Souris
Evaluation de nouvelles molécules dans un modèle murin de tuberculose par infection intranasale
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Des traitements administrés jusqu'à quatre fois par jour pendant six mois attendent 5 370 souris, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées pour prélèvements post mortem. Elles sont infectées par la tuberculose au moyen d'une suspension bactérienne déposée dans les narines sous anesthésie, geste que le porteur décrit comme non invasif tout en signalant qu'il peut entraîner une détresse respiratoire. Les souris non traitées développent la maladie et peuvent perdre du poids, l'objectif affiché étant de raccourcir un traitement humain de six mois et de contourner les résistances aux antibiotiques. Trois lignées sont utilisées, dont des souris nude, immunodéficientes, choisies pour mimer la co-infection par le VIH et présentées comme porteuses d'un "phénotype dommageable".
Objectifs
La tuberculose est une infection due aux bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis. Elle touche encore annuellement 10 millions de personnes dans le monde et provoque 1,5 millions de décès. Le traitement repose actuellement sur l’association de 4 antibiotiques sur une durée de 6 mois. La longueur et la complexité du traitement ainsi que l’émergence de souches résistantes aux antibiotiques sont des causes d’échec. Dans ce contexte, le but de nos travaux de recherche est 1) de mettre au point de nouvelles stratégies thérapeutiques antibiotiques permettant de simplifier le traitement et d’être actif contre les souches ayant développé une résistance aux antituberculeux existants et 2) de mieux comprendre les mécanismes in vivo de virulence et d’émergence de résistance aux traitements. Ces types d’études sont longues voire impossibles à conduire chez l’homme. Le modèle murin permet donc de tester différentes hypothèses qui peuvent ensuite être confirmées chez l’homme voir même utilisées directement. Notre projet recouvre ainsi l’ensemble des expérimentations à réaliser in vivo dans le modèle murin pour étudier les mécanismes de virulence, d’émergence de résistance et évaluer l’activité des traitements.
Bénéfices attendus
La tuberculose touche encore annuellement 10 millions de personnes dans le monde et provoque 1,5 millions de décès. Le traitement repose actuellement sur l’association de 4 antibiotiques sur une durée de 6 mois. La longueur et la complexité du traitement ainsi que l’émergence de souches résistantes aux antibiotiques sont des causes d’échec. Ce projet vise à évaluer de nouvelles molécules qui pourraient diminuer la durée du traitement ainsi que la fréquence de prise des antibiotiques et élaborer des stratégies pour réduire le risque d’échec due aux mutants résistants aux antibiotiques.
Procédures
Les animaux seront infectés par instillation intranasale (1 instillation par animal) afin de créer une infection bactérienne. Les animaux seront anesthésiés 1 fois avant instillation. La suspension bactérienne sera ensuite déposée au niveau des narines de l'animal anesthésié pour que la suspension soit inhalée lors de la respiration (geste d'une minute). Pour les traitements, les animaux vigiles seront maintenus en contention manuelle puis traités par voie orale ou sous cutanée (fréquence de 1 à 4 fois par jour sur 1 à 7 jours pour une durée de 1 à 6 mois) (geste de 30 secondes) . Pour les prélèvements sanguins qui ne concernera pas tous les animaux, les souris vigiles seront tenues en contention manuelle et un petit volume de sang sera prélevé (geste de 15 secondes). A la fin du prélèvement, une pression sera effectuée pour arrêter le saignement (geste de 30 secondes). Les animaux ne subiront qu’un seul prélèvement au cours de la cinétique. Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de suivi conformément au protocole ou en anticipé en cas d’atteinte de point limite.
Impact sur les animaux
Lors de l’instillation intranasale, les animaux seront anesthésiés ce qui pourrait engendrer un stress thermique. Une douleur de courte durée liée à la piqûre de l’aiguille peut être ressentie par l’animal. La suspension à inoculer sera ensuite déposée au niveau des narines de l’animal anesthésié, sans geste invasif mais pouvant entraîner une détresse respiratoire. Les souris non traitées vont par la suite développer une tuberculose. L’évolution de la maladie peut engendrer une perte de poids et seules les souris des groupes non traités pourront donc présenter une perte de poids. L’administration des traitements se fera par administration orale sur animaux vigiles maintenus par une contention. Ces administrations pourront induire un stress en raison de la contention nécessaire. Enfin, les prélèvements de sang pourraient aussi être générateurs de stress et de douleur de courte durée due à la piqûre lors du prélèvement et entrainer un hématome. Les souris nude présentent un phénotype dommageable, elles sont immunodéficientes et peuvent donc être plus sensibles aux infections.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux à la fin de la procédure.
Remplacement
L’ensemble du projet vise à mesurer l’activité de nouvelles molécules afin d’améliorer le traitement de la tuberculose chez l’homme. En effet, les tests in vitro de mesure de l’activité d’antibiotiques contre le bacille tuberculeux menés en amont de notre projet ne prennent en compte que la bactérie et pas la réponse de l’hôte dans son ensemble. Il est donc nécessaire d’avoir recours au modèle murin avant de débuter un essai clinique chez l’homme.
Réduction
Le projet impliquera au plus un total de 5370 animaux. Les hypothèses testées dans le modèle murin seront uniquement celles qui ont franchi les étapes de sélection dans les modèles in vitro réalisés en amont. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum par groupe permettant de conserver une puissance statistique suffisante pour répondre aux problématiques. Notre projet utilisant une voie d’instillation en intranasal celle-ci permet de réduire la variabilité inter animale et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires dans les expériences.
Raffinement
Les procédures ont été établies dans le respect du bien-être animal en limitant la douleur (utilisation d’une analgésie et anesthésie quand cela est nécessaire) et le stress (période d’acclimatation, gestes réalisés par des personnes formées). Les animaux seront hébergés dans un niveau de confinement 3 et leurs conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation. Une période d’acclimatation d’une semaine est observée avant le début des expériences. Les animaux seront hébergés par 5 et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; un enrichissement sera proposé sous forme de lanières de kraft ou de coton (en fonction des procédures de l’animalerie dont dépend ce projet). L’animalerie dispose d’un cycle nycthéméral, d’une hygrométrie et de température surveillées. Les animaux sont suivis quotidiennement et des points limites ont été définis pour garantir le bien-être des animaux pendant toute la durée du projet.
Choix des espèces
Le modèle murin est utilisé depuis plus de 50 ans pour l’évaluation des antituberculeux. Il permet une prédiction de l’efficacité des antituberculeux chez l’homme car la pharmacocinétique choisie chez l’animal est équivalente à celle obtenue chez l’homme aux doses habituelles des antituberculeux. La variété des profils de résistance limite la reproductibilité d’études cliniques et la longueur des essais (supérieur ou égal à 10 ans) est aussi une limite à l’étude chez l’homme. En parallèle, les études in vitro ne renseignent que sur le versant de la bactérie mais pas sur celui l’hôte. Le modèle murin permet donc une évaluation plus courte et reproductible in vivo. Afin réduire la variabilité et donc mieux mettre en évidence les différences dans les études les souris consanguines balbc sont utilisées (3R : réduction et raffinement). Dans les étapes pré-cliniques et pour permettre de mimer la variabilité observée chez l’humain, les souris swiss non consanguines sont utilisées. Enfin, la co-infection tuberculose et VIH étant une problématique majeure de santé publique avec des enjeux spécifiques, pour mimer l’immunodépression, les souris nude sont utilisées. Tous les animaux auront 4 semaines à leur arrivée et entreront en procédure après une semaine d'acclimatation soit à 5 semaines.
Etude préclinique de correcteurs de mutations non-sens dans un modèle murin porteurs d’une mutation non-sens dans le gène codant pour le canal CFTR
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Les souris de ce projet portent une mutation non-sens du gène CFTR, celles qui en héritent des deux parents mourant avant la naissance ou dans leurs deux premiers mois de vie. 4 600 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune peut être gavée une à deux fois par jour pendant 300 jours, recevoir sous la peau du dos une pompe implantée par chirurgie et retirée sous anesthésie une semaine plus tard, ou une goutte de produit déposée dans une narine, et toutes ont une oreille perforée pour le génotypage. Le porteur écrit veiller à ce que les molécules testées ne portent pas atteinte aux libertés de l'animal, et décrit le gavage comme un geste indolore que la souris facilite en positionnant elle-même la sonde dans sa gorge.
Objectifs
Les mutations non sens (MNS), entraînant la production de protéines généralement non-fonctionnelles, sont responsables d’environ 10% des maladies génétiques. Certaines molécules sont capables de restaurer l’expression d’un gène porteur de ce type de mutation et représentent donc des candidats médicaments pour le traitement de certains patients atteints de maladie génétique. Nous recherchons au laboratoire des molécules capables de corriger ces mutations. Pour cela nous criblons des chimiothèques puis validons les molécules sur des lignées cellulaires. Une étude est ensuite entreprise pour déterminer la toxicité des molécules sélectionnées et leur mode d’action. Enfin, nous devons démontrer la capacité de ces molécules à corriger ce type de mutation au sein d’un organisme complexe tel que la souris. Nous disposons d’une lignée de souris disposant d’une mutation non-sens dans le gène codant le canal CFTR. La conséquence est une absence d’expression de CFTR qui entraine une mort prématurée in utero ou dans les deux premiers mois de vie lorsque les souris sont porteuses de la mutation à l'état homozygote. A l'état hétérozygote, les souris sont viables puisque la mutation est récessive. Ce modèle est très pertinent car il est très proche de la pathologie humaine (mucoviscidose). Dans notre projet, nous testerons des molécules correctrices de mutations non-sens dans notre modèle de souris n’exprimant pas le CFTR. Notre but est de déterminer la voie d’exposition optimale, la concentration la plus efficace et la cinétique d’action de la molécule. Pour cela, nous testerons plusieurs voies d’exposition telles que la voie orale (en ajoutant la molécule dans le biberon ou par gavage) ou encore la diffusion sous-cutanée au moyen d’une pompe osmotique (la pose sera réalisée par une personne habilitée à faire de la chirurgie). Nous testerons dans un premier temps 3 doses de molécules de manière quotidienne (selon les informations disponibles dans la littérature scientifique). Cependant, ces quantités pourront être ajustées pour optimiser l’effet de la molécule. Enfin, l’effet des molécules sera évalué sur une période n'excédant pas deux mois.
Bénéfices attendus
La validation de l’efficacité de molécules permettant de corriger des mutations non-sens (entraînant la production de protéines généralement non-fonctionnelles) dans un organisme complexe comme la souris permettra à terme le développement de futurs médicaments pour traiter l’Homme souffrant de maladies génétiques telle que la mucoviscidose.
Procédures
Dans ce projet, plusieurs voies d’administration des candidats médicaments seront évaluées : 1. Voie orale : l’ensemble des animaux (500) seront gavés avec 200µL avec le traitement ou son placebo, une à deux fois par jour sur une durée allant de 1 à 300 jours. Durée de l’intervention : 30 secondes. 2. Voie sous-cutannée : l’ensemble des animaux (500) auront une implantation au niveau du dos d’un système permettant la délivrance en continu du traitement ou de son placebo. Pour cela, les animaux recevront une injection d’anesthésiques, après préparation de la zone avec tonte et solution antiseptique, une incision est pratiquée et la pompe (de la taille d’une gélule) est implantée sous la peau. L’incision est ensuite refermée à l’aide d’agrafes chirurgicales (durée de l’intervention : 5 à 10 minutes). Pour éviter l’hypothermie, l’animal est placé sur une couverture chauffante puis est réveillé par injection d’un antidote à l’anesthésique. Une injection d’antidouleur est réalisée en post-opératoire et répétée si nécessaire pour limiter toute souffrance de l’animal. Une semaine après l’intervention, les agrafes sont retirées sous anesthésie gazeuse (1 minute). Cette étape expérimentale sera réalisée par une personne habilitée à pratiquer la chirurgie sur le petit animal 3. Voie Nasotrachéale : l’ensemble des animaux (500) subiront une anesthésie gazeuse puis une goutte de traitement ou de placebo sera déposée sur une narine (durée : 1 minute). Les animaux seront placés sur une couverture chauffante jusqu’à leur réveil. 4. Génotypage : Afin de savoir si les animaux portent la mutation étudiée, une oreille de chaque animal sera percée et le petit morceau retiré sera utilisé pour purifier l'ADN de l'animal et rechercher s'il porte la mutation ou pas. C'est ce qu'on appelle faire un génotypage.
Impact sur les animaux
Ce projet a pour but de valider l’utilisation de nouvelles molécules comme éventuel candidat médicament. Bien que des tests de toxicité auront été effectués au préalable sur culture cellulaire, l’effet de ces molécules sur un organisme entier doit être évalué. Pour cela, nous veillerons à ce que ces molécules ne portent pas atteinte aux libertés individuelles de l’animal définies comme étant l’absence de faim, de soif et de malnutrition, l’absence de peur et de détresse, l’absence de stress physique et/ou thermique, l’absence de douleur, de lésions et de maladie ainsi que la liberté d'expression d'un comportement normal de son espèce. Cette observation servira à détecter une nuisance sur du long terme d'exposition à la molécule étudiée. Concernant les procédures qui seront utilisées : 1) le gavage : il s'agit d'un geste rapide a priori indolore puisque très souvent la souris positionne elle-même la sonde dans sa gorge, et qui n'entraine aucune atteinte aux libertés individuelles de l'animal. 2) la pompe osmotique : la pose de la pompe se fait sous anesthésie générale puis la gestion de la douleur post-opératoire par l'utilisation d'analgésique. Les autres libertés individuelles ne seront pas affectées par la procédure car la pompe est placée sous la peau dans le dos n'impactant pas le déplacement de l'animal et donc son alimentation par exemple. 3) l'exposition naso-trachéale se fera sur animal endormi supprimant ainsi tout stress lié à cette procédure qui est très rapide (le temps d'une inspiration) 4) le génotypage entraine une douleur légère et passagère sans affecter les libertés de l'animal.
Devenir
Sauf pour la procédure visant à déterminer si un animal est porteur de la mutation ou pas (génotypage), tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Dans la première partie du projet, nous disposons d’un programme de caractérisation des nouvelles molécules que nous identifions et sélectionnons basé sur le criblage cellulaire. Cette étape in vitro préalable est essentielle afin de déterminer la dose efficace en culture cellulaire (ce qui nous permet d'extrapoler pour définir une fenêtre de doses qui seront utilisées chez la souris), la toxicité cellulaire et le mode d'action. Cependant, bien qu’une grande partie de l’étude se réalise in vitro remplaçant ainsi le modèle animal, l’expérimentation in vivo demeure nécessaire afin de pouvoir étudier l’effet de ces molécules sélectionnées avec soin dans un modèle physiologique pertinent reflétant la mutation étudiée à l’échelle de l’organisme entier.
Réduction
Le projet est conforme aux exigences de réduction puisqu'une phase exploratoire avec un nombre réduit d'animaux par lot (lot de 5) sera effectuée afin d'identifier la voie d'exposition, la concentration et la cinétique d'action de la molécule étudiée et ce afin d'abaisser au minimum le nombre d'animaux qui seront ensuite utilisés pour la démonstration de l'efficacité d'action de la molécule in vivo. Ce nombre sera de 40 ce qui correspondra à deux séries d'expériences avec 10 animaux par condition (avec et sans la molécule). La répétition de l'expérience est nécessaire pour s'affranchir d'un éventuel effet biaisé lié à la préparation de la molécule, au lot d'animaux ou à un stress survenu pendant l'expérience. Le nombre de 10 animaux par condition et par série afin de pouvoir réaliser ensuite un "student test" qui est le test statistique utilisé dans les expériences permettant d'évaluer l'efficacité d'un traitement.
Raffinement
En termes de raffinement, l'expérience sera toujours menée de façon à prévenir ou à réduire au maximum toute souffrance. Ainsi, la voie d'exposition efficace la moins invasive sera privilégiée (le gavage par rapport à la pose d'une pompe osmotique par exemple). Afin de pallier le moindre signe de souffrance ou de stress pouvant apparaître chez l’animal, l’observation des animaux sera rigoureuse et quotidienne. Nous avons ainsi mis en place des points limites tels que l’apparition d’un comportement agressif, l’isolement, l’absence d'alimentation (les animaux seront pesés au début de l'expérience puis une fois par semaine et une diminution de 10% par rapport au lot contrôle entrainera l'arrêt de l'expérience pour les animaux concernés) ou encore la présentation d’un pelage hérissé. Toute atteinte d’un de ces points limites conduira à la mise à mort de l’animal. De plus, les gestes réalisés sur les animaux pouvant engendrer une douleur ou un stress seront précédés d’une anesthésie afin de limiter au minimum la souffrance des animaux. Des traitements anti-douleur seront utilisés suite à la chirurgie pour éviter toute souffrance de l’animal.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler sur la souris car cette dernière présente l'avantage d'avoir un mécanisme de reconnaissance des codons stop prématurés semblable à celui retrouvé chez l'Homme. De plus, la durée du cycle de vie de la souris est compatible avec le test in vivo des molécules à visées thérapeutiques qui est réalisé sur plusieurs semaines. Les animaux seront utilisés à partir du sevrage et jusqu'à 2 mois maximum après la naissance car la mortalité des homozygotes mutants est attendue au cours du premier mois de vie.
Evaluation de l’effet de composé sur le niveau de dépression et d’anxiété chez les rongeurs.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 7200
Jusqu'à 36 tests comportementaux, 336 administrations et 44 prélèvements sanguins peuvent être infligés au même animal sur 84 jours. 9 400 souris et 7 200 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Le porteur mesure ainsi l'anxiété et la dépression des rongeurs pour tester des molécules, en les mouillant, en leur injectant un produit qui provoque une apathie de 24 heures, ou un composé panicogène qui déclenche selon ses propres termes un sentiment désagréable d'anxiété dans l'heure. Il annonce 255 études sur cinq ans et présente le bien-être des animaux non-humains comme "primordial".
Objectifs
L’anxiété et la dépression sont des troubles psychiatriques principalement responsables d'invalidité et de mortalité prématurée. Au niveau mondial, on estime qu’environ 300 millions de personnes souffrent de troubles anxieux, soit ~4 % de la population mondiale. Un nombre similaire de personnes souffrent de dépression. On estime que la perte de productivité due à la dépression et à l’anxiété coûtera à l’économie mondiale 1 000 milliards de dollars par an et devrait atteindre 16 000 milliards de dollars d’ici 2030. L’anxiété et la dépression se différencient par les sensations et les sentiments qu’elles provoquent : la peur en particulier pour la première (sentiment général d’insécurité et par une sensation d’inquiétude démesurée), et la tristesse pour la seconde (tristesse profonde, perte de plaisir et d’envie, perte d’énergie et repli sur soi). Ainsi, l’anxiété et la dépression sont des pathologies différentes mais elles sont imbriquées à différents points de vue Les médicaments existants et approuvés présentent des effets secondaires notoires et peuvent être inefficaces chez certains patients. On parle ainsi de forme de résistance aux médicaments. Les comportements d’anxiété et de dépression ne sont pas le propre de l’Homme, on les retrouve également chez les animaux et notamment chez les rongeurs. Ainsi l’utilisation des rongeurs, souris comme rat, sont des modèles couramment utilisés pour évaluer de nouvelles molécules thérapeutiques. Dans ce projet nous allons mettre en œuvre plusieurs procédures permettant de mesurer le niveau d’anxiété et de dépression des rongeurs et ainsi d’évaluer l’effet de nouvelles molécules thérapeutiques. Les procédures seront au nombre de 4 : -La première étudie chez la souris le niveau naturel d’anxiété et de dépression des animaux dans les conditions d’hébergement de notre laboratoire. -La seconde étudie chez le rat le niveau naturel d’anxiété et de dépression des animaux dans les conditions d’hébergement de notre laboratoire. -La troisième étudie chez la souris l’état d’inconfort induit par une inflammation par un traitement. -La quatrième étudie une forme particulière d’anxiété, le phénomène de panique. Il est induit chez le rat par une administration d’un composé panicogénique connu chez l’homme.
Bénéfices attendus
Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour traiter l’anxiété et la dépression. De plus comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique, nous participons à une meilleure connaissance de la prédictivité de nos modèles.
Procédures
Les animaux qui réaliseront la procédure 1 ou la procédure 2 pourront être amener à réaliser 36 tests comportementaux anxio-dépressif et/ou de motricité (10-30 min), recevoir un maximum de 336 administrations et de 1 à 44 prélèvements sanguins sur la période de 84j en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire. Les administrations durent moins de 30 seconds en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. Une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Concernant les prélèvements de sang, ils durent 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée. Les animaux qui seront en procédure 3 subiront au maximum 4 tests de comportement de dépression et/ou d’activité locomotrice (10-30 min) dans les 48h, de plus les animaux subiront une injection d’une substance induisant un état inflammatoire léger et transitoire et bien entendu le traitement avec la molécule à étudier (le schéma de traitement sera fixé en fonction des données pharmacologiques disponible sur cette molécule). Pour les animaux de la procédure 4, chaque individu sera manipulé quotidiennement de 30sec à 1 min pendant une semaine. Une injection d’un composé panicogénique sera réalisée. Ils subiront au maximum 2 tests de comportement de dépression et/ou l’activité locomotrice (environ 10min). De plus les animaux seront sujet à un traitement avec la molécule à étudier (le schéma de traitement sera fixé en fonction des données pharmacologiques disponible sur cette molécule).
Impact sur les animaux
Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun (
Devenir
Une partie des animaux est mis à mort pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.
Remplacement
Bien qu'il soit possible de disséquer les mécanismes d’action des nouveaux médicaments in vitro, les réponses comportementales des animaux suite aux traitements sont des évènements difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse des comportements d’anxiété et de dépression nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous associons plusieurs tests de comportement sur les mêmes animaux afin de ne pas multiplier les cohortes. Des analyses statistiques finales sont réalisées. Les animaux incluent dans ce projet vont nous permettre de mener 255 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.
Raffinement
Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. De plus nous avons établis des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui n’est pas en relation avec les signes attendus du projet. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre Structure du Bien Être Animal (SBEA) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures. De plus dans nos modèles, quand c’est possible, l’environnement des animaux est enrichi. Pour les souris, l’enrichissement du milieu comporte du matériel de nidification, un dôme pour se cacher et un tunnel suspendu pour augmenter la superficie de la cage. Pour les rats, l’enrichissement du milieu comporte un tunnel en carton pour permettre aux animaux de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Si des animaux se retrouvent mouiller pendant un test de comportement alors ils seront séchés avant leur retour dans leur cage d’hébergement. Chaque fois que les animaux sont soumis à divers tests, le choix des tests, la fréquence de mise en œuvre et leur ordre d’exécution est établi afin d’impacter le moins possible le bien-être des animaux. Une partie des animaux sont habitués à l’Homme par une manipulation quotidienne (30sec-1min/jour, handling).
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris ou des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. C’est le cas pour la souris et le rat dans les études des phénomènes d’anxiété et de dépression. De plus tous nos modèles répondent favorablement aux médicaments déjà sur le marché ce qui prouve leur prédictivité et permettent aux industriels d’étudier l’apport de leurs nouvelles recherches par rapport aux traitements déjà existants. De plus, ces espèces disposent d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Etant donné que nous n’étudions pas une pathologie liée au vieillissement, qui affecte les jeunes adultes et que nous avons une longue expertise dans ce modèle en utilisant des souris de 4 à 5 semaines au début du projet et des rats de 6-7 semaines au début du projet, nous allons continuer avec ce stade de développement.
Phénotype et sensibilité des souris exprimant une mutation génétique sur le canal TRAAK
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
768 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune isolée une heure par jour pendant vingt-huit jours de tests. Un agent inflammatoire est injecté dans le coussinet plantaire, puis une source de chaleur infrarouge et une force mécanique croissante sont appliquées quatre fois sur chaque patte arrière, à deux minutes d'intervalle, pour mesurer le seuil à partir duquel l'animal retire sa patte. Ces souris portent une mutation qui reproduit un syndrome humain rare associant épilepsie, déficience intellectuelle et dysmorphie faciale, et le projet cherche à voir si elles en présentent les symptômes. Le bénéfice avancé, la mise au point d'antidouleurs activant le canal TRAAK, reste une hypothèse, quand la douleur infligée aux souris est le cœur du protocole.
Objectifs
Les canaux TRAAK sont des canaux potassiques exprimés dans le système nerveux. Chez la souris, ils ont été impliqués dans la perception de la chaleur et du froid. Chez l'homme, des mutations sur TRAAK sont liées à un syndrome neuro-développemental appelé FHEIG (pour F=dysmorphisme facial, H=hypertrichose, E=épilepsie, I=déficience intellectuelle/retard de développement et G=croissance gingivale). Deux mutations ont été identifiées dans ce syndrome qui causent une augmentation de l'activité du canal TRAAK. La mutation A173E chez la souris, équivalente à A172E chez l’homme, entraine également une forte augmentation du courant. Nous avons donc choisi cette mutation pour créer un modèle de souris de la maladie FHEIG. Deux types de souris seront produites dans cette étude, une souris TRAAK FHEIG dont le gène TRAAK est muté dans toutes les cellules et une souris dont le gène TRAAK est muté seulement dans les nocicepteurs (TRAAK FHEIG TRPV1). Le comportement général de ces souris sera étudié dans le but d'évaluer dans quelle mesure ces modèles animaux peuvent récapituler la pathologie humaine. Nous évaluerons aussi leur sensibilité à différents stimuli en conditions standards et en conditions inflammatoires. Cette étude devrait permettre de mieux comprendre le phénotype des patients atteints du syndrome FHEIG. Elle permettra aussi de déterminer si l’activation des canaux TRAAK dans les neurones sensoriels peut réguler le niveau de perception de la douleur dans le but d’envisager le développement d’activateurs de TRAAK comme traitement possible de la douleur.
Bénéfices attendus
Cette étude a un double intérêt à la fois pour la recherche fondamentale et translationnelle. En effet, il s’agit du premier modèle de souris de la pathologie humaine FHEIG. Cette pathologie est rare mais sévère et les symptomes sont très invalidants (F=dysmorphisme facial, H=hypertrichose, E=épilepsie, I=déficience intellectuelle/retard de développement et G=croissance gingivale). L’étude du phénotype de cette souris devrait nous permettre de savoir si le modèle animal récapitule tout ou une partie des symptomes humains. Si c’est le cas, il devrait permettre de mieux comprendre la maladie et d’envisager de tester des traitements potentiels. L’autre bénéfice concerne la compréhension des voies de la sensibilité à la douleur. En effet, s’il s’avère que l’activation du canal TRAAK au niveau des nocicepteurs peut diminuer la perception douloureuse chez la souris, la recherche d’activateurs pharmacologiques de TRAAK pourra être envisagée pour le traitement de la douleur.
Procédures
Pour une partie des animaux : isolement pour habituation dans la cage d'observation (45 min, aucun geste), puis injection intra plantaire unique puis remise en cage isolée pour observation (dure totale de la procédure : 1h45). Pour une autre partie des animaux : 2 testes réalisées en alternance séparés de 24h (durée totale de la procédure 28 jours) 1er test : injection intra plantaire unique d'agent inflammatoire puis application de chaleur infra rouge avec possibilité d'échappement/libre de ses mouvements, 4 fois sur chaque coussinet des 2 pattes arrière. Chaque mesure est espacée de 2 minutes minimum. 2e test : injection intra plantaire unique d'agent inflammatoire puis application de force mécanique avec possibilité d'échappement/libre de ses mouvements, 4 fois sur chaque coussinet des 2 pattes arrière. Chaque mesure est espacée de 2 minutes minimum. Les injections unique intraplantaires seront réalisées en quelques secondes dans le coussinet de la patte de chaque animal. Chaque jour les animaux seront placés dans cages en plaxiglass et seront donc isolés 1h par jour, tous les jours, durant les tests mécaniques et thermiques.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront présenter des signes de douleur spontanée notamment au niveau de la patte enflammée après injection des produits irritants. Dans certaines situations d'hébergement individuel ou d'isolement expérimental les animaux pourront également présenter des signes de stress, une mobilité réduite ou des stéréotypies, mais ils ne présenteront pas de comportements douloureux spontanés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort dans le but de récupérer leurs organes pour des analyses histologiques, biochimiques et génomiques.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans la continuité des recherches déjà menées au laboratoire et vise à identifier de nouveaux acteurs importants dans les voies de la douleur. Il permettra également de mieux comprendre certains syndromes neurodéveloppementaux liés à un dysfonctionnement des canaux potassiques. Il n’existe pas d’alternative à l’expérimentation animale pour déterminer la sensibilité douloureuse. C’est un phénomène physiologique complexe impliquant plusieurs types de fibres sensorielles et fait intervenir très certainement plusieurs types cellulaires en interaction. Des études histologiques ont déjà été réalisées pour montrer l’expression des protéines d’intérêts dans les structures impliquées dans le contrôle de la douleur et des tests génétiques chez l’homme ont identifié des mutations spécifiques sur ces protéines dans une pathologie. Des expériences ex-vivo seront réalisées à partir des tissus et des cellules prélevées chez ces souris mais qui viendront compléter notre étude et en aucun cas se substituer aux tests sur animaux vivants. Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de remplacement à notre connaissance, et les études précliniques chez l’animal restent nécessaires à la poursuite d’études cliniques pour développer de nouveaux analgésiques.
Réduction
Nous avons pris plusieurs mesures de réduction du nombre d'animaux. Tout d’abord, le nombre d'animaux maximum a été défini par une analyse données statistiques. Puis, tous les animaux mis à mort à la fin de chaque procédure serviront également au prélèvements de leurs organes pour analyse, nous nous limitons à analyser les organes des animaux testés et nous n'utiliserons donc pas d'autres animaux pour ces analyses. Nous avons également conçu nos procédures de manière à utiliser le moins d'animaux possibles, nous utiliserons notamment les mêmes animaux pour différentes procédures divisant ainsi par 2 le nombre d'animaux.
Raffinement
Nous avons défini et mettrons en place de points limites précis précoces et adaptés pour chaque procédure afin de garantir une prise en charge adéquate des animaux en cas de souffrance/douleur ou inconfort. Plusieurs facteurs sont susceptibles de moduler la sensibilité, c’est pourquoi une attention particulière sera apportée à l’hébergement et au bien-être des animaux tout au long de leur vie. Les animaux sont hébergés à cinq par cage, dans des cages mis sur portoirs ventilés avec enrichissement adéquat, nourriture et boisson ad libitum et seront suivi tous les jours. Un des principaux enjeux sera de diminuer le niveau de stress des animaux, afin d’améliorer les conditions de vie des animaux et de maitriser les acteurs pouvant influencer la sensibilité. En cela, les animaux seront habitués plusieurs fois aux environnement des tests pour diminuer le stress des animaux aux nouveaux environnements. Nous avons également concu des procédures les plus courtes possibles pour étudier la douleur inflammatoire.
Choix des espèces
Le choix de cette espèce constitue le meilleur modèle pour notre étude car les caractéristiques des souris de la souche utilisée sont largement documentées. La souris possède également une reproductibilité rapide et fiable, constituant un atout pour développer efficacement notre projet. Les tests de sensibilité sont bien adaptés pour les souris et suffisamment documentés. Nous possédons déjà les souris génétiquement modifiées indispensables à notre étude. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 12 semaines. Ce choix est motivé par la volonté de nous soustraire des variations dues aux processus développementaux ou liés au vieillissement.
Identification du rôle d’un régulateur épigénétique dans les maladies inflammatoires intestinales chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Les souris de ce projet sont génétiquement modifiées et élevées sur place, chaque première portée subissant une biopsie de la queue dans ses deux premières semaines de vie. 604 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Trois gavages espacés de cinq jours, une injection intrarectale sous anesthésie et des injections dans l'abdomen déclenchent une inflammation intestinale susceptible de provoquer perte de poids, baisse d'activité, douleur et diarrhée sanglante, pour tester le rôle protecteur d'une protéine dans la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse. Les souriceaux qui n'ont pas le génotype recherché sont tués après le génotypage, les autres servent à la reproduction et aux expériences avant d'être tués pour prélever l'intestin.
Objectifs
Les maladies chroniques intestinales, telles que la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn, ont un effet dévastateur sur la qualité de vie des patients. L’origine de ces maladies reste inconnue, et de ce fait les traitements manquent de précision et d’efficacité. Une série d’observations suggère que ces maladies sont liées à une inflammation chronique intestinale induite par l'hypersensibilité du côlon à l’alimentation et au microbiote intestinal. Une réponse inflammatoire dérégulée et un dysfonctionnement du système immunitaire sont considérés comme les deux causes les plus suspectes associées à ces maladies. Dans ce travail, nous utiliserons un modèle de souris pour explorer davantage le lien potentiel entre la réponse inflammatoire/immune dérégulée et le développement des maladies chroniques intestinales. Dans ce contexte, l'objectif du projet est de déterminer in vivo le rôle protecteur d’une protéine en réponse à différents stress environnementaux ainsi que d’évaluer son potentiel thérapeutique dans le contrôle de l'inflammation intestinale.
Bénéfices attendus
La maladie de Crohn et la colite ulcéreuse sont des maladies inflammatoires chroniques susceptibles d'évoluer vers la fibrose et le cancer colorectal. Le bénéfice de ce projet est d’évaluer une potentielle cible thérapeutique dans le contrôle de l’inflammation, afin d’optimiser l'efficacité du traitement des maladies inflammatoire intestinale. Ce projet vise également à mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de la réponse inflammatoire intestinale.
Procédures
1) La première portée de chaque couple de souris pour le maintien de lignée dans les 2 premières semaines de vie seront soumises à une biopsie de queue en quelque secondes. 2) Toutes les souris seront soumises à 3 gavages oraux durant moins d’une minute, 1 gavage tous les 5 jours. 3) Certain souris rêverons une anesthésiées administrée en injection intrapéritonéale et recevront par voie intra-rectale un produit chimique. 4) Certain souris seront pesées chaque jour en quelques secondes pendant 3 jours minimum et 2 semaines maximum. 5) Certain souris recevront 3 fois une injection intrapéritonéale et seront pesées 1-3 fois en quelques secondes.
Impact sur les animaux
Le génotypage des souris se fera par une biopsie caudale qui peut provoquer une légère douleur. Le gavage et l’injection intrapéritonéale peuvent induire un stress et une douleur légère. Les modèles d’inflammation intestinale sont susceptibles d’induire une inflammation intestinale, ce qui peut provoquer une perte de poids, une baisse d'activité, de la douleur et de la diarrhée avec saignement. L’injection intra rectale peut conduire à une douleur légère et du stress.
Devenir
Les animaux ayant pas le bon génotype seront mis à mort après le génotypage. Des animaux avec le bon génotype sont gardés en vie pour la reproduction et les procédures expérimentales. L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour récupérer les tissus d'intérêt, notamment l’intestin.
Remplacement
L’emploi du modèle animal est indispensable afin d’étudier une réponse inflammatoire en milieu physiologique où les cellules du tube digestif sont confrontées aux aliments dégradés, aux bactéries participant à la digestion et en présence d’un système immunitaire. Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire l’environnement physiologique auquel est soumis une réponse d’inflammation in vivo.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec le nombre minimum d’animaux nécessaire à l’obtention d’un résultat significatif déterminé par une approche statistique.
Raffinement
Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, nous ajouterons dans la cage du coton, des maisonnettes en carton ou des tunnels ainsi que des bâtonnets de bois à ronger. Les souris seront hébergées par 5 au maximum en cage ventilée pour le maintien en communauté, en accord avec leurs besoins sociaux, et disposeront d’eau et nourriture ad libitum. Le génotypage et la biopsie seront réalisées durant les 2 première semaines de vie des souris. Afin de réduire le traumatisme lié au gavage oral, les manipulateurs seront bien formés et des sondes de gavage souples à bout arrondi seront utilisées. Afin de réduire le traumatisme lié aux injections rectales, une anesthésie sera utilisée. La taille d’aiguille de l’injection sera adaptée à la taille de l’animal. Une surveillance sera effectuée 1 à 2 fois par jour par les membres de ce projet ou par les zootechniciens afin de détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance de l’animal. Pour limiter au maximum la douleur et la souffrance associée au sepsis sévère et notamment lors de la fin de vie, une grille d’évaluation du bien-être animal est mise en place.
Choix des espèces
La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins fait de la souris un modèle de référence pour étudier la réponse inflammatoire/immune et le développement des maladies chroniques intestinales comme la colite ulcérative ou la maladie de Chohn. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8 à 13 semaines après la naissance), où elles possèdent un système immunitaire mature.
le dialogue entre les astrocytes et l’endothélium, un acteur clef de la physiopathologie de la neuro-inflammation
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Du lysat de myéline est injecté sous la peau du dos, suivi de deux injections de toxine, pour déclencher une maladie auto-immune du système nerveux central qui paralyse le train arrière. 1 680 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées pour prélèvement d'organes, après un génotypage par tatouage des pattes et section de l'extrémité de la queue entre le septième et le dixième jour de vie. D'autres subissent une chirurgie stéréotaxique de moins de vingt minutes pour recevoir un composé inflammatoire dans le cerveau, l'ensemble visant à comprendre le rôle des astrocytes et des cellules des vaisseaux dans la sclérose en plaques. Le porteur qualifie la paralysie du train arrière de non douloureuse, annonce un suivi quotidien du score de J0 à J45 et une mise à mort dès le point limite atteint, sans dire à quel degré de paralysie ce seuil est fixé.
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire du Système Nerveux Central (SNC) d'origine autoimmune associée à une demyélinisation et une perte axonale, responsable d'une neurodégérescence chez les patients. Aujourd'hui, 2,3 millions de personnes dans le monde sont affectés par cette maladie qui touchent principalement les sujets jeunes de moins de 50 ans. La cause de la sclérose en plaques reste inconnue et il n'existe pas de traitement curatif contre cette maladie. De plus, il est important de noter que les options thérapeutiques actuelles disponibles pour prévenir les formes sévères de la sclérose en plaques sont principalement des immunothérapies (par exemple le Natalizumab (Tysabri®)) dont le mécanisme d'action conciste à bloquer l'activité et/ou l'infiltration des cellules inflammatoires dans le parenchyme cérébral. Malheureusement, l'utilisation de ces therapies est limitée du fait de leur effets indésirables associés notamment une diminution de l'efficacité du système immunitaire et une toxicité hépatique et rénale. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre la physiopathologie de la sclérose en plaques, ce qui est primordial pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Plus précisément nous nous attacherons à mieux comprendre le rôle de l'unité gliovasculaire, c'est à dire des cellules endothéliales et des astrocytes dans le SNC en contexte neuro-inflammatoire aigu et chronique. A plus long terme nous souhaitons identifier de possibles stratégies thérapeutiques ciblées au niveau de l'unité gliovasculaire jusqu'à présent peu explorées et exploitées pour fournir des alternatives originales et sûres aux traitements actuels que représentent les immunothérapies dans la prise en charge des rechutes et de la progression de la sclérose en plaques.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre comment les cellules endothéliales et les astrocytes se comportent au cours de la sclérose en plaques. Ces cellules composent une barrière (la barrière hémato-encéphalique) qui sépare le sang circulant du cerveau mais en contexte de sclérose en plaques, leur comportement est modifié et elles ne jouent plus leur rôle de barrière. Cela va favoriser le passage de cellules immunitaires dans le cerveau depuis le sang et va également rendre ces cellules immunitaires plus agressives au cours du développement de la maladie. Nous allons plus précisément analyser les interactions entre les astrocytes, les cellules endothéliales et les cellules immunitaires à différents endroits (au niveau du vaisseau sanguin, dans l’espace entre le vaisseau et les astrocytes et dans le tissu cérébral lui-même). Nous allons analyser l'activation, la migration et la prolifération des cellules endothéliales, des astrocytes et des cellules immunitaires et leur production de composants délétères dans la sclérose en plaques. L’objectif à long terme est d’Identifier de nouvelles cibles thérapeutiques personnalisées pour les patients atteints de sclérose en plaques. En effet la sclérose en plaques est une maladie hétérogène avec des formes variées probablement dues à des mécanismes multiples.
Procédures
Toutes les souris seront génotypées entre J7 et J10 après la naissance. Pour cela, chaque animal est tatoué au niveau des pattes avec un numéro d'identification unique puis l'apex de la queue est prélevé pour réaliser le génotypage de l'animal. La durée pour réaliser le prélévement de l'apex sous contention est de quelques secondes et la durée pour réaliser le tatouage sous contention est de moins de 20 secondes. Les animaux avec les génotypes d'intérêt sont ensuite selectionnés pour réaliser les expérimentations. Toutes les souris subiront 1 série de 5 injections intrapéritonéales (1 par jour pendant 5 jours) pour induire le knockout. Chaque injection dure moins de 30 secondes. Pour le modèle de sclérose en plaques chez les souris: les animaux subiront deux injections sous cutanée de lysat de myéline en haut et en bas du dos associées à 2 injections intra-péritonéales de toxine (la première 2h après les injections de myeline, et la seconde 24h après). Les deux injections de myeline combinées durent moins de 30 secondes et les injections intra-péritonéales de toxine moins de 10 secondes chacune. Pour le modèle d'injection stéréotaxique chez la souris: les animaux subiront une injection sous cutanée d'analgésique avant la chirurgie (la chirurgie stéréotaxique dure moins de 20 min par animal). Suite à la chirurgie, les souris recevront trois injection d'anti inflammatoire en sous cutané. Chaque injection sous cutanée dure moins de 10 secondes.
Impact sur les animaux
Injections intra-péritonéale pour induire le knockout: administrations répétées pendant 5 jours consécutifs pouvant induire un stress lié à la contention ainsi qu'une douleur légère lors des injections. Induction de l'encéphalomyélite expérimentale autoimmune: 2 Injections sous cutanées non douloureuses (en haut et en bas du dos) associées à 2 injections intra-péritonéales pouvant induire une douleur légère lors de l'injection. Les souris étant habituées pendant deux semaines avant l'induction, le stress est minimal pour les animaux (l'absence de stress chez les animaux est essentiel pour avoir une réponse uniforme et cohérente à l'induction de la maladie). La paralysie du train arrière est non douloureuse mais peut s'accompagner d'un stress chez l'animal qui doit être surveillé quotidiennement. Injection stéréotaxique: injection sous cutanée non douloureuse d'un analgésique avant la chirurgie pouvant entrainer un stress chez l'animal lié à la contention. Cependant les animaux sont habitués avant la chirurgie notamment à la contention pour minimiser ce stress. Les animaux reçoivent ensuite 3 injections sous cutanées d'anti inflammatoire en post-opératoire pour empêcher l’apparition de douleur associée à l'acte chirurgical. Là encore cela nécessite la contention des animaux.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort afin d'effectuer le prélèvement d'organes.
Remplacement
La sclérose en plaques est une maladie complexe faisant intervenir de nombreux types cellulaires dans le cerveau (cellules endothéliales, astrocytes, péricytes, neurones, oligodendrocytes) et dans le sang (cellules immunitaires comme les lymphocytes). L'étude de l'ensemble de ces cellules et plus encore leurs interactions ne peut pas à l'heure actuelle être réalisées uniquement avec des tests in vitro de culture cellulaire. Le recours à un être vivant, mammifère, présentant des caractéristiques partagées avec l'homme est donc nécessaire et les rongeurs représentent un modèle de choix pour réaliser une analyse in vivo complémentaire des autres expériences.
Réduction
Le nombre d'animaux a été calculé à l'aide d’un logiciel qui nous permet de limiter au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des différences significatives entre les groupes comparés (concernant le score de paralysie dans le modèle de sclérose en plaques chez la souris notamment). Le nombre de souris par groupe et par analyse, calculé par le logiciel, est de 10. Il faut noter cependant que nous ne pourrons pas faire toutes les analyses sur une seule souris. Pour le modèle de sclérose en plaques chez la souris, il faudra 3 lots de 10 souris par groupe pour 3 temps soit 90 souris totales par groupe. Pour le modèle d'injection dans le cerveau d’un composé inflammatoire, il faudra 3 lots de 10 souris pour 3 temps soit 30 souris total pour chaque groupe. Ce chiffre est conforté par notre propre expérience et par celle de la communauté scientifique s'intéressant à la sclérose en plaques, 10 animaux par lot et par analyse sont nécessaires pour obtenir des résultats exploitables statistiquement aussi bien pour les mesures de la paralysie et les analyses histologiques et moléculaires. Pour réduire le nombre d'animaux, aucune expérience déjà publiée ne sera reproduite. Les manipulations seront réalisées par du personnel technique entrainé de façon à réduire la variabilité des résultats donc le nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
L’hébergement des souris sera réalisé dans des conditions qui limiteront le stress et l’inconfort (animalerie agrée, personnels formés, cage de 3 à 6 animaux maximum en portoir ventilé avec libre accès à l’eau et à la nourriture ainsi qu’un environnement enrichi avec igloo cartonné et serpentins de papier à dérouler). La souffrance des animaux sera réduite par l'usage d'anesthésiques et d'antalgiques adaptés pour la réalisation des gestes douloureux. D'autre part, les animaux seront surveillés quotidiennement par le zootechnicien, le responsable du bien-être animal ou l'expérimentateur. Dès le début des expérimentations, une fiche bien-être est ouverte. Y sont gradés l'apparence, la perte de poids, les signes cliniques et le comportement. Les animaux sont surveillés quotidiennement par l’expérimentateur ou le zootechnicien (Y compris le week-end). Si ce n'est pas l'expérimentateur, lui-même qui détecte un signe de souffrance ou de mal être, il sera immédiatement alerté. En fonction du score, la cage est identifiée avec une carte « à surveiller » et surveillée plus fréquemment (2-3 fois par jour) ou bien si le score est plus élevé, les souris reçoivent un traitement antalgique avec mise à disposition de nourriture humide associé au nettoyage/re-fermeture des plaies (si nécessaire) et à des visites plus fréquentes de l’expérimentateur (toutes les deux heures). Lorsque le score atteint le point limite, l’animal est mis à mort immédiatement par le zootechnicien/l'expérimentateur. Pour les animaux avec la sclérose en plaques, un scoring quotidien sera réalisé entre J0 et J45. Dès que les animaux montreront les premiers signes de paralysie, l'expérimentateur mettra à leur disposition des croquettes mouillées sur le sol de la cage. La déshydratation sera évaluée quotidiennement par pincement de la peau du cou et de l'hydrogel sera utilisé comme source d'eau dès les premiers signes de déshydratation.
Choix des espèces
Pour l'étude de la sclérose en plaques, la souris est le modèle animal de choix en terme de susceptibilité à l'induction mais également pour le développement de symptômes très proches de ceux observés chez l'homme. Cela permettra, à terme, d'extrapoler les résultats, obtenus lors de notre étude pré-clinique chez la souris, à l'homme. La souris est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale des vaisseaux du cerveau présente de nombreuses similitudes avec l'organisation des vaisseaux du cerveau chez l'homme. La souris est à ce jour la seule espèce de mammifère pour laquelle il est possible, en routine, de modifier le génome afin de créer des modèles d'études de maladies humaines. Les souriceaux seront génotypés à J7-J10 après la naissance. Des souris adultes âgées de 8 semaines (début du protocole) à 5 mois (fin du protocole) seront ensuite utilisées pour les expérimentations. Notre objectif n'est pas d'étudier des processus développementaux mais des processus physiopathologiques.
Interventions nutritionnelles pour les maladies du foie liées à l’obésité : utilisation de souris transgéniques pour caractériser les mécanismes.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever sang et organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont d'abord rendues obèses et diabétiques par douze semaines de régime gras, puis soumises à un jeûne de seize heures, à un jeûne intermittent de six semaines ou à un régime cétogène, avec des tests de tolérance au glucose comprenant six heures de jeûne et sept piqûres de la queue en deux heures. Il s'agit de savoir si une protéine du foie explique les effets bénéfiques de ces régimes, déjà observés au laboratoire dans une étude non publiée. Le porteur écrit qu'il est "impossible" de reproduire par des méthodes alternatives le jeu combiné du foie, des tissus adipeux, de l'intestin, du cerveau et du muscle.
Objectifs
Les maladies métaboliques du foie (stéatose hépatique non alcoolique, ou NAFLD pour non-alcoholic fatty liver disease) sont en expansion dans les pays industrialisés, parallèlement à la prévalence croissante de l’obésité. Le premier stade de la maladie correspond à une accumulation de graisses dans le foie et est bénin mais peut évoluer chez certains patients vers une forme inflammatoire, puis vers une cirrhose, à l’origine d’autres complications sévères telles que le cancer du foie. Les mécanismes de progression de ces maladies sont encore mal compris et aucun traitement médicamenteux efficace n’est disponible à ce jour. Dans une étude non publiée du laboratoire, nous avons récemment démontré que plusieurs stratégies alimentaires sont capables de diminuer l’obésité, le diabète et la stéatose hépatique chez la souris. Nous souhaitons à présent déterminer les mécanismes impliqués dans ces effets bénéfiques. Nous émettons l’hypothèse que la protéine PPARa pourrait être impliquée dans ces effets. PPARa est principalement exprimée dans le foie où elle contrôle la dégradation des graisses, faisant d'elle une bonne cible thérapeutique pour traiter les maladies métaboliques. Nous disposons au laboratoire de souris mâles et femelles chez qui le gène PPARa est non fonctionnel dans le foie. Dans ce projet, nous utiliserons des souris mâles et femelles qui n'expriment pas PPARa dans le foie et comme contrôle, des souris chez qui PPARa s’exprime. Elles seront nourries par un régime gras induisant une obésité, un diabète de type 2 et une pathologie hépatique mimant celle observée chez l’Homme. Une fois la pathologie installée, les animaux seront soumis à différentes stratégies alimentaires : un retour à un régime contrôle, un jeûne aigu ou intermittent, un régime cétogène (presque exclusivement constitué de graisses et contenant très peu de sucre). Les effets de ces différentes stratégies alimentaires seront évalués grâce à des bilans sanguins et des analyses des prélèvements d’organes (foie, tissus adipeux brun et blanc).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de définir l’importance de PPARa spécifiquement dans le foie dans les effets bénéfiques des différentes interventions sur la progression de l’obésité, du diabète de type 2 et de la stéatose hépatique. En conséquence, ce projet pourrait identifier un des mécanismes hépatiques pouvant être impliqué dans les effets de ces différentes interventions. En effet, aucun traitement de référence n’est disponible à ce jour pour les patients atteints de ces maladies chroniques du foie qui représentent actuellement la 2e cause de transplantation de foie du monde.
Procédures
Les animaux seront nourris avec un régime standard ou un régime obésogène riche en graisses pendant 12 semaines. A l'issue de ces 12 semaines, les animaux subiront l'une des interventions nutritionnelles suivantes : une mise à jeun pendant 16h, un jeûne intermittent de 16 h par jour pendant 6 semaines, un régime cétogène riche en gras et pauvre en sucre pendant 6 semaines, un régime standard pendant 6 semaines, un groupe contrôle qui restera nourri avec le régime obésogène pendant 6 semaines. Les animaux seront aussi soumis à des tests de tolérance au glucose (OGTT) ou à l’insuline (ITT) au début et à la fin de chaque intervention. Ces tests consistent en : 6h de jeûne, suivi d'une mesure de la glycémie puis un gavage avec du glucose pour les OGTT ou une injection d'insuline pour les ITT, puis des mesures de la glycémie toutes les 15 min pendant 2h. Pour les OGTT, le glucose est administré par gavage une fois et pour les ITT, l'insuline est administrée par injection une fois. Le gavage et l'injection prennent chacun moins de 30 secondes. Pour les mesures de glycémie, le prélèvement d’une seule goutte de sang (
Impact sur les animaux
Les régimes obésogènes vont induire une obésité et des perturbations du métabolisme associées tels qu'un diabète et une stéatose, sans souffrance visible des animaux ni changement de leur comportement. La mise à jeun peut entraîner une hypoglycémie et une hypothermie. Le prélèvement sanguin et le gavage oral de glucose et d’insuline peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique
Remplacement
Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car la pathologie étudiée (stéatose non alcoolique) est complexe et fait intervenir différents tissus agissant en synergie (foie, tissus adipeux, intestin, cerveau, muscle). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible de mimer la pathologie étudiée grâce à l’utilisation du régime gras.
Réduction
Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés (calcul de puissance) et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.
Raffinement
Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement. Ainsi, les souris seront en hébergement collectif et dans un environnement contrôlé (température, hygrométrie). Des enrichissements du milieu de vie (cabanes en inox et ouate de coton ou de cellulose) seront disposés dans la cage afin de pouvoir se distraire, se cacher et fabriquer des nids. Pour un meilleur raffinement et limiter le stress, les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons leur consommation alimentaire et hydrique afin de vérifier la bonne tolérance des différentes expérimentations. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres (indice 0 = normal ou léger, indice 3 = changements importants par rapport à la normale). Si un animal présente un signe quelconque de souffrance avec un score de 3 après évaluation de ces paramètres, l’animal sera aussitôt retiré de l’étude et replacé dans des conditions d’hébergement standard (régime standard et aucune procédure réalisée).
Choix des espèces
L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.
Etude de la réponse thérapeutique aux chimiothérapies dans les cancers du sang chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Injectées sans anesthésie de cellules leucémiques dans la veine de la queue, 960 souris de six à huit semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Une ponction de moelle osseuse au fémur, sous anesthésie, suit l'évolution de la maladie, puis les souris malades reçoivent jusqu'à cinq jours de chimiothérapie par injections dans l'abdomen et la queue, elles aussi sans anesthésie, et une partie passe en imagerie. La rate gonfle et peut gêner leurs déplacements, le porteur jugeant possible qu'elle "cause des douleurs" même si les signes visibles en sont rares, et la chimiothérapie peut leur faire perdre du poids, avec un poil terne et parfois le dos voûté pendant deux à trois jours. L'objectif est de comprendre comment une protéine participe à la mort des cellules leucémiques sous chimiothérapie, et les souris sont tuées au plus tard quatre mois après l'injection, plus tôt si elles franchissent un point limite, pour prélever rate et moelle osseuse.
Objectifs
Les agents de chimiothérapie utilisés pour soigner les patients atteints de leucémie (cancer du sang) ont des mécanismes d’action variés, mais leur action précise et majoritaire est encore incertaine. Le projet a pour objectif de mieux comprendre les effets de la chimiothérapie classiquement utilisée pour soigner les leucémies. Nous étudierons en particulier l’importance d’un gène qui participe à la mort des cellules cancéreuses lorsque les patients sont traités avec la chimiothérapie. L’objectif est de comprendre par quels mécanismes la protéine issue de ce gène peut entrainer la mort des cellules cancéreuses.
Bénéfices attendus
Chez les patients atteints de leucémies, les rechutes sont très fréquentes après les traitements par chimiothérapie, en particulier chez les personnes âgées de plus de 60 ans. Les progrès à faire passeront par une meilleure compréhension des mécanismes d’action précis des chimiothérapies, qui pourront alors être améliorées. Ce projet permettra d’approfondir les connaissances sur la chimiothérapie et son mode d’action. Comprendre la manière dont la chimiothérapie conduit à la mort des cellules cancéreuses permet de travailler sur l’amélioration des traitements à plus long terme.
Procédures
Pour mettre en place le modèle de leucémie, les animaux seront soumis à une injection des cellules leucémiques par intraveineuse dans la queue. Cette procédure dure environ 20 secondes et se fait sans anesthésie. L’apparition de la maladie sera suivie par ponction de moelle osseuse (qui est le site d’expansion de ces cellules cancéreuses). Ce prélèvement sera fait au niveau du fémur, dans une patte arrière. Il se fait sous anesthésie et dure environ 2 à 3 minutes. Quand les souris commenceront à être malades, elles seront traitées avec une molécule administrée par injection dans l'abdomen (environ 5 à 10 secondes) et une molécule administrée en intra-veineuse dans la queue (environ 20 à 30 secondes). Ces procédures sont faites sans anesthésie. Pour une partie des souris, des séances d'imagerie seront réalisées (suivi des cellules cancéreuses dans l'animal vivant). Après injection d'une solution permettant de visualiser les cellules d'intérêt (injection dans l'abdomen; durée de 20 secondes), les souris sont anesthésiées puis placées dans un équipement d'imagerie avec maintien de l'anesthésie. Des images sont enregistrées sur une durée de 10 minutes maximum, avant l'arrêt de l'anesthésie et le réveil de l'animal.
Impact sur les animaux
La manipulation des souris pour le traitement engendre un stress, le souris pouvant être traitées quotidiennement pendant maximum 5 jours. Quand la leucémie se développe, la rate des souris grossit (splénomégalie). Cela peut gêner leur mobilité normale. On peut aussi penser qu’elle cause des douleurs même si des signes visibles de douleur ne sont que rarement présents en cas de splénomégalie faible ou modérée. Quand les souris sont traitées avec la chimiothérapie, elles peuvent perdre du poids à partir du troisième jour du traitement. Elles ont alors le poil moins régulier et parfois le dos voûté. Ces effets ont une durée de 2 à 3 jours.
Devenir
Tous les animaux seront systématiquement euthanasiés au maximum 4 mois post-injection si pas d’atteinte du point limite. Les organes cibles de la prolifération des cellules cancéreuses (rate, moelle osseuse) seront prélevés en post-mortem pour une analyse au niveau cellulaire.
Remplacement
Nous avons au préalable testé la chimiothérapie sur des modèles de cellules cancéreuses en culture. Le passage dans l’animal est maintenant nécessaire pour reproduire les conditions physiologiques d’un organisme proche de l’homme, pour confirmer et approfondir les hypothèses.
Réduction
Nous utilisons un nombre suffisant et optimal d’animaux par groupe pour avoir des différences statistiquement significatives entre les groupes. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, différents temps de traitement seront testés en même temps afin de comparer les différents groupes testés à un seul et unique groupe contrôle.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes pour respecter leur comportement naturel. Ils seront surveillés quotidiennement, et une grille d’évaluation, tenant compte de leur apparence de leur comportement et d’un suivi clinique, sera tenue chaque semaine de façon à définir des points limites de douleur/souffrance suffisamment précoces pour déclencher le recours à l’euthanasie si ces points limites étaient atteints. Ce suivi sera quotidien lors de la phase de traitement. En cas de perte de mobilité, l’accès à la nourriture sera facilité. Les cages seront enrichies pour améliorer le bien-être des animaux. La ponction de moelle osseuse ainsi que l'imagerie seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle (utilisation de support à 37°C).
Choix des espèces
La souris est un petit mammifère suffisamment proche de l’Homme pour les expériences menées dans ce projet. Le gène étudié ainsi que la fonction de la protéine qui en découle sont très proches entre l’homme et la souris. Les molécules testées sont à administrer par différentes voies, toutes disponibles sur l’espèce animale choisie. De plus, le contrôle de leur bien-être au quotidien est facilité car les signes de souffrance/douleur ont été bien caractérisés chez cette espèce. Les leucémies touchent des cellules à un stade précoce de leur développement, ce qui nous conduit à utiliser des souris jeunes adultes de 6 à 8 semaines pour nos expérimentations.
Identification d’une nouvelle cible thérapeutique pour stimuler les réponses immunitaires anti-tumorales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Tester si une cible identifiée en culture cellulaire améliore l'effet de la radiothérapie suppose ici de greffer une tumeur à 432 souris. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées, à la fin du suivi de croissance tumorale ou pour des analyses post mortem. Après l'injection sous-cutanée de cellules tumorales viennent un gavage puis une irradiation sous anesthésie, en trois doses sur trois jours consécutifs ou en dose unique par mini-faisceaux, avec diarrhée, perte de poids et dermite possibles. Le porteur affirme que le développement de ces tumeurs n'entraîne ni douleur ni gêne et conclut que le modèle animal reste "indispensable" pour passer à la clinique.
Objectifs
L‘arsenal des traitements contre le cancer comprend la radiothérapie, la chimiothérapie et l’immunothérapie, c’est-à-dire la manipulation du système immunitaire du patient pour combattre la tumeur. Cependant, ces traitements ne sont pas efficaces contre tous les cancers ou seule une partie des patients répondent au traitement. L’efficacité du traitement dépend souvent de l’implication des cellules du système immunitaire. Ces dernières années, le rôle essentiel d’une population particulière de cellules immunitaires, appelées monocytes, a été mis en évidence. Le but de ce projet est de manipuler ces cellules afin de stimuler les réponses immunitaires contre les tumeurs, et de tester une stratégie thérapeutique permettant d’augmenter l’efficacité de la radiothérapie, la chimiothérapie et l’immunothérapie.
Bénéfices attendus
Nous avons identifié par des expériences in vitro une nouvelle cible thérapeutique potentielle qui pourrait stimuler les réponses immunitaires dans le contexte du cancer. Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances essentielles pour évaluer l’intérêt de cette nouvelle cible thérapeutique dans un système physiologique in vivo. Ce projet permettra également de mieux comprendre l’importance des cellules immunitaires appelées monocytes dans les réponses immunitaires anti-tumorales. Ces avancées seront communiquées à la communauté scientifique dès la fin du projet. A plus long terme, ce projet ouvrira la voie à de nouvelles applications thérapeutiques chez l’homme, en particulier de nouvelles stratégies pour optimiser l'efficacité des traitements anti-tumoraux.
Procédures
Des cellules tumorales seront injectées par voie sous-cutanée à tous les animaux de ce projet (injection sur animaux vigiles1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inf à 10 sec). Puis les animaux vigiles recevront un traitement par gavage (durée du geste inf à 10 sec) en préalable à l’irradiation. Ensuite, les animaux seront anesthésiés et ces animaux recevront un traitement de radiothérapie conventionnelle (une dose pendant 3 jours consécutifs, 3 doses au total) ou un traitement de radiothérapie par mini-faisceaux (1 dose unique) (durée de l’anesthésie pour ces irradiations : 30 min).
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs sous-cutanées au niveau du flanc qui seront mesurées régulièrement. Le développement de ces tumeurs n’entrainera pas de douleur ni de gêne pour l’animal Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection de produits non irritants par voie intrapéritonéale (directement dans l’abdomen) (gêne de courte durée),celles liées au gavage oral (gêne de courte durée), et celles liées à une irradiation (possible diarrhée, perte de poids et dermite)
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin du suivi de croissance tumorale ou pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Après des premières étapes d’analyse et de validation dans un modèle de culture in vitro, nous avons formulé l’hypothèse que notre cible d’intérêt pourrait stimuler les réponses immunitaires anti-tumorales. Cette hypothèse ne peut être testée que dans un modèle in vivo, dans un système physiologique représentant un organisme vivant intégré et autonome tel que la souris. Cette étape est indispensable à la compréhension du processus biologique et à l’évaluation du potentiel thérapeutique de l’approche proposée dans ce projet. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation de modèle animal reste indispensable pour pouvoir aborder la phase d’application de nos découvertes en clinique.
Réduction
Le nombre de souris par condition est de 18 (6 par expérience, répétée 3 fois) afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante, selon la différence que l’on souhaite mettre en évidence. Dans notre expérience préalable, ces effectifs sont suffisants pour mettre en évidence des différences significatives dans des modèles expérimentaux semblables. Dans certaines expériences, plusieurs organes seront prélevés post-mortem pour des analyses, ce qui optimise le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Dans le cadre des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés quotidiennement par l'équipe pour l’état général (7j/7). La radiothérapie sera réalisée sous anesthésie générale et les éventuelles douleurs soulagées par des analgésiques. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d’atteinte des points-limite les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche thérapeutique du cancer, car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les réponses immunitaires anti-tumorales. La connaissance complète du génome murin permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés, ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (de 5 à 7 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.
Evaluation de l’efficacité thérapeutique de molécules immunomodulatrices dans des modèles expérimentaux de cancer établis chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Des cellules tumorales sont implantées sous la peau du flanc, puis chaque souris reçoit trois à six injections de produit en trois semaines, la tumeur est mesurée tous les deux jours et l'animal pesé avant et 24 heures après chaque injection. 1 080 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour tester des molécules immunostimulantes contre le cancer. Le porteur décrit une croissance tumorale en général bien tolérée, avec des lésions cutanées pouvant aller jusqu'à l'ulcération et la nécrose, et une gêne respiratoire dans le modèle de métastases pulmonaires. Toutes sont mises à mort à la fin de chaque procédure, au motif qu'elles ne peuvent être ni réutilisées, ni replacées, ni adoptées.
Objectifs
Notre organisme se défend à chaque instant contre des attaques extérieures grâce à la surveillance de notre système immunitaire. Néanmoins, en cas de cancer, ce dernier ne parvient pas à empêcher le développement de la maladie. Les traitements d’immunothérapie anticancéreuse vise donc à réactiver le système immunitaire c’est-à-dire à réapprendre aux cellules immunitaires à reconnaître et à détruire les cellules tumorales, cellules anormales à notre corps. Notre projet s’inscrit dans ce domaine par la recherche de solutions thérapeutiques innovantes qui s’attaquent à la cellule tumorale, mais également à son environnement immunitaire. Pour ce faire, nous développons des molécules immunostimulantes qui sont dans un premier temps sélectionnées in vitro à l’aide de tests cellulaires (criblage sur lignées cellulaires rapportrices et mise en œuvre de co-culture mimant les intéractions entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires). Cependant, l’évaluation thérapeutique de molécules candidates sur des modèles in vivo demeure nécessaire pour comprendre leur mode d’action. C’est la raison pour laquelle, nous avons recours à divers modèles de tumeurs implantées chez la souris permettant de mimer la pathologie tumorale humaine. Ce projet a donc pour but de : - évaluer l’efficacité de nouvelles molécules à activité anti-cancéreuse - étudier les mécanismes mis en jeu dans la réponse immunitaire anti-tumorale - appréhender la sécurité de la molécule candidate dans des modèles expérimentaux de cancer.
Bénéfices attendus
En premier lieu, ce projet nous permettra d’établir des corrélations entre les réponses obtenues sur nos modèles cellulaires in vitro et la réponse anti-tumorale sur un organisme entier. Cela permettra ainsi de mieux comprendre les mécanismes des voies de l’immunité innée mis en œuvre dans la réponse anti-tumorale du candidat médicament et éventuellement de comprendre les mécanismes de résistance à certains traitements. D’autre part, ces expérimentations in vivo, dont le bénéfice principal attendu est une diminution significative du volume tumoral constituent un prérequis indispensable afin de consolider la preuve de l’efficacité du candidat médicament avant d’envisager son utilisation dans le cadre d’essais cliniques. Ces études précliniques permettent d’appréhender la toxicité de la molécule candidate, en identifiant les effets indésirables qui pourraient empêcher une molécule de passer en phase de développement clinique. Selon les résultats du projet, nous pourrions découvrir de nouvelles stratégies thérapeutiques bénéfiques en immuno-oncologie et proposer ainsi de nouvelles molécules à la communauté scientifique pour lutter contre le cancer chez l’homme, enjeu majeur de santé publique.
Procédures
Les animaux subiront différents types d'actes, injections ou prélèvements qui ne requièrent que quelques secondes à quelques minutes par animal. En fonction du produit thérapeutique testé, chaque animal aura : soit 3 injections ; soit 6 injections de produit avec 2 injections/semaine sur une durée de 3 semaines pour lesquels la douleur est modérée à sévère du fait de la répétition. Pour les interventions pouvant induire un stress chez l’animal, elles seront réalisées sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Pour les modèles sous-cutanés, les nuisances principales attendues sont liées à la progression tumorale (d’une durée maximale de 7 à 10 jours) qui peut s’accompagner de lésions cutanées d’intensité légère (inflammatoire) à sévère (nécrose) selon le type de tumeurs (l’ulcération de la tumeur ou perte de substance de la peau, étant la lésion la plus grave). La progression tumorale peut également engendrer une gêne dans le déplacement de la souris car l’injection des cellules tumorales génère une masse au niveau du flanc de la souris. Le volume tumoral est mesuré tous les 2 jours et un volume maximal a été déterminé comme critère d’arrêt de la procédure. Normalement, la croissance de la tumeur est bien tolérée par les souris, mais peut dans des cas rares, être associée à une perte de poids, une activité anormale, entraînant une nuisance d’intensité moyenne à sévère. Dans le cas du modèle métastatique pulmonaire, la nuisance d’intensité sévère associée à ce modèle est un inconfort respiratoire lié à la dissémination métastatique dans les poumons, observé uniquement à un stade évolutif tardif. D’éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux tels que chimiothérapies ou immunothérapies sont possibles, mais il n’est pas attendu d’effet secondaire important avec les molécules évaluées dans ce projet. Quant aux effets prévus, concernant les animaux traités avec le produit thérapeutique, il est attendu une diminution du volume tumoral voire une disparition totale des tumeurs.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Afin de mettre au point des traitements plus efficaces, seuls les modèles in vivo nous permettent de comprendre les mécanismes complexes au sein d’une tumeur, alors que l’utilisation de lignées cancéreuses en culture est insuffisante pour comprendre les relations/interactions permanentes entre les différents types cellulaires dans un organisme entier. En effet, les tests biologiques sur cellules (in vitro) permettent de connaître rapidement l’activité recherchée mais ne permettent pas d’appréhender l’efficacité d’un produit thérapeutique ni son innocuité sur un organisme entier. Le recours à des animaux est justifié par la nécessité d’avoir un système immunitaire complet pour mesurer l’index thérapeutique et la réponse immunitaire antitumorale de nos molécules. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques occupe donc encore aujourd'hui une place centrale en immuno-oncologie.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans une expérimentation sera de 46 au maximum. Ce nombre est réduit à son minimum soit 6 ou 10 animaux/groupe dans le cas des modèles sous-cutanés ou 8 animaux/groupe dans le cas du modèle métastatique. Il a été déterminé à partir de publications évaluant des biomolécules d’immunothérapie sur les mêmes modèles animaux utilisés dans ces procédures et il est suffisant pour mettre en évidence des différences significatives sur le volume tumoral, notre critère majeur. Cela permet également de limiter la répétition des études (réduction du nombre d’études) et de pouvoir gérer techniquement l’expérimentation (surveillance clinique plus adaptée du fait d’un nombre limité d’animaux) tout en gardant suffisamment d’animaux par groupe pour réaliser des études statistiques significatives. Le nombre maximal d'animaux considéré pour ce projet est par conséquent de 1080 souris, sur une durée maximale de 5 ans
Raffinement
Parmi les mesures spécifiques prises, nous privilégions l’utilisation de l’anesthésie gazeuse pour la sédation car elle permet une anesthésie de très bonne qualité, sûre et réversible ainsi qu’un réveil rapide. En effet, pour minimiser le stress et la douleur liés aux injections ou aux prélèvements sanguins, les animaux sont anesthésiés lors de la mise en œuvre de ces actes. D’autre part, nous mettons en œuvre des soins per-opératoires qui contribuent à raffiner nos procédures : vérification de la profondeur d'anesthésie ; surveillance de la fréquence respiratoire ; utilisation de tapis chauffant durant l’implantation des cellules tumorales ou les injections intra-veineuses et les prélèvements sanguins ; utilisation de gel oculaire protecteur durant l’anesthésie ; utilisation d’une lampe chauffante et de fibre naturelle de coton durant la phase de réveil. Enfin, nos procédures requièrent une surveillance accrue en plus d’une surveillance quotidienne : avant et 24h après chaque injection du produit thérapeutique, les animaux sont pesés afin de mettre en évidence une éventuelle toxicité aigüe et 4h après chaque injection, les animaux sont réexaminés. Un examen clinique individuel sur chaque animal est réalisé tous les 2 ou 3 jours au cours duquel la taille des tumeurs est mesurée et l’état général de l’animal est observé. Afin de prévoir l’apparition de la douleur, nous avons établi des points limites précoces (critères d’interruption) ainsi qu’une grille de score qui déterminent les actions à mener en cas de souffrance avérée de l’animal. Cette grille prend en compte 1) le comportement de l’animal dans la cage, 2) l’apparence générale, 3) les fonctions physiologiques et 4) l’inspection et la taille de la tumeur. Grâce à cette grille de score, les éventuels signes cliniques de douleur (locale ou générale) sont détectés et un traitement local ou systémique d’analgésique est appliqué pour y remédier. Dans le cas exceptionnel de douleur non maitrisée par ces traitements post-opératoires, les animaux sont immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
La souris est actuellement l’organisme-modèle le plus utilisé en recherche biomédicale et en cancérologie : en effet, très peu de modèles en cancérologie existe chez l’espèce rat (cancer de la prostate). Elle présente de nombreux intérêts : sa taille, sa courte durée de vie et son rythme rapide de reproduction par rapport à d’autres organismes-modèles. De plus, les souris développent des pathologies tumorales spontanées ou induites, similaires à celles présentes chez l’homme (mécanismes physiopathologiques comparables, biomarqueurs similaires) et ces mammifères présentent une forte homologie phylogénétique avec l’homme (90%). Elles permettent également de produire un grand nombre d’individus identiques (syngéniques), ce qui permet d’assurer une meilleure reproductibilité des conditions expérimentales. En outre, elles présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Enfin, du fait de leur taille (20-25g) par rapport au rat, cela permet une manipulation plus aisée et de réduire les quantités de molécules à utiliser. Ces expériences seront réalisées sur des souris adultes mâtures âgées de 8 à 12 semaines. Le stade adulte ou adulte mâture est celui où les pathologies cancéreuses se développent et où le sytème immunitaire est totalement fonctionnel.
Production de souris humanisées pour le système immunitaire
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Des souriceaux nouveau-nés, des souris juvéniles sevrées et des femelles gestantes sont commandés selon la demande d'utilisateurs académiques et industriels. 5 120 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, irradiées 218 secondes ou traitées chimiquement, puis greffées par injection de cellules souches humaines sous anesthésie. Environ 80 % passent le contrôle qualité et sont expédiées vivantes aux utilisateurs finaux qui poursuivront les expériences, les autres sont tuées dans les jours qui suivent puisqu'elles ne sont plus utilisables. Le porteur présente cette production de souris humanisées comme un "service" et la range dans la règle des 3R, au motif que ces animaux réduiraient le nombre d'individus utilisés plus tard.
Objectifs
Les souris immunodéficientes sont depuis plusieurs décennies des modèles de choix pour la transplantation de cellules souches humaines capables de générer un système immunitaire humain. Le recours à ces souris humanisées permet de proposer et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour une large gamme de pathologies nécessitant des modèles expérimentaux plus proches de la situation humaine. Les objectifs du présent projet sont de générer une gamme de souris humanisées pour le système immunitaire afin de les distribuer à un large panel d’utilisateurs finaux (académiques et industriels) aussi bien dans une perspective de recherche fondamentale que d’évaluation préclinique industrielle dans des domaines tels que l’hématopoïèse, l’immunologie, les maladies infectieuses, la vaccinologie, l’oncologie… Ce projet couvrira la génération de souris humanisées déjà validées en tant que "service" et également la génération de nouveaux modèles immunodéficients humanisés en tant que projet « nouveaux modèles en Recherche et Développement "R&D" ». Ceci permettra d’avoir des modèles plus adaptés aux études pré-clinique et participera à la règle des 3R sur la réduction du nombre d’individu pour des statistiques plus robustes.
Bénéfices attendus
Le recours à ces souris humanisées devrait permettre de proposer et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour une large gamme de pathologies nécessitant des modèles expérimentaux plus proches de la situation humaine (souris humanisées pour des composants cellulaires et moléculaires du système hématolymphoïde).
Procédures
Procédure 1: Afin de rendre les souris permissives à la prise de greffe de cellules souches humaines, les animaux immunodéficients seront soit injectés avec une molécule chimique (1 injection par jour pendant 2 jours d’une durée de 30 secondes), soit irradiés 1 seule fois pendant 218 secondes afin de rendre accessible les niches hématopoïétiques puis, immédiatement traité avec un antibiotique pendant 2 semaines, dans le but de prévenir toute infection. Les animaux seront par la suite humanisés par une unique injection intraveineuse de cellules souches humaines, et ce, après anesthésie générale gazeuse. Cette intervention dure 3 min pour la phase d’endormissement et 30 secondes pour la phase d’injection. Enfin, le contrôle qualité du taux d’humanisation se fera suite à un unique prélèvement sanguin sur souris vigiles pour la partie « Service », ou suite à 9 prélèvements sanguins, toutes les 3 semaines sur une période de 23 semaines pour la partie « nouveaux modèles en recherche et développement "R&D". Le prélèvement sanguin dure 30 secondes par souris. Procédure 2: Afin de rendre les souriceaux permissifs à la prise de greffe de cellules souches humaines, les animaux seront irradiés 1 seule fois (durée irradiation dépendante de la souche de la souris) afin de rendre accessible les niches hématopoïétiques. Les animaux seront par la suite humanisés par une unique injection de cellules souches humaines dans le foie. Un prélèvement de phalange sera réalisé afin de permettre leur identification ainsi que leur génotypage. Enfin, le contrôle qualité du taux d’humanisation se fera à l’aide de prélèvement sanguin à entre 9 et 12 semaines après l’humanisation.
Impact sur les animaux
Les effets néfastes du pré-conditionnement apparaissent sur environ 5% des animaux adultes humanisés et tardivement (6 mois après la greffe de cellules souches humaine). Ils se manifestent souvent par une perte de poids et une modification de l’apparence (extrémités blanches) et du comportement naturel de l’animal (animal sans énergie). Les animaux seront surveillés quotidiennement pour prévenir tout inconfort animal et prendre la décision appropriée selon notre grille d’évaluation de projet. Notre surveillance sera donc accentuée à 6 mois notamment pour la partie « nouveaux modèles en recherche et développement "R&D" » puisque les souris seront observées jusqu’à 32 semaines. De plus, du stress pourra être généré lors des prises de sang et du transport des animaux vers les utilisateurs finaux.
Devenir
Pour le Service : Tous les animaux humanisés validés par le ‘contrôle qualité’ soit environ 80% des animaux produits, présentant une proportion sanguine de leucocytes d’origine humaine >20% des leucocytes totaux sont expédiés aux utilisateurs finaux (utilisation continue chez l'utilisateur final). Les animaux ne satisfaisant pas le critère requis sont écartés de tout groupe expérimental ultérieur. Ces animaux sont mis à mort dans les jours suivants le contrôle qualité car ils ne pourront plus être utilisés dans d'autres protocoles expérimentaux. Pour les nouveaux modèles : A l’issue des 32 semaines, les animaux seront mis à mort pour caractérisation du système immunitaire reconstitué (=humain).
Remplacement
Ce projet vise à produire des souris humanisées comme modèle expérimental préclinique à destination d’utilisateurs finaux des secteurs académique et industriel. Un tel modèle correspond à une attente forte pour pouvoir tester de nouvelles approches thérapeutiques transposables à l’Homme. En proposant comme modèle la souris humanisée pour le système immunitaire, nous offrons la possibilité d’utiliser un modèle expérimental préclinique permettant le criblage d’approches thérapeutiques directement adaptées à la situation humaine. Par ailleurs, les souris humanisées permettent d’approcher la situation physiologique humaine sans avoir recours aux modèles de primates non humains.
Réduction
Nous réalisons le projet d’humanisation en fonction des besoins exprimés ou pressentis de nos partenaires utilisateurs finaux. De plus, notre savoir-faire et l’optimisation de nos protocoles permettent d’utiliser peu d’animaux pour un rendement maximum. En exprimant le système immunitaire humain, la souris humanisée permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire dans ses applications ultérieures. Grâce au contrôle qualité systématique sur chaque souris implantée et au retour d’expérience qui en découle, nous optimisons sans cesse notre modèle de souris humanisée pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine, ce qui diminue la variabilité intrinsèque au modèle et réduit d’autant le nombre d’animaux à implanter pour obtenir le nombre de souris humanisée souhaité. De plus, la génération de nouvelles lignées humanisées permettra de se rapprocher au plus près du système immunitaire humain et d’avoir des modèles plus adaptés aux études pré-clinique et participera également à la règle des 3R sur la réduction du nombre d’individu pour des statistiques plus robustes.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Nous veillerons au bienêtre animal par une surveillance quotidienne des animaux par du personnel qualifié. Tout fait notable sera consigné sur une grille de score évaluant la souffrance et le stress des animaux. Les points limites sont clairement déterminés et les animaux identifiés par une alerte feront l’objet d’une surveillance accrue et des actions seront mises en place pour palier à divers problèmes tels qu’une observation bijournalière par le personnel expérimentateur ; l’ajout de gel Diet, l’ajout de coton…
Choix des espèces
Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. De plus, les conditions zootechniques actuelle et le niveau d’ingénierie génétique des souris de laboratoire sont tels qu’il est possible de construire à façon, des lignées profondément immunodéficientes, une condition sine qua non pour une prise efficace et durable de xénogreffe hématopoïétique humaine. L’âge des animaux au moment de leur inclusion dans le présent projet dépendra de la demande et de l’objectif scientifique de l’utilisateur final. Le projet pourra donc utiliser aussi bien des souriceaux nouveaux nés que des souris juvéniles après sevrage (4 à 5 semaines). Les doses, volumes et voies d’administration seront adaptés au stade de développement des animaux utilisés. Dans le cas de la procédure 1 nous pourrons : recevoir directement des souris sevrées avant envoie (juvénile) ; ou recevoir des femelles gestantes et réaliser la procédure sur les nouveau-nés une fois l’âge de 4 à 5 semaines atteint.
Étude de l’impact d’une exposition chimique aux composés organophosphorés sur l’unité neuro-vasculaire
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une perte de poids de plus de 15 % ou un score supérieur à 7 sur l'échelle de grimace déclenche la mise à mort. 920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. La moitié d'entre elles reçoit une prothèse crânienne posée en quarante-cinq minutes, puis toutes sont intoxiquées par un composé organophosphoré et passent une à trois heures par séance sous IRM ou imagerie ultrasonore. Le porteur indique que l'intoxication peut provoquer fasciculations, mâchouillements, chute du tonus musculaire, tremblements généralisés et mort, et présente ces travaux comme une réponse à la menace des armes chimiques et aux 300 000 décès annuels par pesticides.
Objectifs
Bien que très réglementée, l’utilisation de composés organophosphorés (OPs) est courante dans l’agriculture où sont utilisés des pesticides tels que le chlorpyrifos. L’incidence d’intoxication passive, active ou accidentelle avec des pesticides OPs est associée à près de 300 000 décès annuels dans le monde pour près de 3 millions de cas d’intoxication reportés. Plus inquiétant, l’utilisation en 2017 d’armes de guerres neurotoxiques contenant des OsP (Sarin en Syrie et VX en Malaisie), démontre une menace toujours actuelle pour les populations civile et militaire. Sur le plan physiopathologique, l’intoxication aigue aux OP entraîne l’inhibition irréversible des cholinestérases augmentant la concentration d’acétylcholine dans l’ensemble de l’organisme ce qui conduit à une hyperactivité du système nerveux central (SNC) qui peut engendrer des œdèmes cérébraux, de la neurodégénérescence et des crises épileptiques voir la mort. Si le traitement d’urgence permet de stabiliser les victimes, son efficacité au niveau du SNC est limitée. De plus certaines victimes peuvent être exposées à de faibles doses d’OPs sans présenter les symptômes de la phase aigue mais présentent des déficits cognitifs à long terme. Très peu d’études se sont intéressées aux effets des faibles doses sur le système neurovasculaire. Ainsi, ce projet vise à mieux comprendre l’impact d’une intoxication aux OPs au sein de l’unité neurovasculaire (UNV) à court et moyen terme. De plus, améliorer nos connaissances sur ce domaine nous permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et diagnostiques.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées sur la physiopathologie des intoxications aux composés organophosphorés. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Procédures
(Souris Mus musculus ; n=460) : Modèle d’intoxication - Induction de l’intoxication +/- traitements (durée : 1h). - Evaluation de l’inflammation cérébrale et de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) par imagerie par résonnance magnétique (IRM) (durée : 1h/mesure). - Evaluation des conséquences fonctionnelles par imagerie Doppler et functional ultrason imaging (fUS) sous anesthésie (durée : 1h/mesure). (Souris Mus musculus ; n=460 ) : Modèle d’intoxication vigile - Pose de prothèse crânienne/récupération (durée : 45min). - Induction de l’intoxication +/- traitements (durée : 1h). - Evaluation des conséquences fonctionnelles par imagerie fUS vigile (durée : 1-3h/mesure).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs. De plus, l’intoxication aux organophosphorés est susceptible d’induire des symptômes caractéristiques tels que : l'arrêt d’activité, des fasciculations (contractions involontaires des muscles), mâchouillements/bâillements, chute du tonus musculaire, dos vouté, tremblements généralisés allant jusqu’à la mort de l’animal.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification protéiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité. De même, des approches in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées concernant la physiopathologie d’une intoxication aux OPs.
Réduction
Avant de procéder à une telle étude, une approche statistique a été réalisée afin de s’assurer d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. De plus, des méthodes d’études non-invasives telle que l’imagerie (IRM, fUS…) sont utilisées dans ce projet afin de faire un suivi longitudinal des animaux, permettant de recueillir de nombreuses données sans augmenter le nombre d’animaux. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de son aisance. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine Une fois entrés en protocole, les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si leur score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 7 jours avant le début des procédures pour minimiser leur stress. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes (type IV. La nourriture, la boisson et la litière sont changés une fois par semaine. Néanmoins, ces changements pourront être effectués plus fréquemment si nécessaire. De plus, une maison en carton et des produits nécessaires à la nidification seront placés dans les cages des animaux. La litière et les enrichissements du milieu d'hébergement des animaux permettront de réduire leur stress et de faciliter leur thermorégulation. Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Après chirurgie, les souris seront placées dans des enceintes post opératoires chauffées avant d’être remises dans leurs cages propres et disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage ou bien encore de la nourriture gélifiée pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation pendant la période post-opératoire. Des gommettes de couleurs seront collées sur les étiquettes des cages afin d’assurer une surveillance adaptée (ex : rouge après une procédure chirurgicale pour une surveillance plus importante).
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies diagnostiques et de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour non seulement étudier les effets de l’intoxication aux composés organophosphorés sur le SNC mais également pour tester l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Les animaux utilisés seront âgés de 8 à 10 semaines et auront un poids compris entre 35 et 40g lors de l’intoxication. Nous choisissons des animaux de cet âge afin de pouvoir comparer les données existantes au laboratoire et dans la littérature, puisque le modèle d’intoxication au NIMP a été développé chez des animaux ayant un stade de développement identique.