Souris
Génération d’un nouveau modèle d’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les femelles sont privées de leurs ovaires par chirurgie, six semaines avant la suite du protocole, pour reproduire la forme d'insuffisance cardiaque qui touche surtout les femmes. 156 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une pompe implantée sous la peau qui diffuse des molécules provoquant hypertension et hypertrophie du cœur, puis trois échographies sous anesthésie et trois mesures de pression artérielle sur animal vigile, sur huit semaines. Le porteur écrit que l'ovariectomie n'induit pas d'effets indésirables, et décrit par ailleurs une dyspnée qui peut être sévère en phase terminale, moment où les souris sont tuées.
Objectifs
L'insuffisance cardiaque (IC) se caractérise par une incapacité du coeur à assurer sa fonction de pompe circulatoire et donc à remplir les besoins de l’organisme en perfusion de sang oxygéné. Ce projet porte sur une forme d’IC qui se caractérise par des défauts de relaxation du cœur. Cette forme d’IC touche un peu plus les femmes que les hommes, ; elle est fortement associée à l’âge et aux autre maladies cardiovasculaire (ex : hypertension) et touche près de 50 % des patients en IC. Ces patients souffrent d’une sévère perte de qualité de vie et d’hospitalisations répétées avec une mortalité importante. Actuellement, très peu de traitements efficaces ont été identifiés. Notre projet général d’équipe a pour but de tester de nouveaux médicaments pour ce syndrome sur un modèle murin. Nous testerons des molécules induisant l’hypertension artérielle et l’hypertrophie du cœur pour établir ce modèle au sein de notre laboratoire et comparer la réponse entre les mâles et les femelles. Le but de ce projet est donc de mettre en place ce modèle spécifique d’insuffisance cardiaque afin d’établir un protocole reproductible et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés dans nos investigations futures.
Bénéfices attendus
La capacité fonctionnelle et la qualité de vie chez les sujets souffrant de l’IC avec une fraction d’éjection systolique préservée sont gravement altérées. En effet, le cœur de ces patients n’arrive pas à éjecter suffisamment de sang vers les organes car il n’arrive pas à se relaxer suffisamment durant la phase de relaxation. Ce dysfonctionnement conduit à une intolérance à l’exercice physique et des effets néfastes sur d’autres organes comme les poumons (hypertension pulmonaire) et les muscles squelettiques. Les traitements développés depuis plusieurs décennies ne sont pas ou peu efficaces pour ces patients. L'IC est une maladie affectant plus d’ 1 million de personnes en France et environ la moitié de ces patients souffrent ICFEp ce qui représente un coût socio-économique et humain majeur pour le système de santé en France. Il est donc essentiel de poursuivre la recherche thérapeutique dans ce domaine. Le bénéfice principal attendu de projet pilote est l’établissement d’un modèle murin reproductible et bien caractérisé qui pourra ensuite être utilisé par différentes équipes au niveau de notre laboratoire et au niveau national.
Procédures
Souris mâle: durée de la procédure 8 semaines Les animaux auront une injection (environ 15 secondes) sous anesthésie locale (environ 1heure) 6 semaines avant l'implantation d'une mini pompe osmotique qui permettra l'administration des produits (durée 20 minutes) sous anesthésie générale (30 minutes). Au cours des 8 semaines: 3 échocardiographies sous anesthésie générale (durée environ 15 minutes) et 3 mesures de la pression artérielle sur animaux vigiles seront réalisées. Une habituation est réalisée pendant 4 jours précédents la première de pression artérielle,mesure qui a lieu le 5ème jour pour diminuer l’élévation de la pression artérielle par le stress associé à la procédure. Souris femelles: durée de la procédure 8 semaines Les ovariectomies seront réalisées 6 semaines avant l'implantation de la minipompe (deux chirurgies :durée 20 minutes chacunes sous anesthésie générale (environ 30 minutes)). Les injections (environ 15 seconde) sous anesthésie locale (environ 1h) débuteront le jour d'après l'ovariectomie. Au cours des 8 semaines: 3 échocardiographies sous anesthésie générale (durée environ 15 minutes) et 3 mesures de la pression artérielle sur animaux vigiles seront réalisées. Une habituation est réalisée pendant 4 jours précédents la première de pression artérielle,mesure qui a lieu le 5ème jour pour diminuer l’élévation de la pression artérielle par le stress associé à la procédure.
Impact sur les animaux
La procédure d'implantation de la micropompe osmotique au niveau sous-cutanée correspond à une chirurgie minimale, très souvent source d'un niveau de douleur très limitée et relativement bien tolérée par les animaux. Le seul risque (rare) observé lors de ces interventions correspond à une protrusion de la pompe. Dans ce cas, la pompe peut être réinstallée et la suture refaite. De plus du fait de l’opération les souris peuvent avoir une difficulté à l’accès à la nourriture ce qui pourrait entrainer une perte de poids. Au moment de l’échographie les yeux des souris peuvent subir un léger dessèchement. Le syndrome d’insuffisance cardiaque lui-même, induit une dyspnée qui peut être sévère et une incapacité à l’effort. Ces deux symptômes peuvent induire un stress psychique sur la souris en phase terminale. Cet effet n’est pas prolongé dans le temps puisque les animaux sont sacrifiés lorsqu’ils arrivent dans cette phase terminale. L’ovariectomie elle-même n’induit pas d’effets indésirables.
Devenir
Tous les animaux du projet sont euthanasiés en fin de procédure.
Remplacement
Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d'étudier la fonction cardiaque dans un contexte physiopathologique complexe et multifactoriel impliquant une circulation sanguine avec pression artérielle, une régulation neurohormonale du rythme et de la contractilité cardiaque et une étude du retentissement sur différents organes majeurs impliqués dans l’évolution de l’IC tels que les poumons, les reins et les muscles squelettiques notamment. Les modèles cellulaires ne permettent pas d’étudier le fonctionnement physiologique intégré du cœur et l’effet de l’ICEFp sur d’autres organes. Une légère douleur peut être associée à l’ovariectomie correspondant à l'incision musculaire et cutanée, de plus l’absence d’ovaire n’est pas associée à une douleur.
Réduction
Une planification minutieuse basée sur un calcul de puissance et l’expertise de l’équipe ont permis l'estimation de la taille d'échantillon optimale. Ceci a permis de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité statistique de l’étude, et de conserver une puissance statistique suffisante pour observer un effet de 40% obtenu l’altération de la fonction diastolique (critère principal retenu dans cette étude). Les fonctions cardiovasculaires sont étudiées par des méthodes non invasives permettant de limiter le nombre d’animaux car on peut les mesurer à différents temps sur le même animal. Alors que les méthodes invasives sont des procédures terminales. De plus, afin de minimiser encore le nombre d’animaux utilisés, en fin d’expérimentation les tissus prélevés sont partagés entre les domaines explorés. Les analyses statistiques seront la comparaison de moyennes entre deux groupes, le groupe contrôle est implanté avec une pompe remplie de sérum physiologique et le groupe ICFEp est implanté avec une pompe diffusant la combinaison diluée dans le sérum physiologique. La variation séquentielle des doses est une procédure par étape qui permet de ne pas nécessairement réaliser l’étude de tous les groupes si une des doses convient. Cela limite potentiellement le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Après implantation de la minipompe osmotique, les souris seront observées tous les jours. Les cages sont changées 1 fois par semaine. Les animaux sont hébergés selon les conditions fixées par l'arrêté du 1er février 2013 fixant les conditions d'agrément, d'aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs. Les opérations chirurgicales (pose de minipompe et ovariectomie) sont induites en respectant au maximum les procédures du bien-être animal et en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques. L’expérimentateur, le personnel de l’animalerie seront informés des critères d’observation des animaux qui seront : l’état général, l’état de la cicatrice, le comportement de prostration, la courbure de la colonne vertébrale, l’état du poil (manque d’hygiène), et un critère propre à l’étude de l’IC qui est la manifestation d’une dyspnée sévère. Le poids des animaux sera également relevé quotidiennement. Après l’échographie l’animal est placé dans une cage propre. Au moment de l’échographie les yeux des souris peuvent subir un léger dessèchement ainsi une pommade de protection sera appliqué. Après son réveil complet, l'animal il est remis dans sa cage. Pour les opérations chirurgicales, les animaux sont anesthésiés, pour les maintenir immobiles. Une fois anesthésiés et endormis, ils reçoivent une injection en sous-cutanée d'analgésique. Au réveil, chaque souris est isolée dans une cage pendant quelques heures, au calme et au chaud puis stabulé à 4 ou 5 souris /cage. En post opération, la cicatrisation cutanée de la zone opérée est surveillée régulièrement. Le seul risque (rare) observé lors de ces interventions correspond à une protusion de la pompe. Dans ce cas, la pompe peut être réinstallée et la suture refaire. Un traitement antalgique est alors donné en complément. Une habituation est réalisée pendant 4 jours précédents la première mesure de pression artérielle qui a lieu le 5ème jour pour diminuer l’élévation de la pression artérielle par le stress associé à la procédure.
Choix des espèces
La souris est un des modèles les plus utilisés en recherche biomédicale. La structure des tissus musculaires et cardiaques murins est très proches de celle de l’homme. De plus les souris se reproduisent rapidement et de nombreuses études en IC ont été réalisées chez la souris ce qui nous permettra plus tard de discuter nos résultats par rapport aux autres études publiées. Les souris seront utilisées à l’âge de 2 mois pour avoir la taille minimum pour procéder à implantation de mini pompe osmotique.
Evaluation de l’efficacité du 4P024 sur la prévention du mésusage du méthylphénidate dans le cadre du traitement du trouble du déficit de l’attention avec ou sans hyperactivité (TDAH).
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 216
Une société pharmaceutique fait tester une formulation associant du méthylphénidate à une molécule anti-abus, sur 216 rats et 710 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les rats reçoivent un cathéter veineux et subissent une chirurgie intracrânienne avant d'être hébergés seuls, les souris recevant des injections répétées pendant dix jours qui leur laissent des hématomes abdominaux. Le RNT décrit ces procédures en une seule phrase et résume les atteintes en deux lignes, sans détailler les protocoles d'auto-administration ni les tests de préférence de place. Tous les animaux sont tués à l'issue, et le porteur renvoie pour la toxicité des deux molécules à des "rapports confidentiels" de son propre laboratoire.
Objectifs
Les psychostimulants prescrits tels que le méthylphénidate (MPH) ou les amphétamines (AMPH) sont aujourd’hui indiqués pour le traitement du trouble du déficit de l’attention avec ou sans hyperactivité (TDAH). Ces traitements vont réduire les symptômes liés à la maladie en augmentant l’attention et la vigilance et en réduisant l’hyperactivité. Ils sont généralement sans danger lorsqu’ils sont utilisés à des doses thérapeutiques via la voie d’administration autorisée. Cependant, ces stimulants présentent un potentiel addictif important et sont classés comme substance contrôlée par les organismes de réglementation. L’abus et le mésusage de psychostimulants est devenu un problème de santé majeur. Ces médicaments sont détournés de leur usage normal dans un but récréatif. Après une utilisation répétée et fréquente, se développent des phénomènes de tolérance et de sensibilisation qui modifient la prise de stimulants. Cela renforce la nécessité de prendre plus de pilules entraînant une dépendance et une éventuelle surdose accidentelle. Les troubles liés à l’usage de substances représentent une préoccupation mondiale qui peuvent provoquer une addiction très sévère voire la mort. Il est nécessaire de développer des formulations dissuasives traitant des problèmes d’abus/de mésusage et permettant une prévention de l’addiction aux stimulants pour une utilisation sûre chez les patients atteints de TDAH. Dans le cadre de programme de maturation, nous développons au stade préclinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie (in vitro et/ou in vivo), de pharmacocinétique et d’efficacité sont réalisées. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif l’évaluation d’une formulation dissuasive composée par une combinaison d’un stimulant et d’une molécule anti-abus pour prévenir l’abus, le mésusage et l’addiction associés à la prise de psychostimulants.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'évaluer le pouvoir anti-addictogène du 4P024 dans le cadre du traitement du TDAH. Les résultats attendus permettront d'apporter la preuve de concept de ce composé et ainsi de proposer un traitement du TDAH beaucoup plus sécurisant que le méthylphénidate seul. Connaissant les ravages du mésusage du MPH aussi bien aux Etats-Unis qu'en Eurpoe, le bénéfice pour les patients sera très important.
Procédures
Installation d'un cathéter veineux, chirurgie intracranienne, consommation de psychostimulant, injections répétées sur 10 jours. Chacune des chirurgies ne durera pas plus que 30 minutes et ne seront effectuées qu'une seule fois.
Impact sur les animaux
Rats : Douleurs post-chirurgicales légères à modérées, hébergement isolés. Souris : hématomes abdominaux suite aux injections répétées.
Devenir
Tous les rats auront été soumis à une ou plusieurs chirurgie et ne seront donc pas éligibles à l'adoption ou au replacement. Ces animaux seront donc mis à mort à la fin des procédures. De plus, tous les rats ayant une implantation intra-cérébrale devront faire l'objet d'une vérification histologique des sites d'implantation. Les souris auront reçus plusieurs injections de méthylphénidate et ne pourront donc pas non plus être replacées ou proposées à l'adoption.
Remplacement
Les deux molécules constituant le 4P024 ont une AMM pour un usage chez l’homme et ont donc déjà fait l’objet d’études précliniques de toxicité (rapports confidentiels du laboratoire 4P Pharma). Les doses choisies pour la fabrication du 4P024 tiennent compte de cette toxicité. Malheureusement, il n'existe à ce jour aucune méthode alternative permettant de reproduire in vitro, ex-vivo ou in silico, la complexité comportementale des troubles psychiatriques y compris les troubles de l'usage de drogues. Il nous est donc nécessaire de réaliser nos projets en utilisant des animaux. Les rats sont les animaux de référence dans les études d'auto-administration et les souris dans les études de préférence de place conditionnée et de sensibilisation comportementale. Nous utiliserons donc ces 2 espèces qui ne peuvent pas être remplacées par d'autres moins évoluées.
Réduction
Le nombre d'animaux calculé pour chacune des procédures tiens compte de la compléxité des différentes étapes des procédures (chirurgie, apprentissage de la tâche) qui va impacter le nombre final d'aniamux qui seront utilisable pour l'analyse statistique. Nous estimons à environ 20% la erte des animaux en raison de ces différentes étapes. Quand cela est possible nous allons utiliser les animaux d'une procédure pour une autre procédure sans que ça n'impacte le bien-être des animaux.
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement pour l'évaluation de leur bien-être. De plus, les animaux seront manipulés tous les jours et seront placés dans des cages enrichies. Suite aux chirurgies, les soins adaptés seront appliqués et une surveillance accrue sera effectuée. Les douleurs potentielles seront traitées avec des analgésiques adaptés et les animaux cathétérisés seront traités aux antibiotiques pour éviter toute infection.
Choix des espèces
Les rats sont les animaux de référence dans les études d'auto-administration et les souris dans les études de préférence de place conditionnée et de sensibilisation comportementale. Nous utiliserons donc ces 2 espèces qui ne peuvent pas être remplacées par dautres moins évoluées. Tous les animaux utilisés dans cette étude seront adultes. L'utilisation d'animaux adultes dans la recherche sur les troubles de la consommation de drogues est justifiée scientifiquement en raison de la similitude physiologique et neurologique avec les humains adultes. Les modèles animaux adultes offrent une représentation plus précise des réponses comportementales et des mécanismes neurobiologiques impliqués dans la dépendance aux drogues, permettant ainsi aux chercheurs de mieux comprendre les processus sous-jacents et de développer des interventions thérapeutiques plus efficaces. De plus, l'utilisation d'animaux adultes permet de capturer les effets à long terme de l'exposition aux drogues, offrant ainsi une perspective plus complète sur les troubles de la consommation de drogues chez l'adulte.
Approches thérapeutiques pour la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Anesthésiées pour recevoir un virus par injection derrière l'œil, puis une heure durant pour une IRM, 1 920 souris porteuses de la mutation de Huntington vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont transportées entre trois établissements, dont un en Belgique, et toutes sont tuées pour prélever leur cerveau. Le projet teste deux approches censées restaurer un transport de molécules défaillant dans les neurones, validées jusqu'ici sur des cellules. Sept tests comportementaux sont annoncés, un par jour, sans que le RNT précise lesquels, alors que deux d'entre eux sont décrits comme des stress modérés, un jeûne de 24 heures et un isolement de 48 heures.
Objectifs
Ce projet a pour but de tester in vivo 2 approches thérapeutiques qui ont été validées in vitro contre la maladie de Huntington. Ces approches thérapeutiques sont développées dans le but de restaurer un manque de transport de molécules dans les neurones. Ce projet se déroule dans 3 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Le but du projet est de tester 2 nouvelles approches therapeutiques permettant de retarder la progression de la maladie, ou d’empêcher l’apparition des symptômes. Nous avons récemment mis en place un outil nous permettant de tester cette approche sur des cellules et de valider son effet bénéfique. Ces résultats prometteurs nécessitent désormais une validation sur des animaux en vue de proposer des thérapies aux patients atteints par cette maladie.
Procédures
Les animaux de ce projet vont développer en vieillissant la maladie de Huntington caractérisée par des symptômes neurologiques et moteurs légers qui ne sont observés que lors de certains tests comportementaux conçus à cet effet. L'élevage des animaux utilisés dans ce projet pourra être réalisé dans 2 établissements utilisateurs. À l'âge d'un mois, les animaux seront transportés dans le troisième établissement utilisateur pour y être manipulés comme suit: 1) les animaux seront anesthésiés deux fois, une fois pendant 5 minutes le temps d'injecter le virus qui sert à apporter la molécule d'intérêt dans le cerveau des animaux (durée de l'injection 30 secondes), et une autre fois pendant 1h le temps de l'acquisition des images IRM; 2) 7 tests comportementaux seront réalisés avec ces animaux (1 test par jour, répartis sur une durée de 1 à 2 semaines en fonction du nombre d'animaux testés).
Impact sur les animaux
Les modèles de souris utilisés dans cette étude sont des modèles largement utilisés dont le phénotype devient dommageable avec l’âge, par l’expression de symptomes modérés. Ces symptômes neurologiques et moteurs associés au modèle ne sont observés que lors de tests comportementaux fins conçus à cet effet. Avec l’âge, les symptômes neurologiques (anxiété, dépression, désinhibition) et moteurs (perte d’équilibre, manque de précision dans les mouvements) sont de plus en plus visibles lors des tests comportementaux mais ne deviennent pas handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte de poids excessive. Nous ne nous attendons pas à observer de points limites ni de mort prématurée chez ces animaux dus au phénotype. Nous pouvons identifier plusieurs effets indésirables sur les animaux lors de l’expérimentation : 1) un stress léger pendant leur transport dans établissement utilisateur à l'autre; 2) un stress léger lors de la manipulation pour les injections rétro-orbitales pendant lesquelles les animaux seront anesthésiés une seule fois pendant 5 minutes le temps d'injecter le virus (durée de l'injection = 30 secondes); 3) un stress modéré lors du test de l'alimentation supprimée par la nouveauté, impliquant une mise à jeun de 24h; 4) un stress modéré lors du test d’actimétrie impliquant un isolement prolongé de 48h; 5) un stress modéré pendant leur transport en Belgique; 6) un stress léger pour les expériences d'IRM pendant lesquelles les souris seront anesthésiées pendant 1h avec un anesthésique volatile.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux en vue des études histologiques et biochimiques qui nous permettrons de comprendre les mécanismes des approches thérapeutiques évaluées dans ce projet.
Remplacement
Le projet traitant de réseaux neuronaux complets, il nous est impossible de remplacer le modèle animal vivant par des cultures cellulaires ou des simulations informatiques. Nos résultats in vitro nous ont déjà permis de valider les constructions virales et donc de réduire les nombre d'animaux testés in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’un test statistique d’estimation de la taille d’échantillon optimale grâce aux variances déterminées dans des études préliminaires de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. Nous prévoyons une analyse du comportement des animaux, suivi d’analyses post-mortem des cerveaux. Puisque nous avons observé que les résultats comportementaux pouvaient varier en fonction du sexe dans le modèle souris, tous les groupes seront composés de 50% d‘animaux mâles et 50% d’animaux femelles afin de pallier de potentielles disparités dans les résultats. Dans l’éventualité où aucune différence significative n’est observée entre mâles et femelles, les animaux des deux sexes seront regroupés au sein d’un même groupe de traitement afin d’augmenter la puissance des tests statistiques.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les animaux seront hébergés dans des cages équipées d’une litière stérile et des matériaux permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. Tous deux seront changés toutes les semaines. Les cages seront équipées d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, changés également toutes les semaines. Le transport des animaux sera effectué en cages occultées avec leurs nids et des croquettes mouillées dans la cage. Les groupes sociaux initialement formés dans les cages seront conservés lors du passage d’une animalerie à l’autre. Nous laisserons aux souris au moins une semaine d'acclimatation avant de commencer les expériences. Lors des injections de virus, les animaux seront anesthésiés une seule fois pendant 5 minutes le temps d'injecter le virus (durée de l'injection = 30 secondes). Dans la littérature, aucun signe de douleur lié directement à ce type d'injection n'a pu être observé. Bien que la procédure est peu invasive et très rapide (5 min), des points limites suffisamment précoces et adaptés ainsi que des critères d'arrêt des souffrances seront mis en place. Pour limiter leur stress lors du test d'alimentation supprimée par la nouveauté, la nourriture sera remise à volonté dans les cages dès que chaque animal aura terminé le test. Pour éviter que le test de mesure d'activité n’impacte le reste des expérimentations, il sera réalisé en dernier, avant le sacrifice des animaux. Durant toute la procédure d'imagerie IRM, les souris seront anesthésiées pendant 1h et leur température corporelle sera maintenue à 36.5°C. Les souris seront envoyées avec un transporteur agréé avec un délai de livraison de maximum 24h après leur enlèvement. L’état de santé des animaux sera surveillé régulièrement par des mesures de poids jusqu'a leur mise à mort. Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement.
Choix des espèces
Compte tenu de la similarité de l'anatomie du cerveau avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de la maladie de Huntington. Les modèles souris choisis permettent de comprendre le rôle de la protéine responsable de cette maladie et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Les maladies neurodégénératives se développent dans la majorité des cas à l’âge adulte chez l’Homme. Le but du projet est de tester 2 nouvelles approches thérapeutiques permettant de retarder la progression de la maladie, ou d’empêcher l’apparition des symptômes. Les animaux seront utilisés à l’âge de 10-12 mois car c’est à partir de 6-8 mois qu’ils commencent à développer des troubles moteurs et de mémoire observables en étude de comportement.
Utilisation d’animaux pour la formation interne continue du personnel – Formation et perfectionnement aux gestes techniques – : gavage, prélèvements sanguins et injections chez le rat et la souris
- Formation professionnelle
Rats : 150
Souris et rats écartés d'autres protocoles après génotypage, animaux surnuméraires ou de réserve, tous "destinés à être sacrifiés" selon le porteur : 250 souris et 150 rats vont être utilisés pour entraîner le personnel de l'animalerie aux gestes techniques. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger, sauf pour 75 ratons anesthésiés puis tués sans réveil aussitôt après une injection intraveineuse, afin de vérifier que le colorant s'est bien dispersé. Chaque animal subit au plus deux injections ou deux prises de sang par séance, ou un gavage, et peut être réutilisé lors de séances ultérieures avec au moins une semaine de récupération, jusqu'à sa mise à mort à un an pour les souris et deux ans pour les rats. Le porteur indique envisager des vidéos et des mannequins imitant rats et souris pour réduire ce recours, et conclut que l'utilisation d'animaux vivants reste "incontournable".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mettre en place des formations régulières au sein de notre animalerie pour l'acquisition ou le maintien de compétences concernant différents gestes techniques chez le rat et la souris. Cette démarche vise à améliorer l'efficacité des gestes effectués et à garantir le bien-être optimal des animaux dans notre établissement. Les compétences techniques incluent : prélèvements sanguins, administrations de traitements par gavage, ainsi que diverses méthodes d'injection - intraveineuse (au niveau de la veine caudale chez la souris ou veine pénienne chez le rat) - intrapéritonéale - sous-cutanée et intramusculaire. Ces formations ou entrainements s’adressent à tous les personnels du Centre appliquant des procédures expérimentales (technicien animalier, vétérinaire) ainsi que les détenteurs d’un niveau concepteur ou réalisateur en expérimentation animale, et qui nécessitent une formation encadrée pour la réalisation et l’apprentissage de certains gestes techniques ou un réentrainement à certaines techniques pratiquées moins régulièrement. Toutes les formations seront encadrées par le vétérinaire du centre, par le responsable des animaleries et/ou éventuellement par le concepteur du/des projet(s) détenteur d'une autorisation d'expérimenter. Ce projet répond également à l’Arrêté du 1er février 2013.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet au sein du Centre permettra : 1) L’acquisition et le maintien des compétences avancées en manipulations expérimentales sur des rats et des souris, renforçant ainsi l'expertise du personnel technique animalier et assurant le bien-être des animaux utilisés dans le cadre des projets expérimentaux. 2) L’optimisation des méthodologies de recherche et amélioration de la qualité des projets menés au sein de notre centre à travers une approche multidisciplinaire (personnel technique, vétérinaire, responsable animalier et porteurs de projet) 3) Favoriser la surveillance du bien-être animal et la réactivité du personnel technique concernant la détection précoce de tout signe de détresse, de douleur ou d’inconfort et la mise en place immédiate de mesures correctives
Procédures
Les animaux (rats et souris) utilisés dans ce projet de formation seront soumis à des: (i) Différents types d’injections, réalisées sur animal vigile ou sous anesthésie générale, en fonction de la technique et du site d’injection. Par session de formation, chaque animal sera soumis à une seule de ces techniques, à raison de 2 injections maximum / animal. Durée de l’intervention : entre 2 et 5 minutes (ii) Administrations par voie orale réalisées sur animal vigile. Par session de formation, chaque animal sera soumis à 1 seul gavage. Durée de l’intervention : 15-20 minutes (iii) Prélèvements sanguins réalisés par ponction veineuse au niveau de différentes veines, selon l’espèce concernée, et sur animal vigile ou sous anesthésie générale en fonction du site de prélèvement. Par session de formation, chaque animal sera soumis à des prélèvements au niveau d’un seul site veineux, à raison de 2 prélèvements maximum / animal, de façon à respecter le volume maximal à prélever sur une journée pour ces 2 espèces. Durée de l’intervention : entre 5 et 10 minutes. (iv) Différentes méthodes d’euthanasie réalisées sur animal préalablement anesthésié. Durée de l’intervention : 5 minutes
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis aux techniques suivantes : (i) Différents types d’injections chez la souris et le rat vigile ou anesthésiés. Chez l’animal vigile, la contention et l’injection pourraient provoquer un léger stress et une petite douleur au niveau du point d’injection. Chez l’animal anesthésié, pas de stress, ni de douleur attendu. (ii) Injection intraveineuse chez le raton anesthésié réalisée sous anesthésie complète, qui sera euthanasié en fin d’intervention. Pas de stress ou de douleur pour les animaux. (iii) Administration par voie orale chez la souris et le rat vigile. L’introduction d’une sonde de gavage pourrait provoquer une légère irritation de l’œsophage. (iv) Prélèvement sanguin chez la souris et le rat vigile ou anesthésié, l’acte est peu ou pas douloureux. (v)Mise à mort des souris et des rats après une anesthésie générale renforcée éventuellement par une analgésie préalable n’induisant donc pas de stress ou de douleur. Cependant, si nécessaire, une légère analgésie, voire une légère sédation avant la réalisation des différents gestes pouvant provoquer une douleur (même minime) pourra être effectuée avec accord du vétérinaire ainsi qu’une mise en place d’un traitement anti-inflammatoire si besoin, mais semble peu probable au vu des interventions. A la fin de chaque intervention, l’animal sera replacé dans son hébergement au plus tôt afin de réduire au maximum tout stress environnemental.
Devenir
Dans la mesure du possible, tous les animaux, hormis les ratons anesthésiés ayant reçu une injection intraveineuse, seront gardés en vie suite à une séance de formation pour éventuellement être réutilisés lors de séances ultérieures de formation si l’état et l’âge de l’animal le permet. Le nombre d’inclusion dans les séances de formation pour chaque animal dépendra de l’état et l’âge de l’animal aussi. La mise à mort des animaux sera à 1 an pour les souris et 2 ans pour les rats. Cependant, si l'animal présenterait des symptômes laissant penser à l'existence de douleurs chroniques ou d’atteinte de l’état général, la mise à mort de l'animal sera anticipée. Chaque animal aura un temps de récupération d’au moins 1 semaine entre 2 séances de formation. Concernant les injections intraveineuses chez les ratons anesthésiés, ils seront mis à mort immédiatement après la réalisation du geste technique afin d’étudier la dispersion du colorant injecté donc valider la bonne réalisation du geste. La procédure est donc classée sans réveil.
Remplacement
L’acquisition des compétences relatives aux prélèvements sanguins, aux injections et aux gavages sur ces animaux ne peut être réalisée de manière purement théorique et nécessite donc l'utilisation d'animaux vivants, ce qui limite le remplacement. De plus, il est nécessaire de pouvoir réaliser les gestes sur des animaux vivants de façon à appréhender toute réaction de l’animal lors des protocoles expérimentaux qui seront réalisés par la suite. L’utilisation d’animaux est donc incontournable et ne peut être remplacée par des modèles in vitro. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, un seul animal pourra participer à plusieurs formations techniques pendant son implication dans le projet, avec un délai d'au moins une semaine entre chaque session. Le nombre de participations dépendra de l'âge, de l'état général de l'animal et sa récupération. Cependant, nous avons comme objectif de progressivement élargir la mise à disposition de vidéos de techniques de bases sur rongeurs, aussi bien en tant que rappel pour le personnel le plus expérimenté, que préalablement à une partie pratique. Ceci permettra de réduire davantage le recours aux animaux pour la formation du personnel. Nous envisageons également l'utilisation de modèles imitant les rats et les souris pour acquérir les compétences nécessaires à la manipulation de ces espèces de manière éthique, permettant ainsi de réaliser les différentes procédures sans recourir à des animaux vivants.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux est choisi en tenant compte du nombre nécessaire et suffisant à la mise en place de séances de formation adaptées pour une durée de 5 ans au sein de notre animalerie. Un maximum de 30 rats et 50 souris seront nécessaires par an (estimation haute). Les animaux utilisés dans les procédures seront majoritairement des animaux de réforme, provenant de projets de reproduction, et destinés à être sacrifiés (animaux exclus d’un projet expérimental prévu suite à leur génotypage ou des animaux surnuméraires non inclus dans un projet expérimental), des animaux back up d’un projet expérimental non utilisés. En cas de besoin, des animaux destinés à ce projet de formation pourront être achetés auprès d’un fournisseur agrée. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, un seul animal pourra participer à plusieurs formations techniques pendant son implication dans le projet, avec un délai d'au moins une semaine entre chaque session. Le nombre de participations dépendra de l'âge, de l'état général de l'animal et sa récupération. En général, compte tenu de l'activité dans notre centre, le nombre de personnes à former chaque année (techniciens animaliers, de vétérinaires, de concepteurs et/ou de réalisateurs de projet, etc.) varie entre 5 et 10 (3 à 6 rats et 5 à 10 souris par personne par an, tous gestes confondus).
Raffinement
Au cours de ce projet, le souci du bien-être animal passera notamment par: - une période d'acclimatation d'au minimum 7 jours au sein de l'animalerie avant l'entrée des animaux en "protocole d'entraînement" pour les animaux autres que les animaux réformés. - de bonnes conditions d'hébergement (soins, enrichissements du milieu) - un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) - l'instauration de points limites pertinents et précoces. - la mise en place de mesures adaptées (anesthésie, analgésie…) - les formations seront encadrées par du personnel expert pour les gestes techniques appliqués. Cette étude n'aura pas d'impact environnemental.
Choix des espèces
Les espèces vivantes choisies, rats et souris, correspondent à ceux qui seront utilisées dans de nombreuse études préclinique à venir au sein de notre animalerie et qui nécessitent au préalable la mise en place des séances de formation. Les animaux utilisés lors des séances de formation seront toujours des animaux sains, non génétiquement modifiés. Dans la mesure du possible ils seront du même âge et éventuellement du même sexe que ce qui est prévu ultérieurement dans l’(les) étude(s) à venir. Le stade de développement des animaux (0 à 2 ans pour les rats et à partir du sevrage jusqu'a 1 an pour les souris) dépendra des besoins et des demandes. L’âge de l’animal sera toujours en adéquation avec la technique de prélèvement ou d’injection étudiée, et sera au plus proche de l’âge des animaux qui seront inclus dans les protocoles expérimentaux à venir.
Etude et manipulation du micro-environnement tumoral dans les méningiomes de haut grade chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
Une grille en cinq critères, notée de 0 à 15, doit déterminer le moment où les souris atteintes de méningiome seront tuées avant le terme prévu. 276 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune subit une chirurgie crânienne d'une heure pour recevoir dans le crâne des cellules de méningiome ou un virus recombinant, puis jusqu'à six injections sous la peau du crâne, et peut développer perte de motricité, amaigrissement et crises convulsives. Le projet vise à établir le rôle des cellules immunitaires des méninges dans la progression de ces tumeurs, en vue de futures immunothérapies chez l'être humain.
Objectifs
Les méningiomes sont les tumeurs primitives du système nerveux central les plus fréquentes chez l'adulte. Les formes de haut grade ont une fréquence élevée de mutation d'un gène particulier ( NF2). Ces formes représentent un quart des méningiomes avec des récidives multiples associées à une survie réduite sans option médicamenteuse ou d’immunothérapie disponible. Les méninges jouent un rôle clé dans la communication neuro-immunitaire . Les données récentes, montrent une infiltration fréquente des méningiomes non graves par des cellules immunitaires. Notre hypothèse est que le microenvironnement immunitaire méningé régule la progression maligne des méningiomes et leur comportement d’échappement à la surveillance immunitaire. Nos principaux objectifs sont d’utiliser nos modèles de souris de méningiomes de différents grades de malignité et d'évaluer le rôle des populations immunitaires méningées dans l'initiation et la progression du méningiome.
Bénéfices attendus
Notre projet va permettre de caractériser précisément le rôle du microenvironnement immunitaire dans la malignité des méningiomes-NF2 en manipulant les cellules immunitaires des méninges, pour pouvoir ultérieurement potentialiser les approches thérapeutiques associées à l'immunothérapie dans les méningiomes agressifs chez l’homme
Procédures
Pour chaque expérience, les souris vigiles adultes seront d’abord injectées en sous cutanée avec un antidouleur 30 mn avant, puis en intra-péritonéal avec du chlorure de sodium pour hydratation avant l’anesthésie. Ces gestes rapides et maitrisés par l’opérateur ne sont pas douloureux à part la piqure de l’aiguille. Puis les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse avant la procédure chirurgicale. La procédure chirurgicale sera d’injecter en intra- cranial des lignées cellulaires de méningiome ou de virus recombinant afin d’induire les méningiomes. Durée 1h préparation 30 mn. Puis une semaine après l’intervention : - les souris de la procédure 2 seront seront injectées en sous-cutanée au niveau de la peau du crâne (Durée : 3 minutes, préparation : 10 minutes) répétée 3 fois (1 par semaine pendant 3 semaines ) ou 6 fois (tous les 2 jours sur 12 jours) suivant le produit injecté pour la déplétion en cellules immunitaires. Les souris de la procédure 3 seront injectées en intra péritonéal (Durée : 3 minutes, préparation : 10 minutes) une seule fois pour l’activation d’une sous population de cellules immunitaires. A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de protocole en vue des prélèvements. .
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent développer des symptômes cliniques liés à la présence de méningiomes malins, pas bénins. Les symptômes observés chez l’animal peuvent être : une perte de motricité empêchant l'alimentation, un amaigrissement, des crises convulsives. Les gestes pratiqués chez les souris dans ce projet incluent les nuisances suivantes : les risques anesthésiques lors de l’injection sous durale tels que dépression cardio-vasciulaire, hypothermie, hypocvolémie, sécheresse cornéenne et douleurs post-opératoires. Les animaux pourront ressentir un stress lié à la contention et une douleur de très courte durée lors de l’introduction de l’aiguille pour les injections intra-péritonéales ou sous- cutanées dans les expériences de modulations des cellules immunitaires. Les signes cliniques potentiels seront soulagés par l'administration d'anti-douleurs et le suivi des points limites par du personnel qualifié. Aucune nuisance ne sera liée au génotypage. Le génotypage s’effectuera grâce à des techniques non invasives : soit en associant un prélèvement de tissu pour le génotypage (poinçon d’oreille)qui sera confondu avec la méthode d’identification , soit l’identification par bague à l’oreille et le prélèvement de follicule pileux. Dans les deux cas ces techniques sont considérées comme étant sous le seuil réglementaire.
Devenir
L'euthanasie de tous les animaux à la fin de l'ensemble des procédures est justifiée par la nécessité de réaliser une analyse histologique complète du cerveau pour répondre aux objectifs du projet.
Remplacement
Les modèles in vitro et sur animaux invertébrés ne permettent pas l'obtention de méningiomes avec un aussi grand niveau de complexité et de reproduction de la pathologie humaine que les modèles murins déjà existants. La complexité du cerveau des souris est nécessaire pour une observation comparative avec le cerveau humain.
Réduction
Nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux utilisés (Nombre total : 276 animaux) pour nous permettre de générer des données statistiques solides. Nous aurons des résultats d’animaux expérimentaux à comparer aux résultats obtenus sur les animaux dits « contrôles ». Cela permet d'avoir une évaluation rationnelle du nombre d'animaux pour pouvoir effectivement observer l'effet escompté.
Raffinement
A la réception des animaux en provenance de l’extérieur, une procédure d’acclimatation d’une semaine aux nouveaux locaux sera réalisée. Les souris seront hébergées dans des animaleries protégées, conçues dans le respect de la réglementation et des principes éthiques liés à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques et exemptes d’organismes pathogènes spécifiques. Au courps de la procédure ,les souris seront réchauffées sur tapis chauffant pendant la chirurgie, elles auront un accès facile à de la nourriture humide (contenant 70% d’eau) , des antidouleurs et des bâtonnets à ronger pour améliorer leur rétablissement. Un suivi de l’ensemble des animaux sera effectué quotidiennement par l’équipe zootechnique et par un des membres de l’équipe de recherche. Le bien- être et la douleur des animaux seront évalués par une grille de score selon 5 critères pour donner un score global d’évaluation de la douleur noté entre 0 et 15 : 1-Apparence et Grimace 2- Comportement naturel 3- Evolution pondérale 4-Comportement provoqué 5- Site de la chirurgie. Une surveillance post opératoire dédiée est réalisée afin d’identifier des signes de souffrance physique ou morale, l’apparition des points limites, et également l’apparition de signes d’infection générale ou du site opératoire.
Choix des espèces
Le modèle animal est le seul moyen de pouvoir manipuler le micro-environnement des méningiomes bénin ou malin, notamment en raison de l'absence de cultures cellulaires de méningiomes en général et plus particulièrement avec le profil mutationnel désiré et les différents composants du micro-environnement.
Comprendre comment un dysfonctionnement mitochondrial conduit à une atteinte de la régénération musculaire chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
324 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale ou un gavage chaque jour pendant cinq jours, puis une injection de toxine ou de chlorure de baryum dans le muscle de la patte, qui le paralyse le temps que dure l'effet. Le projet cherche à comprendre comment un dysfonctionnement des mitochondries perturbe la régénération du muscle, avec en ligne de mire les dystrophies musculaires et la sarcopénie. Le porteur qualifie sa propre étude de "menée de manière éthique" et affirme utiliser "judicieusement des modèles animaux" avec des "stratégies d'intervention humaines".
Objectifs
L’ensemble du projet vise à apporter de nouvelles connaissances fondamentales sur la mise en place des muscles squelettiques au cours du développement, de la régénération musculaire et des pathologies. Nous souhaitons comprendre comment les mitochondries sont impliqués dans le développement de muscles des membres. Ces études sont essentielles pour comprendre l’origine des maladies qui touchent le muscle squelettique, appelées dystrophies musculaires, ainsi que la sarcopénie. Pour cette étude, il est essentiel de recourir à des modèles murins génétiquement modifiés qui i) nous permettent de marquer et suivre spécifiquement leur devenir ou éliminer des cellules d’intérêts pour comprendre leur origine et leur fonction et ii) nous permettent d’altérer les fonctions mitochondriales. Le deuxième aspect que nous étudions est le développement du muscle post-natal et sa capacité à régénérer après une blessure ou dans des cas de dystrophies musculaires. Ces processus font intervenir des cellules souches adultes. Les cellules souches ont la propriété de générer des cellules différenciées (les myofibres) qui assurent la fonction contractile du muscle, et de s’auto-renouveler afin d’assurer leur maintenance. La compréhension du fonctionnement normal des cellules souches est nécessaire pour définir l’origine de leur dysfonctionnement dans les pathologies musculaires ou le vieillissement. Notre étude vise à comprendre les propriétés des cellules souches musculaires, les myofibres et les populations interstitielles des muscles des membres. Pour cela, il est essentiel d’utiliser des modèles de souris génétiquement modifiées qui nous permettent d’identifier et d’isoler les cellules souches musculaires, les myofibres et les populations mutantes afin de les étudier aux niveaux cellulaires, moléculaires et fonctionnels. Si certaines expériences d’analyse peuvent être établies in vitro, d’autres doivent impérativement être réalisées in vivo car aucun système in vitro ne permet à ce jour de reproduire fidèlement les conditions naturelles et complexes d’un tissu.
Bénéfices attendus
Cette recherche s'efforce d'explorer la relation complexe entre la dysfonction mitochondriale, les cellules souches adultes et les fibres musculaires, en mettant particulièrement l'accent sur les implications pour la sarcopénie et la dysfonction musculaire. En comprenant les mécanismes moléculaires impliqués, cette étude vise à élucider comment les dommages mitochondriaux contribuent à la dégénérescence et à la régénération du muscle squelettique. La compréhension de ces processus complexes offre d'énormes perspectives pour faire progresser les stratégies thérapeutiques ciblant des conditions telles que la sarcopénie et les maladies musculaires génétiques, visant finalement à améliorer la qualité de vie des personnes concernées. Les avantages potentiels vont au-delà de l'amélioration des pathologies liées aux muscles, car les connaissances acquises grâce à cette recherche pourraient avoir des implications plus larges pour atténuer la fragilité liée à l'âge, réduire le risque de chutes et de fractures, et améliorer l'homéostasie générale du muscle squelettique. Menée de manière éthique, cette étude utilise judicieusement des modèles animaux, mettant en œuvre une surveillance rigoureuse, des statistiques prédictives et des stratégies d'intervention humaines, garantissant que les connaissances acquises contribuent de manière éthique et efficace à la compréhension plus large de la communauté scientifique de la dysfonction mitochondriale dans le contexte des cellules souches adultes et des fibres musculaires. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’apporter des informations nouvelles sur les bases moléculaires qui contrôlent la prédisposition des muscles aux pathologies musculaires et de ce fait, des informations essentielles pour les thérapies à développer.
Procédures
- La procédure comporte essentiellement des injections intrapéritonéales ou intramusculaires. - La procédure comporte en général une injection intrapéritonéale (quelques secondes) ou un gavage (de l’ordre d’une minute) chaque jour, pendant 5 jours, avec optionnellement 4 injections intrapéritonéales supplémentaires avant mise à mort (1 injection/jour) et d’une injection intramusculaire (quelques secondes) sous anesthésie. - La procédure dure au maximum 1 mois
Impact sur les animaux
Nous veillerons dans nos expériences à impacter le moins possible le bien-être des souris. Les expériences consistent essentiellement en des injections intrapéritonéales ou intramusculaires sur quelques jours. La piqure d'aiguille pour injection de toxine ou chlorure de baryum entraine une douleur légère de courte durée. Les effets indésirables attendus est une boiterie transitoire de courte durée (
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, selon les critères énoncés pour la procédure, à la fin de des expériences, pour collecter les tissus nécessaires à nos travaux de recherche.
Remplacement
La formation et la régénération des muscles squelettiques impliquent une multitude de réponses et d’interactions cellulaires entre les progéniteurs/cellules souches musculaires et leur environnement au sein d’une ultrastructure tridimensionnelle complexe. L’environnement ou la niche, est composé de multiples facteurs comme une matrice extracellulaire tridimensionnelle et des types cellulaires interstitiels variés. Les cultures in vitro ne peuvent pas récapituler la complexité de ces interactions. Néanmoins, l’approche in vitro pour les stratégies d’analyses moléculaires sera mise en place toutes les fois où cela sera possible afin de limiter le recours à l’animal en utilisant des lignées cellulaires ou des cellules primaires amplifiées in vitro.
Réduction
Les effectifs des groupes expérimentaux ont été ajustés : - en tenant compte de notre expérience, - en fonction de la nature de l'expérience et des paramètres mesurés, - de la variabilité de ces paramètres, - de façon à produire des résultats interprétables, permettant d'atteindre une signification statistique, par des biostatisticiens.
Raffinement
Un suivi régulier des animaux inclus dans le projet selon leur état général de santé est prévu. L’effet local de l’injection de toxines peut être une paralysie transitoire du muscle tibial antérieur injecté et donc une incapacité pour l’animal de s’appuyer sur son membre inférieur durant le temps de paralysie. Au réveil de l’anesthésie, l’animal présente une boiterie transitoire (
Choix des espèces
L’utilisation de la souris est basée sur plusieurs critères : - Les souris sont des petits Mammifères. Ils partagent donc de nombreuses similarités avec l’homme notamment au niveau des mitochondries. - Leur temps de génération est court et les effectifs des portées élevés, ce qui permet d’avoir rapidement accès à un grand nombre d’animaux. - De nombreuses lignées existent (souris génétiquement modifiées) pour étudier les acteurs de la régénération notamment la souris transgénique étudiée qui permet d’isoler une population pure de cellules souches musculaires. Adulte. Les animaux sont considérés comme adulte après 6 semaines et âgés à partir de 20 mois. Au-delà de 6 mois, le nombre de cellules satellites décroit chez les souris. Pour ces raisons, nous utilisons essentiellement des souris de 6 à 12 semaines.
Optimisation de la méthode d’administration d’un traitement antitumoral
- Recherche appliquée
- Cancers
894 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 864 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, quatre injections de traitement, et pour une partie quatre séances d'électroporation sous anesthésie, la peau ayant été tondue et dépilée à la crème. Les tumeurs peuvent s'ulcérer, gêner les déplacements et provoquer douleur et détresse, et le cancer peut se propager jusqu'à perturber la respiration. Le porteur indique que l'interaction entre tumeur et système immunitaire mobilise trop de cellules d'organes différents pour être reproduite hors de l'animal, et présente ces données comme "essentielles" pour les futurs essais cliniques.
Objectifs
Chaque tumeur est différente, il est donc important de prendre en compte ces différences, les mutations, afin de proposer un traitement adapté à chaque patient et ainsi maximiser les chances de guérison. En ce sens, nous avons développé un traitement personnalisé composé d’un virus atténué, un fragment d’ADN comprenant les mutations spécifiques de la tumeur du patient à traiter et un anticorps déjà utilisé en immunothérapie actuellement. Notre traitement permet donc d’éduquer le système immunitaire du patient à reconnaître sa tumeur et ainsi pouvoir la détruire. Ce traitement personnalisé a déjà fait ses preuves sur des modèles tumoraux de souris mais jusque-là nous n’avons utilisé qu’une seule méthode d’administration. Nous souhaitons donc à présent optimiser l’efficacité antitumorale de notre traitement en testant différentes méthodes d’administration chez l’animal pour sélectionner la plus efficace.
Bénéfices attendus
Nous attendons des bénéfices à deux niveaux à la suite de l’exécution de ce projet : - Améliorer notre traitement en sélectionnant une méthode d’administration plus efficace que l’injection sous-cutanée simple et en testant une nouvelle version de notre formulation pouvant présenter plus d’efficacité que la précédente - Ces données sont essentielles pour les futurs essais cliniques chez l’humain et tester la sureté et l’efficacité de notre traitement pour soigner des patients atteints de cancer.
Procédures
Etude préliminaire : - 1x dépilation (tondeuse et crème dépilatoire) sous anesthésie générale (12 minutes) - 1x injection sous-cutanée sous anesthésie générale (5 minutes d’anesthésie pour 10 secondes d’injection) - 1x électroporation sous anesthésie générale (2 à 3 minutes) Etudes de survie et études de mécanistiques Groupes sans électroporation (injection sous-cutanée simple ou avec composé d’encapsulation) - 1x tatouage à l’aide de pâte à tatouer et d’aiguille sous anesthésie générale (6 minutes) - 1x injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (5 minutes d’anesthésie pour 10 secondes d’injection) - 4x injections sous-cutanées de traitements (30 secondes) Groupes avec électroporation (injection sous-cutanée directement suivie d’une électroporation) - 1x tatouage à l’aide de pâte à tatouer et d’aiguille sous anesthésie générale (6 minutes) - 1x injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (5 minutes d’anesthésie pour 10 secondes d’injection) - 1x dépilation (tondeuse et crème dépilatoire) sous anesthésie générale (12 minutes) - 4x injections sous-cutanées sous anesthésie générale (5 minutes d’anesthésie pour 10 secondes d’injection) - 4x électroporation sous anesthésie générale (1 par injections sous-cutanée - 2 à 3 minutes)
Impact sur les animaux
Il est possible d’observer des rougeurs passagères ou des brûlures légères et transitoires à l’endroit où le traitement a été administré avec la procédure d’électroporation. Chez les souris porteuses de tumeur, la tumeur peut gêner au déplacement de l’animal en fonction de sa localisation. La tumeur peut aussi ulcérer et causer douleurs et détresse à l’animal. Le cancer peut se propager dans l’organisme, ce qui peut alors perturber le comportement de l’animal, sa respiration ou sa locomotion.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de procéder au prélèvement des organes où s'initie la réponse immunitaire et des tumeurs. Ces divers échantillons nous permettront d’effectuer des analyses au niveau cellulaire et moléculaire afin de caractériser la réponse immunitaire induite par notre traitement.
Remplacement
Nous voulons étudier les mécanismes mis en œuvre par notre système immunitaire d’une part et par la tumeur d’autre part, ainsi que l’interaction entre ces deux entités. Cette interaction nécessite l’intervention de nombreuses cellules différentes provenant d’organes différents. Cette complexité requiert pour l’heure des études chez l'animal pour évaluer et comprendre les phénomènes mis en jeu.
Réduction
Pour l’étude pilote chez les souris saines, pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes en utilisant les tests adéquats, nous avons besoin de 6 échantillons par groupe. Cela représente 3 souris par groupe, car nous réaliserons la procédure d’électroporation sur le flanc gauche et sur le flanc droit de chaque animal. Si, et seulement si, lors de l’étude de survie sur le modèle de cancer de la peau notre traitement administré par une ou les deux nouvelle(s) méthode(s) d’administration a montré une efficacité en comparaison à l’injection sous-cutanée simple, nous réaliserons une étude de survie sur le modèle de cancer du côlon. Pour les études de survie chez les souris atteintes de cancer, le nombre de souris nécessaires par groupe est de 20 selon un test statistique adéquat. Pour chaque modèle de cancer testé, si et seulement si, lors de l’étude de survie correspondante notre traitement administré par une ou les deux nouvelle(s) méthode(s) d’administration a montré une efficacité en comparaison à l’injection sous-cutanée simple, nous réaliserons une étude mécanistique. Pour ces études mécanistiques, en utilisant un test statistique adéquat, nous avons besoin de 7 souris par groupe. Le dosage des composés de notre vaccin est basé sur l’art antérieur issu de la littérature et de nos données propres.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupe afin de préserver les interactions sociales et hébergés dans des cages disposant de matériel de nidification, de bâton à ronger et de tunnels de transfert transparents. Les actes expérimentaux susceptibles d'entraîner une angoisse pour l'animal sont réalisés sous anesthésie générale légère. L’observation des animaux sera effectuée tous les jours et un suivi approfondi des animaux porteurs de tumeurs sera assuré trois fois par semaine. Des points limites ont été mis en place et des examens réguliers du bien-être de la souris et de l’évolution de sa tumeur nous permettront, le cas échéant, de soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
La souris est un animal qui comporte un système immunitaire largement décrit dans la littérature qui est proche de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet. Il s’agit d’un modèle de référence en immunologie ainsi qu’en immuno-oncologie et de nombreux outils permettant de caractériser les réponses immunitaires sont disponibles pour cette espèce. Par ailleurs cette espèce dispose de nombreuses ressources en oncologie telles que les modèles de cancer utilisés dans ce projet. Les souris seront de jeunes adultes (6-8 semaines) ce qui correspond à un stade où le système immunitaire est pleinement mature et fonctionnel. Les animaux ne sont pas choisis plus âgés pour limiter les effets de la dégénérescence immunitaire.
Modèle expérimental de décollement rétinien chez le lapin et le rongeur.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 1600
Lapins : 1600
Pour installer dans l'établissement un modèle de décollement de la rétine, 1 600 lapins, 1 600 rats et 1 600 souris vont être utilisés dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. Le décollement est provoqué par une injection sous la rétine, suivie d'examens oculaires hebdomadaires, d'instillations quotidiennes, d'injections dans l'œil une à deux fois par semaine et de prises de sang. Le porteur affirme que le décollement de rétine n'est pas douloureux chez l'être humain et transpose ce constat aux autres animaux, tout en indiquant que l'œil injecté subira une altération permanente de la vision. Les animaux qui suivent la procédure entière sont tués pour analyse des tissus, les autres, environ 10 %, sont gardés en vie et réutilisés dans une autre procédure.
Objectifs
La rétine est un tissu photo sensible nécessaire à la vision. Elle tapisse l’intérieur de l’œil, reçoit les informations lumineuses, les transforme en signaux nerveux et les transmet au cerveau. Certains troubles de la vision peuvent être dus à un décollement de rétine. Les causes du décollement rétinien peuvent être variées (myopie, opérations de la cataracte, diabète, tumeurs de l’œil, forte inflammation, vieillissement des structures de l’œil, un coup porté à l’œil, ou encore hérédité…). Le mécanisme impliqué est le plus souvent une accumulation de liquide sous la rétine, qui pénètre par des trous ou des déchirures de la rétine. Lors de ce décollement la rétine est séparée physiquement de son support, si cette séparation persiste les cellules de la rétine meurent, la zone décollée ne fonctionne plus. Sans traitement par l’ophtalmologiste le décollement s’étend, pouvant ainsi entrainer des lésions irréversibles de la rétine et même la cécité. L’objectif de ce projet est de mettre en place dans l’établissement utilisateur, un modèle de décollement rétinien chez les rongeurs et le lapin, afin de tester des traitements qui vont permettre la survie de la rétine.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de participer à la recherche de nouveaux traitements neuroprotecteurs de la rétine dans les cas de décollement rétiniens.
Procédures
Le déclenchement du modèle expérimental est dû à une injection sous rétinienne. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques (imagerie, observations au biomicroscope, électrorétinogramme) réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes et se produit une fois par semaine Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois par jour. Les injections peuvent être quotidiennes pendant une durée d’une semaine. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leur fréquence est limitée, une à deux fois par semaine. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt.
Impact sur les animaux
Les maladies neurodégénératives de la rétine et les décollements ne sont pas douloureux chez l'homme, et par transposition chez l’animal. Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, la pathologie devrait entrainer une altération permanente de la vision sur l'œil ayant reçu l'injection. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant, de lampe chauffante ou d’armoire de réveil chauffée en fonction des espèces.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale, seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Les animaux n’ayant pas reçu la totalité de la procédure expérimentale (estimé à environ 10%) pourront être gardés en vie et réutilisés dans une autre procédure, après avis du vétérinaire si besoin.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse ...) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques, chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. La possibilité d'induire les deux yeux sera étudiée pour limiter le nombre d'animal en étude si cela est compatible avec le mode de traitement. L'induction de la pathologie dans l'œil entraine une altération partielle et permanente de la vision, nous avons déjà expérimenté ce modèle dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés par deux au minimum en première intention, avec enrichissement à ronger et un abri pour les rongeurs plateforme pour les lapins. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction de la quantité et des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux.
Caractérisation, diagnostique, et traitement des atteintes auditives centrales dans les formes génétiques de surdité
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Exposées à des sons assez forts pour déclencher une crise d'épilepsie réflexe, immobilisées par une pièce fixée chirurgicalement sur le crâne pour enregistrer leur activité cérébrale tous les deux jours pendant huit semaines, 15 385 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées, une partie par perfusion intracardiaque, et au moins 675 d'entre elles reçoivent en plus une injection de vecteur thérapeutique dans la cochlée. Le projet porte sur les atteintes auditives du cerveau associées aux formes génétiques de surdité, dans la perspective d'améliorer les résultats de la thérapie génique et des implants cochléaires. Le porteur écrit qu'aucune nuisance majeure n'est attendue et que la surdité est "largement compensée" chez la souris, tout en décrivant des crises convulsives provoquées, des chirurgies crâniennes et des infections postopératoires traitées aux antibiotiques.
Objectifs
L’étude des atteintes auditives héréditaires a conduit à l'identification de leurs gènes causaux. Les gènes responsables de plus de 140 formes et d'environ 400 formes génétiques de surdité ont déjà été découverts. L'étude de modèles murins de ces formes monogéniques de surdité a permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de l'audition, en particulier ceux impliqués dans le développement et/ou la physiologie de l'organe sensoriel auditif, la cochlée. Parallèlement, l'étude de ces modèles a également permis de déchiffrer les mécanismes physiopathologiques à l'origine des atteintes auditives. Ceci a conduit plusieurs laboratoires à s'intéresser au potentiel de la thérapie génique pour guérir ces formes de surdité. Des preuves de concept ont été obtenues pour le traitement de plusieurs formes de surdité chez la souris, ouvrant la voie à des essais cliniques de thérapie génique cochléaire chez des patients. Néanmoins, la surdité périphérique peut également être associée à des dysfonctionnements auditifs centraux et peut s'étendre bien au-delà du système auditif lui-même, à la suite d'altérations des entrées sensorielles ou de l'implication des gènes responsables de la surdité dans le développement et/ou le fonctionnement des circuits auditifs centraux. L'étude de la diversité, des causes et des mécanismes sous-jacents de ces dysfonctionnements centraux, de la manière dont ils pourraient entraver les avantages escomptés de la restauration de l'audition par la thérapie génique périphérique, et la détermination de la manière dont ces problèmes pourraient être résolus sont devenus un domaine de recherche à part entière. L’objectif du projet est de caractériser les deux grands types de troubles centraux auditifs, i) ceux induits indirectement des suites d’une surdité périphérique, et ii) ceux qui ont pour origine un rôle intrinsèque de gène dans le développement et/ou le fonctionnement des voies auditives centrales. Afin de déchiffrer les mécanismes physiopathologiques induisant ces atteintes auditives centrales, nous caractériserons sur les plans histologiques, transcriptomiques, fonctionnels et comportemental deux grandes classes de modèles de souris mutantes, une première avec des modèles présentant des troubles auditifs périphériques et une seconde avec des modèles pour des gènes de surdité particulier qui induisent une hyperexcitabilité auditive chez l’animal.
Bénéfices attendus
En caractérisant les atteintes auditives centrales directes et indirectes dans les formes génétiques de surdité, notre projet permettra les avancées suivantes : -Nous déterminerons les conséquences vasculaires et neuronales des pertes auditives dans les formes génétiques de surdité. Ce travail contribuera au déchiffrage des mécanismes pathologiques impliqués dans le lien entre perte auditive et risque ultérieur de développer une maladie neurodégénérative. Enfin, notre projet testera la réversibilité de ces déficits vasculaires et neuronaux suite à une récupération auditive. Ce travail sera essentiel pour montrer de quelle façon la pose d’aides auditives est bénéfique afin protéger le système auditif central des patients. - La qualité de la récupération auditive suite à la pose d’un implant cochléaire est variable d’un patient à l’autre. Certains facteurs comme l’âge d’apparition de la surdité et sa durée sont connus pour influer sur le résultat. Cependant, les potentiels troubles centraux auditifs liés à des rôles multiples des gènes de surdité dans la cochlée et le cerveau sont pour le moment mal compris. Notre travail permettra tout d’abord d’identifier les formes génétiques de surdité pour lesquelles il existe des déficits centraux intrinsèques masqués par le déficit périphérique. Puis, il permettra d’étudier les conséquences de ces déficits, de développer de nouveaux outils de diagnostiques et enfin le développement éventuel de thérapies réparatrices ou compensatrices.
Procédures
Les interventions seront: - Une biopsie sera effectuée sur tous les animaux du projet afin de les marquer et de les génotyper. - L’hyperexcitabilité auditive sera testée par des expositions sonores pouvant générer un début de crise audiogène, i.e. une crise d’épilepsie réflexe (réversible) en réponse à un son fort, ou en effectuant des tests de sursaut. Cette procédure impliquera des tests d’une durée d’1h tous les deux jours sur 1 à 3 mois. - L’hyperexcitabilité auditive sera testée par la susceptibilité aux crises audiogènes (2 min de test), puis les tissus seront fixés par perfusion intracardiaque. - L’hyperexcitabilité auditive sera testée au cours du développement par la susceptibilité aux crises audiogènes (2 min de test), puis l’activité du cerveau auditif sera testée en réponse à des sons sur des animaux profondément anesthésiés. Les enregistrements durent 4 à 8h. -Des animaux auront une chirurgie afin de fixer une pièce de maintien sur leur tête en vue de les immobiliser lors des enregistrements ultérieurs de l’activité intracérébrale sur animal éveillé. Ces enregistrements intracérébraux auront lieu tous les 2 jours pendant 2 à 8 semaines sur 870 animaux. A noter qu’une partie de ces animaux aura en plus une injection de vecteur thérapeutique intracochléaire afin de restaurer l’audition. -Nous effectuerons un suivi audiologique de modèles de souris pour des atteintes auditives du cerveau impliquant parfois des anesthésies légères pour immobiliser l’animal. Ces tests dureront environ 2h et seront répétés tous les 2 semaines pendant 6 à 9 mois de vie de l’animal. Enfin, les tissus seront fixés par perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde. A noter qu’une partie de ces animaux (270 souris) aura en plus une injection de vecteur thérapeutique intracochléaire afin de restaurer l’audition. -Nous effectuerons un suivi comportemental de modèles de souris pour des atteintes auditives du cerveau. Ces tests perceptifs auditifs seront effectués dans une chambre opérante connectée à la cage de vie des animaux. L’expérience dure 4 à 6 semaines. A noter qu’une partie de ces animaux (405 souris) aura en plus une injection de vecteur thérapeutique intracochléaire afin de restaurer l’audition.
Impact sur les animaux
Toutes les procédures impliquent des expérimentations légères ou une succession d’expérimentations légères. On ne s’attend donc pas à des nuisances majeures ou effets indésirables sur les animaux. Les modèles de souris que nous utilisons ont des modifications génétiques entraînant des surdités périphériques associées parfois à des atteintes auditives centrales. La souris reposant principalement sur l’olfaction, son système somatosensoriel et dans une moindre mesure sur son système visuel lors des interactions sociales, ces atteintes auditives sont largement compensées et n’entrainent pas de phénotype dommageable. Quelques manipulations du projet pourraient entraîner de légères nuisances : -Certaines expositions sonores à forte intensité mais de courte durée pourraient induire un stress temporaire sur l’animal. C’est pourquoi les différentes mesures utilisant ces tests sont espacées dans le temps. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. -En ce qui concerne les chirurgies classées modérées visant à injecter un gène médicament ou à enregistrer l’activité cérébrale, les animaux bénéficient de traitements antalgiques et antidouleurs adaptés afin de limiter les effets indésirables. Les animaux récupèrent de ces chirurgies généralement en quelques jours. Parfois, ces chirurgies sont susceptibles d’entrainer des infections. Dans ce cas, ces animaux suivent un traitement antibiotique adapté
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, l’ensemble des animaux du projet sont des organismes génétiquement modifiés empêchant tout replacement ou adoption. Par ailleurs, de nombreuses procédures nécessitent la mise à mort de l’animal pour récupérer des tissus afin d’effectuer différentes expérimentations de physiologie, de transcriptomique ou d’histologie. Les autres procédures impliquent des interventions comme des injections de produits ou des entraînements comportementaux auditifs ou des chirurgies. On ne peut donc pas considérer ces animaux comme naïfs expérimentalement. De plus, la plupart des animaux sont porteurs de mutations de gènes de surdité très spécifiques rendant leur réutilisation, par exemple par d’autres équipes, encore plus difficile. Leur réutilisation pourrait donc mettre en péril les conclusions des nouvelles expériences car trop de paramètres ne pourraient pas être contrôlés. Cependant, une fois les animaux mis à mort, nous essayons de les utiliser pour des entraînements à la dissection et la mise au point de nouveaux protocoles. Ces partages se font typiquement à l’échelle de l’Institut au-delà de notre équipe de recherche.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative que ce soit des études au niveau cellulaire ou tissulaire ne sont connues et envisagées pour ce projet. En effet, il n’est pas possible actuellement de simuler de manière pertinente les effets des entrées sensorielles sur des circuits cérébraux composés de millions de neurones densément connectés, en interaction avec l’évolution des niveaux de stress des animaux.
Réduction
Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 20%. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique. Nous utilisons des tests statistqiues classiques pour tester la significativité de nos résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et nous nous concentrerons sur le nombre limité d’animaux en fonction de la capacité des dispositifs expérimentaux et de l’application des mesures sur le même animal le cas échéant.
Raffinement
Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (observation du poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Plusieurs méthodes de raffinement sont utilisées dans nos projets. Nous avons par exemple veillé à ce que nos tests comportementaux ne reposent pas sur des motivations par des déprivations de nourriture ou d’eau. Lors des chirurgies, des antalgiques et des couvertures chauffantes sont utilisées afin de limiter au strict minimum le risque d’hypothermie et de stress physique. Nous utilisons également des enrichissements de cage par défaut et renforcés après certaines procédures, comme par exemple après les chirurgies. Notre projet comporte plusieurs procédures chirurgicales toutes effectuées sous anesthésie. Un suivi régulier des animaux inclus dans le projet selon leur état général de santé est prévu. Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux lors des procédures douloureuses (chirurgie), une analgésie sera administrée en combinaison avec l'anesthésie. Une surveillance postopératoire avec administration d'analgésiques sera assurée pour garantir le confort total de l'animal. Le Dietgel et l'amélioration de la température des cages seront fournis pour certains protocoles. Des points limites précoces spécifiques sont définis pour les différentes étapes de chaque procédure afin d'éviter toute douleur et tout inconfort inutiles.
Choix des espèces
Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. Le projet impliquera des animaux de stades très différents. En effet, la plupart des molécules que nous étudions sont directement impliquées dans le développement du système auditif central (à partir du jour embryonnaire 9). Nous étudierons leur rôle au cours du développement mais aussi les conséquences de leur absence plus tard pendant le développement et la maturation du système auditif. L’étude utilisera donc des animaux âgés de 9 jours embryonnaires à l’âge adulte (15 mois maximum).
Validation de l’effet de la molécule Ma sur la production d’anticorps après immunisation par un antigène modèle
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, quatre-vingts d'entre elles subissant jusqu'à neuf prélèvements sanguins et deux injections sous la peau au cours d'une expérience de soixante-dix jours. Le traitement testé est ajouté à l'eau de boisson, ce qui peut en dégrader le goût au point que les souris boivent moins, et modifier leur transit. L'objet immédiat reste modeste : vérifier qu'une molécule freine la production d'anticorps après une vaccination à l'ovalbumine, modèle retenu comme moins invasif qu'une greffe. Le bénéfice avancé pour les patients transplantés, la prévention des rejets tardifs, est renvoyé au moyen et au long terme, après d'autres expériences sur des animaux non-humains greffés.
Objectifs
Les transplantations d’organes améliorent et sauvent la vie de nombreux patients. La survie des greffons est possible grâce à des traitements qui bloquent la réponse immunitaire responsable des rejets. Les traitements actuels sont souvent bien tolérés et efficaces, notamment pour le contrôle des rejets aigus. Cependant, les rejets tardifs sont responsables de perte de greffons que les traitements actuels ne parviennent pas à juguler. Le mécanisme responsable de ces rejets tardifs implique la production par le système immunitaire d’anticorps qui attaquent les greffons. C’est cette réponse anticorps qui est imparfaitement contenue par les traitements immunosuppresseurs actuels. Il existe donc un besoin de nouveaux traitements pour prévenir les rejets tardifs par un contrôle de la production d’anticorps anti-greffons. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’effet d’une nouvelle molécule sur la réponse anticorps dans un modèle de souris. Ces études sont des préalables obligatoires avant d’envisager un passage en clinique de nouveaux traitements. La preuve de concept de l’efficacité de la molécule sera étudiée dans ce projet avec un modèle moins invasif que la transplantation, à savoir un modèle de vaccination faisant intervenir les mêmes réactions immunitaires. Les souris seront vaccinées avec une molécule modèle et seront traitées via l’eau de boisson par la molécule candidate pour évaluer la réponse immunitaire vaccinale en présence ou non de cette molécule. Différents dosages sanguins seront réalisés au cours des expériences pour suivre la réponse immunitaire. Ce projet sera découpé en 3 étapes :1) s’assurer que l’ajout de la molécule n’affecte pas l’appétence des animaux pour leur eau de boisson ; 2) valider la dose dans l’eau de boisson pour obtenir une concentration sanguine efficace et 3) valider l’effet de cette molécule sur la réponse anticorps suite à une immunisation par un antigène modèle. Au total, ce projet nécessite 190 souris sur une durée de 3 ans.
Bénéfices attendus
A court terme, cette étude nous permettra de valider in vivo l’efficacité de la molécule candidate sur un modèle de vaccination (protéine vaccinale modèle Ovalbumine) A moyen terme, l’étude de l’effet thérapeutique de la molécule candidate permettrait de valider son utilisation pour réduire le risque de rejet de greffe associé aux anticorps dans des modèles vivo de greffe pour in fine, à long terme, etre utilisée en clinique chez les patients.
Procédures
Toutes les souris subiront un changement d’eau de boisson (+/- sucre) et +/- molécule dans des biberons opaques tous les 2 ou 3 jours maximum Elles seront pesées tous les 3 jours à toutes les semaines selon l'étape du projet. Pour 30 souris : elles subiront maximum 3 prélèvements sanguins (sous anesthésie locale) + 1 prélèvement terminal sous anesthésie générale (injection dans le ventre) (pour la récolte sang + organes). Experience de maximum 14 jours Pour 80 souris : elles subiront maximum 5 prélèvements sanguins (anesthésie locale) + 1 prélèvement terminal sous anesthésie générale (injection dans le ventre) (récolte sang + organes). Experience de maximum 21 jours Pour 80 souris : elles subiront maximum 2 Injections sous la peau (vaccination) sous anesthésie gazeuse et au maximum 9 prélèvements sanguins (avec anesthésie locale) + 1 prélèvement terminal sous anesthésie générale (injection dans le ventre) (récolte sang + organes). Experience de maximum 70 jours
Impact sur les animaux
Les injections sous la peau (vaccination) et les prélèvements de sang sont susceptibles d’entrainer un stress et une douleur. L’ajout de la molécule dans l’eau de boisson des souris peut entraîner une perte d’appétence pour l’eau et donc une diminution de la prise hydrique. L’ajout de la molécule dans l’eau peut également entraîner des modifications du transit des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des protocoles afin de prélever le sang et collecter les tissus pour réaliser les analyses et répondre aux questions scientifiques.
Remplacement
Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires nécessaire pour étudier les réponses vaccinales ne peuvent avoir lieu qu’au sein de l’architecture d’un ganglion ou de la rate, ce qui est impossible à reproduire in vitro
Réduction
Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe pour que les résultats soient significatifs avec des analyses statistiques définies selon les paralètres étudiés. Au total, le nombre d’animaux nécessaires à ce projet est de 190 souris (mus musculus).
Raffinement
Le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole avec un suivi adapté en termes de fréquence et de détermination des points limites (poids, comportement, aspect général) . Différents traitements seront administrés : - anesthésie générale avant le prélèvement final - Analgésie locale pour les prélèvements sanguins - Anésthésie gazeuse avant l’injection du vaccin sous la peau. Le suivi se fait 2 à 3 fois par semaine et la fréquence est augmentée selon l’apparition des signes cliniques précoces et anticipés qui ont été définis pour éviter toute souffrance animale. Une semaine d’habituation à l’eau est prévue avant tout début de procédure. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement
Choix des espèces
Du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées, afin qu'elles aient un système immunitaire mature. Age maximum 12 mois en fin de projet (les animaux plus agés ne seront pas utilisés pour éviter une variabilité trop important due à l’age entre les souris jeunes et > 12 mois).
Production d’anticorps prophylactiques anti-Klebsiella pneumoniae après immunisation et évaluation de l’efficacité de candidats vaccins dans un modèle de sepsis à Klebsiella pneumoniae chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Infectées par Klebsiella pneumoniae jusqu'au sepsis, 232 souris vont être utilisées, dont 172 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit six injections dans les cuisses sous anesthésie volatile, deux prélèvements de sang à la veine de la mâchoire, puis les bactéries. Le porteur range la septicémie parmi les nuisances aux côtés du "geste technique", et indique ne pas connaître les effets secondaires des dix candidats vaccins testés. Toutes sont tuées, y compris celles qui servent uniquement à produire des anticorps, prélevés par ponction directe dans le cœur.
Objectifs
S’appuyant sur les données communiquées par 87 pays en 2020, un nouveau rapport de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) met en évidence des niveaux élevés de résistance des bactéries aux antibiotiques (supérieurs à 50 %), en particulier chez des bactéries fréquemment retrouvées en milieu hospitalier, comme Klebsiella pneumoniae, responsables de septicémie. Le traitement de ces infections requiert obligatoirement l’utilisation d’antibiotiques de dernière ligne, tels que les carbapénèmes. Cependant, 8% (jusqu’à 50% dans certains pays) des souches de Klebsiella pneumoniae responsables d’infections sanguines sont résistantes à ces mêmes carbapénèmes, ce qui augmente notoirement le risque de décès imputables à ces infections. D’autres alternatives, en particulier vaccinales, sont actuellement à l’étude. Plusieurs candidats vaccins dirigés contre Klebsiella pneumoniae sont actuellement à l’étude et ont déjà montré des résultats intéressants in vitro. L’objectif du projet est de déterminer si ces potentiels candidats vaccins entraineraient une production d’anticorps permettant la prévention d’une infection septicémique à Klebsiella pneumoniae. A cette fin, un protocole d’immunisation sera testé chez la souris infectée afin d’évaluer l’efficacité potentielle de 10 candidats vaccins sur la prévention du sepsis ; également, les 4 candidats les plus actifs seront administrés chez la souris non infectée dans le but d’obtenir une quantité importante d’anticorps post-immunisation. Le développement de vaccins prophylactiques contre K. pneumoniae constitue une nouvelle stratégie thérapeutique à fort potentiel d'applications cliniques.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer l’efficacité d’un ou plusieurs candidats vaccin prophylactique contre une infection à K. pneumoniae. L’efficacité de cette vaccination permettra d’en apprendre davantage sur les mécanismes immunitaires déclenchés par l’administration de ces différentes solutions. A terme, l’idée est de pouvoir favoriser la vaccination de populations à risque, en l’absence de traitement antibiotiques efficaces.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - Une administration IP de 3 secondes (500µL) dans la phase 1 et 2 avec une aiguille de 26G - 6 administrations IM de 5 secondes (cuisse droite et gauche) de 50µL avec une aiguille de 26G et sous isoflurane 5% - 2 prélèvements de 100µL de sang via la veine mandibulaire de 15 secodes avec une aiguille de 26G et sous anesthésie volatile (isoflurane 5%).
Impact sur les animaux
Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur : - La phase pilote consistera à injecter des bactéries. La nuisance principale sera liée ici au geste technique et à l’apparition du sepsis. - Dans la phase 2, les nuisances attendues seront liées à l’administration des différents vaccins dans la cuisse droite et gauche (J0, J14 et J28 = 6 injections par souris) et au prélèvement sanguin à J0 et J31. Ces souris seront ensuite infectées par les bactéries. Ici une phase de sepsis est également attendue chez certains animaux - Dans phase 3, les nuisances attendues seront liées à l’administration des différents vaccins (J0, J14 et J28 = 6 injections par souris). Le prélèvement intracardiaque aura lieu 7 jours après la dernière injection de vaccin sous anesthésie générale.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux (232). Les animaux seront tous infectés et ne pourront donc pas être réutilisés.
Remplacement
L’évaluation de l’efficacité d’un candidat vaccin ne peut être réalisée sans le concours complexe d’un modèle animal. La reproduction des différentes étapes menant au sepsis ne peut être réalisée in vitro. Également, la production d’anticorps polyclonaux est un mécanisme complexe basé sur l’interaction entre plusieurs types de cellules immunitaires. Aussi, il n’est pas encore possible aujourd’hui de se passer du modèle animal pour la production d’anticorps.
Réduction
Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. Dans la phase pilote les groupes ont été réduits à 8 animaux au lieu de 10, sur la base d’expériences similaires menées au laboratoire. Cet effectif permet d’avoir une analyse statistique robuste. Dans la deuxième phase, 10 animaux par groupe seront également nécessaires afin d’obtenir une analyse statistique robuste pour évaluer l’efficacité ou non de ces différents traitements. Dans la troisième phase, 10 souris seront utilisées par groupe (4 candidats vaccin, témoin positif et un témoin négatif) afin de récupérer le maximum d’anticorps à la suite du protocole d’immunisation.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Des phases d’habituation ont été prévues. Ils seront suivis étroitement (toutes les 4h) durant les différentes phases de l’étude. Les souris seront hébergées soit 8 ou 10 par cage. La fréquence de surveillance sera augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux. De plus, ne connaissant pas les effets « secondaires » de ces vaccins, des critères d’interruption de l’étude supportés par une grille de score de douleur ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance. L’administration des vaccins par voie intramusculaire se fera sous anesthésie volatile (isoflurane 5%).
Choix des espèces
La souris C57/Bl6 est un modèle de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. D’autre part, il s’agit de l’espèce utilisée pour la mise au point d’un modèle de sepsis à Klebsiella pneumonia dans d’autres projets. Des souris femelles de 5 semaines (+ 1 semaine de stabulation) seront nécessaires pour la phase de pré-immunisation. L’infection aura donc lieu sur des souris de 11 semaines, la phase pilote demandera donc des souris de 10 semaines (+ 1 semaine de stabulation)
Etude de l’effet antidépresseur du LSD chez le rat et la souris: rôle de la médiation des récepteurs 5-HT2B et 5-HT1A
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 240
Cinq semaines d'hébergement en isolement, des chocs électriques répétés et jusqu'à trois injections sur animal vigile : 240 rats et 120 souris vont être utilisés dans des procédures allant de la souffrance modérée à sévère, soixante d'entre eux étant anesthésiés puis tués sans reprendre conscience. Les tests comportementaux mesurent l'anxiété, l'apathie, le désespoir et la perte de goût pour le sucre, autant d'états provoqués délibérément avant l'administration de LSD. Le projet cherche à comprendre par quels récepteurs le LSD produit un effet antidépresseur rapide. Le porteur justifie le choix des rongeurs par le fait qu'il s'agit des plus petits mammifères dont le cerveau reste assez proche de celui de l'être humain, et reconnaît calibrer ses effectifs aussi pour éviter "tout scepticisme de la part de rapporteurs lors de la publication".
Objectifs
La dépression majeure concerne environ 17 % de la population française, ce qui en fait le trouble psychiatrique le plus fréquent. La classe d’antidépresseur prescrite en première intention sont les inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine, mais 50% des patients déprimés ne répondent pas correctement à ce type de traitement, d'où l'importance de chercher des molécules capables de potentialiser leur effet. L’acide lysergique diéthylamide (LSD) est une substance psychédélique qui induit des états de conscience altérés caractérisés par des changements dans la perception sensorielle et l’humeur. De manière intéressante, à faible dose, il a été montré qu’une seule injection de LSD a un effet antidépresseur pouvant durée un mois. Toutefois, l’interaction du LSD avec presque tous les récepteurs 5-HT souligne sa pharmacologie assez complexe. Le LSD est un agoniste de la plupart des récepteurs de la sérotonine. Notre projet est de rechercher les modalités d'action du LSD pour mieux discerner sa nouvelle propriété d'antidépresseur à action rapide et sa susceptibilité à augmenter la réponse antidépressive des antidépresseurs classiques.
Bénéfices attendus
L’objectif de notre étude est de mieux comprendre les raisons pour lesquelles de nombreux antidépresseurs couramment utilisés produisent une rémission des symptômes dépressifs chez seulement un tiers des patients. Notre projet vise à identifier les mécanismes par lesquels le LSD aurait un impact majeur sur l’humeur et la réponse antidépressive. La perspective à plus long terme sera de proposer de nouveaux traitements anxiolytiques et/ou antidépresseurs plus efficaces que ceux actuellement disponibles.
Procédures
Les animaux subiront des administrations systémiques de substances actives sur animal vigile : 1 à 3 injections avec une contention d'environ 10 à 20 secondes. Les animaux seront soumis à des stimulations électriques (4 secondes) répétés ou non. Certains subiront 5 semaines d’hébergement en individuel lors du modèle stress répété suivi des tests comportementaux et 1 à 3 injections (10-20 secondes). Les tests comportementaux utilisés ont pour finalité l’évaluation des conséquences de type anxieux (1 test de 5 min), d’apathie (10 min), dépressif (1 test de 6 min) et d’anhédonie (3 jours) chez des modèles de dépression.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent être soumis à différentes nuisances listées ci-dessous : 1) Les animaux subiront des administrations de substances actives comme le LSD entrainant des ébrouements. 2) Certains animaux recevront des injections de substance active induisant une inflammation. 3) Certains animaux seront exposés au modèle de stress répété pharmaco-résistant qui induit un stress important pendant 6 minutes. 4) Certains animaux seront soumis à un hébérgement individuel, à des injections intrapéritonéales répétées (contention de 10-20 secondes), à des stimulations électriques entrainant un l’émission d’ultrasons.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expérimentations. Ayant subi un protocole pharmacologique et/ou de stress chronique, les animaux ne peuvent pas être réutilisés dans une autre étude pour éviter tous biais.
Remplacement
L'objectif de ce projet est la mise au point de nouveaux traitements antidépresseurs destinés à être utilisés chez l'homme. L'étude préclinique doit prévoir une administration sur l'animal entier, d'autant que leurs effets comportementaux ne peuvent être évalués que chez l'animal vigile, tandis que leurs effets sur l'activité électrique neuronale résultent de l'intégration de nombreux signaux émis par une variété de régions cérébrales différentes. En termes de bénéfice/risque, notre étude pharmacologique chez le rat anesthésié reste plus appropriée que chez le rat vigile. Des approches in vitro sont déjà réalisées au laboratoire (évaluation de la neurogénèse, électrophysiologie in vitro). Cependant, l'utilisation de modèles complexes, i.e. d'animaux vivants, est incontournable afin d'analyser les réponses antidépressives dans des modèles de dépression pharmaco-résistants.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé sur la base de nos études antérieures et est réduit au minimum nécessaire pour obtenir une puissance suffisante pour les analyses statistiques. Pour les analyses comportementales nous comptons donc 15 animaux par groupe pour pouvoir en inclure au moins 13 dans l'analyse, sachant que les différences interindividuelles sont plus fortes dans les analyses comportementales. Afin de limiter le nombre d'animaux, les symptômes de dépression seront étudiés sur les mêmes individus en prenant soin de limiter le nombre total de tests à 2. Pour les expériences d'électrophysiologie, nous comptons 10 animaux par groupe pour pouvoir en inclure au moins 8-9 dans l'analyse. Le nombre d'animaux est réduit à une valeur minimale (test statistique PS de Dupont et Plummer) permettant d'une part d'atteindre une significativité statistique pour la validation et l'évaluation des réponses mesurées et d'autre part d'éviter tout scepticisme de la part de rapporteurs lors de la publication.
Raffinement
Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux. Pour pallier à l'hébergement individuel de certains animaux, facteur indispensable à l’induction du modèle de résistance, plusieurs enrichissements sont apportés dans chaque cage (nid végétal à base de fibres de coton, igloo et buchette). Pendant une dizaine de jours, ils feront l’objet d’une attention particulière afin de vérifier le bon développement du modèle. Un monitoring du poids sera entrepris. En cas de problème d’alimentation, les animaux auront accès à de la blédine directement dans une coupelle dans la cage. L’observation des animaux sera effectuée quotidiennement et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci (une grille de score et des points limites seront mis en place).
Choix des espèces
Les rongeurs sont choisis car il s'agit des plus petits mammifères ayant un cerveau encore suffisamment homologue à celui de l'homme pour mener des études expérimentales en neuropsychiatrie. Ce rôle sera notamment déterminé dans deux modèles de dépression, l'un d'origine inflammatoire et l'autre induit par des stress répétés afin d’évaluer l'impact de l'étiologie sur la thérapeutique. Le modèle de stress répété, validé chez la souris, présente la particularité de conduire à une résistance aux traitements antidépresseurs conventionnels. Enfin, le modèle d’anxiété par émission d’ultrason n’a été validé/utilisé que chez le rat par notre équipe. Des animaux adultes seront utilisés car chez l'homme, les antidépresseurs sont majoritairement prescrits chez l'adulte. De plus, nous envisageons l’utilisation d’un modèle de résistance aux antidépresseurs chez l’adulte. Les expériences débuteront sur des animaux âgés de 8 semaines.