Souris
Etude du rôle des molécules de guidage axonal dans la maintenance et la régénération de l’innervation cornéenne dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Jusqu'à 80 séances d'imagerie sous anesthésie, de quarante minutes chacune, réparties sur un an à raison de deux par semaine. 756 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour que leurs yeux soient prélevés et leurs cornées disséquées, 384 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 372 un niveau léger. Une partie subit une lésion de l'épithélium de la cornée, une autre une injection dans l'abdomen, l'objet étant de suivre comment les nerfs de la cornée se maintiennent et se régénèrent. Le porteur écrit que la lésion cornéenne est réalisée "dans des conditions qui n'engendrent pas de douleur à l'animal", et justifie le choix de la souris par un génome identique à celui de l'humain à plus de 98 %.
Objectifs
Les maladies de la cornée sont la deuxième cause de cécité dans le monde après la cataracte. Leur origine peut être génétique, dégénérative (vieillissement, diabète) et/ou environnementale. Il est donc essentiel de mieux comprendre la physiologie de la cornée pour proposer de nouvelles options thérapeutiques aux patients souffrant de défauts de la cornée. L'atteinte de l'innervation cornéenne se traduit par des symptômes allant d'une diminution de la sensibilité oculaire sans lésion cornéenne au syndrome de l'oeil sec en passant par la kératite neurotrophique et la perforation cornéenne. Actuellement, il n'existe aucun traitement disponible en routine pour la gestion de l'innervation cornéenne. Dans ce projet, nous souhaitons étudier le rôle des molécules de guidage axonal dans la maintenance de l'innervation cornéenne ainsi que la régénération axonale suite à des lésions. Grâce à des techniques d'imagerie en temps réel combinés à l'utilisation de souris transgéniques, nous sommes capables de suivre l'innervation de la cornée des souris au cours du temps.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'acquérir des connaissances inédites sur les molécules spécifiques de guidage des axones dans la cornée au niveau physiologique. Ceci constitue une étape importante pour comprendre l'origine de la kératopathie neurotrophique. La compréhension des mécanismes de cette pathologie permettra de développer et tester des traitements pharmacologiques.
Procédures
Un partie des animaux recevra une injection unique par voie intrapéritonéale (réalisé sur animal vigile, l'acte dure moins de 1 min par animal). L'induction de la lésion de l'épithélium cornéen concerne également une partie des animaux du projet, l'acte est réalisé sous anesthésie générale et locale, par une personne expérimentée et dure moins de 5 min par animal. Chaque animal sera imagé 2x par semaine pour une durée allant de 1 mois jusqu'à 1an selon la procédure (soit entre 8 et 80 sessions d'imagerie, selon la procédure, réalisées sous anesthésie d'une durée maximale de 40min chacune). Les animaux seront euthanasiés en fin d'expérimentation par une méthode réglementaire en vue des prélèvements et analyses complémentaires.
Impact sur les animaux
Une partie des animaux recevront une injection unique en intrapéritonéale. Au moment de la réaliser, la contention et l'introduction de l'aiguille peut être source de stress pour les animaux. Une légère douleur au moment de l’insertion de l’aiguille peut aussi être ressentie. Pour réaliser ce projet, nous allons induire une lésion de l'épithélium cornéen chez une partie des animaux. Cette étape est réalisée dans des conditions qui n’engendrent pas de douleur à l’animal. L'imagerie en temps réelle est non invasive et n'engendre pas de douleur à l'animal. La répétition des sessions d'imagerie peut également être source de stress pour les animaux. L'anesthésie peut dans de rare cas amener un stress thermique ou une potentielle détresse respiratoire chez les animaux.
Devenir
A la fin de la période de maintien prévue, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses histologiques complémentaires (les yeux seront prélevés et l'ensemble des cornées des animaux sera disséqué).
Remplacement
Du fait de la complexité de la complexité de l’innervation cornéenne et des interactions avec le tissu épithélial de la cornée, l’utilisation de l’animal nous est indispensable. Il n’y a pas d’alternative par des modèles in vitro.
Réduction
Ce projet impliquera au maximum 756 souris. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. Un test de puissance a été réalisé (à l'aide d'un logiciel dédié) pour déterminer le nombre minimal d'animaux requis par groupe expérimental.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation standard avec enrichissement (bâtons en bois, coton), avec un cycle jour-nuit de 12h. La température des cages et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Des points limites ont été définis (tels que la surveillance du poids des animaux, l'absence de locomotion, l'état du pelage, la prostration). Pour l'étape d'induction de la lésion et pour les sessions d'imagerie, les rongeurs bénéficieront d'une analgésie ainsi que d'anesthésie gazeuse complémenté par une anesthésie locale de la cornée.
Choix des espèces
En ce qui concerne la cornée et son innervation, la souris présente l’avantage d’être très similaire à l’homme que ce soit anatomiquement, physiologiquement et génétiquement. En effet plus de 98% de son génome est identique à celui de l’Homme. Par ailleurs, ce modèle permet la transgénèse et donc de pouvoir étudier in vivo les conséquences de la délétion d’un gène. La souris, et en particulier avec le fond génétique C57Bl6J, est un modèle utilisé depuis de très nombreuses années pour l’étude du système nerveux et de l’innervation cornéenne. De ce fait de nombreuses données sont déjà disponibles sur lesquelles notre étude peut se reposer. L'innervation de la cornée se termine autour du 45ème jour de vie des animaux. Nous utiliserons donc des animaux âgés de 6 semaines pour le suivi de l'innervation de la cornée. Cependant, une partie des animaux sera utilisé dès le 15ème jour de vie afin d'activer notre modèle expérimental.
Mécanisme de toxicité rénale des maladies du sang associée à une production d’anticorps
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Comprendre pourquoi le dépôt d'un anticorps détruit le rein passe ici par des souris qui produisent un anticorps humain prélevé chez un patient et développent d'elles-mêmes une insuffisance rénale. 170 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélèvement des reins. Elles sont isolées douze heures par mois dans une cage à urine, reçoivent chaque jour pendant une semaine, à quatre puis à six mois, un médicament administré par une paille enfoncée dans la bouche, et sont suivies jusqu'à neuf mois, l'âge médian de survie de la lignée. Le porteur ne retient comme nuisances que le stress de l'isolement et celui de la contention, et affirme que le médicament testé ne provoque aucun effet secondaire, quand la souffrance sévère déclarée tient à la maladie rénale que ces souris portent par construction.
Objectifs
Dans certaines maladies rénales appelées "light chain deposition disease" (LCDD ou maladie à dépôts de chaînes légères d'immunoglobulines monoclonales en français), un anticorps (molécule habituellement destinée à se défendre contre les microbes) fabriqué par une cellule cancéreuse ou pré-cancéreuse va se déposer au niveau du rein et provoquer des lésions rénales. Ces lésions rénales vont aboutir à une insuffisance rénale terminale en l’absence de traitement, et potentiellement au décès du patient. Aujourd’hui, les seuls traitements accessibles pour cette pathologie sont des chimiothérapies ciblant la cellule responsable de la fabrication de l’anticorps en cause. Néanmoins, ces traitements ne sont pas spécifiques et provoquent d’importants effets secondaires. Les mécanismes qui permettent le développement des lésions rénales à la suite du dépôt de l’anticorps ne sont pas connus. Les identifier permettrait donc de développer des médicaments plus ciblés, protégeant le rein des conséquences du dépôt de l’anticorps. Un modèle de souris reproduisant la pathologie humaine a déjà été créé, en permettant la fabrication d’un anticorps humain issu d’un patient atteint de LCDD chez la souris. Cela a permis de montrer que l’anticorps est directement toxique pour le rein. Néanmoins, il reste à comprendre les réponses du rein à la suite de ce dépôt. Nous allons donc utiliser ce modèle de souris afin de répondre à cette lacune des connaissances dans ce domaine. Cela permettra, nous l’espérons, d’identifier des cibles thérapeutiques que nous pourrons cibler pour protéger les reins après dépôts d’anticorps. En particulier, les cellules sénescentes paraissent impliquées dans ce processus. La sénescence, du latin senex ou « grand âge », est un état de la cellule dans lequel la cellule ne peut plus se diviser mais peut secréter un grand nombre de molécules. La sénescence a été impliquée dans plusieurs pathologies, comme le vieillissement ou le cancer par exemple.
Bénéfices attendus
Grace à ce projet nous espérons plusieurs bénéfices - Mieux comprendre les conséquences rénales des dépôts d’anticorps - Caractériser le rôle de la senescence dans le développement des lésions rénale après dépôt d’anticorps. - Identifier des cibles thérapeutiques spécifiques au rein permettant d’envisager une thérapie plus ciblée que les actuelles chimiothérapie - Estimer si la suppression des cellules sénescentes permet de protéger le rein de l’apparition de lésions après dépôt d’anticorps. - Etendre les découvertes de ce projet à d’autres pathologies rénales (en particulier le diabète qui présente beaucoup de similarités avec la LCDD) Cela permettra in fine d’envisager des alternatives thérapeutiques aux actuelles toxiques chimiothérapies recommandées dans cette pathologie.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions : - collecte d'urines pour mesurer la fuite de protéines dans les urines. Pour cela les animaux seront hébergés de manière individuelle dans des cages spécifiques pendant 12h afin de récupérer leur urine. Cette collecte se fera de manière mensuelle. - traitement par un médicament permettant d'éliminer les cellules senescentes. Ce traitement sera donné par voie orale, à l'aide d'une paille qui sera introduite dans la bouche de l'animal, de manière quotidienne pendant 7 jours, à 4 et 6 mois d'âge. - au moment du sacrifice, les animaux seront anesthésiés et du sang sera prélevé pour mesurer la fonction rénale
Impact sur les animaux
Plusieurs types d'effets indésirables peuvent etre observés. Stress lors de l'hebergement individuel pour collecte d'urine. Stress lors de la contention pour administration du médicament. Le médicament ne provoque pas d'effet secondaire. Le prélèvement de sang n'induit pas d'effet secondaire car les animaux seront anesthésiés et traités par un antalgique.
Devenir
Euthanasie pour collection et analyse d'organe (rein)
Remplacement
Les modèles de culture cellulaire ne permettent pas de reproduire la complexité de la maladie LCDD. D’autre part, il est probable que le développement des lésions rénales soit la conséquence de multiples types de cellules présentes dans le rein. Il est donc impossible de reproduire cette pathologie sur des modèles qui ne soient pas des animaux.
Réduction
Les procédures ici décrites utilisent des animaux qui risquent de developper des lésions rénales de manière spontanée. Afin de limiter le nombre d’animaux, nous utiliserons la totalité des animaux pour les procédures. Du fait de l’absence de différence entre les mâles et les femelles, nous utiliserons les 2 sexes pour nos procédures. Nous avons utilisé une approche statistique nous permettant de calculer le nombre minimum d’animaux afin de voir une différence de 15% de la sévérité de l’atteinte rénale après traitement.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement qui respectent leur bien-être (contrôle de la température et du taux d'humidité de l’environnement, densité d’animaux, présence d’enrichissement, change régulier des litières, eau et nourriture à volonté, surveillance quotidienne des animaux). Toutes les procédures sont réalisées de façon à limiter le stress et la souffrance des animaux. Les souris seront surveillées quotidiennement par nos soins et du personnel qualifié pour détecter le moindre signe de souffrance de l’animal. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (grilles d’évaluation et points limites) sera strictement respecté, et effectué quotidiennement en concertation avec l'équipe de zootechnie.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce permettant à ce jour de reproduire la maladie observée chez l’homme. Dans les données de la littérature, les souris commencent à développer des lésions rénales microscopiques à l’âge de 6 mois, et la présence de dépôts sans insuffisance rénal est retrouvée dès l’âge de 2 mois. Nous étudierons donc les souris tous les mois dès l’âge de 3 mois, jusqu’à 9 mois, âge médian de survie.
Exploration d’une approche thérapeutique (probiotiques) sur l’impact de produits néoformés générés par le microbiote colique consécutif à la consommation de FODMAPs
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Gavées trois fois par semaine pendant neuf semaines, opérées trente minutes pour recevoir des électrodes, puis soumises à une distension du côlon par un ballonnet en cinq paliers de dix secondes, 540 souris vont être utilisées. 300 relèvent d'un niveau de souffrance sévère, 240 d'un niveau modéré, et toutes sont tuées en fin de procédure pour des prélèvements de tissus. L'objet est de tester des souches probiotiques censées corriger l'hypersensibilité intestinale provoquée par un régime riche en sucres fermentescibles, avec pour horizon les patients atteints du syndrome de l'intestin irritable. Le porteur ramène l'introduction du ballonnet et la mesure des contractions à un "inconfort", et rappelle que la même mesure se pratique chez les patients, quand 300 de ces souris sont déclarées en souffrance sévère.
Objectifs
Le syndrome de l’intestin irritable (SII) est une pathologie intestinale chronique très répandue, qui altère la qualité de vie des patients de façon significative. Sur le plan thérapeutique, les traitements médicamenteux de la douleur restent à ce jour peu efficaces. L’alimentation est le domaine où ces patients sont le plus sensibles. Un groupe d’aliments promoteurs de douleurs abdominales chez ces patients a pu être mis en évidence: les sucres fermentescibles (FODMAPs). La fermentation de ces derniers par le microbiote intestinal des patients génère des composés chimiques provoquant la douleur. Aujourd'hui, pour réduire ces symptômes invalidants, un régime pauvre ou sans ces sucres fermentescibles est proposé aux patients SII. L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de souches probiotiques (micro-organismes vivants qui, lorsqu'ils sont ingérés en quantité suffisante, exercent des effets bénéfiques sur la santé), que nous avons sélectionné pour leurs propriétés bénéfiques sur la perméabilité intestinale et la sensibilité viscérale d’individus murins ayant consommé un régime en riche en FODMAPs. Cette étude préclinique, couplée aux analyses cliniques et in vitro menées dans notre équipe , permettrait à terme de proposer une solution thérapeutique pour les patients SII hypersensibles aux FODMAPs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra 1) de valider les hypothèses sur l’implication d’une consommation riche en FODMAPs sur le disfonctionnement de la barrière intestinale ; 2) d’élaborer des outils de lutte préventive et d’apporter des pistes de stratégie thérapeutique pour une meilleure santé intestinale liée à la consommation des FODMAPs. Il apportera des données objectives permettant à terme de réaliser des études cliniques qui viseront à améliorer la qualité de vie des patients SII.
Procédures
Les animaux seront soumis à des gavages (durée du geste : 30 secondes) trois fois par semaine sur une période de 9 semaines. Des prélèvements de fèces seront effectués au niveau de l’anus le premier jour, le 8ème jour et à la fin de la consommation du régime enrichis en FODMAPs. Des animaux subiront également un prélèvement sanguin unique non létal (20μl) effectué à la queue (durée du geste : 30 secondes). Des animaux seront équipés d’électrodes pour la mesure de sensibilité viscérale, nécessitant une chirurgie de courte durée (30 min). Après trois jours de récupération de l’acte chirurgical, les animaux seront soumis à une distension colorectale de cinq paliers d’une durée de 10 secondes chacune avec un temps de récupération de 10 minutes entre chaque palier.
Impact sur les animaux
Des nuisances ou effets indésirables attendus liés à ces procédures seront les suivants: -Une mobilité réduite liée à la contention manuelle (durée 1min) De plus l’ensemble des animaux pourraient subir une nuisance (peur) et une irritation du tube digestif lors des premiers jours d’administration orale des composés. -Un stress physique possible lié à un prélèvement de sang à la queue (durée 3min) -Des nuisances liées à la chirurgie peuvent être des douleurs post-opératoires, une perte de poids, une déshydratation ou une mauvaise cicatrisation. La nuisance liée à la contention dans le tunnel sera une mobilité réduite. L’introduction du ballonnet et la mesure des contractions peuvent être associés à un inconfort.
Devenir
Tous les animaux en fin de procédure, seront mis à mort afin d’effectuer des prélèvements de tissus post-mortem pour différentes analyses et dosages
Remplacement
Le SII est une pathologie dont les causes sont multifactorielles et méconnues, et qui présentent une physiopathologie complexe. Par conséquent, il n’est pas possible de reproduire cette pathologie uniquement sur un modèle cellulaire. Pour évaluer si un traitement est efficace il faut nécessairement coupler des analyses sur modèle intégré in vivo à des analyses in vitro sur modèles de cultures cellulaires. Cependant, des paramètres comme la sensibilité intestinale ou la perméabilité intestinale totale ne peuvent pas être mesurées in vitro. Ainsi, seule l’utilisation de modèles animaux permettra d’évaluer l’effet des cibles thérapeutiques sur une consommation riche en FODMAPs et ainsi permettre l’obtention de résultats transposables chez l’homme. Par ailleurs, la mesure de sensibilité viscérale en réponse à une distension colorectale est aussi une pratique qui est réalisée en clinique chez les patients souffrant de colopathie.
Réduction
Les études menées précédemment au sein de la communauté scientifique et en interne ont permis d’acquérir une meilleure performance pour le bien-être animal. L’amélioration de la prise en charge post-opératoire par l’acquisition d’armoires ventilées a permis d’améliorer le réveil des animaux, d’éviter des études en répétition et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires. En raison de la variabilité inter-individuelle à la sensibilité viscérale, le nombre calculé au plus juste d’animaux nécessaire est de 15 souris par groupe, et réduit à 12 souris par groupe pour les mesures de perméabilité intestinale.
Raffinement
Pour assurer une fiabilité des résultats et limiter le nombre d’animaux utilisés, une attention particulière est accordée au bien-être de l’animal. A leur arrivée les animaux sont hébergés collectivement au calme et surveillés pendant une période d’acclimatation. L’acclimatation permet de récupérer du stress lié au transport et de s’adapter à leurs nouvelles conditions de vie. Ce n’est qu’à l’issue de cette période que les animaux seront inclus dans l’étude. Dans le but d’améliorer le bien-être de ces animaux captifs, des bûchettes en peuplier seront disposées dans chaque cage afin de répondre à leur besoin naturel de ronger. Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée pour détecter à temps toute anomalie et minimiser la durée de toute souffrance constatée. Un système de surveillance de l’état général des animaux (grille de scoring) associé à des points limites est mis en place. Toutes les mesures seront prises pour réduire la douleur (anesthésie, prise en charge de la douleur pré-post opératoire, réhydratation, tapis chauffant, armoires ventilées).
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention au sein de la communauté scientifique. Le modèle animal murin est un modèle largement utilisé et décrit pour la mesure de la sensibilité viscérale et reproduit les principales caractéristiques du syndrome de l’intestin irritable nécessaire pour une approche globale de cette pathologie. Les animaux utilisés sont tous à l’âge adulte (6 semaines) car il est indispensable d’avoir un tractus digestif à pleine maturité physiologique.
Exploration de l’activité neuronale chez un modèle murin (souris) de la maladie d`alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune subissant deux chirurgies du crâne puis cinq à six semaines dans une cage divisée par une cloison de plexiglas, une souris par compartiment. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. La première chirurgie dure environ 45 minutes, la seconde de 90 à 120 minutes, et une sédation d'une heure sert à fixer une prothèse sur la tête, que l'animal apprend ensuite à porter au cours de séances de deux à six minutes avant une tâche comportementale que le porteur qualifie de légèrement désagréable. Le bénéfice annoncé, repérer un oubli anormal comme marqueur précoce de la maladie d'Alzheimer, reste une piste pour des travaux ultérieurs, quand la séparation des congénères et les deux ouvertures du crâne sont, elles, programmées.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) est une affection progressive et mortelle, représentant la maladie neurodégénérative la plus répandue. Un diagnostic précoce s'avère crucial dans la recherche préclinique et clinique sur la MA, car il ouvre une fenêtre thérapeutique opportune pour initier des interventions avant l'installation d'un déclin cognitif sévère. L'accumulation de la protéine bêta-amyloïde dans la partie frontale du cerveau est associée à une perte de mémoire rapide, constituant un symptôme précoce de la MA détectable par des évaluations cognitives expérimentales et cliniques bien avant l'apparition d'une démence sévère. En effet, les déficits d'apprentissage et de mémoire sont parmi les premiers signes signalés par les proches des patients. Fondée sur ces découvertes et sur des données préliminaires obtenues dans notre laboratoire, qui indiquent une activité neuronale anormale dans diverses conditions pathologiques, notre étude actuelle vise à explorer les changements des circuits cérébraux liés à l'intégration d'informations nécessaires à la consolidation de la mémoire et à l'oubli.
Bénéfices attendus
Ainsi, l'oubli précoce pourrait constituer une cible potentielle pour des études précliniques visant à prévenir ou retarder l'émergence de formes plus graves de la maladie d'Alzheimer (MA). Nos recherches antérieures et actuelles sur le rôle des modifications de l'excitabilité neuronale dans le processus de formation de la mémoire nous conduisent à proposer une exploration des altérations des circuits du cortex préfrontal en tant que marqueur précoce d'un oubli anormal dans la MA. En se basant sur les données obtenues, nous pourrions identifier des cibles prometteuses pour de nouvelles approches thérapeutiques.
Procédures
Tous les animaux subiront deux interventions chirurgicales sous anesthésie : la première intervention durera environ 45 minutes ; la deuxième intervention durera de 90 à 120 minutes. Ils subiront également une intervention sous sédation (sans acte invasif, d'une durée d'environ 60 minutes) pour la pose d’une prothèse sur la tête. Après la deuxième intervention chirurgicale et jusqu'à la réalisation des études d'imagerie calcique et de comportement, les animaux seront placés dans des cages collectives séparées en deux zones par une séparation en plexiglas transparent (deux souris par cage, une souris par zone) pendant une période de 5 à 6 semaines. Ils seront progressivement entraînés (lors de séances de durée croissante de 2 à 6 minutes) à accepter la pose d'un objet sur leur tête. Ils effectueront une tâche comportementale légèrement désagréable d’environ 6 minutes en présence de l’appareil d’imagerie (posé sur la tête). Ils seront ré-exposés au même dispositif de comportement le lendemain et 14 jours plus tard (pendant environ 6 minutes) afin d'évaluer leur mémoire.
Impact sur les animaux
Les animaux subissent deux interventions chirurgicales : le risque d’inconfort, de douleur, d’infection et/ou de perte de poids est inhérent à ces procédures. Ils seront endormis une fois de plus, ce qui pose un risque d'hypothermie ou de problèmes respiratoires temporaires. Ils seront soumis à une tâche comportementale qui est légèrement désagréable et stressante pour l’animal. Celui-ci est entraîné à porter l'appareil d'imagerie sur sa tête, ce qui représente une contrainte pour sa posture. La pose de la prothèse implique également une contrainte pour l'animal et nous oblige à adapter les conditions d'hébergement.
Devenir
Toutes les souris seront euthanisiées et leurs cerveaux seront prélevés pour des analyses post-hoc.
Remplacement
Le projet porte sur l'étude des mécanismes qui sous-tendent la formation et le stockage de la mémoire dans le cerveau et leur changement dans MA. Pour mener à bien notre étude, nous aurions besoin d'un modèle : i) complexe et intact, ii) qui se prête facilement à la modification de son ADN, iii) possédant un néocortex, la partie la plus récente et la plus évoluée du cortex cérébral chez les mammifères, iv) adapté aux approches expérimentales invasives. En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer les approches alternatives si possibles. A notre connaissance, seuls les modèles mammaliens, et plus particulièrement la souris, répondent à tous ces critères. Les études humaines ne sont pas adaptées à notre question scientifique car des tests invasifs sont nécessaires pour détecter et analyser les neurones et leur altération dans MA. De plus, nous étudions le stade précoce de la maladie, lorsque les symptômes n'apparaissent pas nécessairement chez l'homme. Le tissu post-mortem humain n'est pas disponible et les biopsies ne sont pas pratiquées pour cette condition. Les modèles informatiques actuellement disponibles ne permettent pas la modélisation au niveau du cerveau entier. Pour toutes ces raisons, et malgré notre réflexion, le recours à l'animal est malheureusement nécessaire.
Réduction
Afin de n'utiliser qu'un nombre minimal d'animaux nécessaire, nous avons estimé, sur la base des études précédentes, le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique (stratégie : études antérieures au sein de l'équipe et étude bibliographique). Nous sommes très attentifs à l’objectif de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour cette raison, nous proposons d'adopter une stratégie expérimentale permettant une analyse précoce de nos données au fur et à mesure (c.à.d. analyse effectuée en petits lots avec une expérience par jour). Cela nous permettra de modifier la taille de l'échantillon si nécessaire, selon les premiers résultats obtenus. L'utilisation de ces petits groupes permettra également de repérer rapidement les problèmes potentiels de la procédure et de modifier notre approche si nécessaire pour le lot suivant.
Raffinement
Les mesures de raffinement comprennent observation quotidienne des animaux et vérification de l'état de l'animal (avant chaque manipulation) en utilisant des critères généraux ainsi que des signes cliniques spécifiques à la manipulation. Les critères pour évaluer la souffrance incluent l'apparence et le comportement général de l'animal. Tout signe de souffrance, de douleur ou de détresse (comme un comportement inhabituel ou un pelage négligé) entraînera une réponse immédiate et adaptée. Cela peut inclure des mesures conservatoires comme isoler temporairement l'animal, administrer du glucose, le réchauffer dans une couveuse ou soigner les blessures en cas de bagarre avec d'autres animaux. Si l'état de l'animal ne s'améliore pas après ces mesures, l'expérimentateur décidera de l'euthanasier si nécessaire, en consultation avec le vétérinaire et l'équipe des soigneurs. Les animaux sont manipulés quotidiennement avant les expériences pour réduire leur niveau de détresse. Les conditions d'hébergement sont adaptées en maintenant les animaux dans des cages collectives contenant des enrichissements tels que des tubes en carton et du matériel pour la nidification. Pour intégrer de nouvelles techniques de raffinement, les expérimentateurs reçoivent une formation régulière et consultent des sites éducatifs comme NC3R.
Choix des espèces
Nous utiliserons la souris car nous souhaitons exploiter un modèle impliquant la production d'amyloïde bêta. À ce jour, la souris est la seule espèce mammifère pour laquelle il est possible, de manière routinière, de modifier l'ADN et pour laquelle les modèles créés ont été caractérisés au niveau comportemental et moléculaire. Les souris auront entre 8 et 10 semaines au début des procédures (c'est-à-dire la chirurgie) et entre 14 et 18 semaines au moment du test comportemental. Selon les données précédemment rapportées et nos données préliminaires sur le développement de la pathologie, il s'agit de l'âge auquel les animaux commencent à développer les premiers signes de la maladie avant l'apparition de la maladie grave. Nous voulons étudier la phase précoce qui se situe vers 14-18 semaines d'âge. Les animaux seront utilisés pour un test de comportement qui nécessite l'utilisation d'animaux adultes. Cet âge a également été choisi pour être cohérent avec les études publiées et les expériences antérieures dans notre équipe.
Rôle et régulation de la thrombopoïèse pulmonaire lors d’une infection virale pulmonaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Une partie des souris est génétiquement modifiée pour porter le récepteur humain du SARS-CoV-2, ce qui les rend infectables par les variants humains du virus. 5 040 souris vont être utilisées, 4 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 240 opérées sous anesthésie sans réveil. Sept jours après inoculation, le porteur décrit chez ces souris une température corporelle tombée à 25 degrés et une perte de poids supérieure à 20 %, et prévoit par ailleurs des chirurgies pulmonaires de quatre à cinq heures, des interventions sur les os du crâne, jusqu'à cinq prélèvements de sang sous la mâchoire et des injections derrière l'œil. Toutes sont tuées pour prélever sang, poumons, rate et moelle osseuse, ce cumul de prélèvements sur un même animal étant présenté comme une mesure de réduction.
Objectifs
Les mégacaryocytes sont des cellules qui se développent dans la moelle osseuse et qui permettent la formation de plaquettes dans le sang, nécessaire notamment à la coagulation sanguine. Récemment, nous avons démontré que cette formation de plaquettes n’est pas restreinte à la moelle osseuse mais qu’elle peut aussi avoir lieu dans les poumons. Des études récentes et nos données préliminaires suggèrent que cette formation de plaquettes dans les poumons pourrait jouer un rôle clef lors d'une infection virale pulmonaire. Chez l’homme au cours des infections à Sars-CoV-2 une augmentation très importante de ces mégacaryocytes pulmonaires a été reportée chez les patients atteints de COVID-19 en comparaison à d’autres patients atteints d’autres causes de détresse respiratoire. Nous pensons que la formation de plaquettes au niveau des poumons augmente au cours des infections pulmonaires, et cette augmentation semble liée à une aggravation de la détresse respiratoire et à une inflammation aigüe. Les mécanismes y conduisant ne sont pas connus et ce sont donc ces mécanismes que nous proposons d’identifier en utilisant des modèles d’infections pulmonaires chez la souris et des techniques de microscopie intravitale. L’identification de ces mécanismes devrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques non seulement pour les infections pulmonaires comme la COVID-19 mais aussi pour d’autres pathologies inflammatoires pulmonaires comme l’asthme ou les fibroses pulmonaires où l'activation des plaquettes contribue au développement de la pathologie
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de : (i) déterminer l’implication bénéfique ou délétère de la production de plaquettes dans les poumons au cours des infections virales ; (ii) étudier la cinétique de production de plaquettes dans les poumons au cours des infections virales pulmonaires et de l’inflammation pulmonaire ; (iii) caractériser et identifier de nouveaux mécanismes de la biologie plaquettaire (production, modifications, rôles) ; (iv) identifier potentiellement des nouvelles cibles thérapeutiques dans les pathologies pulmonaires dans lesquelles les plaquettes sont impliquées.
Procédures
Dans ce projet, - Les souris sous anesthésie générale subiront une injection de virus. L’injection ne dépasse pas 1 minute. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront une injection de cellules ou de molécules. Les injections ne dépassent pas 2 min. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront entre un et cinq prélèvement sanguin. Les prélèvements ne dépassent pas 2 min. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront une injection de cellules ou de molécules puis une chirugie quelques jours plus tard. Les souris sous anesthésie generale et locale subiront une procédure de chirurgie pulmonaire sans réveil. Les injections ne dépassent pas 2 min, et la chirrugie dure 4h. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront une injection de cellules ou de molécules puis une chirugie quelques heures ou minutes plus tard. Les souris sous anesthésie generale et locale subiront une procédure de chirurgie pulmonaire sans réveil. Les injections ne dépassent pas 2 min, et la chirrugie dure 4h. - Les souris sous anesthésie generale et locale subiront une injection de molécules puis une chirugie quelques heures ou quelques minutes plus tard. Les souris anesthésiées subiront une procédure de chirurgie sur les os du crane. Les injections ne dépassent pas 2 min, et la chirrugie dure 4h. - Les souris anesthésiées subiront une injection de virus, puis quelques jours plus tard une injection de cellules, et quelques heures après ils seront mis à mort par anesthésie. Les injections ne dépassent pas 2 min. - Les souris sous anesthésie generale subiront une injection de virus. Puis quelques jours plus tard une injection de cellules sous anesthésie generale et locale. Les injections ne dépassent pas 2 min.
Impact sur les animaux
Dans ce projet nous utiliserons un variant du SARS-CoV-2 adapté pour infecter les souris qui induit des pertes de poids inférieures à 10% sur toute la durée de l’infection ainsi qu’une faible baisse de la température corporelle
Devenir
Toutes les souris de ce projet seront mises à mort pour des prélevements de tissus et de sang.
Remplacement
Notre projet a pour but de mieux comprendre la production de plaquettes sanguines au cours des infections virales pulmonaires. Afin de répondre à nos questions biologiques, nous avons besoin de travailler sur des organismes vivants ayant une réponse immunitaire suffisamment proche de l’homme. Il est impossible de ne travailler sur des modèles in vitro strictement cellulaires car il n'est pas possible pour l'instant d'obtenir en dehors d'un organisme vivant la production de plaquettes pleinement fonctionnelles. En effet cette production est dépendante du flux sanguin et de nombreuses interactions cellulaires. Ainsi notre projet nécessite l’utilisation d’un organisme entier, le plus adapté étant la souris.
Réduction
Des expériences préliminaires ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les analyses statistiques seront réalisées sur un logiciel d’analyse en combinant les résultats de n=4 expériences indépendantes avec 5 souris par lot (soit 20 animaux par groupe). En fonction des résultats obtenus lors de certaines étapes clés de notre projet, nous poursuivrons ou arrêterons certaines expériences. Après mise à mort de l’animal, des prélèvements seront réalisés, afin d’obtenir le plus d’informations possibles sans avoir à utiliser d’autres animaux. Nous prélèverons par exemple à la fois le sang, les poumons, la rate et la moelle osseuse, ce qui nous permettra de réaliser plusieurs tests à partir d'un seul animal.
Raffinement
Dans ce projet, il existe différentes étapes susceptibles de générer de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse chez les animaux. Pour chaque étape, des mesures adéquates ont été mises en place pour suivre et réduire au maximum ces nuisances. Les conditions d'hébergement et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute angoisse ou dommage durable que pourraient subir les animaux. Les injections sont réalisées sous anesthésie générale. Pour la chirurgie qui est une procédure sans réveil nous utilisons aussi une anesthésie générale, combinés à des anesthésiques locaux et un analgésiant. La température corporelle et l’hydratation des animaux sont maintenues tout au long de la procédure grâce à une caisse chauffante et des injections régulières de solution saline. Un gel est appliqué sur les yeux afin de prévenir leur assèchement. Les souris infectées seront surveillées quotidiennement jusqu’à l’arrêt des procédures. La température, le poids, l’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront prises en compte à chaque observation et les animaux présentant des signes de souffrance seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Pour notre projet visant à explorer la biologie des plaquettes sanguines dans les infections par des virus, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'excellente caractérisation des fonds génétiques ii) de l’utilisation de souris génétiquement modifiées déjà présentes dans l’équipe permettant de suivre les plaquettes et les mégacaryocytes, et iii) du fort degré de convergence des paramètres de l'immunité et de la biologie plaquettaire chez l'homme par rapport aux autres espèces envisageables. De plus, notre projet est basé sur l’étude de la dynamique de production de plaquettes par une technique de microscopie intravitale qui n’est applicable que chez la souris. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes majoritairement âgées entre 8 et 12 semaines, mais également certaines de plus de 40 semaines afin d’étudier notre modèle à différents âges chez la souris. A ces stades de développement, les souris ont un système immunitaire suffisamment mature.
Étude de tumorigénicité et d’efficacité d’un traitement dans six modèles de cancer colorectal humain implantés en sous cutané chez la souris immunodéprimée.
- Recherche appliquée
- Cancers
Établir le dossier préclinique d'une molécule anticancéreuse avant de premiers essais chez l'humain passe ici par six modèles de cancer colorectal humain greffés sous la peau de souris privées de système immunitaire. 540 souris de cinq à six semaines vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées au 56e jour ou plus tôt si un point limite est atteint. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse, puis trois injections dans la veine de la queue ou dans l'abdomen, sur animal vigile. Le porteur indique que l'efficacité du produit a déjà été validée sur lignées cellulaires "par toutes les techniques pertinentes", et que le passage chez la souris devient "nécessaire" pour l'évaluer sur un "organisme entier".
Objectifs
Le cancer colorectal est l’un des cancers le plus fréquent dans le monde avec, en 2020, 1,93 millions de nouveaux cas et 916 000 de décès. En France, il constitue le troisième cancer le plus fréquent chez l’homme et le deuxième cancer le plus fréquent chez la femme. La mise en place du programme de dépistage organisé en France permet la prise en charge des patients à un stade précoce et améliore ainsi le pronostic de ces patients. Malgré cela la majorité des patients sont diagnostiqués alors que la maladie est à un stade avancé, diminuant fortement l’espérance de vie des patients, et cela en dépit des avancées thérapeutiques. Récemment, de nouveaux traitements ont permis une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Dans ce sens, une molécule a été mise en évidence pour son efficacité à stimuler le système immunitaire. Le présent projet vise à établir évaluer l’efficacité cette nouvelle molécule dans ces différents modèles de cancer colorectal humain chez la souris.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont la démonstration de l’efficacité anti-tumorale d’une nouvelle molécule dans le traitement des cancers colorectaux. Ces résultats sont nécessaires afin de procéder à l’évaluation ultérieure de ce produit dans le cadre d’études cliniques précoces chez l’Homme.
Procédures
Pour chaque souris : - 1 injection sous-cutanée de cellules tumorales sous vapeur d’isoflurane (3,5 %) (durée < 1 minute) - 3 injections intraveineuses (animal vigile) du composé testé ou intrapéritonéales du contrôle positif + contention (durée < 5 minutes)
Impact sur les animaux
- Douleur de courte durée lors de l’injection des cellules tumorales en sous cutanée (quelques secondes maximum) - Injection dans la veine caudale : douleur caudale si inflammation du point d’injection (très peu probable) - Douleur de courte durée lors de l’injection intrapéritonéale (quelques secondes maximum) - Stress lié à la contention et aux mesures des volumes tumoraux cutanés (quelques minutes maximum) - Perte de poids < 10% et transitoire (moins de 24h) suite à l’injection de notre produit sous forme liposomale - Gêne à la locomotion, nuisances possibles si le volume tumoral au site d’injection atteint le point limite
Devenir
Pour les deux procédures, tous les animaux seront mis à mort 56 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai.
Remplacement
Avant le passage chez l’animal, l’efficacité de notre produit a été validé sur les lignées cellulaires par toutes les techniques pertinentes pour l’étude de notre produit. Le passage chez la souris, est désormais nécessaire pour évaluer l’effet du produit sur un organisme entier.
Réduction
La procédure sera réalisée sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable. La partie mise au point sera réalisée de façon séquentielle afin d’arrêter cette mise au point dès que la prise tumorale sera suffisante.
Raffinement
Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Les souris seront observées trois fois par semaine en surveillant leur état général, leur comportement (activité, isolement…), des critères physiques (poils hérissés, dos voussé (signe de douleur chez la souris) …), ou le moindre signe de douleur. Lors des manipulations, les souris seront anesthésiées sous vapeur d'Isoflurane. Des points limites détectés via une grille de score permettront, en fonction des observations, la mise en place des mesures nécessaires afin que le bien-être de l’animal soit respecté. Si souffrance animale, de la buprénorphine sera injectée aux souris. Chaque cage présentera des enrichissements (cotons de nidation, tunnel).
Choix des espèces
Les souris sont particulièrement adaptées pour l’étude des cancers. La souris immunodéprimée (déprouvue de système immunitaire) est un modèle reconnu pour l’implantation de xénogreffes. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.
Rôle des gènes de Salmonella dans la colonisation, la virulence et la persistance de cette bactérie– Développement/Tests d’inhibiteurs des produits de ces gènes ou de la viabilité de Salmonella
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Infectées par Salmonella par voie orale à deux reprises en vingt-quatre heures, puis suivies par imagerie trois fois dix minutes par jour pendant trois jours, des souris subissent aussi une chirurgie de deux heures sur les anses intestinales, menée sous anesthésie sans réveil. 6 600 souris vont être utilisées, 3 300 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 3 300 opérées sans réveil, toutes tuées pour prélèvement des organes. L'objet est d'identifier les gènes qui permettent à la bactérie de coloniser son hôte, et de tester des inhibiteurs. Pour 3 300 souris en souffrance sévère, le porteur résume les nuisances attendues à une perte de poids et une diarrhée, tout en décrivant par ailleurs des animaux tués dès que l'expérimentateur estime qu'ils mourraient dans la demi-journée.
Objectifs
Salmonella est une bactérie pathogène importante en santé publique. Elle est responsable, suivant le sérotype, d’infections systémiques létales, de gastroentérites ou encore d’un portage asymptomatique chez l’homme et les animaux. Chez l’homme, la fièvre typhoïde touche encore 22 millions de personnes chaque année et on estime à 1,3 milliard le nombre de cas de gastroentérites à Salmonella chaque année dans le monde. Comprendre les mécanismes d’interactions d’un pathogène avec son hôte est indispensable au développement de méthodes de prophylaxie ou de thérapeutiques. Notre projet vise à (1) identifier les gènes de Salmonella impliqués dans la colonisation, la réponse de l’hôte, la virulence et la persistance de cette bactérie chez son hôte et à caractériser leur rôle ; et/ou (2) à tester des inhibiteurs des produits de ces gènes ou de la viabilité des salmonelles. Après caractérisation des gènes et/ou développement/analyse d’inhibiteurs in vitro, l’expérimentation animale est nécessaire pour valider les résultats obtenus in vitro, c’est à dire l’implication du gène d’intérêt dans la virulence de Salmonella, l’efficacité de l’inhibiteur. Elle permet également de caractériser plus finement le rôle du gène d’intérêt in vivo.
Bénéfices attendus
Comprendre les mécanismes d’interactions d’un pathogène avec son hôte est indispensable au développement de méthodes de prophylaxie ou de thérapeutiques. Notre projet vise à (1) identifier les gènes de Salmonella impliqués dans la colonisation, la réponse de l’hôte, la virulence et la persistance de cette bactérie chez son hôte et à caractériser leur rôle ; et/ou (2) à tester des inhibiteurs des produits de ces gènes ou de la viabilité des salmonelles. Après caractérisation des gènes et/ou développement/analyse d’inhibiteurs in vitro, l’expérimentation animale est nécessaire pour valider les résultats obtenus in vitro, c’est à dire l’implication du gène d’intérêt dans la fitness et/ou la virulence de Salmonella, l’efficacité de l’inhibiteur. Elle permet également de caractériser plus finement le rôle du gène d’intérêt in vivo.
Procédures
Les animaux seront soumis à une infection à salmonella par voie orale (2 fois à 24h d'intervalle) . Ils pourront ensuite être soumis à des prélèvements sanguins afin d'étudier la perméabilité intestinale (1 fois), à un suivi par imagerie in vivo (3 x 10 min par jour pendant 3 jours). L'inoculation de salmonella sera également réalisé grâce à la méthode des anses intestinales ( 1 fois x 2heures; chirurgie sans réveil) .
Impact sur les animaux
Dans le cas de l'infection par voie orale les animaux pouront perdre du poids et développer une diarrhée
Devenir
Mise à mort afin de réaliser le prélèvement des organes
Remplacement
Une caractérisation préalable des gènes est réalisée in vitro pour permettre la sélection des gènes les plus pertinents et pour orienter le choix des voies d’inoculation à mettre en oeuvre. Le principe de remplacement n'est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduisent pas l'ecosystème complexe au cours de l'infection et par conséquent ne permettent pas l'obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine.
Réduction
L'utilisation de l'IVIS (In Vivo Imaging System) permet de suivre les souris au cours du temps et permet donc l'étude de la cinétique de la colonisation sur une même souris là où il aurait fallu les sacrifier à différents temps sans cela. Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux. De plus, nous avons déjà validé certaines de nos approches expérimentales in vitro permettant d'optimiser l'utilisation des animaux. Les rongeurs utilisés sont consanguins et de même âge réduisant la variabilité entre les animaux et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Une étude statistique est réalisée sur les données brutes d’immunohistochimie ou de FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) obtenues à partir des organes prélevés. Les tests appliqués sont des tests non paramétriques (Kruskall-Wallis one-way analysis of variance suivi d’un Mann-Whitney en post-test). Pour les niveaux de colonisation des organes par les bactéries, les tests utilisés sont des tests paramétriques (ANOVA suivi d’un posttest Tukey-Kramer) car le cumul de l’ensemble des données que nous avons obtenues depuis plus de 10 ans concernant ce caractère montre que ces données suivent une loi normale. Ceci nous permet lorsque nous souhaitons uniquement comparer le niveau de colonisation de plusieurs souches de diminuer le nombre d’animaux pour obtenir la même puissance de test.
Raffinement
Le bien-être de l’animal, outre les considérations éthiques, est aussi un facteur de variabilité expérimentale, qui est pris en compte et réduit grâce au suivi rapproché quotidien des animaux, l’enrichissement de leur environnement (coton ou sopalin afin qu'ils puissent faire un nid) et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage). De plus une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant l'expérimentation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé quotidiennement. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. Dans le cas du modèle de portage, les souris ne présentent aucun symptôme. Un animal est euthanasié lorsqu’il présente des difficultés à se mouvoir après une stimulation et que l’expérimentateur juge que l’animal décèdera dans la ½ journée suivante c’est-à-dire avant la prochaine visite de l’expérimentateur afin d’éviter toute souffrance inutile. Ceci est rendu possible grâce à l’expérience acquise par l’équipe depuis plus de 15 ans. Les expérimentateurs « novices » travaillent en binôme tant qu’ils n’ont pas acquis l’expérience nécessaire De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Lorsque la procédure le nécessite les animaux seront anesthésiés à l’isofurane.
Choix des espèces
La souris est particulièrement pertinente pour étudier les infections à Salmonella en choisissant la bonne lignée de souris puisque nous reproduisons ainsi une infection naturelle. Le modèle gastroentérite a été montré dans la littérature comme reproduisant l’infection et la réponse immunitaire au cours d’une gastroentérite chez le veau, où Salmonella est responsable naturellement d’une gastroentérite. L’utilisation de ce modèle murin de « gastroentérite » est justifiée par rapport au modèle bovin par le moindre coût, la moindre lourdeur et la plus grande disponibilité des animaux. Les souris utilisées sont adultes, elles ont entre 8 et 12 semaines et ce, conformément aux modèles établis dans la littérature
Etude de l’inactivation des microARNs cérébraux via les vecteurs viraux adéno-associés à différents temps du dévéloppement
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des femelles gestantes, des souriceaux nouveau-nés et des souris adultes vont être utilisés, chaque groupe correspondant à une voie d'injection différente. 396 souris en tout, 228 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 168 un niveau léger. Les adultes subissent une chirurgie intracérébrale pouvant durer deux heures, les gestantes une injection dans la veine de la queue ou dans le plexus derrière l'œil, les nouveau-nés une injection le jour de leur naissance, avec pour risque documenté le cannibalisme de la mère. Toutes sont tuées deux à six semaines après l'intervention, pour vérifier que trois microARN du cerveau ont bien été inactivés, une validation d'outil qui précède l'étude proprement dite.
Objectifs
Les troubles psychiatriques comme la dépression ou la schizophrénie affectent une partie de plus en plus importante de la population. Bien que leur origine soit multifactorielle, l’environnement joue un rôle majeur dans le déclenchement, le développement et/ou l’évolution de ces troubles. Les mécanismes épigénétiques sont connus pour réguler l'expression génique et moduler l'adaptation à l'environnement. Leur dérégulation est associée à nombreuses maladies psychiatriques et ils seraient des pistes intéressantes pour des nouvelles thérapies. Nous avons déjà montré que le changement de l'environnement social (niveau de soins maternels) a des effets sur le comportement de la souris et peut engendrer aussi une vulnérabilité à la dépression. D'ailleurs, nous avons identifié des voies épigénétiques altérées en fonction des niveaux de soins maternels, notamment des microARNs. Dans ce projet, nous cherchons à valider in vivo l’efficacité des vecteurs viraux AAVs permettant l’inactivation des 3 microARNs précis, miR-218, miR-124 et miR-132. Les vecteurs AAVs seront validés (via des analyses anatomiques, histologiques et moléculaires) dans un premier temps chez la souris adulte via des injections intra-cérébrales. Comme les changements de soins maternels que nous utilisons opérent juste après la naissance, nous voudrions tester deux autres mode d’administration permettant une inactivation perinatale (injections rétro-orbitales ou systémiques chez la femelle gestante) et sur des souriceaux nouveau-nés. Ces différentes procédures chirurgicales seront effectuées une seule fois par animal.
Bénéfices attendus
La validation des outils viraux et les voies d’administration proposées dans ce projet est l'étape préalable pour pouvoir étudier l'implication de miR-218, miR-124 et miR-132 dans les maladies psychiatriques.
Procédures
Les animaux adultes seront soumis à des procedures chirurgicales (injections intracérébrales), 1 fois par animal et avec une durée max de 2h. Des femelles gestantes subiront des injections dans la veine caudale ou dans le plexus rétro-orbitale (1 seule fois, durée max 5 min). Des souriceaux seront injectés à la naissance (1 seule fois, durée max 5 min)
Impact sur les animaux
Tous les animaux subiront une seule procédure chirurgicale suivi d’une mise à mort 2-6 semaines plus tard. Les nuisances potentielles sont liées a la procédure (i. e. infections) ou à la récuperation de la chirurgie (i.e. perte de poids ou retard de la croissance). Les injections chez le nouveau-né peuvent aussi induire du cannibalisme de la mère.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour les analyses moléculaires et anatomiques requis pour la validation de l'inactivation des miR-218, miR-124 et miR-132
Remplacement
Le but de cette étude est de déterminer l’efficacité d’inactivation des outils viraux dans le cerveau . Comme le but ultime est d'utiliser ces approches pour comprendre l'implication des microARNs précis sur les comportements dits, dépressifs, cet objectif ne peut être atteint qu’en étudiant l’animal dans son ensemble et il ne peut être réalisé sur le sujet humain. Nous avons choisi la souris, étant une espèce suffisamment proche de l'Homme et dans laquelle les comportements dits dépressifs peuvent être induits de façon expérimentale. Par contre, nous avons utilisé des données obtenues chez l'Homme et chez la souris pour determiner quels etaient les microRNA cibles qui présentareaient plus d'intéret pour la recherche chez le patient.
Réduction
Nous allons limiter au maximum le nombre d’individus à utiliser pour ce projet. Le fait d’utiliser des vecteurs viraux évitera la génération de nouvelles souches transgéniques présentant des anomalies/handicaps. Nos données préalables ainsi que des approches statistiques largement utilisées par la communauté scientifique ont permis un calcul approximatif de la taille optimale des cohortes pour ces expériences. Cela permet de limiter le nombre d’animaux sans diminuer pour autant la puissance de nos analyses. De plus, l'ensemble des échantillons supplémentaires (protéines, ARN, coupes) seront mis à disposition pour d’autres membres de l’équipe ou du laboratoire travaillant sur des thématiques similaires afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans l'ensemble de l'institut.
Raffinement
L’hébergement se fait dans un environnent (température, luminosité et hygrométrie contrôlées) et matériel (cage, portoirs et biberons) adaptés à la souris. Un enrichissement de régulier de leur milieu (avec des quarts de coton, des bouts bois …) est prévu pour les animaux tout au long de leur vie. Lors de la chirurgie, les animaux sont anesthésiés et ils reçoivent une injection de lidocaine au lieu de l'incision et une analgésie sous-cutanée (buprénorphine : 0.05 mg/kg) 30 min avant et 24h après la procédure. Dans les injections sur les nouveau-nés, le plus gros problème rencontré dans nos procédures est le cannibalisme maternel. Afin de diminuer au maximum ce phénomène, nous mettons en place plusieurs actions : 1- seules les femelles qui ne présentent pas de signes de stress sont utilisées 2- nous favorisons l'utilisation de femelles non primipares 3- une grande quantité de matériel de nidification est fournie 4- les femelles ne sont manipulées qu'avec des tunnels 5- deux à trois fois par semaine pendant la gestation, nous fournissons quelques friandises ou du gel nourrissant aux femelles afin qu'elles associent notre intervention à quelque chose de positif. Les procédures 1 et 2 seront réalisées sur des portées de souriceaux. Des points limites adaptés (notamment la croissance pondérale, marqueur de bonne santé chez les souriceux apuisqu'elle indique que l'individu arrive à se nourrir) a été mis en place. Ainsi tout individu qui présente une croissance pondérale altérée est, selon le degré, suivi de plus près (point limite) ou euthanasié (point d'arrêt).
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris, étant une espèce suffisamment proche de l'Homme et dans laquelle les comportements dits dépressifs peuvent être induits de façon expérimentale. Nous allons utiliser des femelles gestantes, des nouveau-nés et des souris adultes car, dans ce projet, nous cherchons à évaluer les effets de nos manipulations à différents stades du développement cérébrale
Immunothérapies antitumorales renforcées par un complexe organométallique
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Le volume de la tumeur greffée sur le flanc est plafonné, au-delà l'animal est tué. 325 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tumeurs et leurs ganglions, 300 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 25 un niveau léger. Chacune reçoit une injection de cellules cancéreuses sous la peau du flanc, puis des injections tous les trois jours pendant vingt et un jours, avec mesure de la tumeur au pied à coulisse quatre fois par semaine. Ce travail s'inscrit dans un projet de maturation financé par un service de valorisation, l'enjeu étant de positionner un composé organométallique comme renfort d'immunothérapies anticancéreuses.
Objectifs
Le nombre de nouveaux cas de cancer a augmenté ces dernières années en France métropolitaine avec plus de 430.000 (en 2023) tous cancers confondus. Malgré les progrès dans leur diagnostic et leur traitement, certains ont encore un pronostic défavorable. Le système immunitaire joue un rôle primordial pour éliminer les cellules cancéreuses. Cependant, l’environnement au sein de la tumeur permet aux cellules cancéreuses d’échapper aux cellules du système immunitaire. L’essor de nouvelles thérapies ciblant le système immunitaire a montré des résultats prometteurs. Toutefois, seulement 20-30% des patients répondent efficacement à ces traitements. C’est pourquoi de nouvelles stratégies sont en cours de développement, pour améliorer la prise en charge des patients non répondeurs. Dans ce contexte, nos travaux actuels portent sur l'étude d'un nouveau composé pouvant altérer les cellules cancéreuses et favoriser la réponse immunitaire. C'est pourquoi, l’objectif de ce projet est de développer des nouvelles associations de traitements couplant les propriétés de notre composé à l’utilisation d’immunothérapies afin de développer nouvelles stratégies thérapeutiques dans le domaine de la cancérologie.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un projet maturation soutenu et financé par le service de valorisation afin de pouvoir positionner un nouveau composé comme agent thérapeutique pouvant potentialiser l’efficacité de traitements anticancéreux par immunothérapie afin d'améliorer la réponse immunitaire antitumorale.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection unique de cellules cancéreuses au niveau du flanc pour développer le modèle (durée < 5 minutes par souris). Une fois que les tumeurs auront commencées à se développer, les souris recevront des injections tous les 3 jours pour administrer les traitements d’intérêt (notre composé et/ou immunothérapies), sur une durée de 21 jours à compter de l'injection de cellules cancéreuses. Au cours des expériences, la croissance de la tumeur sera suivie 4 fois par semaine. Le temps de chaque intervention, injection des cellules cancéreuses, injections des traitements et mesure de la taille des tumeurs se fera en moins de 5 minutes par souris et par manipulation.
Impact sur les animaux
Les injections, ainsi que la contention des souris nécessaire pour réaliser ces injections, nécessaire pour l’ensemble de la procédure peuvent entrainer un état de stress chez ces dernières. C’est pourquoi nous avons choisi d’effectuer ces gestes sur souris anesthésiées. Un suivi quotidien des animaux (évaluation du comportement, alimentation, hydratation) et l’évaluation 4 fois par semaine de la courbe de poids ainsi que de la croissance tumorale (à l’aide d’un pied à coulisse sur animal vigile) provoquera peu de nuisance/stress et permettra la surveillance d’apparition des points limites définis Le développement de la tumeur sur le flanc (qui sera limité à un volume maximal) pourrait provoquer une gêne légère de la souris – c’est pourquoi déplacements et activité seront particulièrement observés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les tumeurs et les ganglions lymphatiques Application de la règle des «trois R»
Remplacement
Ce projet est basé sur des études préliminaires réalisées sur cellules en culture montrant un effet fort du composé testé à la fois sur les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires. Toutefois, ces études sur cellules ne permettent pas de prendre en considération les échanges qu’il peut y avoir entre elles, ni l’impact des tissus autour de la tumeur sur la réponse au traitement anticancéreux. A ce jour, seules les expériences in vivo permettent de prendre en considération l’ensemble de ces paramètres.
Réduction
L'effectif du nombre d'animaux requis par groupe expérimental a été calculé statistiquement en nous basant sur des études similaires menées au sein de notre laboratoire.
Raffinement
Les expérimentations débuteront après une période d’acclimatation de 7 jours aux conditions de l’animalerie. Les souris femelles seront hébergées par 5 en cages filtrées, à une température de 22±2°C et une humidité relative de 50±20%. Les souris seront soumises à un cycle lumière-obscurité inversé de 12h. Elles auront accès à volonté à eau et nourriture et disposeront d’un enrichissement (frisures de papier graft pour faire des nids, bûchettes de peuplier à ronger, tunnel ou dôme, pour se cacher et grimper). Les injections seront effectuées sur animaux anesthésiés. Des critères d'arrêt anticipé de l'expérimentation en cas de survenue d'une complication ont été identifiés.
Choix des espèces
Les deux modèles de souris sélectionnés possèdent un système immunitaire efficace et sont les modèles animaux le plus appropriés pour pouvoir induire un développement d’une tumeur et étudier l'impact de traitement anticancéreux. souris adultes, dont le système immunitaire est mature.
Nouvelles formes de traitement ARN par voie orale dans les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Cinq jours de traitement destiné à enflammer l'intestin, quatre injections ou quatre gavages selon le groupe, puis une coloscopie sous anesthésie au dixième jour. 45 souris mâles de neuf à dix semaines traversent ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec pertes de poids et saignements possibles. Le porteur qualifie l'induction de l'inflammation de traitement sévère mais "nécessaire", et s'appuie sur une dose largement utilisée dans la littérature et sur un modèle qu'il décrit comme maîtrisé depuis longtemps. La coloscopie terminée, elles sont tuées sans reprendre conscience, et le foie, le cœur, la rate, l'intestin entier, les ganglions, le sang, les urines et les selles sont prélevés.
Objectifs
Nous développons une nouvelle méthode d’administration de traitement anti-inflammatoire dans les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI) comme la maladie de Crohn et la Rectocolite Hemorragique. Les études in vitro et in vivo ont d’ores et déjà montré des résultats prometteurs, permettant le dépôt d’un premier brevet. L'objectif général est de développer une stratégie alternative aux produits biologiques (anticorps administrés actuellement par voie injectable) dans le traitement des MICI modérées à sévères, par l'administration locale de petites molécules à base d'ARN, enveloppés dans des microcapsules qui peuvent être administrées par voie orale. Cette nouvelle technologie présente de nombreux avantages par rapport aux traitements conventionnels : (1) réduction des effets indésirables grâce à une action locale ; (2) diminution des effets secondaires par rapport aux anticorps injectés largement utilisés à l’heure actuelle (3) action simultanée possible sur plusieurs cibles en délivrant différentes petites molécules en une seule fois, à l'instar des stratégies biologiques doubles utilisées chez les patients atteints de MICI réfractaires (4) administration orale beaucoup moins contraignante par rapport aux voies injectables, permettant une meilleure observance thérapeutique. Pour optimiser et valider la stratégie d'administration orale de nos molécules à l'aide de microcapsules, les objectifs sont maintenant l'évaluation préclinique, sécurité et efficacité de nos microparticules par rapport aux produits biologiques conventionnels dans un modèle bien caractérisé d'inflammation intestinale.
Bénéfices attendus
Les petites molécules à base d’ARN vont inhiber localement l’expression de protéines cibles impliquées dans la réponse inflammatoire. Ce projet permettra donc à long terme de développer une stratégie alternative aux produits biologiques afin de traiter les MICI modérées à sévères. Grâce à l’administration orale de petites molécules permettant d’améliorer l’observance thérapeutique des patients puisque la voie orale est beaucoup moins contraignante et risquée que les traitements injectables utilisés aujourd'hui chez les patients souffrants de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin.
Procédures
4 interventions seront réalisées durant ce projet : (1) Le traitement pro-inflammatoire pour "imiter" les symptômes d'une Maladie Inflammatoire Chronique Intestinale sera réalisé sur tous les animaux (45 souris) durant 5 jours. (2) Les injections du traitement de référence chez 9 animaux ou d’une solution tampon chez les autres animaux seront réalisées sur animal vigile 4 fois au cours du protocole (durée : quelques secondes). (3) L’administration par voie orale des microcapsules ou d’une solution tampon sera réalisée sur animal vigile 4 fois au cours du protocole (durée quelques secondes). (4) L'endoscopie rectale : examen de quelques minutes (10 min maximum) réalisé le dernier jour du protocole (10ème jour) sous anesthésie générale sur la totalité des animaux juste avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
L’induction d’une inflammation de l’intestin (intervention n°1) réalisée sur tous les animaux est un traitement sévère pour les animaux mais nécessaire pour étudier l’inflammation intestinale. Les souris pourront perdre du poids ou présenter des saignements pendant la durée du traitement. Cependant, la dose administrée est une dose très largement utilisée dans la littérature scientifique. C’est un modèle maîtrisé depuis longtemps. Il est à noter que la sévérité de la réponse au traitement est aussi très dépendante de l’environnement de l’animal et que de par nos protocoles antérieurs, les symptômes sont rapidement identifiés afin d'intervenir sans délai et ainsi limiter la souffrance des animaux. Aucun effet indésirable n'est attendu concernant l'administration des molécules anti-inflammatoires aussi bien par voie injectable (intervention n°2), en s’appuyant sur la littérature scientifique ; que par voie orale (intervention n°3) en s’appuyant sur le protocole initialement réalisé dans un modèle similaire d'inflammation chez la souris. L'administration par gavage ou par injection étant réalisé par un zootechnicien qualifié maîtrisant les gestes interventionnels, ceci limite le risque de nuisance pour les animaux. Enfin, concernant la coloscopie (intervention n°4), elle est réalisée sous anesthésie générale et suivie de la mise à mort des animaux donc sans nuisance ni effets indésirables.
Devenir
Les interventions successives sont réalisées sur animal vigile, seule la dernière (coloscopie) est réalisée sous anesthésie générale et à l’issue de celle-ci les animaux sont mis à mort sans réveil afin que tous les organes (foie, cœur, rate, intestin entier, ganglions mésentériques) ainsi que le sang, les urines et les selles soient prélevés.
Remplacement
A ce jour, les maladies intestinales ne peuvent pas être entièrement reproduites par des modèles cellulaires. En effet, la physiologie intestinale est complexe car elle implique plusieurs systèmes distincts notamment le système digestif, le système immunitaire et la flore intestinale. Aussi, les réponses inflammatoires sont des processus temporels et évolutifs impliquant des organes extérieurs au tube digestif, il n’existe donc pas de remplacement possible du modèle animal pour explorer l'effet thérapeutique de notre nouvelle technologique d'administration d'un traitement anti-inflammatoire.
Réduction
Afin de réduire au strict nécessaire le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, 45 souris (4 groupes expérimentaux de 9 animaux et un groupe témoin de 9 animaux également) seront nécessaires dans cette étude afin d’obtenir une puissance statistique suffisante tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux. Le nombre de souris nécessaires a été calculé par une approche statistique sur la base d'études antérieures menées au sein du laboratoire, dans la même animalerie et sur le même modèle expériemntal pour permettre les analyses statistiques a postériori.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupe de 4 à 5 animaux, dans des cages ventilées, avec à disposition du papier, des cabanes en carton pour se cacher et grimper, des buchettes de bois pour usure des dents et autres matériaux d’enrichissement tout au long du protocole. Toutes les interventions expérimentales seront réalisées par des personnes formées et expérimentées. Elles auront lieu dans l’animalerie du laboratoire, dans un environnement sécurisant pour l’animal et les coloscopies se feront sous anesthésie générale. Une procédure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place. Le point limite est fixé selon un score défini au préalable et en tenant compte des signes éventuels de mal-être. En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des organes prélevés pour permettre des analyses biologiques. Le modèle d'inflammation est un modèle bien maîtrisé et les symptômes sévères sont repérés rapidement afin de limiter la souffrance des animaux et intervenir sans délai.
Choix des espèces
Il n’existe pas d’alternative pour étudier l’effet d’une nouvelle molécule dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin car : - La physiologie de l’intestin est complexe d’une part, et la réponse inflammatoire implique de nombreux acteurs présents dans l’ensemble de l’organisme. Les cultures cellulaires ont montré des résultats intéressants mais ne sont donc pas suffisantes pour valider l'effet anti-inflammatoire sur organisme entier. - La sévérité de l’inflammation étant évaluée notamment par endoscopie rectable, l’utilisation de l’animal comme modèle d’étude est donc indispensable. - Le choix du modèle murin permettra de comparer nos résultats avec d’autres études réalisées avec des modèles transgéniques (modèle de colite spontanée Il10-/- où l’inflammation est chronique et non aiguë). Les animaux utilisés sont des souris mâles car la réponse à la colite est plus variable chez les femelles. L'âge fixé des animaux est de de 9 à 10 semaines correspondant au passage à la maturité sexuelle chez la souris soit au stade « jeune adulte » car les MICI sont des maladies du jeune adulte donc cela correspond aux besoins du projet.
Effets fonctionnels et morphologiques de candidats médicaments sur le bas appareil urinaire chez le rongeur dans un modèle mimant la ménopause.
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 720
Tués au terme d'une dernière intervention menée sous anesthésie sans réveil, pour que leurs organes soient prélevés, 720 souris et 720 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles sont ovariectomisées à quatre semaines pour reproduire une ménopause, reçoivent des hormones jusqu'à six mois, subissent de deux à quatre chirurgies et passent des séjours de vingt-quatre heures en cage métabolique individuelle, jusqu'à deux fois par semaine. S'y ajoutent jusqu'à vingt-quatre prélèvements de sang, à la queue ou à la veine saphène, sur animal vigile. Le porteur teste des molécules dont ses clients ne lui communiquent ni la nature ni les effets secondaires possibles, prévoit trente études sur cinq ans, et indique qu'aucun test statistique n'a servi à fixer la taille des groupes, arrêtée à huit animaux.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets fonctionnels et morphologiques de candidats médicament sur l’appareil urinaire dans un modèle mimant la ménopause. Nous pensons réaliser 3 études par an et par espèce, soit sur 5 ans 30 études.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les symptômes de la ménopause.
Procédures
Les animaux vont recevoir des traitements pharmacologiques ou hormonaux (fréquence dépendante de chaque protocole expérimental pouvant aller de quelques jours à 6 mois selon les procédures) donc vont être manipulés régulièrement. Chaque administration classique durera 30 sec – 1 min en moyenne. Ils pourront également subir plusieurs chirurgies allant de 10 à 30 minutes environ. Au maximum, les animaux auront 4 chirurgies et 2 au minimum. Les animaux iront dans des cages à métabolisme pour la collecte d’urine où ils seront en cage individuelle pendant 24H. Selon le protocole expérimental, plusieurs sessions de cages à métabolisme pourront être réalisées mais pas plus de deux par semaine sur une période de 6 mois maximum. Des prélèvements sanguins sur animal vigile pourront être réalisés à la queue ou à la veine saphène (1 prélèvement maximum par semaine sur un suivi total de 6 mois d’expérimentation). Sur animal anesthésié, des prélèvements terminaux pourront être réalisés. La fréquence des prélèvements est dépendante de chaque protocole expérimental et peut aller de 1 à 24 (1 prélèvement par semaine pendant 6 mois). Ces gestes étant réalisés par du personnel qualifié seront rapides (5 min max).
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Cependant, nos clients ont déjà des données sur l’innocuité des doses utilisées et les doses testées n’engendrent pas d’effets toxiques. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). Les animaux auront des chirurgies pour mimer la ménopause ou pour les traitements hormonaux, par conséquent, les animaux pourront avoir les mêmes symptômes cliniques que chez l’homme (humeur et comportement changeants notamment avec les hormones). De plus, toute chirurgie peut provoquer des douleurs, des saignements, un certain mal-être.
Devenir
Tous les animaux de l’expérience seront mis à mort car la dernière intervention de cette procédure se réalise sous anesthésie sans réveil et des organes seront collectés pour des analyses histologiques.
Remplacement
Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement des symptômes de la ménopause. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer les symptômes dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments ou nouvelles hormonothérapies.
Réduction
Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) pour certains paramètres. Pour mesurer certains paramètres, nous utilisons des méthodes non invasives telles que des cages métaboliques. Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. La méthode nous permettant d’analyser la fonction vésicale et principalement la fuite urinaire se réalise sur des animaux anesthésiés (anesthésie sans réveil), ne provoquant pas de douleur aux animaux. Aucun test statistique pour déterminer la taille des lots n’a été fait mais en considérant la variabilité interindividuelle des animaux (et en accord avec ce qui a déjà été publié par des équipes scientifiques et leurs résultats obtenus et notre expérience sur ce modèle) nous conduit à dimensionner les groupes de traitement avec des effectifs de 8 animaux par groupe afin d’envisager des différences statistiquement significatives entre les groupes de traitement.
Raffinement
Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, carré de coton) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de symptômes tels que prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure avant d’atteindre des points limites… En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée afin d’éviter toute hypothermie. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ses congénères. Des antalgiques seront administrés lors des chirurgies afin de limiter la douleur des animaux. Si un animal présentait des symptômes pouvant aller jusqu’à l’atteinte d’un point limite, il serait hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière, isolé et soigné si besoin selon les symptômes. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h ou si un point limite était atteint, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient. Les protocoles utilisés seront conformes aux recommandations des comités d'éthique et viseront à assurer le bien-être des animaux, en se référant aux "cinq libertés fondamentales" établies par l'Organisation mondiale de la santé animale. Cela implique : 1. que les animaux ont accès à une alimentation et à de l'eau en quantité et en qualité suffisantes 2. que nous prenons des mesures pour minimiser la douleur, les blessures et les maladies chez les animaux. 3. que nous veillons à ce que les conditions de logement et d'environnement des animaux soient adaptées 4. que nous permettons aux animaux d'exprimer leurs comportements naturels et essentiels à leur bien-être 5. que nous prenons des mesures pour minimiser la peur et la détresse chez les animaux lors des contentions.
Choix des espèces
Ces procédures seront effectuées chez des animaux « normaux » et chez des animaux transgéniques avec inactivation du récepteur aux œstrogènes, de l’un de ses sous-types, ou de l’une de ses voies d’action (nucléaire ou membranaire). Le modèle d’ovariectomie et d’effet sur l’appareil urinaire est bien décrit dans la littérature chez le rongeur. Les femelles seront ovariectomisées à 4 semaines afin d’éviter toute imprégnation hormonale. Le traitement hormonal sera administré 1-2 semaines après l’ovariectomie et ce pendant 6 mois maximum. Les expérimentations de mesure de point de fuite et les administrations de candidats médicaments seront de ce fait réalisées sur des animaux matures afin de miner la condition humaine.
Etude de l’activité de produit pharmacologique dans des modèles murins de tumeurs implantées
- Recherche appliquée
- Cancers
Greffées d'une tumeur sous la peau, soumises à une à trente-cinq administrations du produit testé et à dix micro-prélèvements de sang à la queue, 1 320 souris vont être utilisées pour trier vingt-cinq candidats-médicaments anticancéreux sur cinq ans. 1 120 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, 200 d'un niveau modéré. Les souris chez qui la tumeur ne prend pas pourront être réutilisées dans des séances de formation d'ingénieurs, dans la limite de 200 sur cinq ans, et seront tuées si aucune formation n'en a l'usage, comme toutes les autres à la fin des études. Le porteur décrit des fausses routes possibles au gavage avec détresse respiratoire aiguë, des œdèmes, une nécrose de la queue voire une automutilation, et écrit dans le même document qu'aucun "scoring" de la douleur n'est envisagé parce qu'il faudrait maintenir la souffrance de l'animal pour en suivre l'évolution.
Objectifs
Le cancer est la deuxième cause de décès dans les pays développés après les maladies cardiovasculaires. Les traitements conventionnels de nombreux cancers telles que la radiothérapie, la chimiothérapie et la chirurgie ont démontrés des limites d’efficacité nécessitant un besoin urgent de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans ce projet, nous souhaitons utiliser des modèles de tumeurs implantées en sous-cutanées chez la souris afin d’évaluer l’activité des candidats-médicaments. Ces candidats auront été préalablement développés et sélectionnés pour leur activité anti-tumorale sur des modèles cellulaires alternatifs. Cette étape reste indispensable car c’est la seule qui permet de s’assurer de la capacité d’un candidat médicament à être distribué jusqu’à la tumeur puis d’atteindre sa cible biologique dans un contexte bien différent et bien plus complexe que les modèles préliminaires. Cette phase permet à la fois de valider l’activité du candidat-médicament et sa posologie, ainsi que l’implication de la cible choisie dans la survie et le développement de la tumeur. Pour les candidats-médicaments dont l’activité aura été validé, ils pourront être testés en association avec des médicaments connus pour leur activité anti-tumorale. Cette étape supplémentaire a pour but de déterminer si les 2 thérapies peuvent être synergiques et en mesure de lutter plus efficacement contre les tumeurs. Un intérêt certain pour le traitement des cancers en clinique humaine qui peut permettre de réduire les doses de chacune des thérapies et limiter ainsi les effets secondaires.
Bénéfices attendus
La mesure de l’activité anti-tumorale des candidats-médicaments permettra de sélectionner les candidats-médicaments les plus actifs afin de poursuivre leur développement pour le traitement des cancers en clinique humaine.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection pour l’implanter des cellules tumorales. Lorsque les tumeurs seront suffisamment développées, les candidat-médicaments et médicaments étudiés seront administrés 1 à 35 fois. Des anesthésies gazeuses de quelques minutes chacune seront nécessaires pour l’administration sous-cutanée des cellules tumorales et les administrations intra-tumorales. Afin de suivre la concentration sanguine du candidat médicament ou la formule sanguine (NFS) au cours du temps, 10 micro-prélèvements de sang pourront être réalisés à l’extrémité de la queue, chacun espacé d’un minium de 24h.
Impact sur les animaux
La préhension et la contention peuvent provoquer un stress ponctuel pour l'animal. Les administrations et les prélèvements sanguins provoquent un inconfort transitoire et un stress modéré des animaux. Lors des administrations orales, une fausse route est possible entrainant un étouffement avec reflux induisant une détresse respiratoire aiguë. Les injections intraveineuses peuvent conduire à la formation d’œdème en cas de rupture de la veine caudale. Les injections intrapéritonéales et sous cutanées peuvent entrainer la formation d’œdèmes et/ou un endurcissement de la zone d’injection. L’implantation des cellules tumorale conduit au développement d’une tumeur qui peut affaiblir les animaux et entrainer une nécrose. Les prélèvements de sang ou une blessure trop profonde et invasive peut conduire à une nécrose ou une infection (notamment chez les animaux immunodéficients) de la queue ou à une automutilation de l'animal.
Devenir
Les animaux exclus des études car les tumeurs ne se sont pas développées pourront être utilisés dans le cadre de la formation continue et/ou initiale de nos ingenieurs en s’appuyant sur un projet dédié et en accord avec le responsable de la SBEA (structure en charge du bien-être animal). Nous prévoyons la réutilisation d'un maximum de 200 animaux sur 5 ans. Dans le cas où aucune formation n’est nécessaire, ces animaux seront mis à mort. Tous les animaux inclus dans les études seront mis a mort pour atteinte des points limites ou à la fin des études pour le prélèvement des tissues pour les analyses.
Remplacement
Les candidats-médicaments auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…) et pharmacocinétiques. Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l'activité d'un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans la distribution et l’activité des médicaments. Pour ces raisons, une approche chez l’animale reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement.
Réduction
La réalisation des procédures par un technicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. Du fait de la variabilité de la prise tumorale, proche de 85%, une partie des animaux ne developerons pas de tumeur et servirons d'animaux temoins. Des tests statistiques seront utilisés sur les données obtenues tel que les volumes tumoraux. Il est prévu de mesurer l’activité anti-tumorale de 25 candidats-médicaments sur une période de 5 ans, soit un maximum de 1320 souris.
Raffinement
La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance de l’animal. La souris étant un animal social, les souris seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’un tube de change et de matériaux de « nidification ». Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état des animaux par l’expérimentateur. Les souris seront anesthésiées pour permettre une implantation des cellules tumorales parfaitement répétables. Les souris seront placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Malgré les précautions prises en amont, les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments pour mettre en évidence tous signes de toxicité imprévue. Tout trouble comportemental, temporaire ou non, (comportement différent d’un animal témoin et signes habituels de douleur et/ou de mal-être) ne pourra être suivi de mesure corrective et implique l’exclusion immédiate de l’animal de l’analyse finale et du protocole expérimental. De fait, aucun animal ne sera maintenu en vie s’il présente des signes de douleur ou d’inconfort. Pour cette même raison, aucun « scoring » n’est envisagé, car il nécessite de maintenir la souffrance de l’animal pour en évaluer l’évolution. Il arrive cependant qu’aucun signe extérieur de douleur ne puisse être observé, et que seule une perte ou absence de prise de poids soit mise en évidence. Dans ce cas, les animaux seront mis à mort dès la mise en évidence d’une différence significative (généralement dès 2 à 5% d’écart). Les micro-prélèvements de sang sont indolores et réalisés sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention), à même de signifier librement tout manquement à leur bien-être.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence en oncologie, avec de multiple modèles expérimentaux disponibles chez des souris immunodéficientes ou immunocompétentes. De nombreux outils permettant de caractériser les réponses immunitaires et le développement tumoral sont disponibles dans cette espèce Les souris seront âgées d’au minimum 6 semaines (sub-adultes, en phase de croissance) afin que les cellules tumorales bénéficient d’un environnement riche en facteurs de croissance. L’évolution pondérale des animaux étant reportée à la croissance d'individus témoins et non à son poids initial au début de l’étude, débuter l’étude chez des animaux sub-adultes n’est pas ici un moyen détourné de s’octroyer une perte de poids supplémentaire et ne présente donc aucun risque pour le bien-être de nos animaux.