire.
Réduction
Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux à inclure sera de 12/groupe. Ce nombre d’animaux/groupe a été fixé (1) en utilisant des calculs de puissance nous permettant d’obtenir une différence significative pour les différentes variables d’intérêt qui seront évaluées dans l’étude et de rejeter une hypothèse nulle, et (2) en se référant à des publications du domaine (3) en prenant en compte la variabilité que nous retrouvons habituellement dans le comportement d'intérêt. Nous utiliserons 2 cohortes d'animaux (n=12/groupe/cohorte) afin de valider la reproductibilité des résultats. Nous avons regroupé dans la mesure du possible différents tests comportementaux sur les mêmes lots de souris, et avons conçus nos expériences de manière à obtenir un maximum d'informations à partir des mêmes animaux.
Raffinement
Pour le raffinement, plusieurs précautions seront prises en compte. Les souris seront hébergées dans des cages individuelles pour contrôler la consommation de nourriture et pour éviter les bagarres, fréquentes chez les souris mutantes. Les cages d’hébergement des souris seront enrichies en matériel de nidification (7 carrés de cellulose), ainsi que d’un morceau de bois à ronger et d’un tunnel en carton (comme prévu par la directive 2010/63/CE). Durant les études comportementales, les animaux seront manipulés grâce au tunnel en carton présent dans leur cage d’hébergement afin d’éviter la préhension par la queue. Les animaux, vivant dans les chambres opérantes, auront du nid provenant de leur cage d’hébergement, ainsi qu’un abri/jouet. Les chirurgies intracérébrales seront effectuées sous anesthésie générale. Les animaux recevront un traitement analgésique. Suite à la chirurgie, chaque animal est suivi quotidiennement (poids, prise alimentaire, aspect général) et une étiquette est accrochée au dos de sa carte de cage individuelle pour le personnel animalier, avec l’ensemble des informations concernant son suivi post-opératoire sur une semaine. Des points limites ont été définis par un état anormal constaté sur deux jours consécutifs (perte de poids de 15%/jour, ataxie, hypolocomotion, pelage non soigné). Si ce point est atteint, nous préviendrons immédiatement la vétérinaire de l’établissement afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (comme la poursuite du traitement analgésique). En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort par dislocation cervicale afin de lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions pas soulager. Nos études comportementales ne sont pas aversives, nous ne devrons donc en théorie jamais atteindre ce point limite.
Choix des espèces
1) Ce projet nécessite l’utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement chez les modèles de souris. 2) Reproductibilité et comparaison avec les résultats obtenus dans le laboratoire auparavant et la communauté scientifique plus large. 3) Des modèles animaux moins évolués (par exemple, ver C. elegans ou poisson zèbre) ne peuvent convenir pour nos observations comportementales (course et prise alimentaires). Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines) qui se justifie par l’immaturité du système nerveux au cours de l’adolescence.
Recherche de traitement adjuvant à l’immunothérapie par injection d’anticorps monoclonaux anti-PD1 dans un modèle murin de tumorigenèse pulmonaire 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Pour tester si une supplémentation nutritionnelle et l'exercice volontaire renforcent l'effet d'une immunothérapie anticancéreuse, 84 souris mâles de cinquante semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour un prélèvement de sang et de tissus. Des cellules tumorales leur sont injectées dans la veine de la queue, puis un anticorps anti-PD1 dans le péritoine tous les quatre jours pendant trente jours, avec une imagerie hebdomadaire sous anesthésie. Les tests mesurent la force par traction sur un dynamomètre, l'animal étant tiré par la queue, la vitesse maximale de course sur tapis roulant jusqu'à l'épuisement, et l'équilibre sur un cylindre rotatif. Le porteur signale que la tumorisation pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires, une léthargie et une agressivité accrue, et prévoit la mise à mort dès trois points limites notables ou un point limite sévère.
Objectifs
L’immunothérapie est une stratégie thérapeutique en plein essor, notamment dans le cancer du poumon, car elle n’induit pas de toxicité secondaire comme les traitements par radiochimiothérapie. Son efficacité reste cependant à améliorer car tous les patients ne répondent pas aux traitements d’où la nécessité de travailler sur des traitements adjuvants. Nous souhaitons combiner 2 approches pour améliorer cette efficacité : - nutritionnelle : supplémentation en acides gras polyinsaturés et en béta-hydroxybutyrate - activité physique : mise en place d’enrichissement dédié à l’augmentation de l’activité physique volontaire. Afin de répondre à cet objectif, le projet se déroulera sur 2 établissements utilisateurs (un principal et un second pour la réalisation d'imagerie optique in vivo)
Bénéfices attendus
Nous attendons à ce que nos traitements améliorent l’efficacité de l’immunothérapie. Pour voir cela, nous suivrons l’évolution du volume tumoral. Des traitements adjuvants tels qu’une supplémentation nutritionnelle ou la mise en place d’une activité physique adaptée est envisageable au cours du traitement par immunothérapie chez les patients. Il y a donc une réelle possiblité de transfert des résultats obtenus dans ce projet en clinique.
Procédures
Les supplémentations nutritionelles se feront ad libitum, par remplacement de l’eau de boisson par le béta-hydroxybutyrate et avec des croquettes pour les acides gras en débitant une semaine vant la tumorigenèse puis pendat les 30 jours du suivi tumoral. L’implantation des tumeurs sera effectuée par injection I.V dans la veine de la queue. Le suivi du volume tumoral sera réalisé par imagerie de biolomuminescence à raison d'un examen par semaine sur une durée 30jours. L’administration de l’immunothérapie sera effectuée tous les 4 jours pendant les 30 jours de tumorigenèse par injection intra-péritonéale d’anicorps anti PD-1. La tumorigenèse sera suivie par imagerie avec calcul du volume tumoral sous anesthésie à l’halothane. La mesure de la synthèse protéique sera effectuée après injection sous cutané d’un traceur (isotope stable). Le test d'agrippement sera réalisé à l'aide d'un dynamomètre munie d'une grille où la souris s'accroche, le manipulateur tire alors la souris par la queue. La mesure de la vitesse maximale de course sera effectuée sur un tapis roulant, le test s'arrête quand la souris est épuisée, elle reste alors sur une grille en bout de tapis. Le test dure en moyenne une quizaine de minutes. Une habituation au tapis de course aura leiru en amont du test. Le test d'équilibre au rotarod se déroule sur un cylindre en rotation, les souris seront habituées à cette procédure en amont. Le test dure en moyenne 2-3 minutesLe passage en echoMRI implique une légère contention des animaux dans un tube placé dans l'appareil. La mesure dure 1 minute environ. Les mesures de performances physiques ainsi que l'echoMRI auront lieu juste avant l'implantation (J0) puis à J15 et J30 post-implantation. Pour ce projet, l'ensemble des procédures se déroulera dans l'EU.1. Seule les acquisitions d'imagerie de bioluminescence seront réalisées au sein de l'EU.2.
Impact sur les animaux
La tumorigenèse peut s'accompager de difficultés respiratoires, d'une perte de poids, de comportements anormaux, tels que l'isolement social, la léthargie, l'agressivité́ accrue ou une altération de la locomotion. Les souris seront surveillées quotidiennement pour suivre leur comportement général.
Devenir
tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole pour prélèvements de sang et de tissus
Remplacement
L’utilisation d’animaux, dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacer par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 voire 3 dimensions. En effet, ces systèmes ne permettent pas d’aborder les relations inter-organes et de mesurer simultanément la digestibilité des acides gras polyinsaturés w3 et du béta-hydroxy-butyrate, l’évolution de la fonctionnalité musculaire, de la performance et de la mobilité, le métabolisme protéique musculaire et le statut inflammatoire circulant et enfin l’évolution du volume tumoral.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans en compromettre les objectifs. Il a été déterminé par un calcul d’échantillonnage. Le nombre de souris nécessaires à l’étude est calculé pour une différence attendue de 25% pour le volume tumoral entre les souris supplémentées en acides gras ou en béta-hydroxybutyrate + activité physique et les souris nourries avec un régime standard. Des études antérieures ont montré que la variabilité du paramètre choisi est de 14%. L’effectif est calculé pour un risque de 1ère espèce alpha de 5% et un risque de 2ème espèce béta de 5%. Ainsi, le nombre de souris nécessaires par groupe est de 8. Toutefois, afin d’anticiper une mortalité éventuelle liée à la tumorigénèse, nous avons choisi de débuter l’étude avec des groupes de 12 souris. Le nombre total de souris nécessaires à la réalisation de ce projet est donc de 84.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les souris seront hébergées par 6 dans des cages T4 (55cm x 33cm, soit 1815cm2, et 19cm de hauteur sous grille). Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque souris, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Une grille d'évaluation définissant des points limites sera mise en place. Elle permettra d'identifier des points limites notables et des points limites graves. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum. Les points limites et l’arbre de décision adapté à cette étude sont présentés en annexes 1 et 2. Afin de réaliser les imageries optique dans l'EU.2 les animaux seront transportés dans des cages à filtres dans un véhicule dédié. Le transport dure moins de 5min d'un site à l'autre. A leur arrivée, les animaux seront hébergés au calme dans une armoire ventilée.
Choix des espèces
Pour réaliser notre projet d’étude, nous avons choisi la souris C57BL/6 car nous allons leur injecter des cellules tumorales issues de souris C57BL/6. Le modèle de tumorigenèse est donc syngénique. De plus, ces souris sont très actives en environnement enrichi ce qui est crucial pour tester l’effet de l’activité physique volontaire. Nous avons utilisé cette espèce par le passé et validé toutes les procédures détaillées dans ce dossier avec ces souris. Chez l’homme, le cancer du poumon non à petites cellules est diagnotiqué à l’âge moyen de 65 ans. Nous utiliserons par conséquent des souris mâles adultes de 50 semaines.
Carence en vitamine D chez la souris mâle et conséquences sur la descendance.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Les souris mâles subissent une chirurgie scrotale de vingt minutes sous anesthésie pour un prélèvement de sperme, après dix semaines de régime carencé en vitamine D. 60 souris vont être utilisées et toutes tuées pour prélever leurs tissus, dans des procédures que le porteur déclare en gravité légère. Leur descendance est répartie en six groupes tués à différents âges, certains dès quatre jours après la naissance, pour analyser l'adiposité et l'empreinte épigénétique du tissu adipeux. Le porteur qualifie pourtant lui-même le prélèvement de sperme de nuisance "modérée", et l'objet du projet reste d'établir des recommandations nutritionnelles pour les hommes en âge de procréer.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’apporter des données permettant d’évaluer l’impact d’insuffisance en vitamine D chez la souris mâle, sur les trajectoires métaboliques de la descendance. Des souris mâles seront nourris pendant 10 semaines avec un régime contrôle ou un déficient en vitamine D. Les mâles carencés seront étudiés (suivi de l'evolution pondérale, prise alimentaire, impact sur le microbiote). Ces males seront ensuite accouplés avec des souris femelles nourries avec une alimentation contrôle. Ceci permettra de générer une descendance issue de pères carencés ou non. Un prélèvement de sperme sera réalisé. L'étude portera ensuite sur cette descendance. Des groupes de 10 animaux de chaque sexe sont utilisés. Au total, l'etude sur la descendance portera donc sur 6 groupes d'animaux étudiés à différents stades de leur vie (4 jours post naissance; post-sevrage et age adulte), repartis de la façon suivante : mâles après naissance, femelles après naissance, mâles post-sevrage, femelles post-sevrage, mâles adultes, femelles adultes. Sur la descendance, à l'exception des animaux mis à mort 4 jours apres la naissance, un suivi de croissance sera réalisé par pesée toutes les semaines ainsi que la quantification de la consommation alimentaire. Les animaux seront euthanasiés à différents stades afin d'etudier l’adiposité, l’expression génique du tissu adipeux et l’empreinte épigénétique du tissu adipeux. A noter qu'il est prévu de réaliser 3 cohortes de géniteurs sur la période des 3 années sur laquelle va se dérouler ce projet.
Bénéfices attendus
Les données obtenues dans le cadre de ce projet permettront de connaitre l'impact d'une déficience paternelle en vitamine D sur la descendance. Cela servira de base pour émettre des recommendations nutritionnelles aux hommes en âge de procréer.
Procédures
Les animaux femelles seront soumis à un perçage d'une oreille une fois à leur arrivée. À 9 semaines d'alimentation contrôlée, un prélèvement de fécès nécessitant de les isoler pendant ~30 minutes sera réalisé; suivi d'une prise de sang à la queue sur animal vigile à 10 semaines. Les animaux mâles recevront une chirurgie scrotale qui dure maximum 20 minutes par animale.
Impact sur les animaux
Les animaux mâles seront soumis à un régime carencé en vitamine D, aucune souffrance n'est attendue mais des nuissances peuvent survenir (nuissance de gravité légère, longue durée). Les animaux seront également maintenu en isolement lors des recueils de fécès ce qui peut constituer une source de stress (nuissance de gravité légère, courte durée). Un prélèvement de sang sera réalisé à la veine caudale (nuissance de gravité légère, courte durée). Un prélèvement de sperme sera réalisé sous anesthésie et lors d'une chirurgie scrotale (nuissance modérée, durée de la chirurgie environ 20 minutes). Enfin l'induction de l'anesthsie peut constituer une source de nuisance (nuissance de gravité légère, longue durée).
Devenir
Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'intérêt qui seront ensuite analysés.
Remplacement
Il n'existe à l'heure actuelle aucune méthode de substitution in vitro pour étudier l'impact de la nutrition périnatale. La souris est un modèle de choix car elle présente des mécanismes physiologiques proches de ceux qui sont observables chez l'homme. Le but de ce projet est de rechercher les conséquences métaboliques chez la descendance, d’une carence en vitamine D chez le mâle géniteur. Ce processus est complexe et met en jeu de nombreux organes et systèmes métaboliques, qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux est le minimum nécessaire pour étudier la variabilité biologique de la descendance (descendance issue de 10 géniteurs différents). Ce nombre minimal est également nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, à l'aide d'un test statistique, notamment en ce qui concerne la prise de masse des animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage de 2 pour les mâles et les femelles, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en focntion des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt. Une anesthésie et une analgésie sont prévues lors du prélèvement de sperme.
Choix des espèces
La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les désordres métaboliques causés par l’alimentation en raison des similitudes avec l’homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 8 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondant tels que le vieillissement.
Interaction du microbiote et des lymphocytes T spécifiques, les cellules MAIT, lors d’une inflammation intestinale chez la souris (Site 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Un composé chimique ajouté à leur eau de boisson déclenche une inflammation intestinale, en trois cycles de cinq jours à concentrations croissantes, entrecoupés de quatre jours d'eau avec ou sans antibiotiques. Le porteur indique que cette inflammation peut provoquer des diarrhées et une perte d'environ 25 % du poids initial, poids retrouvé deux à sept jours après la fin du traitement. Les souris sont hébergées sur un site et transportées vers un second uniquement pour y être mises à mort, leurs organes étant ensuite analysés par histologie et par cytométrie en flux.
Objectifs
Les bactéries du système digestif (microbiote intestinal) assurent des fonctions essentielles telles que la digestion et la protection contre les agents pathogènes, mais peuvent aussi exacerber l’inflammation intestinale chez les patients atteints de maladie de Crohn ou de rectocolite hémorragique. Le système immunitaire, et notamment des globules blancs : les lymphocytes T, jouent un rôle central dans la surveillance du microbiote intestinal et dans la réduction de l’inflammation du colon. Décrypter les interactions entre les lymphocytes T et le microbiote, chez les sujets sains ouen cas d’inflammation intestinale chronique, est donc essentiel pour comprendre les nombreuses pathologies associées au microbiote. Les fonctions des lymphocytes T reposent sur leur capacité à reconnaitre des molécules microbiennes appelées antigènes. L’un de ces antigènes est produit par certaines bactéries du microbiote. Les lymphocytes reconnaissant cet antigène microbien sont activés chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, ainsi que dans les modèles d’inflammation intestinale chez la souris. Nous souhaitons maintenant déterminer le rôle des bactéries dans l'activation et dans la fonction protectrice des lymphocytes T au cours de l’inflammation du colon. L'étude permettra de mieux comprendre le mécanisme de protection des lymphocytes T au cours de cette inflammation. Le modèle de souris nécessite des conditions d’élevages particulières qui sont disponibles dans le laboratoire 1. L’euthanasie et les prélèvements d’organes seront réalisés dans le laboratoire 2.
Bénéfices attendus
Ce projet améliorera notre compréhension d’une nouvelle interaction entre le système immunitaire et les bactéries du système digestif. Cette interaction est impliquée dans l’inflammation intestinale et le projet peut donc offrir de nouvelles opportunités thérapeutiques.
Procédures
Toutes les souris recevront dans l’eau de boisson un composé chimique qui génère une inflammation intestinale pendant 3 cycles de 5 jours à des concentrations progressives. Chaque cycle est suivi de 4 jours d’eau avec ou sans traitement d’antibiotiques. Le projet est réalisé sur le site n°1 sauf l’acte de mise à mort qui est réalisé sur le site n°2.
Impact sur les animaux
L’inflammation intestinale est induite par administration d’un composé chimique dans l’eau de boisson et est associé à des effets indésirables attendus. Elle peut causer des diarrhées entrainant une perte de poids d’environ 25% du poids initial. Le poids initial est retrouvé 2-7 jours après la fin du traitement. Aucun autre effet indésirable n’est attendu pour le reste du projet, les antibiotiques utilisés n’ont jamais montré d’effet indésirable lorsqu’ils sont utilisés pour éradiquer les bactéries. De plus, la bactérie utilisée pour le projet est une bactérie naturellement présente dans le système digestif. Le transport peut engendrer un stress supplémentaire.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem : collecte des organes et analyses par histologie ou cytométrie en flux.
Remplacement
Nous avons analysé in vitro la capacité de différentes cellules humaines et murines de différents tissus à capturer l’antigène microbien qui nous intéresse et à le présenter aux lymphocytes T spécifiques. Ces informations sont utiles mais ne permettent pas de conclure quant au rôle de ces cellules dans un organisme entier. Le rôle (bénéfique ou délétère) de l’interaction hôte-microbiote ne peut pas être déterminé dans des modèles in vitro ou ex vivo. Le modèle animal est donc nécessaire à ce stade.
Réduction
Nous utiliserons des modèles d’inflammation intestinale chez la souris. Les modèles ont déjà été mis en place, limitant ainsi le nombre d’animaux à utiliser. Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé en utilisant un test statistique. Ce nombre a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats.
Raffinement
Il y aura une observation quotidienne des animaux, une observation individuelle hebdomadaire à l’occasion des interventions d’entretien (changes de cages etc…) et une observation accrue durant l’inflammation intestinale induite, susceptible d’entrainer de la douleur, de la souffrance ou du stress, et cela plusieurs fois dans la journée pour s’assurer qu’il n’y a pas d’effet délétère. En cas de déshydratation, les souris seront réhydratées par voie intra-péritonéale et un gel hydratant sera placé dans la cage. Nous utiliserons une grille de score pour évaluer de façon objective l’état des animaux et des points limites adaptés aux signes cliniques associés à l’inflammation intestinale. Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début des procédures afin de les habituer aux manipulateurs. Les animaux seront hébergés en isolateur dans des cages standards par groupes de sexe identique (3 par cage). Du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et des tunnels en plastique pour se cacher seront ajoutés dans les cages. La litière sera constituée de copeaux stérilisés par irradiation. Les souris recevront ad libitum un aliment standard stérilisé par irradiation et de l’eau autoclavée. Pour le transport, les animaux seront transférés en cage de transport selon leur répartition d’origine afin de ne pas induire un stress supplémentaire dû à l’isolement ou à la cohabitation avec des nouveaux congénères. Les animaux seront transportés dans une boite de transport stérile à laquelle sera rajoutée de la litière, de l’enrichissement et de la nourriture provenant de leur cage d’hébergement. Le transport se fera dans un véhicule agréé et climatisé.
Choix des espèces
La souris est l'espèce dans laquelle les lymphocytes T ont été largement étudiés (en dehors de l’humain) et pour laquelle nous disposons d’outils moléculaires et génétiques permettant leur étude. La souris est également le modèle de choix pour l’étude de l’inflammation intestinale du fait de l’existence de modèles bien définis, de la similarité de la flore intestinale, et de la parenté génétique avec l’humain. Les souris seront utilisées à l’âge adulte car nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire mature.
Etude du microenvironnement immunitaire dans le développement précancéreux à la zone de transition anorectale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3 424 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à huit grattages de la zone anorectale au scalpel à bout rond, deux fois par semaine pendant quatre semaines, dans des procédures allant d'un niveau de souffrance léger à sévère. Toutes sont tuées, avec ou sans prélèvement d'organes selon qu'elles portent ou non le génotype recherché. Elles expriment un oncogène qui leur fait développer au bout d'un mois des papillomes dans la bouche, gênant la prise de nourriture solide, ce que le porteur dit compenser en humidifiant l'aliment. Le bénéfice avancé, mieux comprendre les étapes précoces des carcinomes de la zone anorectale, reste une hypothèse de recherche fondamentale, quand les blessures répétées et l'inflammation qu'elles provoquent sont infligées d'emblée.
Objectifs
Les épithéliums sont des tissus qui se renouvellent constamment et sont susceptibles de développer des cancers. Ces cancers appelés carcinomes font partie des cancers les plus fréquents et les plus agressifs chez l’homme. Nous avons fait des progrès majeurs dans la compréhension des mécanismes impliqués dans ces cancers. Nous avons identifié une voie de signalisation qui est un puissant suppresseur de tumeur dans ces épithéliums et un oncogène qui est un facteur important dans l’initiation tumorale. Nous avons aussi montré que les zones de transition entre différents types d’épithéliums sont entourées d’un environnement unique qui pourrait favoriser l'initiation de cancers. Nous avons développé un modèle unique de souris exprimant cet oncogène spécifiquement à la zone de transition se trouvant à la zone anorectale et qui entraine une prolifération anormale dans cette zone. Le but de ce projet est de récapituler des tumeurs anorectales pour suivre les étapes précoces de la progression tumorale et pour établir une cartographie au niveau de l'environnement tissulaire et immunitaire de cette zone. Cette étude permettra de mettre en évidence des éléments potentiellement impliqués dans la progression d’un état normal à cancéreux, que nous validerons in vivo et sur des cultures tridimensionnelle de zone de transition.
Bénéfices attendus
Les cancers se développant dans les zones de transition anorectales sont des carcinomes et font partie des cancers les plus fréquents et agressifs chez l’homme. Cependant les mécanismes moléculaires de dissémination de ces cancers sont peu étudiés et basés majoritairement sur des corrélations cliniques. De plus, la physiologie des cellules dans ces régions et leur rôle dans l’initiation tumoral sont peu étudiés. Depuis 10 ans, les développements de l'oncologie et les succès récents de l'immunothérapie ont montré le rôle déterminant des cellules immunitaires dans la progression des cancers en stade avancé. Cependant, peu de choses sont connues sur l'interaction entre les cellules immunitaires et les cellules épithéliales au début du processus de transformation. L’utilisation de modèles animaux qui permet de suivre le devenir de ces cellules dans des situations de stress induit par des blessures qui peuvent être des débuts de situation cancéreuses sont donc indispensables pour extrapoler de futur développement de thérapies ciblées chez l’homme.
Procédures
Une partie des animaux seront soumis à des blessures mécaniques à la zone de transition anorectale. La blessure sera effectuée sous anesthésie gazeuse, sera complémentée d’une injection d’un antidouleur et sera répétée 2 fois par semaine pendant 2 semaines (4 blessures) ou 4 semaines (8 blessures) afin de récapituler les étapes de la progression tumorale. Le geste complet (en prenant en compte la durée d’anesthésie, l’injection et la blessure) dure environ 10 minutes par animal. Une partie des animaux seront soumis aux mêmes blessures en ajoutant des injections intrapéritonéale d'anti-IL-17 ou d'IgG contrôle afin de déterminer si la diminution de l'inflammation ralentit ou arrête le développement tumoral. Ces injections seront réalisées la veille de chaque blessure. Une partie des animaux recevront une transplantation orthotopique de cellules issues d'organoïdes murins exprimant un oncogène pour analyser les étapes précoces du développement tumoral. La transplantation se fera via une injection à la zone anorectale. Les animaux seront manipulés pour évaluation de l’état général via une grille de score et pesés 2 fois par semaine (environ 5 minutes par animal).
Impact sur les animaux
Les animaux exprimant l'oncogène KRAS au niveau des zones de transition, sont connus pour présenter un phénotype dommageable qui se traduit par le développement de papillomes au niveau buccal au bout de 1 mois d'induction. Les papillomes sont des proliférations excessives de couches épithéliales non malignes et non invasives mais qui créent une gêne lors de la prise de nourriture solide lorsqu'ils atteignent une certaine taille. Les animaux induits présentent également une hyperplasie au niveau des zones de transition (notamment gastrique et anorectale). La répétition des blessures crée une inflammation au niveau de la zone anorectale qui entraîne une prolifération anormale. Les animaux recevront des injections ce qui crée une douleur. Lors de l’acte de blessure anorectale (2 fois par semaine pendant 2 ou 4 semaines), la zone anorectale sera grattée avec un scalpel à bout rond ce qui va créer une lésion et donc une douleur. Le développement des organoïdes greffés à la zone de transition anorectale crée une lésion. La manipulation des animaux peut entrainer un stress. Les animaux seront identifiés avec une bague au niveau de l'oreille et une biopsie de queue sera réalisée pour le génotypage ce qui crée une douleur ponctuelle.
Devenir
Tous les animaux de toutes les procédures du projet seront mis à mort afin d'effectuer les prélèvements d'organes nécessaires à nos analyses ou sans prélèvements s'ils ne possèdent pas le génotype d'intérêt.
Remplacement
Nous ne pouvons pas reproduire une blessure physiologique in vitro et l’utilisation de ces souris est cruciale pour nos expériences afin de tester le rôle des cellules des zones de transition dans l’initiation tumorale. Néanmoins, nous prévoyons de mettre en culture des organoïdes à partir des tissus de ces souris afin d'étudier si des populations spécialisées de cellules sont directement liées au développement tumoral, ce qui nous permettra de diminuer le nombre d'animaux utilisés.
Réduction
Nous réduirons au maximum le nombre d'animaux pour n'utiliser que le nombre nécessaire afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables. Nous prévoyons d'utiliser des organoïdes pour effectuer certains tests, ce qui nous permettra de diminuer le nombre d'animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe pour un enrichissement social et afin de respecter l'instinct grégaire de cette espèce. La nourriture et l'eau sont fournies ad libitum. Du matériel de nidification est mis à disposition des animaux (dôme, coton, copeaux compressés). Les locaux d'hébergement sont séparés des locaux d'expérimentation. Les animaux destinés aux procédures expérimentales feront l’objet d’une phase d’acclimatation dans les locaux dédiés au suivi de l’expérimentation. Cette phase sera de 7 jours pour les animaux produits sur site. Les animaux exprimant l'oncogène KRAS au niveau des zones de transition, sont connus pour présenter des papillomes au niveau buccal au bout de 1 mois d'induction. Les papillomes sont des proliférations excessives de cellules de la peau qui ne sont pas tumorales. Nous avons démontré que l'ajout de nourriture humidifiée dans la cage permet aux animaux de continuer à se nourrir normalement, sans perte de poids.
Choix des espèces
Nous avons créé un modèle murin pour une meilleure compréhension du développement des cancers des zones de transition et pour le développement de meilleures méthodes de diagnostic et traitement des cancers épithéliaux dans le futur. De plus les techniques de blessure proposées chez la souris sont optimales pour obtenir des résultats qui pourront être extrapolés chez l’homme. Des animaux adultes seront utilisés pour avoir un poids équivalent entre les animaux et s’assurer de la maturité.