Souris
Elevage de souris transgéniques utilisées pour l’étude des syndromes myélodysplasiques, maladies avec un développement anormal des cellules du sang et pouvant progresser en leucémies (cancer du sang).
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Tuées quand elles ne portent pas la mutation recherchée, quand elles sont trop âgées pour la reproduction ou quand elles n'ont plus donné de portée depuis deux mois, même sans aucun signe de mal-être, 8 500 souris vont être utilisées dans un élevage de six lignées génétiquement modifiées. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. À trois ou quatre semaines, l'extrémité de la queue de chaque petit est coupée aux ciseaux pour vérifier la présence de la mutation, et certaines lignées développent des tumeurs à partir de deux mois. L'établissement affirme que seul un animal vivant et entier permet d'étudier la réponse immunitaire, et présente ce projet comme la fourniture d'animaux à d'autres protocoles déjà autorisés.
Objectifs
Les syndromes myélodysplasiques (SMD) marquent une étape préalable à la leucémie, caractérisée par une moelle osseuse défaillante qui entraine une production insuffisante de cellules sanguines saines. Lorsque des mutations génétiques perturbent le renouvellement, la multiplication et la maturation des cellules souches (= cellules à l'origine de toutes les cellules du sang) dans la moelle osseuse, cela conduit à la leucémie myéloïde aigue (LAM). Parmi les mutations décrites dans la littérature scientifique, nous nous intéressons tout particulièrement à deux d'entre elles pour lesquelles nous disposons de souris génétiquement modifiées (modifications génétiques reproduisant celles observées chez les patients atteints de ce type de cancer). Notre projet consiste à identifier (mise en place d'une boucle numérotée à l'oreille) et à vérifier la présence des modifications génétiques chez ces souris afin de disposer d'animaux pouvant ensuite être inclus dans des projets de recherche faisant l'objet d'une autorisation délivrée par les instances.
Bénéfices attendus
Les modèles murins utilisés sont essentiels pour comprendre les mécanismes impliqués mais aussi pour évaluer le développement de nombreuses pathologies comme dans notre projet SMD/LAM. Cela pourrait nous permettre d’ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques en testant des drogues et ce, pour aider les patients souffrant de ces maladies souvent encore incurables.
Procédures
Ce projet consiste en l'élevage de 6 lignées de souris génétiquement modifiées. Afin de caractériser les souris, issues des différents croisement, exprimant les gènes modifiés, l’extrémité de la queue (moins de 5 mm) sera coupée à l’aide de ciseaux fins, parfaitement aiguisé et préalablement désinfectés. Ce geste, réalisé à l'âge de 3-4 semaines, est très rapide et ne dure pas plus de quelques secondes. Ce fragment de tissu permettra d'obtenir l'ADN de la souris et ainsi s'assurer de la présence de la mutation génétique d'intérêt. Certaines lignées de souris peuvent développer des tumeurs (à partir de l'âge de 8-9 semaines). Nous réaliserons donc un suivi clinique une fois par semaine afin de détecter l'apparition de ces pathologies, se caractérisant par un affaiblissement général de l'animal.
Impact sur les animaux
L’incision de l’extrémité de la queue (moins de 5mm) nécessite une contention de courte durée, pouvant entrainer un stress, et peut conduire à une légère perte de sang. Une partie des animaux génétiquement modifiés peuvent développer (à partir de l'âge de 8-9 semaines) des tumeurs conduidant à un affaiblissement général.
Devenir
Les animaux comportant la mutation d’intérêt seront utilisés pour de la reproduction, le prélèvement de tissus post- mortem ou seront utilisés dans d’autres procédures expérimentales validées et autorisées par le comité d’éthique et le ministère. Les animaux ne comportant pas la mutation d’intérêt ou trop âgés (pour être utilisées en accouplement ou incluses dans un protocole de recherche) ou n'ayant plus donnés de portées depuis 2 mois seront euthanasiés, même s'ils ne présentent pas de signes de mal-être. Les souris seront euthanasiées de manière anticipée si elles présentent des signes de souffrance. Les souris incluses dans un projet de recherche seront euthanasiées à l'issue des procédures expérimentales, conformément au protocole autorisé.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans sa globalité la réponse immunitaire et l’effet des traitements sur la réponse anti tumorale, ainsi que les relations entre les différentes cellules dans un contexte physiologique ou pathologique. Cela est impossible à reproduire in vitro (dans des cultures de cellules) en raison de la complexité des interactions entre les différents types de cellules jouant un rôle dans le développement et la progression de la maladie.
Réduction
Nous connaissons bien l'ensemble de ces lignées (nombre et taille des portées), ce qui permet de gérer les élevages de façon raisonnée. Nous avons déterminé le nombre de souris inclus dans ce projet afin de ne produire que le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de nos projets de recherche.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, afin d'éviter qu'elles soient contaminées par des agents pathogènes. Elles sont maintenues en groupe dans un environnement enrichi (présence de tunnel en carton, papier kraft pour faire des nids et buchettes en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé afin de détecter des signes de mal-être, en s’appuyant sur l’évaluation visuelle de différents paramètres (comportement, apparence physique, blessures). Différentes actions seront mises en place allant de l’ajout de nourriture dans la cage à l’euthanasie anticipée de la souris. Pour les souris pouvant développer une pathologie (type cancer), la surveillance sera renforcée par un suivi clinioque hebdomadaire afin de détecter de manière anticipée l'affaiblissement de l'animal. Les souris seront utilisées autant que possible avant l'âge d'apparition de la maladie. Après coupure de l'extremité de la queue de la souris, nous surveillerons qu'il n'y a pas de saignement et dans le cas contraire, un point de compression sera fait pour favoriser la coagulation.
Choix des espèces
L'utilisation de ces différentes lignées de souris génétiquement modifiées pour l’étude des SMD/LAM est largement décrit dans la littérature scientifique. Ces modèles sont robustes et reproductibles et leur élevage permettra d'inclure ces souris dans des projets de recherche permettant de mieux comprendre le développement de ces maladies et de trouver de nouvelles pistes de thérapie. Les souris seront mises en accouplement à l'âge adulte (8 semaines), stade qui correspond à leur maturité sexuelle. Le sevrage, l’identification et le prélèvement de tissu en vue de l’analyse génétique seront réalisés entre 3 et 4 semaines.
Rôle des cellules des vaisseaux sanguins dans la survie et le maintien des monocytes en condition physiologique et inflammatoire
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Irradiées puis greffées de moelle osseuse par une injection dans la veine située derrière l'œil, saignées jusqu'à sept fois à la veine de la mâchoire, 240 souris vont être utilisées dans des procédures dont le niveau de souffrance va de léger à sévère. Soixante d'entre elles reçoivent un agent inflammatoire par voie intraveineuse avant une série de prélèvements étalés sur une semaine, et l'irradiation laisse leur système immunitaire incomplet pendant quinze jours. Le projet cherche à établir quels facteurs produits par les parois des vaisseaux maintiennent en vie les monocytes du sang, avec l'espoir déclaré de retombées sur les maladies cardiovasculaires. Toutes sont tuées à la fin des procédures pour prélever le sang et les organes.
Objectifs
Les monocytes sont des cellules immunitaires présentes dans le sang qui surveillent et préservent la santé des vaisseaux sanguins. Leur travail consiste à se fixer aux parois des vaisseaux pour éliminer les cellules mourantes et prévenir l'accumulation de débris ou de graisses. Les monocytes se caractérisent par leur mouvement constant, dû à leur localisation dans le sang, soulevant des interrogations sur les signaux nécessaires à leur survie. Grâce à des modèles murins innovants, nous avons découvert que des facteurs de croissance, qui sont des substances produites par les cellules et qui stimulent la croissance, la différenciation, ou la survie d'autres cellules, dérivés des cellules constituant les vaisseaux sanguins sont indispensables au maintien des monocytes dans la circulation sanguine. De plus, nous avons constaté que lorsque les monocytes se fixent aux vaisseaux sanguins, ils sont mieux à même de capter ces facteurs de croissance. Cette étude vise à clarifier par quel mécanisme (prolifération, différenciation, ou la survie) ces facteurs de croissance influent sur le nombre de monocytes dans le sang. Bien que notre attention se soit principalement portée sur le rôle physiologique des facteurs produits par les vaisseaux sanguins, l’un de nos autres objectifs est également de comprendre leur rôle dans la réponse des monocytes à l'inflammation.
Bénéfices attendus
Les monocytes sont fortement associés au développement de pathologies cardio-vasculaires. Par exemple, les souris déficientes en monocytes souffrant d’athérosclérose présentent des vaisseaux plus endommagés que leurs homologues contrôles. Notre étude sur les mécanismes régissant la survie des monocytes vise à mieux contrôler leur nombre dans certaines pathologies dans lesquelles leur présence (ou leur absence) serait bénéfique. En outre, ce projet va générer de nouveaux modèles murins pour manipuler les monocytes, ce qui est essentiel pour étudier leur rôle dans des contextes pathologiques et homéostatiques. Enfin ce projet met en évidence les voies moléculaires mises en jeu dans l’interaction entre les endothéliums et les monocytes. La manipulation de ces voies pourrait contrôler le développement de certaines maladies cardio-vasculaires, aboutissant in fine à la découverte de nouvelles voies thérapeutiques immunomodulatrices.
Procédures
Procédure 1 : - 20 souris vigiles recevront une injection d'anesthésique, puis seront irradiées partiellement pendant 8 min et recevront une injection intraveineuse via la veine située derrière l’œil de cellules de moelle osseuse. - 40 souris vigiles seront complètement irradiées, puis anesthésiées afin de recevoir une injection intraveineuse via la veine qui se trouve derrière l'œil de cellules de moelle osseuse. Procédure 2 : 60 souris anesthésiées recevront du sang par voie intraveineuse par la veine qui se trouve derrière l'œil. Puis 4 prélèvements sanguins à la veine située près de la mâchoire seront effectués à jour 0, 1, 3, 5 et 8 post-injection de sang. Procédure 3 : 40 souris seront injectées pendant 4 jours (1 injection/par jour) avec un facteur de croissance (20 souris) ou avec une solution contrôle (20 souris) Procédure 4 : 60 souris vigiles seront injectées avec un agent inflammatoire par voie intraveineuse par la veine située dans la queue. Puis 7 prélèvements sanguins à la veine située près de la mâchoire seront effectués à jour 0, 1, 2, 3, 4, 5 et 7 post-injection de l’agent inflammatoire. 20 souris vigiles recevront une injection intrapéritonéale l’agent inflammatoire et seront euthanasiées 24h après cette injection.
Impact sur les animaux
-le stress à court terme lié à la contention et aux différentes injections, - Le système immunitaire des souris est incomplet pendant 2 semaines suite à irradiation, ce qui les rendra plus susceptibles aux infections -Des blessures légères ou symptômes d’irritation cutanée sont des effets secondaires de l'irradiation, - Une perte de poids attendue sur 3j liée à l’injection d’un agent inflammatoire
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des différentes procédures afin de prélever le sang total ainsi que les organes dans le but de les analyser.
Remplacement
La complexité des interactions entre les monocytes sanguins et les différents types de cellules composant les vaisseaux sanguins présentes dans l'organisme ne peut par définition pas être reproduite in vitro puisque ces dernières ont lieu dans la circulation sanguine. L'ensemble des modèles murins générés dans ce projet permet d'étudier le maintien des monocytes dans un environnement où seulement quelques sous-types de cellules formant les vaisseaux sanguins ne sont plus capables de produire de facteur de croissance, tandis que le reste de l'organisme est toujours capable de le produire. Ceci permettra d'identifier spécifiquement les sous-types de vaisseaux sanguins impliqués dans la production du facteur de croissance essentiel à la survie des monocytes. D'autre part nous savons que la différentiation, l’identité et les fonctions spécifiques des monocytes dépendant d’une multitude de facteurs produits par les cellules formant les vaisseaux sanguins mais aussi pour les autres types cellulaires de l'organisme. L'utilisation d'un modèle in vitro ne permettrait donc pas de refléter cet environnement complexe et dynamique impliqué dans le maintien des monocytes. Le projet vise également à comprendre quelles sont les conséquences de l'absence de monocytes sur l'organisme. Là encore, seule l’étude d’un animal entier nous permettra d’observer des phénotypes à l’échelle de l’organisme.
Réduction
Afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés et de garantir des résultats exploitables, le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été calculé à l’aide du logiciel statistique. Des tests statistiques appropriés seront utilisés pour les analyses des données.
Raffinement
Les animaux seront examinés quotidiennement afin de vérifier l’apparition éventuelle de douleur/souffrance et veiller à ne pas dépasser des points limites. Les conditions d'hébergement des souris respectent les règles suivantes : - Les cages utilisées peuvent héberger 5 souris adultes. Les souris sont donc élevées en groupes sociaux afin de satisfaire leur instinct grégaire, de favoriser les comportements naturels et limiter l’agressivité. – Les cages seront supplémentées en enrichissement tel que du coton, ou un dôme pour confectionner des nids - Les animaleries bénéficient d'une température régulée, d'une hygrométrie ainsi que d'une photopériode contrôlée. -Les animaleries sont calmes. Par ailleurs, la mise en place de points limites précoces, prédictifs et adaptés à chaque procédure, basés sur une observation quotidienne des animaux, de l’évolution de leur poids, de leur apparence et de leur comportement au cours de chaque procédure permettra de prendre les mesures adéquates pour limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux. L’utilisation d’analgésiques sera également proposée quand cela sera possible et jugé nécessaire.
Choix des espèces
L´espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés, et leur utilisation dans ce projet est nécessaire pour répondre aux questions scientifiques posées. Des animaux âgés de 6 semaines seront utilisés, puisque nous nous intéressons aux monocytes chez l’adulte.
Lésions rénales : Evaluation de l’efficacité de composés chimiques ou biologiques sur les lésions rénales chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 750
Le pédicule d'un rein ou des deux clampé pour couper le flux sanguin, l'uretère gauche ligaturé, ou du cisplatine injecté dans le péritoine : 750 souris et 750 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, 1 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 500 un niveau sévère. Les chirurgies durent jusqu'à deux heures sous anesthésie générale, et souris et rats reçoivent ensuite les composés à tester par voie intranasale, intratrachéale, intramusculaire, intradermique, orale, sous-cutanée ou intrapéritonéale. Le porteur ne décrit qu'une douleur "modérée durant 3 jours environ" après les chirurgies, alors qu'un tiers d'entre eux relève d'un niveau de souffrance sévère. L'effectif de dix rongeurs par groupe peut être porté à vingt si les analyses réclament un volume de prélèvement plus important, le nombre d'individus utilisés suivant ainsi les besoins de la bioanalyse.
Objectifs
L’objectif est de tester l’efficacité thérapeutique de composés chimiques ou biologiques dans des modèles de lésions rénales résultant en des états inflammatoires aigus et chroniques du rein : lésions dues à une ischémie/reperfusion rénale ou à une obstruction urétérale unilatérale causant de la fibrose. En général, la lésion rénale initiale est associée à une insuffisance rénale aiguë (déclin rapide et potentiellement réversible de la fonction rénale), tandis que la fibrose tend à se produire dans le cadre de la maladie rénale chronique. La maladie rénale chronique peut par ailleurs résulter d’une non résolution d’insuffisance aiguë. Chez l’homme, plusieurs agressions initiales peuvent déclencher des lésions rénales. L’objectif de ce projet est de modéliser chez le rongeur deux d’entre elles : l’ischémie-reperfusion (arrêt temporaire du flux sanguin dans un rein ou les deux), et l’obstruction des voies urinaires (uretère). Ces modèles nous permettront de tester des candidats médicaments visant à traiter des patients présentant des lésions rénales. Les lésions d'ischémie reperfusion (IR) rénales sont une cause fréquente d'insuffisance rénale aiguë chez les patients. Aucun traitement spécifique n'est actuellement disponible. Parmi les modèles in vivo existants, le modèle de clampage du pédicule rénal (contenant les vaisseaux sanguins rénaux) chez la souris est couramment décrit dans la littérature et utilisé en raison de l’existence de nombreuses souches de souris transgéniques. Ce clampage temporaire génère une ischémie rénale. Selon l’objectif à atteindre, le clampage peut être réalisé sur un rein (pour mimer une ischémie-reperfusion au cours de la transplantation de l’organe) ou sur les deux reins à la fois (pour mimer une ischémie-reperfusion secondaire à une forte hypotension). Aucun traitement n’existe à ce jour pour la fibrose rénale chez l’homme. Le modèle d'obstruction urétérale unilatérale (UUO) sera utilisé pour modéliser des affections rénales aboutissant à un fibrose rénale. Ce modèle d’obstruction urétérale se caractérise par une dilatation tubulaire, une expansion interstitielle, une perte de masse tubulaire proximale, une hypertrophie, une hydronéphrose, une infiltration de leucocytes, la mort des cellules épithéliales tubulaires et la présence de fibroblastes, qui conduisent tous à une fibrose tubulo-interstitielle progressive.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation mode préventif ou thérapeutique sur les lésions rénales. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces lésions rénales pour laquelle les options sont pour le moment limitées.
Procédures
Les lésions rénales seront induites sur des animaux sevrés de plus de 6 semaines soit ischémie reperfusion unilatérale ou bilatérale rénale ou par ligature de l’uretère gauche soit par administration de cisplatine (intrapritonéale). Les trois procédures chirurgicales auront lieu sous anesthésie générale qui durera au maximum deux heures. Le cisplatine sera administré sur animal vigile (5 min maximum) ou anesthésié (30 minutes maximum). Afin d’évaluer l’efficacité de potentiels traitements sur les lésions rénales, des composés chimiques ou biologiques pourront être administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’au maximum une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie ou en moins de 5 min sur animal vigile; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’au maximum une heure sinon). Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Les études dureront au maximum 2 mois pour les modèles chirurgicaux et au maximum une semaine pour le cisplatine
Impact sur les animaux
La constitution de groupes lors de la randomisation impliquera un remaniement des groupes sociaux qui pourra générer un stress léger durant moins de 3 jours. Les chirurgies pourront générer une douleur modérée durant 3 jours environ compte tenu de l’analgésie prévue. Dans le cas d’administrations par injections ou dans le cas de prélèvements sanguins, ceux-ci génèreront une douleur limitée à celle d’une piqûre d’aiguille.
Devenir
Après les trois procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.
Remplacement
L'étude des mécanismes impliqués ne peut être remplacée par des modèles cellulaires en raison des très nombreux types cellulaires composant le rein et de la complexité des voies de signalisation cellulaire modifiées par l'ischémie reperfusion rénale ou l’obstruction des voies urinaires, à l’origine de fibrose. Ainsi, ce projet ne peut être évalué que dans un modèle in vivo chez l’animal tant pour la compréhension précise de ces phénomènes que pour la mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est réduit au minimum nécessaire pour permettre une analyse statistique fiable des résultats. Dans le cas où des composés auraient besoin d’être testés dans les trois modèles au même moment, les animaux sham seront mis en commun pour ne pas être dédoublés. Sur la base de la littérature, le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure est de 10 animaux par groupe. Cependant, les premières études visant à établir les modèles permettront de modifier au besoin ce nombre, s’il est insuffisant, ou au contraire s’il peut être réduit. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 20 animaux par groupe. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Le nombre d’animaux nécessaire a été validé par une analyse statistique.
Raffinement
Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et analgésique avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermostatée. Une surveillance quotidienne stricte, avec évaluation du réveil et de l’état de santé post-opératoire, permet de détecter rapidement toute complication éventuelle et d’adapter immédiatement la prise en charge, en respect des points limites préétablis, en particulier par un traitement analgésique adapté. Les animaux recevront une analgésie préalable à la chirurgie (buprénorphine au moins 30 minutes avant la chirurgie) et un anesthésique local sera utilisé (SC autour du site d’ouverture chirurgicale au moins 5 minutes avant, et sur le feuillet musculaire avant fermeture de la peau). En cours d’étude, les animaux seront pesés 2 fois par semaine jusqu’à la chirurgie puis tous les jours à partir de la chirurgie. La déshydratation sera évaluée quotidiennement à partir de la chirurgie et les animaux déshydratés seront réhydratés par voie sous cutanée. A partir de la chirurgie, de la nourriture gélifiée sera placée en fond de cage, pendant une semaine Les points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans la procédure. Si la litière venait à se souiller plus rapidement que ce qui est constaté habituellement, la fréquence de change des cages sera augmentée.
Choix des espèces
Ces modèles sont décrits dans la littérature chez le rat et la souris. Les mâles seront privilégiés car leur utilisation est bien décrite dans la littérature. La souris sera privilégiée lorsque l’utilisation de souches génétiquement modifiées est nécessaire. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.
Elevage de lignées de souris immunodéficientes et prélèvements pour génotypage
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système respiratoire
79 950 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacune pour une biopsie d'oreille au poinçon de deux millimètres ou une prise de sang, contention comprise, en une trentaine de secondes. Aucun anesthésique ni analgésique n'est prévu, le porteur estimant la douleur aiguë mais limitée à deux secondes environ. Ces prélèvements servent au génotypage de lignées de souris immunodéficientes élevées en vue d'être utilisées dans d'autres projets, et le porteur indique qu'une méthode non invasive sur poils ou salive sera privilégiée quand elle sera au point. Une partie des souris est gardée vivante selon les génotypes recherchés et les besoins de reproduction, les autres sont tuées faute de génotype utile, en fin de reproduction, ou parce qu'aucune procédure ne les attend.
Objectifs
Il concerne donc toutes les méthodes de prélèvements invasives d’échantillons en vue des génotypages (biopsies oreilles ou prélèvements sanguins) ainsi que l’hébergement de souris immunodéficientes. Le génotypage des animaux est indispensable afin de définir le génotype de chaque individu, ce qui permettra par la suite d’identifier les animaux qui seront utilisés en reproduction ou à des fins scientifiques dans le cadre de projets/procédures de recherche autorisés. A terme, lorsque la technique de génotypage sur échantillon de poils ou salivaire sera mise au point et que cela sera possible techniquement, une méthode non-invasive sera privilégiée.
Bénéfices attendus
Pouvoir fournir des animaux d’intérêts de lignées de souris génétiquement altérées qui seront utilisés dans les différentes procédures expérimentales des projets autorisés. De manière à atteindre les objectifs scientifiques dans les domaines de l’inflammation, du cancer et de l’infectiologie.
Procédures
Biopsies oreilles : animaux vigiles, prélèvement unique, durée de l’intervention moins de 20 secondes (30 secondes avec la pose de la bague) Prélèvements de sang : animaux vigiles, prélèvement unique, durée de l’intervention moins de 20 secondes (30 secondes avec la pose de la bague)
Impact sur les animaux
Les nuisances pouvant être causées aux animaux sont : - le stress lié à la contention (environ 30 secondes) - la douleur, aigue mais de très courte durée, ressentie lors du poinçonnage de l’oreille (environ 2 secondes) ou au point de ponction pour le prélèvement sanguin (environ 2 secondes)
Devenir
Les animaux sont gardés en vie, en fonction des procédures expérimentales en cours, des génotypes d’intérêts ainsi que des besoins en reproduction. Les animaux mis à mort concernent les animaux ayant un génotype ne présentant pas d’intérêt, arrivant en fin de reproduction, n’étant pas inclus dans une procédure expérimentale.
Remplacement
L’utilisation du modèle animal est incontournable dans certains projets des équipes de l'institut. En effet, la nature des travaux qui sont menés imposent le choix du modèle murin, dans la mesure où les processus développementaux étudiés ne peuvent être abordés dans leur complexité physiopathologique dans des lignées cellulaires ou d’autres systèmes in vitro.
Réduction
Une gestion raisonnée des accouplements est mise en place au sein du service de zootechnie. Nous adaptons au mieux le schéma de reproduction en fonction de la spécificité de chaque lignée et/ou des besoins expérimentaux. Cela ayant pour objectif de limiter au maximum la production d’animaux.
Raffinement
Les procédures expérimentales ont été optimisées afin de générer le moins de stress et de douleurs aux animaux. Le personnel étant formé et sensible au bien-être animal et les animaux habitués à la manipulation, le stress engendré lors de la préhension (pince au-niveau de la peau du cou ou tunnel) et de la contention est moins présent. De plus, toutes les mesures sont prises lors des gestes techniques afin de minimiser au maximum les dommages causés aux animaux. Le matériel est adapté à l’espèce et la taille ou le volume de prélèvement est minimisé (poinçon de 2 mm pour la biopsie d’oreilles et volume de 50µl pour le sang). Tous ces éléments font qu’il n’est pas prévu d’utiliser d’anesthésiques volatils, d’analgésique et/ou anesthésique local.
Choix des espèces
Le modèle murin offre plusieurs avantages : 1) sa génétique est bien connue ce qui permet une certaine souplesse dans le choix du fond génétique approprié aux questions posées, 2) il existe de nombreuses lignées mutantes permettant des analyses génétiques et développementales fines, 3) le fonctionnement de son système immunitaire est relativement bien connu et est à maints égards semblable au système immunitaire humain. Les animaux seront prélevés au sevrage soit entre 21 et 27 jours pour les biopsies d’oreilles et à partir de 28 jours pour les prélèvements sanguins.
Evaluation de nouveaux candidats LNP-V dans différents modèles précliniques de tumeurs ectopiques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris utilisées sont athymiques, dépourvues de thymus et donc incapables de rejeter les cellules tumorales qu'on leur implante. 625 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur est injectée sous la peau du flanc sous anesthésie, puis viennent une injection intraveineuse de nanoparticules lipidiques, deux prélèvements de sang par incision du bout de la queue sur souris vigile, une injection de luciférine et dix à quinze minutes d'imagerie sous anesthésie, la tumeur pouvant gêner les déplacements et la toilette. Le calendrier est celui d'une société privée, cinq études de vingt-cinq souris par an pendant cinq ans, pour mesurer où se logent des nanoparticules destinées à transporter des médicaments.
Objectifs
Ce projet est centré sur l'adressage sélectif de nanoparticules lipidiques vectorisés (LNP-V) vers des tumeurs afin d’en améliorer leur diagnostic/traitement. L’imagerie par bioluminescence permet la détection et la quantification/accumulation in vivo de conjugués ou de cellules développées pour présenter une activité bioluminescente. L'objectif principal de ce projet est donc d’utiliser cette technique pour étudier les effets de l'utilisation de différents vecteurs sur la biodistribution et l'accumulation plus spécifique dans les tumeurs de LNP-V en limitant leur accumulation non spécifique dans les autres tissus. En effet un ARNm codant pour l'enzyme luciferase sera encapsulée dans les LNP-V et servira de read out de l'accumulation des différents LNP-V dans les tumeurs.
Bénéfices attendus
L'utilisation de nanoparticules lipidiques vectorisées (LNP-V) permets de protéger la molécule thérapeutique de la dégradation et de permettre une distribution plus spécifique. D'un point de vue médical, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos molécules constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.
Procédures
Chaque souris sera implantée avec un modèle de cellules tumorales par une injection en sous cutanée sur le flanc de l’animal anesthésié. Après croissance tumorale, les souris recevront une injection par i.v. de nanoparticules lipidiques (LNP) vectorisées (V) contenant un ARNm codant pour la luciférase (protéine émettant de la lumière en présence de son substrat la luciférine), en solution isotonique stérile, sous anesthésie gazeuse. Après administration des petits prélèvements sanguins intermédiaires seront réalisés sur animaux vigiles en contention par une micro-incision de l’extrémité caudale, 3 à 5 gouttes de sang (≤50μl) suffiront pour quantifier la 1/2 vie plasmatique de nos conjugués. Au maximum seront réalisés 2 prélèvements de maximum 50μl, pour un volume total n’excédant pas 10% de la volémie. Vingt-quatre heures après, pour induire la bioluminescence, une injection intrapéritonéale de luciférine sera réalisée sous anesthésie, juste avant l’imagerie. Les imageries bioluminescentes dureront environ 10-15min et les animaux seront maintenus sous anesthésie pendant la totalité de l'acquisition.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pour les souris sont principalement le stress causé par la capture, l'implantation des cellules tumorales en sous-cutanées (réalisé une seule fois) sous anesthésie, les injections en i.v. des molécules (réalisé une fois) et en i.p du susbtrat Luciferine (réalisé une fois) sous anesthesie, les prélèvements sanguins intermédiaires ( 2 prélèvements (≤50μl) /individus, n’excédant pas 10% de la volémie), ainsi que le développement de la tumeur primaire chez l’animal en tant que pathologie. Ce developpement de la tumeur en sous cutanée peut entrainer une gène physique, avec de possibles grattages et demangeaisons. Les animaux seront soumis à la mesure bi-hebdomadaire des volumes tumoraux. La pousse de la tumeur peut eventuellement entrainer chez l'animal une gêne physique au déplacement ou à la toilette par exemple. Les LNP-V peuvent (éventuellement) causer des effets secondaires observés post-administration comme des chocs immunitaires (anaphylactique), des réactions allergiques, des détresses cardio-respiratoires et des troubles comportementaux.
Devenir
A l'issue de chaque procédure d'imagerie les animaux seront mis à mort et certains organes seront prelevés afin de valider ex vivo la biodistribtuion des LNP-V.
Remplacement
Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos LNP-V ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement en mesurer le bénéfice. L'utilisation de rongeurs (ici, n= 125 souris/an) impose la prise en compte de la règle des 3 R, la conformité vis à vis des recommandations et cahier des charges.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été réduit au minimum requis pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le nombre total de souris pour cette étude s'élève à 625 souris. Il tient compte du suivi des modèles expérimentaux développés dans le projet et de la variabilité de développement des tumeurs qu’il peut exister dans les différents modèles. L’optimisation de nos vecteurs in vitro nous permet aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure. Le nombre total d’animaux répartis sur des études necessitants 25 souris chacune sera de 625 souris décomposé en 5 études de 25 individus/an sur 5 ans. Ce nombre sera suffisant pour appréhender la détection et l'accumulation de nos molécules dans les tumeurs. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société. Ce nombre d'animaux pour ces procédures nécessaire à l'obtention d'une significativité statistique a été défini en déterminant le test statistique et l'effet biologique et la dispersion escomptés.
Raffinement
La formation initiale et l’expérience du personnel permettent d’avoir suffisamment de recul pour appréhender tout signe et/ou comportement caractéristique d’une douleur ou gène chez l’animal, appuyés si besoin par la présence sur site d’un pharmacien, personne dument qualifiée, pour exercer dans le respect des 3R. Nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Dès leur arrivées les souris sont placées dans une pièce cyclée (12h/12h), insonorisée, armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage (taille standard pour portoir ventilé+couvercle à filtre), un maximum de 5 individus par cage, litières (copeaux de bois) et alternance d'enrichissement, dômes, tubes, fibres pour faire des nids. Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Une personne compétente (formation en experimentation animale) réalisera les injections des cellules tumorales qui se feront sous anesthésie gazeuse (Sévoflurane). Une observation bi-hebdomadaire des animaux par les expérimentateurs (poids, douleurs/souffrance) sera faite ainsi qu'une surveillance du volume des tumeurs, en plus de leur observation quaotidienne par les animaliers. Toute perte de poids, signe de douleur (analgésiques prévus en cas de nécessité) ou souffrance notable (cardiaque, respiratoire) de l'animal éveillé après anesthesie ou au cours du developpement tumoral constituera un point limite. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs de deux fournisseurs extérieurs.
Choix des espèces
- Facilité d'utilisation en général, espèce athymique (sans thymus) comme modèle in vivo, pour faciliter la mise en place et la prise de tumeurs solides (facilité et maîtrise de l’injection, déficience du système immunitaire), ainsi que pour le suivi de leur croissance. - Modèle d’injection de lignées tumeurs en sous-cutanée bien décrit dans la littérature et déjà utilisé dans le passé par des membres du laboratoire ou membres du projet collaboratif. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de lignées cancéreuses, c’est à dire des souris athymiques « jeunes adultes » âgés de 6 semaines au moment de l’implantation de la lignée tumorale et 10 à 12 semaines au moment du traitement (injection du candidat imagerie) en fonction de la taille des tumeurs.
Lyssavirus et d’autres virus neurotropes : étude de nouveaux virus, de leur pathogenèse et développement de nouvelles approches thérapeutiques et prophylactiques
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
Inoculées par le virus de la rage dans le muscle ou directement dans le cerveau, des souris développent une perte de poids, une mobilité réduite puis une paralysie des membres postérieurs. 1 500 souris vont être utilisées, 1 440 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 60 un niveau léger, avec craniotomies, laparotomies, pompes implantées sous la peau et tests comportementaux nommés : champ ouvert, rotarod, test de serrage, reconnaissance d'objet, labyrinthe en croix surélevé. Le porteur écrit que chez les souris traitées efficacement une paralysie, souvent d'un seul membre, peut persister "sans qu'il y ait d'impact sur l'état général des animaux". Toutes sont tuées, ni réutilisées ni adoptées, parce qu'infectées par un agent de biosécurité de niveau 3, les souris non infectées subissant le même sort du fait de leur hébergement en confinement.
Objectifs
Les encéphalites chez l'humain présentent une incidence de 2 à 12 pour 100000 suivant l'âge des patients considérés et leur localisation géographique. Une fraction de ces encéphalites corresponde à des cas de rage. Ils sont très souvent la conséquence d'une morsure de chien enragé et concernent principalement des enfants. L'OMS estime l'impact de la rage sur l'humain à au moins 50000 décès par an. Ce projet a trois objectifs : 1) Diagnostic des virus agents d'encéphalite et en particulier des Lyssavirus (les agents responsables de la rage) chez l’humain et chez les animaux 2) Évaluation et mise au point de nouvelles approches thérapeutiques et prophylactiques de la rage chez l'humain 3) Compréhension des mécanismes liés à la neuroinvasion, virulence et pathogénie des Lyssavirus en lien avec leur capacité à franchir la barrière d'espèce et à infecter l'humain
Bénéfices attendus
Bénéfice à court terme : 1) La surveillance de la rage chez l'humain et chez l'animal sera assurée, ainsi que la coordination de la prophylaxie de la rage chez l'humain en France Bénéfices à long terme : 2) Contribution au développement de nouvelles approches thérapeutiques et prophylactiques de la rage chez l'humain 3) Progression des connaissances des mécanismes infectieux des Lyssavirus, notamment liés aux facteurs de virulence, les voies de neuroinvasion et la capacité à franchir la barrière d'espèce et à infecter l'humain.
Procédures
Interventions uniques - Inoculation virale sur animaux vigiles (injection intramusculaire). Durée de l’intervention : moins d’une minute - Inoculation virale sous anesthésie (injection intracérébrale, et/ou dans la sous-muqueuse duodénale). Durée de l’intervention : moins d’une minute - Procédures chirurgicales (laparotomie, craniotomie, installation de pompes sous-cutanées). Durée de l’intervention : entre 30 et 60 minutes - Tests de comportement non-invasifs (test du champ ouvert, rotarod, test de serrage, test de reconnaissance d’objet, labyrinthe en croix sur-élevé). Durée de l’intervention : entre 5 et 10 minutes/test - Tests d’imagerie sous anesthésie. Durée de l’intervention : entre 5 et 10 minutes Interventions répétées - Prélèvement sanguin sur animaux vigiles. Durée de l’intervention : moins d’une minute. Nombre d’interventions : 2 à 3 - Administrations de composés antiviraux (injections intrapéritonéale, intraveineuse ou intramusculaire). Durée de l’intervention : moins d’une minute. Nombre d’interventions : 1 injection tous les 5 jours (5 injections)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux sont des conséquences directes de l’infection par les Lyssavirus, à savoir perte de poids et une mobilité réduite, et une paralysie des membres postérieurs. Ces effets apparaissent de façon progressive au début de l'évolution clinique et ont une durée de 2 à 3 jours avant d’atteindre le point limite de l’expérimentation. Une exception à cette durée concerne les expérimentations qui visent le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour la rage : dans certains cas de traitement efficace, les animaux traités peuvent survivre à l'injection de virus rabique tout en présentant une forte baisse de poids ou une paralysie des membres postérieurs. Avec la progression efficace du traitement, le poids revient souvent à la normalité, mais une paralysie (souvent monoplégie) peut occasionnellement persister, sans qu’il y ait d’impact sur l’état général des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car infectés par un pathogène de biosécurité niveau 3. Les animaux non-infectés ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car hébergés dans une animalerie de confinement niveau 3.
Remplacement
Les expériences proposées dans ce projet font suite et viennent compléter des expérimentations effectuées sur culture cellulaire et ne sont utilisées que lorsqu’elles représentent une étape incontournable pour l'avancement de la connaissance scientifique et non actuellement remplaçable par des tests in vitro. Dans ce contexte, l’utilisation d’animaux sera nécessaire dans 3 cas, notamment (i) pour l’isolement viral à partir du cerveau et des procédures liées au diagnostic de la rage ; (ii) pour la validation in vivo de molécules candidates pour la prophylaxie ou la thérapie de la rage ayant montré une efficacité in vitro ; et (iii) pour comprendre la pathogénie (les mécanismes utilisés par les virus pour envahir le système nerveux central) d'agents infectieux responsable d'encéphalites.
Réduction
Les analyses statistiques seront appliquées aux variables primaires suivantes : poids, score clinique, charge virale. On s'intéresse aux effets de souche virale, voie d'infection, traitement sur ces variables. 1500 animaux (en 5 ans) seront utilisés selon trois procédures décrites ci-dessous. Les effectifs prévus sont compatibles avec la recherche d'effets forts. Des tests statistiques seront appliqués pour les comparaisons multiples entre groupes. A la fin de chaque procédure les animaux ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car infectées par un pathogène de biosécurité niveau 3. Les animaux non-infectés ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car hébergées dans une animalerie de confinement niveau 3.
Raffinement
Les animaux seront suivis de façon quotidienne pour analyse de leur poids et des éventuelles signes cliniques liés à l’infection. Des mesures seront prises pour réduire la douleur et la souffrance (anesthésie, analgésie, support nutritionnel et hydrique).
Choix des espèces
La souris est l’animal de choix des modèles d’évaluation de l’efficacité de prophylaxie et du traitement antirabique chez l'humain. Elle a une durée d’incubation relativement courte et une sensibilité au virus rabique suffisante. Les souris adultes et les souriceaux sont extrêmement sensibles aux virus neurotropes en général. Leur utilisation permet d'isoler des virus dont la culture serait difficile voire impossible (absence de lignées cellulaires susceptibles). Souris adultes et souriceaux nouveau-nés. La souris adulte et le souriceau sont extrêmement sensibles aux virus à l'origine d'encéphalite en général. L'utilisation de ces animaux permet d'isoler des virus dont la culture serait délicate voire impossible autrement (absence de lignées cellulaires susceptibles).
Etude de l’efficacicité d’un traitement neuroprotecteur dans le cadre de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées à l'issue pour des analyses biochimiques et immunohistochimiques du cerveau, 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces souris portent des mutations humaines qui leur font surproduire une protéine toxique et développer les marques précoces de la maladie d'Alzheimer, hyperactivité neuronale puis plaques séniles. Elles reçoivent une injection quotidienne dans l'abdomen, dès le quatorzième jour après la naissance et jusqu'à l'âge de trois mois, d'une molécule dont une première étude préclinique a déjà été menée sur le même modèle. Le porteur indique que la revendication a été brevetée et attend de ces travaux qu'ils confirment une stratégie susceptible d'"intéresser les industriels pharmaceutiques".
Objectifs
La maladie d'Alzheimer est la plus fréquente des maladies neurodégénératives (900 000 personnes atteintes en France en 2021). Elle est caractérisée par une évolution lente mais progressive de l'atteinte neuronale affectant les capacités de mémorisation des patients réduisant progressivement leur autonomie. Cette pathologie complexe est liée à un dysfonctionnement des connections entre neurones qui aboutit à la dégénérescence des neurones de l'hippocampe (structure du cerveau impliquée dans la mémoire) puis de l'ensemble du cerveau. Les patients doivent endurer une perte irréversible de leurs fonctions cérébrales puisqu'à l'heure actuelle, aucun traitement ne permet de stopper l'évolution de la pathologie. Nous avons récemment identifié un stade auquel on peut stopper la progression de la maladie avec une substance pharmacologique originale. Nous souhaitons mieux comprendre les mécanismes impliqués dans cette efficacité et nous souhaitons également tester d'autres inhibiteurs de la même famille afin de confirmer que ce traitement pourrait se révéler être une nouvelle stratégie thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer et intéresser les industriels pharmaceutiques. Les molécules testées diffusent dans le cerveau et peuvent être injectées par voie périphérique à l'animal. Dans ce projet, nous allons étudier les effets d'un traitement quotidien sur les marqueurs précoces de la pathologie (hyperactivité neuronale) et intermédiaires (présence des plaques séniles et inflammation).
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d'évaluer l'efficacité d'un candidat médicament sur la mise en place de la maladie d'Alzheimer. Cette revendication a été brevetée et une première étude pré-clinique réalisée sur ce même modèle animal a évalué la pertinence de cette approche. Pour valider cette stratégie thérapeutique nous devons poursuivre l'étude des mécanismes associés à l'efficacité thérapeutique chez la souris et tester l'efficacité d'autres substances de la même famille.
Procédures
Les animaux recevront une injection quotidienne d'une substance pharmacologique au niveau abdominal. L'injection dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
L’injection peut éventuellement induire une douleur légère au point d’injection et un inconfort pour l’animal.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort pour des études biochimiques ou immunohistochimiques.
Remplacement
Notre approche méthodologique permet d'avoir accès à l’activité d’une structure dans un réseau complexe au sein du cerveau. Ce modèle ne peut être remplacé par des modèles de culture cellulaire ou d’autres approches in vitro. De plus, la souris permet d’avoir accès à des lignées transgéniques modèles de la pathologie humaine. La similarité moléculaire, cellulaire et fonctionnelle des circuits impliqués dans les processus de mémoire chez la souris en fait un modèle de choix pour ce projet.
Réduction
Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet.
Raffinement
L’injection dans l'abdomen peut éventuellement induire une douleur légère au point d’injection et une gêne pour l’animal. Pour prévenir cela, nous utilisons des seringues microfines pour induire le moins de lésion et de douleur possible. Les seringues sont changées tous les deux animaux pour prévenir l'émoussement des aiguilles. Le côté d'injection (doite-gauche) sera alterné chaque jour. Les animaux sont habitués à la préhension la semaine précédent le début des injections. A l’issue de la procédure, les animaux seront replacés dans leur cage d’origine. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d'évaluer l'état général de chaque animal et de définir le point limite, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l'animal. Lors des expériences de perfusion intracardiaque, une couverture analgésique et anesthésique est mise en place pour éviter tout ressenti douloureux. Les animaux seront également hébergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l'hébergement des animaux de l'Annexe II du premier février 2013 de l'arrêté fixant les conditions d'agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l'environnement. Les animaux transgéniques sont stabulés à l’animalerie depuis leur naissance.
Choix des espèces
Le modèle souris permet d’avoir accès à des modèles transgéniques mimant certaines pathologies humaines. Dans notre cas, l'existence de modèles transgéniques murins exprimant des mutations humaines de deux protéines impliquées dans les formes familiales génétiques de la maladie et responsables d’une surproduction d'une protéine toxique, permet de mimer la maladie d’Alzheimer et de l'étudier dès les stades précoces (sans symptomes). Cette lignée permet l’utilisation de contrôles issus de la même portée. De plus, la similarité moléculaire, cellulaire et fonctionnelle des circuits impliqués dans les processus de mémorisation, notamment l’hippocampe, en fait un modèle de choix pour ce projet. Les animaux seront injectés dès 14 jours post-natal et jusqu’à 3 mois post-natal.
Etude de la fibrose pulmonaire: évaluation par imagerie et évaluation de nouveaux traitements chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Pour mettre au point des traceurs d'imagerie de la fibrose pulmonaire et tester des traitements, 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La fibrose est induite à la bléomycine, suivie d'injections de traceurs radioactifs, de jusqu'à cinq séances d'imagerie de quarante minutes sous anesthésie, d'un gavage quotidien de J8 à J28 ou d'injections intrapéritonéales quotidiennes, puis d'une ponction dans le cœur. Pendant la phase d'inflammation, les souris peuvent perdre du poids, se déshydrater, respirer difficilement et rester prostrées, sans analgésie, le porteur indiquant que les antidouleurs interféreraient avec le développement de la fibrose. Le nombre de souris par groupe a été fixé d'après l'expérience de l'équipe, le porteur précisant qu'aucune approche statistique n'a été utilisée.
Objectifs
Ce projet porte sur l’étude de la fibrose pulmonaire qui se caractérise par une modification de la structure du tissu pulmonaire qui devient plus rigide. Elle résulte de l’accumulation excessive de protéines comme le collagène et mène à des défauts de fonctionnement des poumons. Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode permettant un diagnostic précoce et le suivi de la progression de la maladie. Peu de traitements sont disponibles car les mécanismes menant à la fibrose sont peu connus. Ces traitements permettent uniquement de ralentir la progression de la maladie mais ne permettent pas de la stopper. De plus, il n’existe, à l’heure actuelle, aucun moyen de suivre l’efficacité de ces thérapies chez les patients. Ce projet est donc construit avec un triple objectif: 1/ Mettre en place de nouveaux traceurs d’imagerie pour le diagnostic précoce et le suivi de la progression non-invasif de la fibrose pulmonaire, 2/ évaluer l’action de ces traceurs pour le suivi de l’efficacité de traitements anti-fibrose et enfin 3/ évaluer les effets de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
La découverte de biomarqueurs pour la FPI en est encore à ses débuts et il n'existe pas de consensus dans ce domaine, en particulier pour l'imagerie moléculaire. L'imagerie actuelle de la FPI repose uniquement sur le scanner haute résolution et n'a que peu d'impact sur le diagnostic précoce et la survie. En outre, l'efficacité des thérapies actuellement approuvées pour la FPI dans l'ensemble de la population atteinte de FPI reste incertaine et les outils permettant de contrôler l'efficacité des thérapies font cruellement défaut. Ce projet permettra donc de développer et d’évaluer des traceurs d’imagerie qui pourraient être des biomarqueurs d'imagerie pour la FPI. Un nombre important de patients atteints de FPI doivent subir une biopsie pulmonaire pour obtenir un diagnostic définitif. Cependant, l'hétérogénéité spatiale des lésions fibrotiques dans le poumon de la FPI rend difficile l'échantillonnage précis de la zone pulmonaire malade afin d'obtenir une décision de diagnostic fiable. Le développement de sondes radiomarquées spécifiques des zones pulmonaires affectées par la FPI, telles que les sondes développées dans notre projet, pourrait aider les cliniciens à prendre des décisions thérapeutiques. En outre, ce projet fournira des outils innovants pour la détection de voies biologiques spécifiques impliquées dans la fibrose pulmonaire. Dans ce contexte, les sondes développées dans le cadre de ce projet constitueront une première étape dans le développement de thérapies personnalisées pour les patients atteints de FPI, ce qui n'est pas le cas actuellement, en identifiant les répondeurs potentiels ou les non-répondeurs aux thérapies évaluées dans ce projet. Notre projet ambitieux favorisera donc le développement de thérapies ciblées qui sont inexistantes pour le traitement de la FPI.
Procédures
Intervention subies par les animaux : - Injection de traceur radioactifs par voie IV sous anesthésie (100µl, 2 minutes, 1 à 4 injection par animal) - Prélèvement sanguins sous anesthésie (2 minutes, 4 par animal, n=30 (procédure 1 seulement)) - Imagerie in vivo sous anesthésie (40 minutes maximum, 1 à 5 imagerie par animal) - Traitement par gavage sur souris vigile (procédure 3 uniquement, 200µl, gavage quotidien de J8 à J28, 1 minute) - Traitement par injection IP sur souris vigile (procédure 4 uniquement, 100µl, quotidien de J8 à J28, 1 minute) - Prélèvement de sang terminal sans réveil par ponction intracardiaque sans thoracotomie sur animal anesthésié (1 minutes).
Impact sur les animaux
Durant la phase d’inflammation de J0 à J7 les animaux peuvent subir une perte de poids importante et présenter des signes cliniques caractéristiques tels que la déshydratation, l’augmentation de la fréquence respiratoire (associé à une difficulté respiratoire) et un comportement de prostration et d’isolement. Toute observation anormale sera répertoriée et suivie de mesures.
Devenir
A l’issue de chaque procédure la totalité des animaux seront mis à mort afin de mesurer et quantifier la fibrose pulmonaire par des méthodes ex vivo classiques (histologie, dosage de protéine) et les comparer avec nos techniques d’imagerie in vivo.
Remplacement
L’étude de la fibrose pulmonaire ainsi que l’effet d’un traitement sur celles-ci ne peut se passer d’une étude chez l’animal. En effet, les modèles cellulaires ne reflètent pas l’environnement complexe et pluricellulaire présent physiologiquement, ni la fonction pulmonaire (rigidité, stress mécanique dû à la respiration…) dans son ensemble. Néanmoins, les molécules qui seront évaluées dans ce projet auront été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Puisqu’il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent, la seule alternative reste l’utilisation d’animaux.
Réduction
Dans le cadre de cette étude, les traceurs/composés seront évalués à l'aide de techniques d'imagerie préclinique in vivo couplées à des techniques de comptage de la radioactivité ex vivo. Ces techniques étant particulièrement sensibles et spécifiques, seuls de faibles effectifs sont nécessaires pour obtenir des données fiables et précises tout en réduisant le nombre d’animaux au maximum. De plus l’imagerie in vivo permet d’évaluer les traceurs/composés à plusieurs stades de fibrose sur les mêmes animaux limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminée suivant notre experience de ce type de manipulation et aucune approche statistique n'a été utilisée. De plus, le nombre d’animaux utilisé pourra être revu à la baisse pour certaines procédures en fonction des résultats obtenus lors des procédures précédentes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages, en groupe (10 maximum par cage), suivant un cycle jour/nuit inversé avec accès illimité à l’eau et la nourriture. Les litières des cages seront supplémentées par un enrichissement de type « SIZZLE PAD ». Les gestes de ce projet (injection, imagerie, mise à mort) se dérouleront tous sous anesthésie et sur lit chauffant réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Les animaux recevant de la bléomycine seront observés une fois par jour pendant la phase aigüe d’inflammation (de J0 à J7) puis trois fois par semaine de J8 à J28 pendant la phase de progression de la fibrose. Le développement de la fibrose reposant sur l'induction d'une phase d'inflammation, il n'est pas possible d'utiliser des analgésiques qui pourraient interfèrer avec le bon développement de la fibrose. En dehors des effets induits par le modèle, aucun effet indésirable n’est attendu mais des points limites adaptés ont été définis. Toute observation d’un signe de souffrance excédent les points limites sera suivie de l’arrêt immédiat du protocole et de la mise à mort.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les modèles de choix pour l’étude de la fibrose pulmonaire. La souris est l’espèce la plus utilisée et la plus connue notamment pour le modèle à la bléomycine, permettant ainsi une extrapolation à l’homme et une comparaison à de résultats antérieurs. Les souris débuteront les études à un âge de 8 semaines, déterminé en fonction de résultats déjà publiés. Cet âge correspondant à un stade de développement adulte de l’animal.
Evaluation de l’immunité et de l’inflammation mammaires chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système urogénital
Jusqu'à treize anesthésies en dix jours pour une même souris : 260 souris vont être utilisées, 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 100 un niveau modéré. Elles sont épilées, reçoivent des bactéries en injection dans la mamelle, parfois une sonde fluorescente dans la veine de la queue, et certaines sont gavées tous les jours pendant deux semaines. Le modèle sert à étudier l'immunité mammaire des ruminants, le porteur indiquant que le passer chez la souris évite "des protocoles plus dommageables sur des espèces telles que la brebis". Les mères infectées sont tuées pour mesurer la charge bactérienne dans leur glande mammaire, et leurs souriceaux le sont aussi, l'allaitement s'interrompant avant le sevrage sans possibilité d'adoption dans la zone d'expérimentation.
Objectifs
L'occurence des mammites dans les élevages représente un problème majeur en santé animale. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans l'immunité mammaire est nécessaire pour améliorer la santé et le bien-être des animaux d'élevage, ainsi que la qualité (nutrionnelle, microbiologique...) des produits d'origine animale tout en réduisant le recours aux intrants chimiques dont les antibiotiques.
Bénéfices attendus
Le caractère inédit du protocole mis en place, ainsi que l'utilisation d'une technique d'imagerie innovante permettront d'apporter des informations de grande importance dans le domaine de l'immunité mammaire. De plus, la mise en place de ce modèle chez la souris évite l'application de protocoles plus dommageables sur des espèces telles que la brebis.
Procédures
Les souris sont anesthésiées par inhalation d'un anesthésiant à plusieurs reprises : - une fois pour leur épilation, pour une durée maximale de 20 minutes - une fois pour les injections intra-mammaires pour une durée maximale de 30 minutes - potentiellement une fois pour une injection de sonde fluorescente pour une durée maximale de 15 minutes - une fois par jour pour les analyses pour une durée maximale de 15 minutes, durant la durée du protocole (durée maximale de 10 jours), soit un nombre maximal de 13 anesthésies. Les souris sont également soumises à des injections de bactéries intra-mammaires (sous anesthésie gazeuse comme indiqué ci-dessus) qui durent environ 5 à 10 sec. Elles seront aussi potentiellement soumises à une injection de sonde fluorescente (sous anesthésie gazeuse comme indiqué ci-dessus) dans la veine caudale des souris qui doivent durer environ 5 à 10 sec. Enfin, elle subissent une euthanasie à la fin du protocole. Pour le deuxième projet, les souris sont prélablement gavées quotidiennement pendant 2 semaines, la durée de l'intervention est d'environ 5 à 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés lors des expériences d’infections réalisées à ce jour dans le cadre de ce projet ont montré une légère perte de poids mais cette perte s'est rapidement résorbée au cours de l'expérimentation. Des signes de prostration ont pu être observés sur certaines souris après réveil suite aux injections mais n'étaient plus visibles dès le 1er jour post-infection. Aucun autre signe de souffrance ou d'altération du bien-être des animaux n'a pu être observé au cours de ces expériences.
Devenir
Les souris adultes sont euthanasiées à la fin des expériences afin de pouvoir faire des prélèvements de glande mammaire dans le but de faire des mesures de charge bactérienne. De plus, l'infection subie par les animaux induit une modification de leur statut immunitaire ce qui empêche leur utilisation dans de nouvelles expériences d'infection qui nécessitent l'utilisation d'animaux n'ayant jamais été infectés. Les souriceaux sont également euthanasiés car l'interruption de la lactation survient avant le sevrage (du fait de l'euthanasie des mères) et il n'est donc plus possible de les maintenir en vie du fait de l'impossibilité de réaliser des adoptions et des déplacements d'animaux dans une nouvelle zone à cause des spécificités de la zone d'expérimentation.
Remplacement
Les infections expérimentales réalisées chez la souris ont pour but la compréhension du rôle d'une protéine et de l'administration d'alicaments sur la sévérité et l'issue de l'infection, ainsi que le recrutement des cellules immunitaires. Ces expériences ne peuvent être réalisées qu'à l'échelle de l'organisme d'animaux vivants et ne peuvent être reproduites in vitro puisqu'elles impliquent des interactions entre les différents acteurs du système immunitaire de l'organisme, après contact avec les bactéries en multiplication. Elles permettront ainsi une analyse pertinente et complète du point de vue physiopathologique, dont les résultats seront à priori plus fiables et auront une plus grande probabilité d'être transférables aux espèces de ruminants.
Réduction
Cette technique d'imagerie a été choisie car elle est non invasive et qu'elle permet d'analyser plusieurs paramètres simultanément sur les mêmes souris tout en réalisant une cinétique de suivi de l'infection. Cette méthode permet donc de limiter grandement le nombre d'animaux utilisés pour obtenir un grand nombre d'informations sur les mêmes souris : intensité de l'infection et du recrutement des cellules immunitaires à différents temps post-infection. Des premiers essais tests seront réalisé sur des lots successifs de nombres réduits d'animaux pour optimiser les conditions expérimentales au fur et à mesure et ajuster la cinétique pour avoir le maximum d'information et de fiabilité des résultats tout en limitant au mieux la durée du protocole et la souffrance des animaux. Les expériences seront ensuite réalisées sur des lots successifs de souris et les résultats obtenus analysés à l'aide de tests statistiques pour évaluer leur fiabilité, et ainsi déterminer la nécessité ou non d'augmenter les effectifs examinés pour l'obtention de résultats statistiquement fiables.
Raffinement
Les anesthésiques choisis sont peu toxiques et permettent ainsi une anesthésie de courte durée pour les analyses (15min maximum) et le réveil rapide avec une reprise immédiate de l'activité. L'infection des souris se fera par injection intra-mammaire, geste non traumatisant pour la glande mammaire. Le nombre d'analyse sera limité à un ou deux par jour et un suivi régulier des animaux sera effectué pendant toute la durée du protocole. Tout animal présentant des signes de souffrance ou de léthargie, dont la gravité sera évaluée en fonction des points limites pré-établis, sera exclu de l'étude puis euthanasié.
Choix des espèces
Les protocoles de modifications génétiques sont beaucoup plus faciles à mettre en place chez la souris que dans les autres espèces. La souris a donc été choisie pour créer un modèle d'intérêt de souris génétiquement modifiées. De plus, la grande majorité des données publiées sur l'immunité et les thématiques d'intérêt des projets d'intérêt ont été acquises chez la souris. Il est donc nécessaire de prolonger les analyses dans la même espèce afin de pouvoir s'appuyer sur les résultats déjà obtenus pour la réalisation des protocoles et pour compléter les données pré-existentes tout en ayant des points de référence. Enfin, l'utilisation de la souris permet d'éviter la mise en oeuvre de protocoles beaucoup plus dommageables sur des espèces telles que la brebis. Les souris seront utilisées à l'âge adulte, entre 14 et 16 semaines, puisqu'elles doivent être en lactation.
Réseau vasculaire dans des modèles murins de Maladie de Willebrand 1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses de mutations reproduisant la maladie de Willebrand, elles subissent un ou deux prélèvements sanguins sous anesthésie profonde, puis une endoscopie de quinze à vingt minutes, également sous anesthésie profonde, avant que leurs organes ne soient prélevés. L'objectif est de comprendre comment se forment les malformations vasculaires de l'intestin responsables de saignements chez les patients, un travail dont le porteur situe les retombées thérapeutiques "à plus long terme". Des souris âgées de 18 à 24 mois figurent parmi celles utilisées, et l'effectif de 400 repose sur la littérature et sur l'expérience de l'équipe, sans calcul détaillé.
Objectifs
La maladie de Willebrand (MW) est la maladie hémorragique la plus fréquente mais reste assez méconnue. Elle touche homme et femmes et affecte jusqu’à 1% de la population dans sa forme modérée. La maladie empêche d’arrêter les saignements. En fonction des différents défauts, les patients ont des formes plus ou moins sévères de la maladie. Certains sous-types de la MW sont associés une fréquence accrue de malformations vasculaires dégénératives intestinales susceptibles de saigner. Les saignements parfois impossibles à traiter ou récidivants, conduisent à des hospitalisations fréquentes et répétées et les patients concernés souffrent d’une dégradation importante de leur qualité de vie. Notre projet va consister à étudier les vaisseaux intestinaux dans des modelés murins de la MW, ce qui pourra aider à comprendre le mécanisme de formation de ces malformations à l’origine des saignements gastrointestinaux. Le projet se déroule dans deux Etablissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude permettront de mieux comprendre les mécanismes de formations des malformations vasculaires gastrointestinales. A plus long terme, ce projet pourra servir de base pour la mise en place d'essais précliniques pour développer et tester des nouvelles options thérapeutiques pour les patients avec maladie de Willebrand (et pas seulement) souffrant de saignement gastrointestinaux.
Procédures
Dans l'établissement EU/1, les souris seront soumises a un geste tres rapide de prélèvement sanguin (30-60 secondes), réalisé sous anesthésie profonde une o deux fois. Dans l'établissement EU/2, l’endoscopie (15-20 minutes) se fait une seule fois sous anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
Douleur légère au réveil après le prélèvement. Stress lors de la préhension des animaux.
Devenir
Les organes d’intérêt sont prélevés après l’endoscopie pour des analyses de microscopie, il est donc impossible ré-utiliser ces souris.
Remplacement
Le système de la coagulation est complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs, que ce soit les cellules sanguines, les protéines qui circulent dans le sang mais aussi la paroi des vaisseaux sanguins. Actuellement les tests disponibles qui ne font pas appel aux animaux, même s’ils se sont beaucoup améliorés depuis quelques années, ne permettent pas de reproduire l’intégralité de ce processus.
Réduction
Afin de déterminer le nombre d’animaux approprié, nos calculs sont basées sur la littérature existante et sur notre expérience en utilisant ces modèles en prenant en compte les variabilités de chaque test.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien- être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques. Les animaux ne sont jamais seuls dans les cages d’hébergement et ils ont un accès libre à la nourriture et à l'eau. L’ensemble des expériences sera effectué par une personne habilitée à expérimenter sur animaux et la procédure aura lieu principalement sous anesthésie et sans réveil. Au cours de ce projet, les opportunités de raffinement seront régulièrement ré-évaluées pour nous assurer de la mise en place rapide de tout nouveau développement technique qui interviendrait pendant la période du projet. Les souris sont sous observation quotidienne (une fois pendant le weekend) et les points limites, susceptibles d'entraîner l'euthanasie immédiate de l'animal, seront strictement appliquée.
Choix des espèces
Ce projet fait appel à des modèles murins déjà développés qui reproduisent les pathologies étudiées (Maladie de Willebrand de différents sous-types). Ces modèles ont d’ores et déjà montré leur pertinence en tant que modèles des pathologies humaines. Des souris adultes, entre 3 et 6 mois d’âge et des souris âgées, entre 18 et 24 mois , des deux sexes seront utilisées.
Cannabis et psychoses : décodage du lien
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour chercher pourquoi certaines personnes réagissent au cannabis par des symptômes psychotiques, 6 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Selon les protocoles, elles subissent jusqu'à sept injections dans l'abdomen, des chocs de 0,4 mA aux pattes, des injections de chlorure de lithium qui provoquent un malaise d'environ une heure, une restriction de nourriture ou d'eau, ou une chirurgie du cerveau d'environ 90 minutes pour injecter un virus ou implanter une fibre optique. En dehors des conditionnements opérants, par chocs ou par récompense alimentaire, et de deux protocoles de 19 et 25 jours désignés par des sigles, les tests comportementaux ne sont pas nommés. Si une souris présente deux jours de suite un état anormal, perte de poids, ataxie, baisse d'activité ou pelage négligé, le porteur prévoit d'en informer le vétérinaire et de décider avec lui de la suite.
Objectifs
Ce projet de recherche veut mieux comprendre comment fonctionne notre cerveau quand on pense au quotidien, et comment des problèmes dans ce fonctionnement peuvent être liés à des troubles mentaux. On regarde surtout comment les substances dans le cannabis interagissent avec la dopamine, et comment cela influe sur notre façon d'apprendre de manière fortuit et de faire la distinction entre la réalité et l'imagination. Les premiers résultats montrent que ces substances ont une influence intéressante, surtout sur les associations qu’on faire au quotidien et les symptômes psychotiques. On cherche à savoir pourquoi les réactions varient d'une personne à l'autre, et surtout pourquoi certaines réagissent de façon psychotique au cannabis. On essaye aussi de trouver des moyens pour protéger le cerveau des effets néfastes du cannabis. Plutôt que de suivre les méthodes habituelles, on explore l'idée d'utiliser des substances qui pourraient aider à contrôler les récepteurs dans le cerveau influencés par le cannabis. En fin de compte, ce projet pourrait nous aider à mieux comprendre comment fonctionne notre cerveau, et aussi à créer de nouveaux traitements pour les problèmes mentaux graves.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche se concentre sur le rôle du récepteur CB1 dans les processus d'apprentissage et de mémoire, en mettant particulièrement l'accent sur son implication dans les processus mentaux d'ordre supérieur. En explorant la signalisation endocannabinoïde, nous cherchons à mieux comprendre les mécanismes moléculaires liés à des fonctions complexes telles que l'imagination et les croyances. L'objectif global est de dévoiler comment des altérations dans ces processus peuvent contribuer à des troubles psychopathologiques tels que les psychoses et les troubles de la consommation de drogues, qui ont un impact significatif sur la santé publique. Nous examinons également le rôle du système endocannabinoïde dans la modulation de la perception sensorielle, soulignant son lien potentiel avec les états psychotiques. En dévoilant ces mécanismes neurobiologiques, notre recherche vise à approfondir notre compréhension des circuits neuronaux impliqués chez la souris. À plus long terme, nous anticipons que ces découvertes pourraient poser les bases de nouveaux concepts thérapeutiques pour traiter des conditions neuropsychiatriques importantes. En résumé, ce projet offre une opportunité tangible d'approfondir nos connaissances sur le cerveau et de développer des perspectives thérapeutiques novatrices.
Procédures
Les injections intra-peritoneales (i.p) se font dans toutes les procédures. La nuisance provoquée par les injections i.p. est un stress et la douleur de l’injection (qui est modérée). Les injections ont une durée de 2 secondes environ et elles se font avec les animaux en vigile. Pour un test les animaux subiront 6 injections (une par jour) et dans le cas des expériences avec les agents pharmacologiques, une injection de plus pour administrer l’agent. Dans les cas des autres test, les souris vont recevoir seulement une injection dans le cas d’administration d’un agent pharmacologique. . Pour la chirurgie et l’injection d’un virus ou de l’implantation d’une fibre optique (durée 90 minutes environ dans les deux cas), les animaux seront d'abord placés dans une boîte contenant 5% d'anesthesique pour l'induction d'une anesthésie générale pour éviter toute douleur.
Impact sur les animaux
Les procédures utilisées dans ce projet varient en fonction de leurs effets sur les souris. Nous utiliserons des protocoles comportementaux et des chirurgies. Quelques souris vont subir une expérience longue [19 jours pour AF/25 jours pour RT]. Cela peut entrainer une perte de poids aux souris. Dans ce protocole aussi les injections de LiCl produisent du malaise aux animaux pendant environ une heure. Pour le protocole de conditionnement opérant aversif, certains souris reçoivent pendant une seconde des chocs au pied [0,4mA] pour induire le conditionnement. Cela leur produit une douleur et du stress également. Dans le cas du protocole opérant appétitif, la nourriture sera restreinte avant de commencer l’expérience et les souris peuvent avoir une perte de poids. Les autres test comportamentaux n’impliquent pas un risque ou aucune nuisance aux souris, sauf le stress de leur manipulation et déplacement de leur cage à la structure où elles doivent faire la tache comportementale. Pourtant, la nuisance peut être due à l’injection intra péritonéale. Cela peut induire du stress aux souris. Les chirurgies entrainent une perte de poids, de la douleur et du stress à la souris.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des toutes les procédures, car les procédures entrainent une plasticité cérébrale et apprentissage qui empêchent pouvoir utiliser ces animaux à nouveau.
Remplacement
A ce jour, notre connaissance de l'organisation des circuits neuronaux chez les mammifères, y compris l'homme, ainsi que leur plasticité, ne nous permet pas de concevoir et de réaliser des simulations numériques fiables pour étudier les changements qui se produisent. En outre, l'utilisation d'invertébrés, dont le système nerveux est complètement différent, serait inappropriée. Dans ce contexte, le recours à des expériences sur les mammifères reste nécessaire. Le but du projet est d'étudier un phénomène comportemental qui ne peut pas être reproduit par des études in-vitro (dans des cultures cellulaires) car il s’agit de tests comportementaux. De plus, les symptômes de type psychotique sont très complexes et ne peuvent pas être étudiés dans d'autres modèles animaux comme le poisson zèbre, le cobaye...etc. L'utilisation de souris comme modèles animaux pour reproduire certains des symptômes a été le pilier de la littérature.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux ne doit pas dépasser 10 animaux, c'est-à-dire le nombre minimum d'échantillons permettant l'application des tests statistiques classiques dans le domaine et également décrits dans la littérature scientifique sur le sujet. Les chiffres attendus garantissent une bonne interprétation des résultats. Toutefois, si l'expérience montre que les échantillons peuvent être réduits, ils le seront en conséquence.
Raffinement
Pour le R de raffiner, tous les protocoles sont optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux tout au long de cette étude. Les animaux sont logés dans des cages collectives avant et après la manipulation, avec un environnement enrichi (matériel de nidification) et un accès libre à l'eau et à la nourriture. Nous attendons au moins 1 semaine (7 jours) pour permettre aux animaux de s'adapter au cycle jour/nuit de notre animalerie expérimentale. Pour le point limite, nous le définissons par un état anormal constaté sur deux jours consécutifs (perte de poids de 15%/jour, ataxie, hypolocomotion, pelage non soigné). Si ce point est atteint, le vétérinaire en sera informé et nous prendrons une décision ensemble pour le bien-être de l’animal. Ensuite, les souris vont subir les protocoles expérimentaux avec accès à la nourriture et à l'eau. Elles seront soigneusement surveillées comme mentionné avant. Dans le cas des expériences de restriction d'eau, le poids et le bien-être des animaux seront soigneusement surveillés. Si des procédures douloureuses sont utilisées (p. ex. chirurgie stéréotaxique), l'utilisation appropriée d'un anesthésique et d'un analgésique est prévue. De plus, les animaux seront logés dans des cages collectives avant et après la manipulation. Les souris sont hébergées avec du matériel de nidification en coton dans des conditions optimales de température, d'humidité et de lumière. Les souris sont observées quotidiennement par du personnel qualifié ainsi que par des expérimentateurs formés conformément à la réglementation en vigueur, afin que des mesures d'analgésie et de bien-être soient prises immédiatement si nécessaire. L'établissement des points limites est basé sur une évaluation de l'état général et du comportement des animaux, comme expliqué dans la procédure. Toutes les procédures chirurgicales, tant préopératoires que postopératoires, comprennent également l'utilisation d'analgésiques pour la gestion de la douleur et doivent être effectuées par des expérimentateurs formés à la chirurgie des rongeurs, conformément à la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
À ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères, y compris l'homme, et surtout leur plasticité, ne permet pas de concevoir et de mettre en œuvre des simulations numériques fiables permettant d'étudier les changements qui se produisent. De plus, l'utilisation d'invertébrés dont le système nerveux est complètement différent serait inappropriée. Dans ce contexte, l'expérimentation animale reste nécessaire. La souris est le modèle idéal pour ces trois raisons 1) Possibilité d'étudier des mutants pour une protéine donnée (dans ce cas le récepteur CB1), 2) Reproductibilité et comparabilité avec d'autres résultats obtenus dans le laboratoire et la communauté scientifique au sens large. 3) Les installations sont équipées pour les études sur les rongeurs. Les animaux seront âgés de 8-17 semaines pour l’étude des comportements. Les animaux qui vont subir les protocoles comportementauxdoivent être adultes, donc ils devront avoir 10-13 semaines. Pour les animaux qui vont avoir l’une des deux chirurgies, les chirurgies vont être faites à l’âge de 8 semaines, et après une convalescence de quelques semaines, les tests comportementaux seront réalisés. Par conséquent, l’étude avec ces animaux se fera quand ils auront 12-17 semaines.
Identification d’une nouvelle piste thérapeutique dans l’atteinte pulmonaire de la sclérodermie systémique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Abordées chirurgicalement sous anesthésie générale pour recevoir de la bléomycine directement dans la trachée, 228 souris vont être utilisées, 20 tuées avant tout réveil et 208 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à J14 pour analyse des poumons, après cinq séances d'imagerie par tomographie de trente minutes. La fibrose ainsi provoquée sert à tester si une protéine, CD146, peut devenir une cible thérapeutique dans la sclérodermie systémique. Le porteur décrit une douleur et une perte de poids possibles après la chirurgie, et annonce vouloir mettre au point une instillation non chirurgicale pour "limiter la morbimortalité des souris", reconnaissant ainsi que la technique employée aujourd'hui en tue une partie.
Objectifs
La sclérodermie systémique (ScS) est une pathologie auto-immune caractérisée par une mauvaise fonction des petits vaisseaux sanguins responsables d’une inflammation cutanée et fréquemment pulmonaire. L’atteinte pulmonaire, appelée fibrose, est responsable d'une toux et essoufflement handicapant des patients pouvant aboutir au décès. Cette atteinte représente la principale cause de décès et son mécanisme reste mal connu. CD146 une protéine impliquée dans la formation des vaisseaux été récemment identifiée comme une nouvelle piste thérapeutique dans la ScS. Nous avons montré dans l’atteinte cutanée chez l’humain et dans un modèle de sclérodermie cutanée induite par la bléomycine (agent profibrosant), que CD146 était impliqué. Ces résultats nous conduisent aujourd’hui à poser l’hypothèse du rôle de CD146 dans la fibrose pulmonaire sclérodermique et d’en étudier le mécanisme. Pour cela nous comparerons le développement d’une fibrose pulmonaire induite par la bléomycine entre des souris saines et des souris pour lesquelles le gêne CD146 a été inactivé. Nous étudierons les mécanismes impliqués et évaluerons l’efficacité d’un traitement par CD146 afin de prévenir ou diminuer la fibrose pulmonaire. Ces résultats permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la fibrose pulmonaire de la ScS et de proposer CD146 comme nouvelle piste thérapeutique pour le traitement des patients.
Bénéfices attendus
L‘évaluation du rôle de la protéine CD146, une protéine impliquée dans la formation des vaisseaux, dans notre modèle murin de fibrose pulmonaire permettra d’approfondir les connaissances dans le domaine de la fibrose pulmonaire de la sclérodermie systémique. La mise en évidence d’une telle voie physiopathologique et d’un tel marqueur permettra d’obtenir un outil d’évaluation et pronostic simple pour les patients atteints de sclérodermie avec fibrose pulmonaire mais surtout de développer des thérapeutiques ciblées sur CD146 dans cette population à haut risque de mortalité.
Procédures
Les animaux seront soumis à une instillation intratrachéale, qui dure 10 minutes, de bléomycine (un agent profibrosant) ou sérum physiologique sous anesthésie générale par voie chirurgicale. Nous tenterons également de mettre au point un modèle par instillation par voie non chirurgicale afin de limiter la morbimortalité des souris. Les animaux auront une imagerie, qui dure 30 minutes,par tomographie par emission de positons à J-1 , J0, J3, J7 et J14 sous anesthésie générale. A J14, les animaux seront euthanasiés après anesthésie générale pour analyse des poumons
Impact sur les animaux
Du fait de l’instillation intratrachéale d'un agent profibrosant, une douleur et une perte de poids pourront suivre la chirurgie. Une surveillance particulière sera réalisée. Le protocole sera arrêté si l'animal présente des difficultés à respirer, s'il est prostré ou si la perte de poids de l'animal est supérieure ou égale à 20%. Grille d'évaluation de la douleur permettant de reconnaître la douleur, de la quantifier et d’agir. Au moyen de cette grille, nous déterminerons un score régulièrement (3 fois/semaine). Ainsi, selon le score obtenu, l'analgésie peut- etre effectuée (score 4 à 9). Si le score est élevé (10 à 20) : l’arrêt de l’expérimentation par mise à mort de l’animal sera immédiate.Grille d'évaluation de la douleur permettant de reconnaître la douleur, de la quantifier et d’agir.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour analyse histologique des tissus.
Remplacement
Notre projet nécessite l’utilisation d’animaux. Malgré les stratégies de remplacement mises en place dans le projet, ces dernières ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de l’isolement des cellules du contexte physiologique. Par ailleurs, les animaux génétiquement modifiés (souris transgéniques et knockouts) représentent un atout majeur pour l’obtention de résultats les plus pertinents relatifs à la compréhension des maladies humaines. Ainsi, l’expérimentation animale utilisant des souris sauvages et génétiquement modifiées est indispensable à l’étude intégrée des phénomènes physio-pathologiques et à la réalisation de notre projet.
Réduction
Nous utiliserons un nombre d’animaux en fonction des données disponibles dans littérature. L’objectif sera d’obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence une différence entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre tout en réduisant le nombre d’animaux au minimum nécessaire. Un dernier lot d’animaux sera nécessaire afin d’optimiser la procédure et limiter la souffrance. Le protocole initial et tel qu’il est décrit dans la littérature consiste en une instillation intra-trachéale par voie chirurgicale. Au cours de l’étude nous nous efforcerons de mettre en place une technique non chirurgicale par intubation en passant par les voies naturelles. Cela limitera la mortalité mais aussi la morbidité liée à la douleur tout en garantissant une technique d’induction aussi efficace. Afin de limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal, tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions reliées à l'étude, des stratégies ont été mises en place. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. De plus nous procèderons à une utilisation maximale les données obtenues sur chaque animal. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire et génétique des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Des stratégies d’optimisation sont mises en place au cours du projet afin de réduire voire de supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse.
Raffinement
L'induction trachéale s'effectue sous anesthésie des souris à la kétamine/xylazine par voie intra-péritonéale, avec injection de buprénorphine 30 minutes avant l'incision et d'une anesthésie locale de la souris par injection sous-cutanée de lidocaïne 5%. Du fait de l’instillation intratrachéale de bléomycine, une douleur et une perte de poids pourront suivre la chirurgie. Une surveillance particulière quotidienne sera réalisée. Le protocole sera arrêté si l'animal présente des difficultés à respirer, s'il est prostré ou si la perte de poids de l'animal est supérieure ou égale à 20%. Au moyen de la grille d'évaluation de la douleur, nous déterminerons un score régulièrement (3 fois/semaine). Grille d'évaluation de la douleur permettant de reconnaître la douleur, de la quantifier et d’agir. Ainsi, selon le score obtenu, l'analgésie peut- etre effectuée (score 4 à 9) par administration de buprénorphine .Nous nous efforcerons de mettre au point une technique non invasive par instillation à travers une sonde d’intubation oro-trachéale. Ainsi aucune douleur et gêne ne pourra être attribuée à l’induction, limitant ainsi la douleur et les décès pour la procédure.
Choix des espèces
Les souris utilisées seront des souris mâles et femelles C57bl/6. Nous utiliserons ces souris car c’est l’espèce de souris la plus utilisée dans la littérature pour le modèle murin de fibrose pulmonaire induit par bléomycine. En effet les thérapeutiques disponibles actuellement ont été évaluées sur un modèle murin de fibrose pulmonaire. L’utilisation de cette espèce nous garantit donc des résultats analysables et extrapolables aux données déjà disponibles dans la littérature. Les souris seront à un stade adulte, elles auront ainsi entre 8 et 12 semaines lors de l’induction, cet âge est celui utilisé dans la littérature pour l’induction de fibrose pulmonaire.