Souris

Marquées par entailles aux oreilles, vaccinées trois fois par voie sublinguale et trois fois par voie nasale sous anesthésie, saignées jusqu'à neuf fois par ponction à l'œil, 1 020 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles est maintenue jusqu'à 22 mois pour tester les candidats vaccins sur des organismes vieillissants, le porteur signalant que cette durée d'hébergement peut entraîner alopécie, hypothermie et blessures de combat. La dernière étape est une trachéotomie terminale pour recueillir salive et mucus nasal, après quoi tous les animaux sont mis à mort pour prélever organes et fluides. Le porteur présente la lignée choisie comme proche de l'humain sur le plan immunitaire, tout en la décrivant comme une étape avant le passage à des animaux "plus pertinents et proche de l'humain", les primates non humains.

Objectifs

Actuellement, la vaccination classique dirigée contre la grippe utilise la voie d’injection par aiguille. Cependant, ce mode d’administration ne procure qu’une immunité partielle (production d’anticorps au niveau sanguin) ce qui n’empêche pas l’entrée des pathogènes dans notre corps. La voie muqueuse nez/bouche/gorge est une voie intéressante car ces muqueuses sont la porte d’entrée des pathogènes impliqués dans le cas de la grippe. Il a été décrit dans la littérature scientifique que la vaccination par cette voie peut permettre l’induction d’une double protection immunitaire dans le sang et dans les muqueuses, et ainsi diminuer le risque d’infection et de transmission du virus. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer et de comparer la réponse immunitaire vaccinale dirigée contre le virus de la grippe après vaccination par voie muqueuse : la muqueuse sublinguale ou la muqueuse nasale. Un rappel vaccinal sera pratiqué par injection pour réactiver la réponse immunitaire et l’amplifier. Ces paramètres seront étudiés sur des souris de deux âges différents (8 semaines et 16 mois) afin de mesurer l’efficacité de différents candidats vaccins sur des animaux vieillissant. En effet, les personnes âgées sont une population particulièrement à risque dans les cas d’infection par le virus de la grippe. L’objectif au long terme de ce projet est d’élaborer un vaccin capable d’induire une immunité durable dans le sang et les muqueuses à la fois chez les individus jeunes et âgées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices scientifiques du projet concernent majoritairement la compréhension des mécanismes de la réponse immunitaire vaccinale au niveau des muqueuses, en fonction de l’âge et des différents candidats vaccins étudiés. Le bénéfice majeur du projet à long terme est le développement d’un vaccin à administration muqueuse qui réduira drastiquement l’infection et la transmission des virus respiratoires. En cas de succès, ce projet sera étendu à d’autres virus respiratoires (SARS-Cov-2, Virus Respiratoire Syncytial…).

Procédures

Ci-dessous, la liste des interventions réalisées sur l’animal à chaque étape du projet : - L’identification : le marquage sera réalisé sur l'animal anesthésié par de petites entailles au niveau sur les bords des oreilles (1 fois/animal, durée : 1 minute). - Les administrations par voie sublinguale sont des actes induisant une douleur légère mais pouvant générer un stress supplémentaire pour l’animal notamment par la contention. Nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie gazeuse (3 fois/animal, durée : 15 minutes). - Les administrations par voie intranasale sont des actes induisant une douleur légère mais pouvant générer un stress supplémentaire pour l’animal notamment par la contention. Nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie générale (3 fois/animal, durée : environ 30 minutes). - Les injections par voie sous-cutanée sont des actes induisant une douleur légère et ne nécessitant pas d’anesthésie au préalable (1 fois/animal, durée : 5 minutes). - Le prélèvement sanguin à l’œil est un geste qui dure 30 secondes maximum. Ce geste est une technique pouvant induire une douleur modérée et un stress supplémentaire à l’animal, notamment par la contention. Nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie générale additionnée d’une anesthésie locale (1 à 9 fois/animal, durée : 5 minutes). - Les prélèvements de salive et du mucus nasal nécessitent une trachéotomie et une immobilisation de l’animal. Pour ces raisons, nous réaliserons ces prélèvements en phase terminale sous analgésie et anesthésie (1 fois/animal, durée : 40 minutes).

Impact sur les animaux

- Identification des animaux : ce geste d’inconfort peut entrainer la fragilisation de l’oreille et augmenter les risques de blessure en cas de combats. - Prise de température : la prise de la température au niveau de l’abdomen nécessite une contention pouvant générer un stress chez l’animal. - Administration sublinguale et intranasale : ces gestes seront réalisés sur l’animal anesthésié et peuvent induire un inconfort léger après leur réveil. - Injection en sous-cutané et dans l’abdomen : ces gestes seront réalisés sur animaux vigiles et sous contention pouvant générer un stress chez l’animal. - Immunisation : Une petite fièvre passagère est envisageable après les vaccinations. - Prélèvement de sang en rétro-orbitaire : Ces prélèvements sont réalisés sous anesthésie et peuvent induire des lésions au niveau de l’œil ainsi un inconfort léger après leur réveil. - Vieillissement des animaux : pour les expériences concernant les animaux de 16 mois, les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 8 semaines et seront hébergées jusqu’à un âge maximal de 22 mois. Cette durée prolongée d’hébergement peut être la source de stress et d’anxiété chez l’animal pouvant entrainer divers symptômes liés au vieillissement (alopécie, hypothermie, blessure liée au combat…). Pour éviter cela, une surveillance hebdomadaire et un enrichissement de l’environnement sera appliqué.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin de procédure pour procéder à des prelèvements d’organes et de quantités importantes de fluides (sang, mucus).

Remplacement

Avant l’utilisation des candidats vaccins sur l’animal, des études de toxicité et de réponse inflammatoire ont été menées sur des cultures cellulaires épithéliales et immunitaires. De manière générale, la vaccination repose sur la mise en place d’une réponse immunitaire faisant appel à l’ensemble des organes lymphoïdes, dont les ganglions lymphatiques et la rate, et dans différents organes ciblés. Le recours à l’animal est donc incontournable, nous n’avons donc pas d’autre solutions que d’utiliser l’animal dans son entier pour étudier la réponse immunitaire de nos candidats vaccins.

Réduction

Dans l’ensemble, le nombre d’animaux utilisé a été réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet et la significativité statistique des expérimentations. Il a été évalué pour 5 ans à 1020 souris. Pour les 3 procédures, des groupes de 10 souris/lot ont été calculés pour répondre à l’objectif. Les analyses se feront avec des statistiques classiquement décrites pour les études vaccinales. Un choix restreint de groupes expérimentaux a été fait après sélection de candidats vaccins in vitro. Les temps de chaque procédure ont été sélectionnés d’après nos précédentes expériences et par la littérature scientifique pour se focaliser uniquement sur les 3 temps d’analyses les plus pertinents. Nous avons également réduit le nombre d’animaux contrôles au strict minimum : 10 animaux contrôles « naïf » pour chaque âges (8 semaines et 16 mois) soit deux groupes par procédure. C’est-à-dire que dans chaque procédure, tous les groupes expérimentaux se réfèrent au groupe contrôle du même âge. De plus, selon l’avancée du projet, le nombre d’animaux est susceptible d’être réduit. En fonction des groupes expérimentaux, si les résultats obtenus lors des premières expérimentations ne donnent pas de données robustes, alors les expériences prévues pour les groupes similaires à des temps plus tardifs ne seront pas réalisées.

Raffinement

Dans ce projet, des points limites assez prédictifs ont été établis pour pouvoir anticiper tout stress et souffrance des animaux. Dans l’ensemble du projet, voici les mesures appliquées afin de limiter la souffrance et le stress des animaux : - De l’enrichissement du milieu sera appliqué dès la réception de animaux. - Une période d’acclimatation d’une semaine dans l’animalerie sera respectée après la réception des animaux. - L’identification individuelle des animaux sera réalisée grâce à des petites entailles au bord de l’oreille (moins sensible) et sous anesthésie générale. - La période de vieillissement (de 2 à 16 mois) sera ponctuée par des observations et des pesées hebdomadaires, additionnées à partir de 15 mois de mesures de la température corporelle. - Les administrations sublinguales et intranasales se feront sous anesthésie générale. - Les prélèvements sanguins et des mucus se feront sous analgésie et anesthésie générale. - Après chaque anesthésie, le bon réveil des souris sera vérifié (mouvement de la souris, comportement, prise de boisson ou de nourriture, etc) avant de les renvoyer dans leur pièce d’hébergement. - Un suivi des animaux à 4h/24h après chaque étape des procédures (identification, immunisations, prélèvements) et/ou au moins une fois par semaine sera réalisé. Ce suivi comprend : la réalisation d’une pesée de l’animal et l’observation de l’activité/comportement (isolement, dos vouté, etc…), des modifications physiques (inflammation/rougeur au niveau des sites d’administration : gueule/langue, museau ou abdomen) et des modifications végétatives (respiration anormale). En complément, une prise de la température de l’animal sera effectuée, à 24h après chaque immunisation afin de détecter d’éventuelle montée de température. Concernant les souris âgées de plus de 16 mois, une prise de la température sera aussi réalisée au moins une fois par semaine afin de détecter une éventuelle hypothermie. - En cas de perte de poids importante, de la nourriture se mise à disposition au sol dans la cage. - En cas de variation importante de la température, une nouvelle mesure sera effectuée toutes les 24h et des moyens seront mis en œuvre pour la rétablir (anti-inflammatoire, armoire chauffante). - En cas de lésion cutanée, une pommade nettoyante et cicatrisante sera appliquée sur la zone et si besoin un isolement de l’animal sera effectué.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris qui sont un modèle très adapté aux études de l’immunité car il existe beaucoup d’outils biologiques d’analyses de la réponse immunitaire chez la souris, qui est bien caractérisée. Les souris seront utilisées à partir de 10 semaines de vie, ce qui correspond à un jeune adulte avec une système immunitaire mature. De plus, la lignée choisie présente des caractéristiques immunitaires proches de l’humain. Cette faculté est primordiale pour l’analyse de candidat vaccin. Ces modèles sont essentiels avant de passer à des animaux plus pertinents et proche de l’humain dans un contexte d’infection viral, tel que le primate non humain.

Deux à quatre injections sous anesthésie et un prélèvement de sang qui expose à une infection de l'œil : 566 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort ensuite pour prélèvement d'organes. Elles reçoivent des cellules tumorales, qui forment une tumeur rejetée en quatorze jours, ou une infection virale, afin de comparer les cellules immunitaires mémoires produites dans les deux cas. Les bénéfices annoncés se limitent à une meilleure compréhension du développement d'un cancer. L'effectif de 566 animaux n'est justifié que par un "minimum nécessaire et suffisant" à l'analyse statistique, sans autre précision.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer si une tumeur transitoire, rapidement éliminée de l’organisme par le système immunitaire, est suffisante pour altérer la réponse immunitaire mémoires. Pour cela, les cellules mémoires générées en réponse à un virus ou un tumeur transitoire seront comparées.

Bénéfices attendus

L’objectif est d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes mise en place lors du développement d'un cancer.

Procédures

Chaque animal reçoit : 2 à 4 injections (15 secondes) sous anesthésie / 1 prélèvement sanguin (150 uL) sous anesthésie (10 secondes) / Anesthesie : 3 minutes pour anesthésie gazeuse , 30 minutes pour anesthésique injecté

Impact sur les animaux

Injection intraveineuse de cellules ou prélèvements : possibilité d'infection au niveau de l'oeil (très rare) Infection virale : Aucun signe clinique attendu Injection de tumeur : La tumeur n’est pas métastatique, n’excède pas 200 mm3 et est rejetée par les animaux en 14 jours.

Devenir

Mis à mort pour prélèvements des organes

Remplacement

La réponse immunitaire est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires dans différents organes. Les procédures ne peuvent donc être reproduites in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été defini au minimum nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique des résultats

Raffinement

Une semaine d'acclimatation sera réalisée avant la mise en place de chaque expérience. A la réception, des groupes seront réalisés et maintenus tout au long de la procédure pour créer des groupes sociaux et éviter le stress dû à l'isolement. Tous les traitements/prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie et en condition stérile afin de prévenir tout risque d’infection. Un collyre anesthésique est administré avant chaque prélèvement sanguin en prévention d'éventuelles infections. Des points limites bien définis et suffisament précoces permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris.

Choix des espèces

Le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir utiliser des animaux génétiquement modifiés. Les souris seront âgées de 7-12 semaines au moment de l’immunisation, le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.

Injectées d'acroléine directement dans un ventricule du cerveau, gavées six jours sur sept pendant quatre semaines, puis soumises à des injections quotidiennes dans le nez ou l'abdomen pendant deux semaines, 484 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des tests comportementaux sont annoncés à raison d'un par jour, sans que le RNT dise lesquels. L'objectif est de vérifier si une molécule dérivée d'un polyphénol protège du déclin cognitif un modèle de maladie d'Alzheimer construit par intoxication chimique. Toutes sont tuées à la fin pour analyser leur tissu cérébral.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est la forme la plus fréquente de maladie neurodégénérative associée à une démence chez les sujets âgés. L'élaboration et la mise sur le marché de nouveaux traitements pour lutter contre ce fléau est un défi sanitaire et économique majeur. Le stress oxydant induit par de nombreux facteurs environnementaux (notamment l'exposition à des polluants chimiques) est un évènement extrêmement précoce et jouant un rôle majeur dans la maladie. En effet, l’oxydation des lipides et du glucose favorise l’accumulation d’espèces carbonylées réactives (ECR, stress carbonylé) dont la réaction avec les acides aminés entraîne des modifications et pertes de fonctions irréversibles des protéines cellulaires. Parmi les molécules capables de combattre ce phénomène, les polyphénols, métabolites secondaires du règne végétal, présents dans de nombreux fruits et légumes de notre alimentation, ont été largement étudiés. L'obstacle majeur à l'utilisation de ces composés en thérapeutique est leur très faible biodisponibilité. Pour contourner ce problème, une équipe de chimistes a synthétisé un composé capable de réduire à la fois le stress oxydant et le stress carbonylé. Un polyphénol naturel, le phloroglucinol (Phloro) a été modifié chimiquement afin de pouvoir piéger les espèces responsables du stress carbonylé. Afin d’augmenter sa biodisponibilité, le phloroglucinol modifié a ensuite été couplé à un acide gras à longue chaîne (DHA) pour donner le Phloro-OiP-DHA. Son activité a été validée in vitro et in vivo dans un modèle murin présentant une dégénérescence des photorécepteurs induite par la lumière. L'objectif de ce projet est de déterminer le potentiel thérapeutique de ce composé dans un modèle de stress carbonylé induit par une exposition chronique à une ECR (l'acroléine), mimant le développement de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra : -de confirmer que l'exposition chronique à l'acroléine, conduisant à l'apparition d'un stress carbonylé, s'accompagne de troubles comportementaux et de neurodégénérescence. -de déterminer le potentiel thérapeutique du lipophénol Phloro-OiP-DHA dans ce modèle. Avec cette étude, nous posons donc l'hypothèse d'un mécanisme reliant le stress carbonylé aux processus neurodégénératifs asssociés à la maladie d'Alzheimer, et en particulier ceux associés à la formation des dépôts amyloïdes et l'hyperphosphorylation de la protéine tau. Ce projet nous permettra d'en appréhender les mécanismes biochimiques sur le long terme et de tester le potientiel thérapeutique d'une molécule ciblant le stress carbonylé, le Phloro-OiP-DHA.

Procédures

Les animaux, en fonction de leur groupe, pourront être soumis à : -un gavage quotidien pendant 4 semaines (6j/7) -une injection intracérébroventriculaire d'acroléine -des injections intrapéritonéales ou intranasales quotidiennes pendant 2 semaines - des tests comportementaux (un test par jour) - ils seront euthanasiés en fin de projet.

Impact sur les animaux

La dose d'acroléine utilisée est basée sur des travaux précédemment publiés . Les animaux seront observés quotidiennement afin d'évaluer les potentiels effets indésirables. L'inconfort lié au traitement peut provenir de la répétition quotidienne du gavage pendant 4 semaines et/ou des administrations intranasales pendant 2 semaines. Ces administrations seront toutefois effectuées par une personne qualifiée et après une période d'habituation à l'expérimentateur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de pouvoir procéder à des analyses biochimiques et immunohistologiques du tissu cérébral.

Remplacement

De manière générale, il est aujourd’hui très difficile en neurosciences d’étudier le fonctionnement du cerveau sur des modèles simplifiés (in vitro ou in silico) et donc de remplacer l’étude sur l’animal dans sa globalité. En effet, il n'existe pas de modèles alternatifs (in vitro ou in silico) validés pour étudier la neurodégénérescence et le déclin cognitif dans leur globalité. Il est primordial d’avoir des circuits neuronaux in vivo associés aux cellules gliales et vasculaires, pour caractériser les modifications moléculaires liées à la maladie d’Alzheimer d’un point de vue spatiotemporel. Les modèles utilisés sont acceptés, bien documentés, et très utilisés par la communauté des neurosciences.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum pour répondre aux objectifs du projet. Le nombre d'animaux dans chaque groupe, ainsi que le nombre de groupes est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe et a été déterminé par une analyse de puissance statistique basée sur nos études précédentes. Pour les analyses comportementales, histologiques et biochimiques, les tests seront de type non appariés, paramétriques sur les moyennes à variances égales ou différentes suivants les résultats des analyses précédentes. Ici, 10 animaux par groupe seront nécessaires pour observer d’éventuels changements. A ce nombre d’animaux une marge de 10% sera ajoutée afin de compenser les aléas expérimentaux.

Raffinement

Afin de minimiser les effets du stress qui pourraient fausser les résultats (en particulier sur les analyses comportementales), mais également de contrôler l’état général des animaux, les souris seront manipulées chaque jour par l’expérimentateur en charge de l’expérience, avant la procédure expérimentale. Tous les incidents et toutes observations anormales (comportement, poids, pelage, plaie,…) seront transmis à l’expérimentateur afin d’être traités dans les plus brefs délais et seront notés dans un tableau de suivi expérimental.

Choix des espèces

Il s'agit d'une espèce de choix au niveau international pour l’étude de la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer. Ces études chez l’animal vigile sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements potentiels. De plus, l'utilisation d'animaux transgéniques (modèle Alzheimer) justifie également le choix de cette espèce. La maladie d'Alzheimer étant une maladie se déclarant chez l'adulte voire la personne âgée, les animaux seront utilisés et sacrifiés à l'âge adulte (6 mois). De plus, la caractérisation du modèle de souris transgéniques a déjà été effectuée dans notre laboratoire et nous avons montré que : -les déficits comportementaux commencent à partir de 3 mois -les modifications biochimiques (augmentation de la charge amyloïde, de la phosphorylation de la protéine tau, principaux marqueurs de la maladie d’Alzheimer) et histologiques (formation des plaques amyloïdes) sont visibles à l’âge de 6 mois

Pour établir le rôle d'une enzyme dans la résistance des mélanomes aux traitements, 1 728 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous la peau ou dans les poumons une greffe de cellules de mélanome, puis un gavage trois fois par semaine pendant cinq semaines ou des injections d'immunothérapie, avec un suivi de la rechute jusqu'à trois mois. Les tumeurs peuvent s'ulcérer et se nécroser, le gavage peut léser l'œsophage, et toutes les souris sont tuées pour prélever les tissus tumoraux. Le porteur conclut qu'en l'absence de système artificiel reproduisant l'environnement d'une tumeur, la souris constitue "un modèle sans alternative".

Objectifs

Le mélanome est un cancer de la peau qui reste difficile à traiter malgré les progrès récents grâce aux thérapies ciblées et aux immunothérapies. Globalement, plus de 50% des patients ont besoin de traitements supplémentaires, justifiant le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. La fonction des enzymes appelées déubiquitinases dans la réponse des mélanomes aux thérapies actuelles est très mal connue. Dans ce contexte, l’objectif du projet est de montrer l’importance de certaines enzymes comme RPN11 dans la réponse et la résistance thérapeutique des mélanomes.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra d’apporter la preuve de concept pré-clinique de l'importance de l’enzyme RPN11 dans la réponse des mélanomes aux thérapies ciblées et aux immunothérapies (bénéfices à court terme). A plus long terme, notre projet doit permettre d’identifier de nouveaux biomarqueurs de la réponse des patients aux thérapies actuelles ainsi que de nouvelles cibles thérapeutiques pour développer des stratégies innovantes permettant de combattre le mélanome métastatique résistant.

Procédures

Pour les greffes sous-cutanées, les animaux sont anesthésiés et reçoivent sur un flanc une injection de cellules de mélanome (1 minute/animal). La croissance des tumeurs est suivie trois fois par semaine par mesure au pied à coulisse (1 minute/animal) jusqu'à 3 mois après le début du traitement pour suivre la rechute tumorale. Pour les greffes pulmonaires, les animaux sont anesthésiés puis injectées avec des cellules de mélanome bioluminescent (1 à 2 minutes/animal). La croissance des tumeurs est suivie par analyse de la bioluminescence sur les animaux anesthésiés le jour de l’injection puis une fois par semaine pendant le traitement (durée de l'analyse 30 min/groupe d'animaux). L’expérience est poursuivie jusqu’à 12 semaines après le début du traitement pour suivre la rechute tumorale. Une partie des souris reçoivent les traitements par gavage oral (1 minute/animal). L’administration des substances se fait trois fois par semaine pendant 5 semaines. Une autre partie des souris sera traitée par l’immunothérapie par injection en intrapéritonéale (1 minute/animal) à raison de 3 injections pendant 1 semaine.

Impact sur les animaux

- Ulcération/nécrose des tumeurs sous-cutanées - Les injections intrapéritonéale peuvent provoquer une inflammation locale - Perte de poids anormale suite au traitement - Risque de lésion de l’œsophage lors du gavage oral.

Devenir

Dans tous les cas, à la fin de l’expérience ou lorsque les points limites sont atteints, il est nécessaire de prélever post-mortem les tissus tumoraux afin de réaliser des analyses complémentaires permettant de confirmer l’intérêt des cibles thérapeutiques identifiées. Tous les animaux sont donc mis à mort et ne seront pas réutilisés.

Remplacement

Dans le cadre du remplacement, nous avons réalisé un certain nombre d'expériences in vitro qui ont permis de déterminer les conditions optimales pour cibler l’enzyme RPN11 dans le mélanome. Cependant, en l’absence de système artificiel pouvant reproduire in vitro l’environnement complexe d’une tumeur, il est nécessaire de confirmer nos résultats dans des modèles pré-cliniques de réponse thérapeutique chez la souris. La combinaison de nos modèles permettra d’apporter une solide preuve de concept in vivo de l'importance de RPN11 pour l’amélioration des thérapies ciblées et des immunothérapies. En ce sens, le modèle murin constitue un modèle sans alternative pour les études pré-cliniques visant à valider de nouvelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Nos études sont réalisées dans le souci d'utiliser un nombre minimum d'animaux sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre d'animaux nécessaires au projet a été calculé au plus juste afin d’obtenir des résultats exploitables. Le recours à des techniques d'imagerie non invasive réduit de façon importante le nombre d’animaux nécessaires dans chaque groupe expérimental. Dans tous les cas, les tissus tumoraux sont prélevés post-mortem à la fin de l’expérience afin de réaliser des analyses complémentaires permettant de valoriser au mieux les expériences chez la souris.

Raffinement

Nous hébergerons les animaux dans des conditions enrichies d’hébergement prenant en compte leur bien-être et de soins afin de réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable. L’hébergement et la manipulation en condition stérile permettra d’éviter toute contamination des animaux. Les souris seront observées quotidiennement et très attentivement par du personnel qualifié pour permettre la détection très précoce des signes de souffrance ou de mal-être, une réaction immédiate si le point limite est atteint, et une surveillance accrue en cas de doute. Le personnel participant à ce projet maîtrisent les expériences de greffe et les modes d'administration des drogues. Les transplantations de mélanome réalisées sont bien supportées par les animaux. Afin de réduire le stress ou la souffrance éventuelle, une anesthésie est effectuée avant les injections. Le risque d'inflammation associée aux injections intrapéritonéales est diminué en alternant les sites d'injection ou en privilégiant l’administration des drogues par gavage oral. Le gavage est amélioré par l’utilisation d’une canule courbée terminée par une olive qui permet de minimiser le risque de lésion de l’œsophage. Tout changement de comportement significatif, modification physique, variation anormale de poids ou signes de douleur conduiront à l’euthanasie des souris. Si des ulcérations des tumeurs sont observées, la tumeur est traitée avec une solution antiseptique jusqu'à la résolution de la plaie. L’ensemble de ces procédures nous permettra d'intervenir au plus tôt en cas de souffrance des animaux dans les phases avancées de la maladie.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale relativement proche de l’homme, systématiquement utilisée dans les études précliniques visant à étudier l'efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. De plus, la souris présente plusieurs avantages comme un cycle de vie relativement court et une natalité importante. Nos expériences seront réalisées sur des modèles de souris permettant d'éviter le rejet des greffes de cellules tumorales humaines et sur des modèles de souris permettant d’étudier la réponse immunitaire contre la tumeur. En l’absence de système artificiel pouvant reproduire in vitro l’environnement complexe d’une tumeur, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour mener à bien ce projet. Les expériences de greffes de mélanome seront réalisées sur des animaux âgés de 6 semaines, un âge auquel la prise tumorale est particulièrement efficace d'après les données de la littérature. Les souris sont commandées à l'âge de 5 semaines. A leur arrivée, elles sont acclimatées pendant une semaine à l'animalerie avant d'être utilisées.

58 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une colite est provoquée chez elles par traitement, avec inflammation de l'intestin et perte de poids possibles, et chacune subit cinq injections intrapéritonéales et six pesées. Le porteur indique que les données obtenues hors de l'animal ne suffisent pas, faute d'y retrouver le système immunitaire et les facteurs circulants. Le bénéfice annoncé se limite à identifier "potentiellement" des cibles thérapeutiques pour les troubles digestifs liés au stress.

Objectifs

Le système nerveux entérique (SNE) régule la motricité digestive et les fonctions de la barrière épithélio-intestinale. Il est admis que le stress altère l’axe cerveau-intestin et contribue à un large éventail de troubles gastro-intestinaux, incluant le syndrome de l’intestin irritable. La survenue d’évènements stressants ou traumatisants affecte les fonctions digestives, qui en pratique se manifestent par des flatulences, des douleurs abdominales, plus ou moins associées à une accélération ou à une diminution de la vidange gastrique. La réponse biologique au stress implique l’activation de l’axe hypothalamo-hypophysaire-surrénalien, initiant une sécrétion de glucocorticoïdes. Bien que la synthèse de glucocorticoïdes ait lieu principalement au niveau des glandes surrénales, il a été décrit de nombreux autres sites de production, associés à une action locale des glucocorticoïdes via le récepteur aux glucocorticoïdes. Dans l’intestin, le système nerveux exprime le récepteur des glucocorticoïdes ainsi que l’enzyme responsable de leurs synthèses. Une étude préliminaire in vitro de notre équipe de recherche a permis de mettre en évidence une synthèse de corticostérone par le système nerveux entérique et une augmentation de la synthèse de corticostérone en conditions inflammatoires. De plus, des modifications de l’expression de protéines impliquées dans l’activité neuronale ont également été mises en évidence en conditions inflammatoires et lorsqu’on bloque l’effet des glucocorticoïdes. L’objectif de ce projet est d’étudier comment l’inflammation module le système nerveux entérique in vivo, et si les conséquences fonctionnelles de l’inflammation passent par l’action des glucocorticoïdes.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre les mécanismes de la synthèse locale des glucocorticoïdes au niveau de l’intestin afin de pouvoir potentiellement identifier des cibles thérapeutiques pour améliorer les troubles digestifs intestinaux liés au stress et à l’inflammation.

Procédures

Pesée quotidienne des animaux – 10 sec sur la balance – 6 au total Contention + injection intrapéritonéale – 30 sec – 5 au total

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent avoir une inflammation des intestins à l’issue du traitement et cela peut générer une perte de poids. Ils peuvent également avoir peur au moment des injections intrapéritonéales.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus d’intérêt (tube digestif) pour analyser les échantillons ex vivo.

Remplacement

Les données préliminaires obtenues dans un modèle ex vivo ne sont malheureusement pas suffisantes pour extrapoler les résultats obtenus à un individu entier. Plusieurs acteurs comme le système immunitaire et la présence de facteurs circulants sont absents de nos modèles ex vivo. C’est pourquoi il n’est pas possible de remplacer ce modèle d’induction de colite aigüe par un modèle ex vivo ou in vitro.

Réduction

Nous avons calculé le nombre d’animaux minimum nous permettant d’obtenir des résultats statistiquement interprétables (n=9 pour une augmentation de 40 % de la production de corticostérone). Pour s’assurer de la réussite de ce projet, nous avons prévu un lot d’animaux « pilote » de 10 souris qui permettra de valider les expérimentations in vitro sur les échantillons issus de nos animaux. Comme une partie des animaux va recevoir une injection intrapéritonéale d’antagoniste et que ce type d’injection peut rater malgré un personnel compétent, nous avons prévu un lot supplémentaire (n=3 par groupe) qui sera réalisé seulement si certains animaux doivent être exclus. L’utilisation d’un tel nombre (58 au total) devrait nous éviter de devoir répéter l’expérience.

Raffinement

Les souris seront au maximum 5 par cages et de l’enrichissement (frisottis, tubes) sera placé dans les cages leur permettant de déchiqueter, de jouer et de se cacher. Elles seront également surveillées quotidiennement à l’animalerie avant et pendant la procédure expérimentale, y compris le week-end. Les souris seront habituées à la présence de l’utilisateur grâce à une manipulation régulière pour limiter le stress lors des expérimentations. Nous avons également défini des points limites à nos expérimentations pour évaluer le bien-être de nos animaux et prendre en charge la douleur si elle a lieu.

Choix des espèces

La colite expérimentale provoquée par le traitement chez les rongeurs est un modèle reconnu d’affections inflammatoires chroniques humaines. La souris représente un très bon modèle d’étude (plus petit) et est plus adapté à nos besoins qu’un modèle rat et nous permettra de faire un parallèle avec l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 10 semaines) puisque ce projet s’intéresse à la régulation de la production de glucocorticoïdes à l’âge adulte.

48 souris rendues obèses par un régime gras vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune subissant 26 pesées, 12 injections dans l'abdomen, 39 injections sous la peau, cinq prises de sang et deux séjours de 96 heures en cage de mesure. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, et les souris sont hébergées seules pendant toute l'étude, ce que le porteur reconnaît comme une nuisance pour une espèce sociale. Un jeûne de quatre heures précède chaque prise de sang, et l'obésité elle-même réduit leur capacité de mouvement. L'étude est menée pour un client, à un stade précoce du développement d'un candidat médicament anti-obésité, avec la perspective déclarée d'une mise sur le marché.

Objectifs

Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un candidat médicament de notre client et vise à tester son efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse, en administration seule ou combinée avec un autre composé anti-obésité déjà autorisé sur le marché. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament sur l'appétit, les dépense énergétiques et, en conséquence, sur le poids corporel du modèle d'obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieures molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (26 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de véhicule ou du candidat médicament par voie intrapéritonéale (12 administration; durée de la mesure : 1 minute); 3) Administrations de véhicule ou de sémaglutide par voie sous-cutanée (39 administrations; durée de la mesure : 1 minute); 4) Analyse non invasive de composition corporelle (5 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 5) Prélèvements sanguins (5 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 6) Mesures de dépenses énergétiques (2 sessions de mesures de 96h); 7) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).

Impact sur les animaux

De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements intrapéritonéaux et sous-cutanés, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs aiguës et de stress. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe témoins non obèse a été réduit à 8 animaux, contre 10 pour les groupes expérimentaux constitués de souris obèses, compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genres.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par voie intrapéritonéale et sous-cutané seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J nourris avec une alimentation enrichie en graisses (45% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 20 semaines (28 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une pèriode de 14 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur.