Souris
Evaluation thérapeutique de l’électrostimulation du nerf splénique sur des modèles inflammatoires expérimentaux de la maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. 480 reçoivent une endotoxine bactérienne quatre jours de suite pour déclencher une neuroinflammation et détruire une partie de leurs neurones dopaminergiques, 288 se font implanter une électrode sur le nerf de la rate avec des connecteurs fixés au crâne, et 384 traversent une piste les pattes encrées pour mesurer leur longueur de foulée. Reliée trente-six jours par un fil à un stimulateur électrique, chaque souris opérée est séparée de ses congénères, et le bénéfice annoncé pour les personnes atteintes de Parkinson reste une piste thérapeutique à explorer. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'un tel travail ne peut être mené que sur des "organismes entiers" préservant les interactions entre système nerveux et système immunitaire.
Objectifs
L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer sur des modèles murins l'effet thérapeutique de l'électrostimulation du nerf splénique de la maladie de Parkinson. Ce modèle de Parkinson est caractérisé par une réponse pathogénique neuroinflammatoire médiée par le système immunitaire. Il a pour finalité éventuelle d'appliquer ce traitement par électrostimulation en clinique. La maladie de Parkinson est une maladie du cerveau qui entraîne de la neuroinflammation, des problèmes moteurs, des troubles de la santé mentale et du sommeil, ainsi que des douleurs et d’autres problèmes de santé. L'efficacité des traitements actuels est malheureusement inconstante, et épuisable obligeant à changer souvent de molécule. Il n’y a pas de traitements curatifs. Une thérapie basée sur l’électrostimulation des nerfs périphériques est une approche thérapeutique innovante et pourrait apporter une nouvelle alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements actuels. Nous avons ainsi récemment démontré que la stimulation du nerf de la rate (splénique) réduisait significativement la neuroinflammation dans un modèle murin de la sclérose en plaque. On sait que la stimulation de certains nerfs périphériques agit également directement sur les cellules du système immunitaire en inhibant leur activité inflammatoire. Toutefois, l’impact d’une stimulation chronique du nerf splénique sur l’évolution de la maladie de Parkinson n’a jamais été évalué. Le projet consiste à : 1- implanter chez une souris une électrode de stimulation au niveau du nerf de la rate (nerf splénique); 2- puis induire la maladie de Parkinson (modèle par injection intra-péritonéale d’une endotoxine bactérienne ; 3- puis réaliser ou non des sessions d'électrostimulation du nerf de la rate. La comparaison des scores cliniques entre les animaux ayant subi une électrostimulation du nerf splénique et ceux n'ayant pas subit cette électrostimulation nous permettra de déterminer l'effet de l'électrostimulation sur le développement de la maladie de Parkinson.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer l'effet thérapeutique de l'électrostimulation du nerf splénique dans un modèle murin de la maladie de Parkinson. Une thérapie basée sur l’électrostimulation des nerfs périphériques est une approche thérapeutique innovante, présentant une toxicité potentielle moindre comparée aux molécules de type stéroïdien par exemple. Déterminer si l’électrostimulation inhibe les principales cellules immunitaires pathogéniques impliquées dans la sclérose en plaque pourrait conforter l’utilisation de cette nouvelle alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements actuels.
Procédures
Induction de la maladie de Parkinson : 480 animaux Les animaux subiront une anesthésie générale gazeuse et recevront une injection d'endotoxine bactérienne tous les jours pendant 4 jours consécutifs afin d’activer le système immunitaire (durée de l'intervention: 10 minutes). Implantation électrode : 288 animaux. Les animaux recevront un analgésique 20 minutes avant l’opération puis subiront une anesthésie générale pendant 20 minutes. Une électrode sera implantée au niveau du nerf splénique et les connecteurs seront fixés au niveau du crâne. La durée prévue de l’opération est de 20 minutes. Le lendemain de l'opération, les animaux opérés recevront un traitement anti-inflammatoire maintenu pendant les 3 jours suivants. Mesure de la longueur de foulé : 384 animaux. Les longueurs de foulée sont mesurées sur une piste plein champ contenant une bande de papier et disposée pour déboucher sur de la nourriture. Les pattes antérieures et postérieures de la souris sont humidifiées au préalable avec de l'encre avant d'être relâchées pour traverser la piste éclairée. Pas de prélèvement sur animaux vigiles, pas de prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
1- Nuisances associés à l’induction de la maladie de Parkinson par injection d'endotoxine bactérienne : Dans ce modèle, la maladie de Parkinson est induite par injections d'une endotoxine bactérienne. Ces injections provoquent chez l’animal une réaction immunitaire induisant de la neuroinflammation et à terme la perte partielle de neurones dopaminergiques dès le 5ième jour. A partir du 19ème jour après la première injection , un déficit moteur modéré apparaît qui se traduit par une diminution maximale de la longueur de foulé de l’ordre de 8%. Le pic de la pathologie est atteint aux alentours du jour 19 post induction puis les symptômes associés à la maladie vont décroitre progressivement jusqu’à la fin de l’expérimentation (jours 36). 2- Nuisances associées à l’électrostimulation : Il n’y a pas de douleurs associées à l’électrostimulation du nerf splénique car ce nerf n’est pas constitué de fibres nerveuses sensitives. La procédure d'implantation d'une électrode sur le nerf de la rate et l'électrostimulation chronique de ce nerf est réalisée de manière récurrente au sein de notre équipe. Une douleur d’une durée estimée à 48 heures est par contre engendrée par la procédure chirurgicale permettant l’implantation de l’électrode de stimulation sur le nerf splenique du fait de l’incision de la peau et du péritoine. Lors de l'électrostimulation les animaux seront séparés les uns des autres car la stimulation électrique requiert une connexion à un stimulateur électrique externe par un fil incompatible avec une stabulation en groupe pendant 36 jours (risques de rognage de fils).
Devenir
Afin de limiter au maximum les souffrances potentielles associées à l'évolution de la pathologie, l'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue de chaque procédure
Remplacement
Ce type d’étude ne peut être envisagés que sur des organismes entiers préservant l’intégrité des interactions entre les systèmes immunitaires et nerveux dans un contexte pathologique et non pathologique.
Réduction
Les estimations du nombre d'animaux par condition expérimentale a été determiné par une approche statistique afin de calculer au plus juste le nombre d’animaux nécessaire au bon déroulé de l’expérimentation et donc de limiter le nombre d’animaux
Raffinement
Des mesures de raffinements seront mises en place afin de limiter au maximum les contraintes imposées aux animaux dans le contexte de cette étude : les interventions chirurgicales seront menées suivant un protocole d’anesthésie et d’analgésie en prenant soin de maintenir la température corporelle des animaux en les plaçant sur une couverture chauffante. Le suivi postopératoire inclura un traitement antalgique et une grille d’observation préétablie prévoyant des mesures correctives et la mise en oeuvre le cas échéant de points limites précoces et adaptés.
Choix des espèces
Le modèle souris a été choisi car c’est l’espèce animale de référence en Immunologie chez laquelle l’induction de la maladie de Parkinson par injection d'une endotoxine bactérienne a été bien caractérisée. Le projet portera sur des souris mâles C57Bl/6 âgées de 12 semaines permettant une chirurgie aisée (poids entre 20 et 25 gr).
Etude des effets bénéfiques de la reprogrammation cellulaire partielle sur les altérations musculaires associées au cancer chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des souris de 8 à 12 semaines sont retenues pour un muscle jugé proche de celui de l'humain, et pour un stade jeune adulte qui favorise la pousse tumorale. Elles sont 60, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une bague à l'oreille, un prélèvement au bout de la queue, puis une greffe de cellules tumorales dans le flanc, avant vingt et un jours de pesées quotidiennes et de mesures de tumeur trois fois par semaine, maintenue à la main une quinzaine de secondes à chaque fois. La tumeur peut affaiblir l'animal jusqu'à l'empêcher d'atteindre sa nourriture, et la mise à mort sert à prélever un tissu musculaire que le porteur indique ne pas pouvoir analyser sur un animal vivant.
Objectifs
Le développement d’une tumeur au sein du corps humain a des répercussions sur l’organisme entier. Plus particulièrement, il a été démontré que la croissance d’une tumeur conduit à une fonte du tissu musculaire notamment en altérant les capacités de régénération musculaire. Nous avons observé qu’un groupe de gènes est capable de favoriser la régénération musculaire. L’objectif du projet est d’évaluer l’impact de l’expression de ces gènes sur le système musculaire chez un modèle murin de greffe de cellules tumorales.
Bénéfices attendus
Le développement d’une tumeur engendre une fonte et une faiblesse du tissu musculaire, réduisant drastiquement la qualité et la durée de vie des patients ainsi que l’efficacité des traitements. Les bénéfices attendus sont donc d’avoir une meilleure compréhension des dysfonctionnements musculaires impliqués et de concevoir de nouvelles thérapies non pharmacologiques.
Procédures
Avant le début de la procédure, les souriceaux sont identifiés par la pose d’une bague à l’oreille et un prélévement est effectué afin d’identifier la génétique de chaque individu. Ces deux procédures sont réalisées lors de la même anesthésie générale, d'une durée inferieure à 1 minute par animal. Des cellules tumorales seront greffées dans le flanc des animaux. Cette procédure n’est réalisée qu’une fois par animal et sous anesthésie générale (durée totale de l’anesthésie inférieure à 5 minutes par animal, l’injection dure une quinzaine de secondes). Cette implantation va engendrer le développement d’une tumeur qui va provoquer une perte de poids. Le poids des souris, sera mesuré tous les jours et le diamètre des tumeurs 3 fois par semaine, pendant 21 jours ou jusqu’à un point limite. Pour permettre ces mesures, les animaux seront maintenus à la main pendant une quinzaine de secondes.
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables modérés sont attendus du fait d’un cumul d’actes (pose de la bague d’identification, prélèvement du bout de la queue, contentions, injections, mesures des tumeurs, anesthésies), qui induisent du stress. Le développement de la tumeur peut induire une perte de poids et diminuer les défenses immunitaires. La fonte musculaire peut engendrer une faiblesse de l’animal et une difficulté à accéder à la nourriture et au biberon.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée du tissu musculaire qui ne peut pas être réalisée sur un animal vivant.
Remplacement
Afin d’évaluer les effets de la perte de poids et de la fonte musculaire induites par le cancer, nous n’avons d’autres choix que d’utilisé un système intégré, en l’occurrence le modèle murin. En effet, il est impossible de modéliser une perte de poids à l’aide de modèle in vitro.
Réduction
L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales. Des analyses statistiques ont été réalisées afin de déterminer le nombre minimal requis pour générer des résultats significatifs.
Raffinement
Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. Le prélevement pour identification de la génétique de chaque individu est réalisé sous anesthésie générale. Les procédures expérimentales utilisées incluent un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors de l’inoculation des cellules tumorales. Avant le début de l’expérimentation, les animaux seront habitués à être manipulés pendant une semaine dans le but de réduire leur stress lorsque l’expérimentateur devra les manipuler dans le cadre des suivis de pousse tumorale. Une fois les implantations réalisées, une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée afin de repérer au plus tôt toute douleur ou souffrance éventuelle. L‘implantation des cellules cancéreuses impliquant le développement tumoral et une fonte musculaire, un suivi de poids des souris sera effectué quotidiennement ainsi que de volume des tumeurs trois fois par semaine. De la nourriture et un hydrogel seront déposés à même la litière afin de prendre en compte la réduction de la mobilité de l’animal et le risque de ne plus pouvoir accéder facilement à la nourriture avec le développement de la tumeur. Une grille de cotation des critères de bien être est utilisée pour déterminer les points limites de manière objective. Notre expérience montre que cette stratégie est suffisamment prédictive pour que l’ensemble des animaux soit inclus dans l’étude.
Choix des espèces
L’espèce choisie sera la souris car elle présente un tissu musculaire très proche de celui de l’Homme dans sa structure et son fonctionnement. Les animaux seront âgés entre 8 et 12 semaines, nous permettant de mener nos projets sur un stade jeune adulte avec des muscles complètement développés. De plus, le stade jeune adulte favorise la pousse tumorale.
Etude pilote pour l’évaluation de l’efficacité d’induction d’un gène de mort et de la destruction de lymphocytes T humains greffés chez la souris femelle
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Dépourvues de lymphocytes T et B fonctionnels, avec des cellules Natural Killer affaiblies pour qu'elles ne rejettent pas la greffe, 100 souris femelles de sept à huit semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des lymphocytes T humains porteurs d'un gène de mort, puis le médicament censé déclencher ce gène, en deux injections au plus sous anesthésie et analgésie, avec trois pesées en dix jours et un prélèvement de sang pour douze d'entre elles. Cette étude pilote vise à montrer qu'on peut détruire à volonté des cellules thérapeutiques devenues dangereuses chez un patient, la preuve ayant déjà été obtenue in vitro puis chez la souris avec un gène rapporteur fluorescent. Toutes sont tuées pour que leurs tissus et organes soient prélevés.
Objectifs
Les lymphocytes T (LT) font partie d’une catégorie de globules blancs qui jouent un rôle très important pour les défenses de l’organisme. Ces cellules sont responsables de la réponse immunitaire cellulaire visant à détruire les agents pathogènes, aussi bien les bactéries que les cellules cancéreuses. L’idée d’utiliser ces LT pour le traitement de maladies est en plein développement. Le principe de ces thérapies consiste à prélever les LT des patients pour les modifier génétiquement et les lui réinjecter dans le but de reconnaître puis d'éliminer les cellules cancéreuses. Leur efficacité est contrebalancée par de fréquents effets secondaires indésirables tels que la production massive de cytokines suivie par des neurotoxicités. Dans ce projet nous souhaitons démontrer la possibilité de pouvoir éliminer de façon contrôlée les cellules T génétiquement modifiées si des effets adverses apparaissaient. Pour contrôler ces cellules en clinique chez l’homme, elles peuvent être équipées de gènes « dit suicide » qui sont activables par des médicaments cliniquement approuvées. L’activation du gène suicide par le médicament va déclencher la mort du LT. Nous avons validé le concept in vitro en substituant le gène suicide par un gène rapporteur fluorescent et montré que notre médicament permettait d’activer ce gène rapporteur en activant un signal fluorescent dans la cellule. Puis, in vivo, chez la souris nous avons confirmé que ce médicament est capable d'induire l'expression de ce gène rapporteur. L’objectif de ce projet est de déterminer l'efficacité de notre médicament à induire la mort de LT humains équipés, cette fois-ci, d'un gène suicide après une greffe chez la souris .
Bénéfices attendus
Le bénéfice de cette étude pilote préclinique est la validation de systèmes de sécurité, inductibles et contrôlés, permettant d'éliminer des cellules T greffées chez un patient en cas d’effets secondaires graves pour le traitement de pathologies. Cette sécurité vise à perfectionner considérablement les protocoles actuels de cellules T et favorisera leurs utilisations en première intention améliorant ainsi la prise en charge des cancers et le traitement de certaines pathologies auto-immunes.
Procédures
Les souris seront soumises à 3 pesées d'une durée de moins de 30 secondes (réalisées sur animal vigile) à J0, J5 et J10. Deux injections maximum sur animal anesthésié et analgésié, d'une durée de moins de 30 secondes, seront réalisées. Un prélèvement de sang sur animal anesthésié sera réalisé sur 12 animaux.
Impact sur les animaux
Un stress, de courte durée de moins de 30 secondes, pourra être généré au moment des contentions des souris et lors des pesées hebdomadaires. Du stress sera également généré lors des anesthésies d'une durée de 5 à 10 minutes maximum. Les injections pour l'inoculation des lymphocytes et du médicament ainsi que le prélèvement de sang pourront également générer une douleur d'intensité légère de courte durée (10 à 15 secondes).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus et d'organes pour des analyses tissulaires.
Remplacement
Des tests in vitro réalisés ont montré que le médicament utilisé est capable d'activer le signal de mort dans des lymphocytes T humains modifiés. Nous souhaitons maintenant valider le concept in vivo aussi l'utilisation du modèle souris est indispensable.
Réduction
Il s'agit d'une étude pilote répartie en deux étapes comportant un effectif de 100 animaux au total. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, les groupes comporteront 10 animaux maximum tout en permettant une analyse à l'aide d’outils statistiques appropriés sur les prélèvements analysés.
Raffinement
Les souris seront acclimatées au moins 7 jours à l'animalerie avant d'être incluses dans la procédure. La procédure expérimentale a été conçue de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. Les pesées seront réalisées sur animal vigile par contre tous les autres gestes techniques seront réalisés sur animal anesthésié/analgésié afin de diminuer le stress et l'inconfort de l'animal. Durant les 10 jours de la procédure, les souris sont suivies quotidiennement, le registre de soins est complété en se rapportant à la grille de suivi de soins adaptée.
Choix des espèces
Afin de pouvoir greffer des lymphocytes T humains, une immunodéficience est nécessaire. Nous utiliserons comme modèle une souris immunodéprimée caractérisée par une absence des cellules T fonctionnelles et des lymphocytes B, une diminution des activités des cellules présentatrices d’antigènes, des cellules myéloïdes et des cellules Natural Killer. Ces caractéristiques évitent le rejet des lymphocytes T humains. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines dont le poids varie entre 15-20 grammes. C'est l'âge des souris adultes couramment utilisées dans la littérature lors de la greffe de cellules humaines.
Modulation de la reproduction et du comportement socio-sexuel à l’aide de fragments d’anticorps chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Lavages vaginaux quotidiens pendant huit à vingt jours, que le porteur reconnaît "désagréables pour les femelles", inoculations intravaginales sous anesthésie, six prélèvements de sang à la queue, pose d'une puce sous la peau et tests de comportement sexuel répétés jusqu'à huit fois : 6 227 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 3 427 d'entre elles et modéré pour 2 800. 5 227 sont tuées, notamment les femelles dont il faut examiner les ovaires, les embryons et les organes génitaux, et 1 000 mâles sont gardés vivants pour être réutilisés d'un fragment d'anticorps à l'autre. Le projet teste des fragments d'anticorps de camélidés censés contrôler la reproduction sans toucher au comportement sexuel. Le porteur le présente comme mené "à des fins strictement scientifiques", tout en visant des alternatives à la contraception hormonale et des méthodes de synchronisation et de superovulation pour les animaux d'élevage.
Objectifs
Les méthodes actuelles de contrôle de la reproduction (traitements hormonaux, stéroïdes) sont associées à de nombreux effets secondaires, et les molécules utilisées s’accumulent dans l’environnement où elles agissent comme des perturbateurs endocriniens. Par ailleurs, aucune solution thérapeutique n’existe pour la prise en charge des troubles du comportement social, et les contraceptifs peuvent être associés à une diminution de la libido. La prise en charge des patients souffrant de troubles de la reproduction et du comportement, ainsi que la maîtrise de la reproduction des animaux d’élevage, bénéficieraient donc du développement de nouveaux traitements pharmacologiques. Les anticorps monoclonaux représentent une des meilleures promesses thérapeutiques dans le domaine de la reproduction. Les fragments d’anticorps de camélidés (VHH) présentent des caractéristiques uniques : ils ont une durée de vie courte dans le sang, sont dégradables et capables de moduler l’activité des récepteurs, et sont donc une alternative majeure aux composés chimiques et hormones stéroïdiennes. Nous caractérisons in vitro des VHH capables d’activer ou inhiber l’activité de cibles impliquées dans le contrôle de la reproduction et/ou du comportement sexuel localisées dans les gonades : récepteur de l’hormone folliculo-stimulante (FSHR), récepteur de l’hormone lutéinisante (LHR), récepteur des oestrogènes couplé aux protéines G 1 (GPER). Les VHH les plus prometteurs doivent désormais être développés pour un usage in vivo, afin de déterminer leur potentiel thérapeutique. Le projet proposé a pour objet i) de déterminer la pharmacocinétique et pharmacodynamique in vivo de ces fragments d’anticorps, ii) le cas échéant de procéder à une ingénierie de leurs séquences pour leur utilisation in vivo, iii) de déterminer les effets fonctionnels sur la reproduction et le comportement chez la souris de ces nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes, le tout à des fins strictement scientifiques. Le projet a ainsi pour objectif de démontrer la faisabilité de l’utilisation in vivo de VHH pour contrôler et moduler la fonction de reproduction sans affecter le comportement sexuel dans le cadre i) du développement d’alternatives aux méthodes actuelles de contraception, ii) du traitement de troubles de la reproduction, ou iii) du développement d’alternatives aux méthodes de contrôle de la reproduction (synchronisation, induction de l’ovulation, …) utilisées en élevage.
Bénéfices attendus
En cas de succès de la preuve de concept chez la souris, la voie sera ouverte pour i) le développement de nouveaux traitements innovants des troubles de la reproduction, présentant une meilleure efficacité et moins d’effets indésirables, ii) le développement de méthodes de contraception non hormonales qui présenteraient moins d’effets secondaires et seraient mieux tolérées que les traitements actuels, tout en préservant l’environnement de l’accumulation de perturbateurs endocriniens à très longues demi-vies, iii) le développement de nouvelles méthodes non hormonales pour la synchronisation et l’induction de superovulation chez les animaux de rente.
Procédures
- Test d’interaction sociale réciproque : le test d’une durée de 10 minutes sera réalisé à faible intensité lumineuse avec des animaux vigiles. Chaque animal sera soumis 1 fois au test. - Test des trois chambres : le test sera réalisé à faible intensité lumineuse avec des animaux vigiles. Chaque animal sera soumis à 1 session de 10 minutes à J-2, 1 session de 10 minutes à J-1, et 2 sessions de 10 minutes à J0. - Test de comportement sexuel : le test sera réalisé avec des animaux vigiles et aura une durée maximale d’une heure. Selon les animaux, ceux-ci pourront être soumis : i) 3 fois au test à 4 jours d’intervalle, ii) 2 fois au test à 2 semaines d’intervalle, iii) 8 fois au test, ou iv) 1 fois au test. - Pesée : la procédure sera réalisée avec des animaux vigiles et dure moins de 5 minutes par animal. Chaque animal sera soumis à la procédure 1 fois par jour pendant environ 25 jours. - Puçage : la procédure sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse, et une injection sous-cutanée d’anesthésique sera réalisée pour réduire la douleur liée à l’incision. Chaque animal sera soumis une seule fois à la procédure. - Lavages vaginaux : la procédure sera réalisée sur animaux vigiles et dure moins de 5 minutes. Chaque animal sera soumis à la procédure 1 fois par jour. Selon les animaux, ceux-ci pourront être soumis à la procédure pendant 16-20 jours ou pendant 8-10 jours. - Injection intrapéritonéale : la procédure sera réalisée sur animaux vigiles et dure moins de 5 minutes. Chaque animal sera soumis 1 fois à la procédure. - Prélèvements sanguins par la queue : la procédure dure moins de 5 minutes et sera réalisée sur animal vigile avec une anesthésie locale. Chaque animal sera soumis 6 fois à la procédure, à 1h, 12h, 2 jours, 5 jours et 7 jours d’intervalle du premier prélèvement. - Inoculation intravaginale : la procédure dure moins de 5 minutes et sera réalisée sous anesthésie générale pour une durée d’environ 30 minutes. Chaque animal sera soumis 1 fois à la procédure.
Impact sur les animaux
Les injections en intrapéritonéale, en intraveineuse et en sous-cutané ainsi que les prises de sang à la veine caudale peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site. La pose d’une puce RFID sous anesthésie générale peut engendrer une légère douleur au niveau du site de l’incision lors du réveil de l’animal. La contention des animaux génère du stress. Les tests d’interaction sociale peuvent entrainer une certaine agressivité entre les animaux et ces tests comportementaux peuvent être anxiogènes lié à l’environnement nouveau. Les lavages vaginaux sont des actes désagréables pour les femelles.
Devenir
Pour le génotypage et phénotypage des animaux transgéniques, les femelles doivent être euthanasiées pour pouvoir étudier les paramètres embryonnaires ainsi que les gonades et organes accessoires. Les mâles seront également euthanasiés car aucuns animaux de ces génotypes ne seront utilisés par la suite, et nous ne pouvons pas envisager de les replacer étant donné que nous ne connaissons pas à l’avance leur phénotype. Pour la mise au point de l’analyse automatisée des tests de comportement sexuel, les femelles ovariectomisées seront euthanasiées à l’issue de la procédure car elles ne seront pas réutilisées par la suite. Tous les autres animaux seront gardés en vie pour être réutilisés. Pour l’effet des fragments d’anticorps (VHH) sur la cyclicité et le comportement sexuel des femelles, les femelles devront être euthanasiées à l’issue de la procédure afin de déterminer si l’oestrus est ovulatoire ou anovulatoire, et pour pouvoir étudier les ovaires (marquage VHH, nombre et taille des follicules, …). Les mâles seront gardés en vie pour être réutilisés. Pour l’effet des fragments d’anticorps (VHH) sur la fertilité des femelles, les femelles devront être euthanasiées à l’issue de la procédure afin d’étudier les paramètres embryonnaires, et pour pouvoir peser et étudier les organes accessoires et les ovaires (marquage VHH, nombre et taille des follicules, …). Les mâles seront gardés en vie pour être réutilisés. Pour l’effet des fragments d’anticorps sur la mobilité spermatique, les femelles devront être euthanasiées à l’issue de la procédure pour pouvoir étudier les paramètres embryonnaires. Toutefois, si aucune gestation n’est constatée, les femelles seront gardées en vie pour être réutilisées.
Remplacement
Tous les VHH utilisés ont été entièrement développés et caractérisés in vitro, mais aucune étude de reproduction ou de comportement ne peut se réaliser par des approches in vitro, ex vivo ou de modélisation. Ce projet étudie les régulations entre plusieurs fonctions physiologiques et/ou comportementales, qui sont impossibles à reproduire par des méthodes alternatives. La gestation ne peut être mimée in vitro, et l’activité neuronale à l’origine des comportements socio-sexuels est dépendante de l’interconnectivité des neurones, ces phénomènes ne peuvent donc être étudiés que sur des animaux entiers. De plus, la pharmacocinétique (demi-vie dans la circulation sanguine ou temps de résidence dans les organes cibles), la pharmacodynamique (effets des substances injectées sur leur cible), les effets secondaires éventuels et les effets fonctionnels des VHH sur la reproduction ou les comportements ne peuvent être évalués que chez l’animal. Compte tenu de l’ensemble de ces paramètres et de l’absence de méthodes de remplacement in vitro, il est indispensable de recourir à une expérimentation in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé afin de ne pas utiliser plus d’animaux que nécessaire pour pouvoir mettre en évidence un effet après analyse statistique. Un effectif de 16 animaux par groupe est ainsi nécessaire. Toutefois, il est indispensable de prendre en compte un certain nombre de facteurs de variabilité pouvant conduire à l’élimination de certains animaux de l’expérience. Ainsi, afin d’assurer un effectif exploitable de 16 animaux par groupe en fin d’expérience, nous avons besoin d’un nombre total de 20 animaux expérimentaux par groupe. De plus, nous avons fait le choix de regrouper certains tests dans une même expérimentation, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés pour étudier ces paramètres. Enfin, les effectifs décrits correspondent aux effectifs maximaux qui pourraient être utilisés. En effet, dès que cela sera possible, plusieurs aménagements nous permettront de réduire le nombre d’animaux utilisés pour les expériences : i) pour les tests de comportement sexuel, les mâles pucés pourront être réutilisés pour les expériences avec différents VHH, ii) pour les femelles ayant reçu une administration intravaginale de VHH, si aucune gestation n’est constatée au bout de 20 jours après mise en présence du mâle, celles-ci seront gardées en vie et réutilisées pour tester d’autres VHH, iii) dès que cela sera possible, plusieurs fragments d’anticorps candidats seront testés en parallèle avec un seul groupe contrôle commun, ce qui permettra de réduire les effectifs totaux des animaux contrôles utilisés. Enfin, concernant les animaux exprimant le transgène FSHR humain, si ceux-ci ne présentaient pas de restauration de la fertilité, aucune expérience ultérieure avec ces animaux ne serait réalisée.
Raffinement
Les expériences sont menées dans les plus courts délais possibles afin de minimiser l’inconfort et le stress des animaux et de les remettre dans leurs cages en présence de leurs congénères. Les animaux sont observés quotidiennement et leur état de bien-être déterminé sur la base de 3 critères : apparence, poids, comportement (critères décisionnels en annexe). Un enrichissement est mis en place dans l’arène utilisée pour les tests de comportement : cabane en plastique rouge, copeaux, biberon, gamelle de croquettes. Des phases d’habituation sont réalisées avant les tests de comportement, qui sont effectués à faible intensité lumineuse pour limiter l’anxiété des animaux. Ces derniers sont transférés dans une salle contigue à la salle de tests comportementaux 1h avant le début des procédures. Avant d’euthanasier des animaux, ceux-ci sont transférés un à un dans la salle dédiée, afin d’éviter une communication d’anxiété entre congénères. Les puces RFID sont insérées sous la peau au moins 1 semaine avant le début des expériences sous anesthésie gazeuse et une anesthésie locale est réalisée pour réduire la douleur liée à l’incision. Pour les tests de cyclicité, nous réalisons de simples lavages au liquide physiologique plutôt que des frottis vaginaux à proprement parler (qui nécessitent l’introduction de petits coton-tiges à l’intérieur du vagin), cette méthode étant suffisante à la réalisation des objectifs scientifiques tout en limitant l’inconfort des animaux. Une anesthésie locale est réalisée pour les prélèvements de sang ainsi qu’en cas d’injections répétées des fragments d’anticorps. Les administrations intravaginales d’anticorps seront réalisées sous anesthésie générale de courte durée et les animaux sont placés sur un tapis chauffant au cours de la procédure. Les animaux sont soigneusement examinés jusqu’à leur réveil total et contrôlés 2 fois par jour après l’opération pendant 15 jours, pour détecter tout signe de douleur ou d’infection. En cas de signes, le responsable du bien-être animal serait immédiatement informé et les animaux traités. Si le traitement ne fonctionnait pas dans les 24 heures, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. L’hébergement des femelles gestantes sera enrichi avec des cotons de ouate. Lors de l’introduction des mâles avec les femelles, nous surveillons l’absence de comportements agressifs pendant 1 heure puis quotidiennement. En cas d’agressivité du mâle envers les femelles, celui-ci serait remplacé.
Choix des espèces
La souris est une espèce sociale qui se reproduit bien et vite, dont la physiologie de la reproduction est bien caractérisée, et qui présente de façon innée des comportements socio-sexuels bien décrits. Cette espèce permet la génération d’animaux modèles transgéniques (souris « humanisées » pour une cible dans le cas présent), approches qui ne sont pas ou que peu possibles sur d’autres espèces. Par ailleurs, à l’heure actuelle seules des petites quantités de VHH sont produites au laboratoire, compatibles uniquement avec une utilisation in vivo chez la souris. Les études seront réalisées chez l’animal adulte (à partir de 7 semaines), les animaux devant avoir passé la puberté pour pouvoir étudier leurs paramètres reproducteurs et comportements sexuels.
Méthodes de prélèvements pour génotypage de souris en condition d’élevage
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
200 000 souris sur cinq ans, soit environ 40 000 par an issues d'un millier de cages de croisement, vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit une fois dans sa vie une identification, piqûre pour tatouage des phalanges, poinçon d'oreille ou pose d'une puce, et un prélèvement de bout de queue pour lire son génotype, à partir de sept jours de vie. Le porteur signale un stress de courte durée pour les souriceaux comme pour leurs parents, une douleur légère au point de prélèvement, et "dans de très rares cas" une perte de sang hémorragique. Les souris porteuses du génotype recherché partent vers d'autres projets de recherche, les autres et les anciens reproducteurs sont tués, cet élevage étant présenté comme "nécessaire" à des projets déjà autorisés.
Objectifs
L'unité de service met, à disposition de la communauté scientifique, un ensemble de prestations liées à l’utilisation de modèles animaux à des fins scientifiques. Des modèles rongeurs sont générés, hébergés, développés et maintenus dans les locaux, pour les besoins de la communauté scientifique qui, pour réaliser sa recherche fondamentale et biomédicale, doit disposer de modèles précliniques permettant de comprendre diverses fonctions biologiques dans les pathologies humaines (maladies immunitaires, métaboliques, infectieuses inflammatoires, cancéreuses, etc). Tous les animaux en zone d’élevage, sont uniquement présents pour établir des animaux d'intérêts qui seront ensuite restitués aux unités utilisatrices pour entrer en phase expérimentale dans une animalerie d’expérimentation, dans un projet de recherche déposé par leur soin. L'utilisation de rongeurs génétiquement modifiés nécessite d'avoir recours à un génotypage et donc de réaliser une biopsie caudale. Aucun signe de rejet maternel ou d'absence de tétée n'a été observé, après réalisation de cette procédure sur les souriceaux.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont : *réaliser une identification permanente de qualité sur les souris afin de les distinguer en fonction de leur génotype *réaliser une biopsie de qualité permettant un génotypage sans contamination croisée entre deux individus *identifier et récupérer une biopsie sur les souris de manière à optimiser au maximum le bien-être animal *permettre aux utilisateurs des équipes de recherche de faire un suivi individuel des animaux en fonction de leur génotype. L’élevage de ces animaux est nécessaire dans le cadre de nombreux projets scientifiques préalablement validés qui permettront de répondre à des questions scientifiques précises et aux enjeux de santé/société.
Procédures
Chaque animal sera soumis une seule fois dans sa vie à une identification individuelle (piqûre pour tatouage au niveau des phalanges ou poinçon d'oreille ou piqûre pour puçage) et à un prélèvement caudale pour génotypage. Ces actes ne durent que quelques secondes. Dans de rare cas, un reprélèvement à l'oreille pourra être réalisé et ne durera que quelques secondes. Dans de rares cas, un prélèvement sanguin sera réalisé (1 seul fois dans la vie de l'animal, acte de quelques secondes).
Impact sur les animaux
Lors de la contention, les animaux peuvent ressentir un stress de courte durée lors de leur manipulation ainsi que pour les parents. De la douleur légère de courte durée peut être ressentie lors des prélèvements pour génotypage (biopsie caudale et pavillon de l'oreille) et au point de prélèvement pour les prélèvements sanguin. Dans de très rares cas une perte de sang hémorragique peut être observée.
Devenir
Les animaux avec un génotype d'intérêt seront utilisés dans un projet de recherche autorisé par le ministère. Les autres animaux du mauvais génotype qui n'auront pas pu être utilisés dans d'autres projets seront euthanasiés par une méthode réglementaire adaptée à l'âge des animaux ainsi que les anciens reproducteurs. Les animaux passant dans les projets de recherche autorisés seront alors en utilisation continue. Les accouplements sont réalisés pour produire au maximum des animaux d'intérêt.
Remplacement
Actuellement il n'est pas possible de recréer in vitro la complexité d'un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Un organisme vivant est donc nécessaire pour mener à bien les divers projets scientifiques autorisés au sein de l'établissement. La souris est le modèle le plus utilisé par les chercheurs pour étudier les fonctions biologiques et les pathologies. L'agrément de l'animalerie d'élevage ne concerne que les souris.
Réduction
L'établissement d'élevage lance environ 1000 cages de croisements de lignées par an pour lesquelles l'identification individuelle et le génotypage sont nécessaires. En considérant que chaque accouplement donne en moyenne 5 portées de 8 souriceaux/an, notre établissement générera environ 40 000 animaux qui devront être identifiés et génotypés par an. Le projet comprend donc 200 000 animaux sur 5 ans. Tous les animaux en zone d’élevage, sont uniquement présents pour établir des animaux d'intérêts qui seront ensuite restitués aux unités utilisatrices pour entrer en phase expérimentale dans une animalerie d’expérimentation, dans un projet de recherche déposé par leur soin. Les demandes d'accouplements sont donnés par les équipes de recherche via un logiciel de gestion de lignées afin d'accoupler les animaux des génotypes d'intérêt pour leurs projets de recherche. Le nombre d'accouplements lancés est systématiquement revu en fonction du nombre d'animaux déclarés dans les projets de recherche. Les animaux sans génotype d'intérêt seront réutilisés en priorité (projets d'autres équipes de recherche ou projet de tutorat).
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’isolement est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft, carré de coton, batônnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Si un animal se retrouve isolé de manière imprévue, il bénéficiera de deux enrichissements. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et quotidienne des animaux. Pour respecter la règle des 3R et le bien-être des animaux, des points limites ont été déterminés.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé par les chercheurs pour étudier les fonctions biologiques et les pathologies. L'agrément de l'animalerie ne concerne que les souris. Tous les souriceaux, mâles et femelles, seront principalement identifiés et génotypés à partir de 7 jours de vie (plus l'animal est jeune, moins la nociception est développée). Pour certains projets de recherche, il est déconseillé d'utiliser de la pâte à tatouer/encre de Chine qui pourrait migrer dans différents tissus ou encore de toucher aux phalanges des animaux. Dans ces conditions, l'identification après 15 jours de vie sera privilégiée.
Etude des mécanismes protecteurs de l’inhibition de beta-caténine dans les cardiomyopathies associées au diabète de type 2 chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une injection sous la peau chaque jour pendant sept semaines, de la septième à la quatorzième semaine de vie : 96 souris subissent ce traitement, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles est anesthésiée, reçoit de l'insuline en intraveineuse, puis est mise à mort cinq minutes plus tard. Le porteur reconnaît que la répétition des injections est "le point critique" du protocole, la faible stabilité de la molécule empêchant l'usage de pompes implantables, et il annonce des seringues fines et des points d'injection variables. Il qualifie les autres procédures de "classe légère" et parle d'un "modèle murin présentant une cardiomyopathie diabétique", sans dire comment ce diabète et cette atteinte du cœur sont obtenus.
Objectifs
Le but de notre projet est de déterminer l’implication d’une protéine connue pour être impliquée dans la prolifération et le remodelage cellulaire, la beta caténine, dans le développement de la cardiomyopathie diabétique. A l’aide d’un modèle murin présentant une cardiomyopathie diabétique (hypertrophie et dysfonction diastolique), nous allons déterminer si l’inhibition de la beta caténine avec un inhibiteur pharmacologique (ICG-001) améliore les paramètres cardiaques. Notre approche va nous permettre d’éclairer les mécanismes conduisant au développement de la cardiomyopathie chez les patients présentant un diabète de type deux et de développer des stratégies thérapeutiques afin d’en limiter les conséquences.
Bénéfices attendus
Compte tenu des enjeux médicaux, sociaux et économiques liés aux maladies cardiovasculaires, les complications cardiaques ont été largement étudiées dans une multitude de contextes physiopathologiques. Les publications sur le rôle de la beta-caténine dans l’hypertrophie cardiaque liée au diabète de type deux sont quasi inexistantes dans la littérature scientifique. Ceci reflète un vaste champ de connaissances fondamentales à explorer avec a la clé de nouveaux traitements. Nos résultats préliminaires obtenus dans un modèle murin de cette pathologie montrent que la voie de la beta-caténine est augmentée dans les cœurs malades comparé aux cœurs sains. A court terme, ce projet permettra de déterminer quels sont les mécanismes fondamentaux en jeux et éventuellement d'identifier des leviers à actionner sur ceux-ci. A moyen terme, en démontrant la possibilité de moduler l’activité de la beta-caténine pharmacologiquement ce projet favorisera le développement de stratégies thérapeutiques pour diminuer le risque cardiaque chez les patients présentant un diabète de type 2. Une telle approche sera bénéfique pour les patients diabétiques mais aussi pour la population générale en promulguant des recommandations pour les personnes à risque.
Procédures
Dans les deux procédures de cette saisine, une dose journalière de l’inhibiteur de la beta-caténine ou du véhicule sera délivrée par injection en sous cutané et ce pendant sept semaines, de 7 à 14 semaines d’âge. Pour le groupe dédié au test de résistance à l’insuline, les animaux seront anesthésiés et injectés avec de l’insuline en intraveineuse et seront euthanasiés 5 min post injection.
Impact sur les animaux
Le point critique est la répétition des injections en sous-cutané. La stabilité faible de l’ICG ne permet pas d’utiliser des pompes alzet. Afin de limiter la souffrance liée à la répétition des injections, nous utiliserons des seringues microfine pour insuline, nous ferons varier les points d’injection et utiliserons un volume d’injection faible injecté. Les autres procédures sont de classe légère, il y a peu d’effets indésirables attendus.
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux sont euthanasiés pour prélever les organes d'intérêt pour les analyses de contenu lipidique, de contenu protéique et de mesure d'expression génique.
Remplacement
Le projet global dans lequel la présente demande s'applique repose sur d'autres modèles expérimentaux qui permettent de remplacer un certain nombre d’animaux : nous utilisons notamment des cardiomyocytes en culture. Ce modèle de culture permet de remplacer les modèles animaux dans l’affinage de la détermination du rôle de la beta-caténine dans l’hypertrophie des cardiomyocytes et également de la détermination des mécanismes cellulaires et moléculaires en jeu . L’utilisation de modèle animal reste indispensable car il permet d’étudier une pathologie qui résulte d’une communication interorgane ne pouvant être étudié que dans un modèle intégré.
Réduction
Le projet préconise l’utilisation d’un nombre de 96 animaux, ce qui, dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs. Nous avons précédemment défini la cinétique de l’apparition des complications cardiaques associées dans notre modèle murin de cardiomyopathie diabétique, et donc de déterminer le temps traitement le plus approprié et de réduire le nombre d’animaux et le temps de l’expérimentation. Nous utiliserons des tests non paramétriques pour tester la valeur statistique de nos données.
Raffinement
Afin de limiter le stress et la souffrance chez les animaux, un suivi clinique quotidien des animaux est réalisé par du personnel formé. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux et avec un enrichissement adapté à leur besoin. Pour les expérimentations, les gestes invasifs sont réalisés sous une couverture anesthésique analgésique adaptée.
Choix des espèces
Les modèles animaux sont des modèles intégrés et sont l'unique moyen d’observer les effets systémiques des modèles pathologiques utilisés (diabète de type 2 et cardiomyopathie pour ce projet) ainsi que la réponse physiologique intégrée et les communications inter-organes (conséquence cardiaque d’une dysfonction adipocytaire à l’origine dans notre modèle murin en ce qui concerne ce projet). Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé de longue date pour caractériser les différentes complications cardiaques associées aux dérégulations métaboliques. De plus, la délétion du gène causant la cardiomyopathie diabétique, n’a été réalisé que dans le modèle murin. Ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de biochimie et/ou de biologie moléculaire qui nous permettront de découvrir de nouveaux déterminants moléculaires importants pour mieux comprendre les effets bénéfiques de l’inhibition de la beta-caténine. Pour tous les animaux débuterons l’administration de l’inhibiteur à 7 semaines d’âge de façon à travailler sur des animaux adultes. Le but de ce travail n’étant pas de déterminer l’effet de cette inhibition sur le cœur au cours du développement de l’organisme.
Etude de la dynamique de la reconstitution hematopoïétique post-stress induite par chimiothérapie ou immunomodulateur
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 216 souris vont être utilisées, toutes tuées pour des analyses après leur mort, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux chimiothérapies ou un immunostimulant dans l'abdomen, puis subissent de trois à neuf prélèvements de sang dans l'orbite de l'œil, sans anesthésie. Le porteur décrit des effets de la chimiothérapie qui peuvent durer plusieurs mois, diminution du poids, altérations du comportement et du pelage, et cherche à comprendre comment ces traitements dérèglent la moelle osseuse avant l'apparition d'une leucémie secondaire. Il écrit aussi que "les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux".
Objectifs
La chimiothérapie permet de guérir un grand nombre de cancers. Actuellement une grande partie de ces traitements ne sont toujours pas « ciblés » sur la tumeur. Ils empêchent la multiplication des cellules du cancer ce qui est l’objectif désiré, mais empêchent aussi la multiplication de certaines cellules saines notamment dans la moelle osseuse. La moelle osseuse est le lieu de fabrication des cellules du sang à partir des cellules souches. La chimiothérapie fait baisser transitoirement les globules rouges, les globules blancs et les plaquettes (désignés sous le terme de lignées sanguines). Malheureusement, dans un certain nombre de cas rares, les traitements anti-cancéreux sont eux-mêmes à l’origine du développement de maladies cancéreuses de la moelle osseuse comme les leucémies aigues et les myélodysplasies dites secondaires des années après la guérison du premier cancer. Ce projet vise à comprendre comment la chimiothérapie affecte les cellules de la moelle et la production des lignées sanguines avant l’apparition d’une maladie leucémique secondaire. Pour mener à bien notre projet, nous allons étudier la production des trois lignées sanguines issues de la moelle osseuse, suivre les dérèglements induits au cours du temps par la chimiothérapie et la comparer à un autre facteur perturbant la production des lignées sanguines temporairement et qui n’induit pas de maladies leucémiques secondaires. Nous souhaitons étudier la quantité des cellules souches de la moelle, avant et après traitement par chimiothérapie et par l’agent perturbateur. Les cellules souches sont une population rare, capable de fabriquer toutes les autres lignées, mais aussi de se maintenir tout au long de la vie. Notre hypothèse est que la chimiothérapie diminue le nombre de cellules souches et que cette diminution favorise à son tour le développement précoce de la leucémie en favorisant des cellules qui prolifèrent plus. Notre projet a pour objectif d’étudier, chez la souris, les phases précoces du développement leucémique favorisé par la chimiothérapie. Une meilleure compréhension de ces phases précoces permettra de surveiller les patients porteurs de cancers traités par chimiothérapie et ainsi de prévenir la survenue d’un second cancer, souvent fatal, chez des patients souvent guéris d’une première maladie grave. De plus, la capacité de la moelle osseuse à se réparer après chimiothérapie est un domaine encore peu étudié.
Bénéfices attendus
La capacité de la moelle osseuse à se réparer après chimiothérapie est un domaine encore peu étudié. Nous pensons que notre projet à son terme apportera des avancées significatives dans ce domaine et participera ainsi à l’amélioration du traitement du cancer et notamment des leucémies . Il permettra de mieux connaître ce qui induit l’apparition de leucémie secondaire et comment le prévenir.
Procédures
Dans ce projet, les souris vigiles recevront 2 traitements par voie intra-péritonéale. Le 1er traitement sera administré à raison d’une injection par jour pendant 3 jours (durée du geste inférieure à 10 sec) puis 4 mois après ce 1er traitement les souris recevront un 2ème traitement. En fonction de la molécule, ce 2nd traitement sera administré à raison d’une injection par semaine pendant 6 semaines ou d’une injection à jour 1 et jour 3 ou d’une injection unique (durée de chaque injection inférieure à 10 sec) . Entre 3 et 9 prélèvements de sang par voie rétro-orbitaire, sans anesthésie, seront aussi effectués. Un prélèvement sanguin après le premier traitement et entre 2-6 prélèvements une fois par mois maximum après le deuxième traitement. Chaque prélèvement sanguin se fera en moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, nous administrerons aux souris deux chimiothérapies et un immuno-stimulateur par voie intra-péritonéale. La douleur sera une nuisance directe associée à cet acte. Les effets possibles de la chimiothérapie comprennent une diminution du poids, des altérations du comportement et du pelage qui peuvent durer sur plusieurs mois. Pour l’utilisation de l’immunomodulateur, une inflammation systémique est généralement observée pendant 3 jours après traitement.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Pour étudier la production des cellules hématopoïétiques (cellules sanguines) matures perturbée par la chimiothérapie, un animal ayant un système hématopoïétique proche du nôtre est nécessaire : la souris reste le modèle de référence. De plus, l’hématopoïèse se développent durant des mois ou des années et il n’est pas encore possible de les reproduire in-vitro. C’est chez elle que des premiers résultats précliniques ont été obtenus pour modéliser les leucémies secondaires. Il n’existe donc pas de méthode alternative à l’expérimentation animale. En revanche, notre schéma expérimental et nos hypothèses reposent sur de nombreuses observations cliniques chez des patients ayant reçu de la chimiothérapie pour le traitement de leur cancer.
Réduction
Le choix des traitements et leurs doses dans ce projet provient des résultats positifs de notre précédente étude. Nous effectuerons des suivis longitudinaux des souris, minimisant leur utilisation. L’évaluation du nombre d’animaux nécessaire est aussi le fruit d’analyses statistiques basés sur le résultat de précédentes expériences effectuées dans notre laboratoire ou dans la littérature. Ainsi nous avons identifié que 8 animaux étaient suffisants pour avoir assez de pouvoir statistiques.
Raffinement
Des protocoles d’intervention en cas de début de souffrance seront mis en place (réchauffement, enrichissement de l’alimentation et du milieu), ainsi que des critères stricts d’arrêt de l’expérimentation en suivant une grille de score. En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de l’hématologie, les animaux sont suivis trois fois par semaine afin d'assurer leur bien-être et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. Les effets possibles de la chimiothérapie comprennent une diminution du poids, des altérations du comportement et du pelage. Pour l’utilisation de l’immunomodulateur, une inflammation systémique avec apparition de fièvre est généralement observée mais que nous n’avons jamais observée dans les doses que nous utilisons. La surveillance à l’aide de la grille de score permettra de réduire au minimum la souffrance animale : dès qu’un signe de souffrance débutante sera détecté, l’expérimentation sera interrompue. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d'atteinte d'un point-limite, nous arrêterons les traitements administrés, et si les symptômes persistent, l'animal sera mis à mort dans les 24h heures .
Choix des espèces
Pour étudier la production des cellules hématopoïétiques matures perturbée par la chimiothérapie, un animal ayant un système hématopoïétique proche du nôtre est nécessaire : la souris reste le modèle de référence. De plus, il n’est pas encore possible de reproduire in vitro l’hématopoïèse car elle se développent durant des mois ou des années et dépend du microenvironnement qui ne peut pas encore être reproduit expérimentalement in-vitro. L’hématopoièse dépend du microenvironnement qui ne peut pas encore être reproduit expérimentalement in vitro. De plus, l’induction de code-barres ou du rapporteur de cycle cellulaire se fait in vivo, grâce à deux lignées de souris spécifique excluant la possibilité de modèle in vitro. A noter cependant que notre schéma expérimental et nos hypothèses reposent sur l’étude de nombreuses cohortes cliniques de patients traités pour le cancer et ayant développé ensuite un cancer secondaire. Les animaux seront adultes. Nous souhaitons étudier l’effet de la chimiothérapie sur les cellules souches hématopoïétiques à l’âge adulte car c’est l’âge de survenue des cancers secondaires.
Impact des microplastiques alimentaires sur la sévérité de l’inflammation intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Cinquante souris reçoivent, par cycles de sept jours pendant quatre semaines, un agent qui enflamme leur intestin et peut provoquer des saignements et une perte de poids, tandis que 80 des 100 souris du projet boivent pendant dix semaines une eau chargée de trois polymères de microplastiques. Les procédures sont déclarées modérées pour la moitié des animaux et sévères pour l'autre. Le RNT qualifie ce traitement de "sévère pour les animaux mais nécessaire", puis le présente comme "un modèle maîtrisé depuis longtemps" dont "nous savons rapidement repérer les symptômes". Toutes sont tuées après une endoscopie rectale finale sous anesthésie, pour que le foie, le cœur, la rate, les intestins, le sang, les selles et les urines soient prélevés.
Objectifs
Les microplastiques sont des particules de très petite taille (c'est à dire 70 fois plus petit que l’épaisseur d’un cheveu), que l’on retrouve sous différentes formes (fragments, fibres, films, billes…) et composées de différents polymères. Présentes partout dans l’environnement. On estime aujourd’hui que 10 % de l’ensemble des plastiques produits depuis leur invention auraient terminé leur vie dans les océans. Ils s’accumulent ensuite dans tous les écosystèmes, y compris les habitats les plus reculés comme les fonds marins ou les plus accessibles comme l’alimentation, ce qui conduit à leur ingestion involontaire par l’Homme. Ainsi, l'Homme consommerait en moyenne 52 000 microparticules de plastique chaque année via son alimentation. Leur omniprésence a conduit à de nombreuses études, même si les conséquences sur notre santé restent encore peu connues. Certains modèles animaux laissent à penser qu’ils pourraient impacter l’intestin. Chez l’Homme, une étude a retrouvé plus de microplastiques chez des patients atteints de Maladies Intestinales que chez les personnes saines. Certains microplastiques aggravent l’inflammation de l’intestin chez la souris. D’autres études ont montré que les microplastiques provoquent des perturbations de la flore intestinale et de la santé digestive. Cependant, ces études se sont uniquement concentrées sur les microplastiques les plus retrouvés chez les individus sains alors que des polymères différents ont été retrouvés chez des patients atteints de Maladies Intestinales. A ce jour, aucune étude ne s’est intéressée à l’effet combiné de ces microplastiques qui contaminent notre alimentation. Pour cela, notre projet propose d’étudier les effets des trois polymères les plus détectés dans les selles de patients atteints de Maladies Intestinales. Nous souhaitons, par ce projet, évaluer la capacité à provoquer une inflammation de l’intestin des microplastiques sélectionnés, indépendamment ou combinés, dans un modèle de souris. Les résultats attendus de ce travail permettront de mieux comprendre les mécanismes par lesquels les microplastiques affectent la santé de l’intestin et dans quelle mesure ces derniers sont responsables de l’aggravation de l’inflammation de l’intestin.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de ce travail permettront de mieux comprendre les mécanismes par lesquels les microplastiques affectent la santé de l’intestin et dans quelle mesure ces derniers sont responsables de l’aggravation de l’inflammation de l’intestin. De tels résultats sont indispensables pour proposer de nouvelles approches thérapeutiques pour freiner la progression de la maladie et d’améliorer la qualité de vie des patients atteints de Maladies Intestinales. Enfin, la santé de notre planète a un impact sur la santé des patients et le projet contribuera à développer des stratégies préventives contre la pollution par les déchets plastiques dans le Monde, tant au niveau des patients qu'au niveau de la société.
Procédures
4 interventions seront réalisées durant ce projet : (1) L’administration des microplastiques directement faite via l’eau de boisson durant 10 semaines sur 80 animaux (tous sauf les contrôles) (2) Le traitement pro-inflammatoire pour "imiter" les symptômes d'une Maladie Inflammatoire Chronique Intestinale sera réalisé sur la moitié des animaux (50) durant 4 semaines par cycle de 7 jours. (3) La mesure de la perméabilité intestinale : des gavages gastriques seront réalisés avec un produit fluorescent et des prélèvements de sang réalisés à la joue, sous anesthésie générale (durée maximum 2 à 3 minutes). Cette procédure sera réalisée sur animaux vigiles pour le gavage (durée quelques secondes) et ne sera réalisée qu’une seule fois. (4) L'endoscopie rectale : examen de quelques minutes (10 maximim) réalisé le dernier jour du protocole sous anesthésie générale sur la totalité des animaux juste avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
4 interventions seront réalisées durant ce projet : (1) L’administration des microparticules de plastique sera faite via l’eau des biberons pendant toute la durée du protocole sur 80 animaux (tous sauf les contrôles). Elle ne devrait pas induire de nuisances pour les animaux et ne pas provoquer de perturbation au niveau de la faim et de la soif des animaux. (2) Induction d’une inflammation de l’intestin : réalisée sur la moitié des animaux (50 animaux) 4 semaines après le début de l’administration des microparticules de plastique, selon 3 cycles de 7 jours. Ceci reste un traitement sévère pour les animaux mais nécessaire étudier l’inflammation chez les animaux. Ces derniers pourront potentiellement perdre du poids pendant la durée du traitement mais également avoir des saignements. Cependant, la dose administrée est une dose très largement utilisée dans la littérature scientifique. C’est un modèle maîtrisé depuis longtemps. Il est à noter que la sévérité de la réponse au traitement est aussi très dépendante de l’environnement de l’animal mais que nous savons rapidement repérer les symptômes afin de limiter la souffrance des animaux. (3) Mesure de la perméabilité intestinale : des gavages oraux seront réalisés avec un produit fluorescent sur animaux vigiles et des prélèvements de sang réalisés à la joue sous anesthésie générale. Maîtrisée par l’expérimentateur, cette procédure n’engendre que très peu de stress à l’animal. Elle ne sera réalisée qu’une seule fois et n’a jamais provoqué de nuisance chez les animaux par le passé. (4) Endoscopie rectale : cette procédure est réalisée à la fin du protocole sous anesthésie générale sur la totalité des animaux du protocole avant mise à mort.
Devenir
Les animaux mis à mort à la fin de la dernière intervention (coloscopie) afin de récupérer les différents organes. Une anesthésie générale sera réalisée pour le prélèvement de sang de l'intervention n°3 et pour la coloscopie finale n°4. A l’issue de celle-ci, les animaux seront mis à mort et tous les organes (foie, coeur, rate, intestins) ainsi que le sang, les selles et les urines sont prélevés.
Remplacement
A ce jour, les maladies intestinales ne peuvent pas être entièrement reproduites par des modèles cellulaires. En effet, la physiologie intestinale est complexe car elle implique plusieurs systèmes distincts notamment le système digestif, le système immunitaire et la flore intestinale. Aussi, les réponses inflammatoires sont des processus temporels et évolutifs impliquant des organes extérieurs au tube digestif, il n’existe donc pas de remplacement possible du modèle animal pour explorer notre question de recherche.
Réduction
Nous avons réduit au minimum le nombre de souris par groupe, à savoir 10 souris par groupes réparties dans 5 groupes, eux mêmes subdivisés en 2 sous-groupes soit un total de 10x5x2 = 100 souris nécessaires à cette étude pour obtenir la puissance statistique suffisante tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupe de 5 animaux, dans des cages ventilées, avec à disposition du papier, des cabanes en carton pour se cacher et grimper, des buchettes de bois pour usure des dents et autres matériaux d’enrichissement tout au long du protocole. Toutes les procédures expérimentales seront réalisées par des personnes formées et expérimentées. Elles auront lieu dans l’animalerie du laboratoire , dans un environnement sécurisant pour l’animal et les coloscopies se feront sous anesthésie générale. Une procédure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place. Le point limite est fixé selon un score défini au préalable et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids de plus de 15%, déshydratation, yeux et abdomen creux). En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des organes prélevés pour permettre des analyses biologiques. Le modèle d'inflammation est un modèle bien maîtrisé et les symptômes sévères sont repérés rapidement afin de limiter la souffrance des animaux et intervenir sans délai.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix dans l’étude des Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin. Le modèle choisi est très largement publiée, en raison de sa simplicité d'administration (dans l'eau de boisson) de la facilité de contrôle du dosage (pour déterminer la gravité) et de la durée (pour étudier le processus inflammatoire et de « récupération »). En matière d’étude préclinique, ce modèle reste le modèle de choix. Les souris utilisées auront 8 à 9 semaines. Ce stade correspondant au passage à la maturité sexuelle chez la souris soit au passage au stade « Jeune Adulte», ce qui correspond aux besoins du projet, les Maladies Inflammatoires Chroniques de l'Intestin touchant majoritairement de jeunes adultes.
Exploration de l’activité métabolique cérébrale dans un modèle animal murin d’autisme traité ou non à l’Arbaclofene.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Quatre jours de contention à blanc dans une cage chauffée à 37 °C, une nuit de quinze heures sans nourriture, une injection de traceur radioactif dans l'abdomen, trente minutes d'imagerie sous anesthésie, puis le même enchaînement une seconde fois après douze jours de traitement dans l'eau de boisson. 40 souris mâles vont être utilisées ainsi, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Elles portent l'inactivation d'un gène du chromosome X associé à l'autisme et à la déficience intellectuelle, et le porteur cherche à objectiver par imagerie l'effet de l'arbaclofène sur leur métabolisme cérébral. Toutes sont tuées à l'issue du projet et leurs cerveaux prélevés.
Objectifs
Les troubles du spectre de l’autisme (TSA) font partie des troubles du neurodéveloppement qui sont la conséquence d’un développement cérébral atypique sous l’influence de facteurs génétiques et environnementaux. Ces troubles se manifestent tôt dans la vie de l’enfant et ont des conséquences sévères sur leur intégration sociale et scolaire. Des études montrent qu’une grande contribution dans ce développement cérébral atypique serait d’ordre génétique. Plus de 800 gènes ont été associés aux troubles du spectre de l’autisme (TSA), dont notamment des gènes localisés sur le chromosome X. L’objectif général de ce projet est de mieux comprendre le rôle de mutations génétiques retrouvées dans un gène qui contribue à la physiopathologie de la déficience intellectuelle et des troubles du spectre de l’autisme (TSA). L’objectif de cette saisine est de comparer l’activité métabolique cérébrale et la connectivité cérébrale par imagerie, d’un modèle murin. De plus, nous évaluerons l’effet d’un traitement pharmacologique dans ce modèle animal par imagerie.
Bénéfices attendus
Ce projet va apporter des informations sur les conséquences de l’inactivation d'un gène spécifique de la physiopathologie des TSA et de la déficience intellectuelle. De plus, ce projet a pour but d’objectiver les effets d'un traitement pharmacologique sur l’activité métabolique cérébrale dans ce contexte.
Procédures
Habituation des souris : mimer injection Intra-péritonéale (IP) 30 secondes et mettre l’animal dans sa cage et poser dans une cage étuve à 37°C pendant 20 min durant 4 jours avant chaque imagerie - Les animaux auront deux mises à jeun durant le projet, la veille de chaque imagerie (jeûne de 15 heures maximum). L'animal recevra 2 injections de radiotraceur en IP durant le projet : durée 30 secondes chaque injection - souris dans cage étuve : 2 fois 45 min d’habituation durant le projet - Imagerie : 2 fois 30min - traitement pharmacologique dans l'eau de boisson pendant 12 jours.
Impact sur les animaux
La contention/ manipulation de l’animal, la mise à jeun et le déplacement de l’animal dans une autre pièce de manipulation peuvent engendrer un stress. L’injection intrapéritonéale peut engendrer une lègère douleur au site d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue du projet et les cerveaux seront prélevés pour des analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Le modèle utilisé dans cette étude présente des anomalies comportementales similaires à celles observées chez des patients atteints de TSA et nous souhaitons tester in vivo l’impact du traitement proposé, pour cela il est nécessaire que nous travaillions dans un contexte moléculaire et physiologique que l’on retrouve seulement chez l’animal intègre.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux, les animaux seront imagés plusieurs fois. A partir des images acquises avec le radiotraceur, nous réaliserons des analyses statistiques appropriées pour ce projet afin de comparer les 2 groupes d'animaux. Le nombre d'animaux dans ce projet est dicté par des études antérieures menées au sein de notre laboratoire qui ont montré qu'un effectif de n=20 par groupe est nécessaire. Nous utiliserons 40 animaux sur 3 ans pour répondre à notre objectif.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les animaux seront observés une à deux fois par jour. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en œuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par les procédures. Pendant le prototocole, si nous constatons des conflits dans les cages, nous procèderons à une séparation des individus. En cas de blessures, nous appliquerons de la Vétédine savon et solution sur la plaie jusqu’à la cicatrisation complète. Pendant le projet, le point d’injection, les expressions faciales, la posture de l’animal, la réactivité de l’animal à des stimuli externes (bruit…) seront monitorés chaque jour. Une perte de poids de plus de 15%, une réactivité anormale à des stimuli externes (bruits), une posture et des expressions associées à une souffrance de l’animal impliqueront sa mise à mort. Pendant 4 jours avant l’imagerie, pour minimiser leurs stress, une habituation des animaux sera réalisée. Cette période d’habituation consiste pendant les 4 jours précédents l’imagerie à prendre l’animal en contention pour mimer l’injection du traceur en intra-péritonéale et à le placer dans une cage, elle-même déposée dans une cage étuve maintenue à 37°C pour une durée de 20 min, puis replacer l’animal dans sa cage. Le jour de l'imagerie, l’induction d’anesthésie sera réalisée en gazeux à 3% et pendant les imageries les animaux seront maintenus à 1,8-2%. Une protection oculaire sera appliquée. L’animal sera maintenu durant toutes les expérimentations d’imagerie sur tapis chauffant, le rythme respiratoire et la température corporelle seront surveillés. Dès son réveil, l’animal sera remis dans sa cage d’hébergement.
Choix des espèces
Les modèles murins sont des modèles d'expérimentation animale de choix pour l’étude du système nerveux en conditions normale et pathologique, la souris partage environ 99% de ses gènes avec l'homme. Le modèle utilisé dans cette étude présente des anomalies comportementales similaires à celles observées chez des patients atteints de TSA. Nous utiliserons des souris mâles adultes afin d'avoir une taille de cerveau compatible avec la technique d'imagerie utilisée dans ce protocole.
Evaluation de l’effet d’un peptide-médicament sur la croissance tumorale dans des modèles murins de xénogreffes de cellules cancéreuses
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des injections cinq jours sur sept pendant quarante-cinq jours, plus trois gavages par semaine pour une partie des animaux : 620 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses après leur mort. Des cellules cancéreuses humaines, de pancréas, de poumon, de côlon, de vessie ou de la sphère ORL, leur sont greffées sous la peau du flanc, où les tumeurs se développent jusqu'à devenir palpables. L'immunodéficience est recherchée pour éviter le rejet de ces cellules et pour que le système immunitaire des souris ne vienne pas moduler l'effet du peptide testé. Le porteur détaille une grille de douleur qui va du rétrécissement de l'aire orbitale aux vibrisses orientées vers l'arrière, et prévoit la mise à mort par dislocation cervicale des animaux dont l'état ne s'améliore pas en vingt-quatre heures.
Objectifs
Nous travaillons sur est une protéine (ci-après nommée K1) qui joue un rôle central dans le contrôle de divers fonctions cellulaires (adhésion, migration, croissance et différenciation). La surexpression de K1 dans différents types de cancers est un facteur de mauvais pronostic qui prédit une diminution de la survie des patients. En particulier, K1 est impliquée dans les cancers du pancréas, du côlon, du poumon, de la vessie et de la sphère ORL, cancers présentant souvent des options thérapeutiques limitées. Nous avons récemment montré que la déplétion de K1 réduit spécifiquement la viabilité des cellules cancéreuses dépendantes de voies oncogéniques particulières. Nos résultats montrent, par ailleurs, qu’un mutant de K1, qui ne peut plus se lier à ces partenaires moléculaires inhibe totalement les propriétés prolifératives et invasives des cellules tumorales. L’ensemble de ces résultats suggère que le ciblage de K1 à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques sélectifs pourrait être une approche thérapeutique pertinente pour le traitement des cancers dépendants de voies de signalisation particulières. Nous avons donc conçu un peptide-médicament qui interfère avec la capacité de liaison de K1 à d’autres protéines. L’utilisation de notre inhibiteur pharmacologique sur un grand nombre de lignées immortalisées de cancers du pancréas, du poumon, du colon, de la vessie et de la sphère ORL a montré une réduction importante de la prolifération tumorale in vitro. L’objectif de ce projet est de déterminer si notre inhibiteur pharmacologique peut inhiber la croissance de tumeurs dépendantes de voies de signalisation particulières in vivo et de mettre en évidence de potentiels effets synergiques de notre inhibiteur pharmacologique en combinaisons avec des agents thérapeutiques classiquement utilisés en clinique.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de l'étude proposée est de déterminer les groupes de patients atteints de cancer susceptibles de répondre favorablement à notre peptide inhibiteur et qui pourront donc bénéficier de notre inhibiteur pharmacologique en monothérapie ou en combinaison avec d’autres molécules déjà utilisées en clinique. De plus, notre inhibiteur pourrait permettre de surmonter la résistance à certains traitements, utilisés actuellement en clinique, et ainsi améliorer la prise en charge de patients dont les options thérapeutiques sont limitées.
Procédures
Afin d’évaluer l’effet anti-tumoral de notre inhibiteur pharmacologique, les souris seront greffées avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée (J1 de l’expérience) sur le flanc de l’animal afin de minimiser la gêne liée à la croissance tumorale. Les souris vigiles recevront une seule injection Les souris seront ensuite suivies quotidiennement afin de contrôler l’apparition de tumeurs et l’état général des animaux. De plus, une mesure du poids sera effectuée 2 fois par semaine. Dès lors que les tumeurs deviendront palpables les souris vigiles recevront une injection d’un produit non irritant, 5 jours sur 7, sur une durée de 45 jours maximum. Certains animaux recevront également un second traitement anticancéreux par voie orale à raison de 3 gavages par semaine.
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée développeront des tumeurs. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection elle-même (gène de courte durée) ou à l’administration des traitements par voie orale (stress lié au gavage)
Devenir
Tous les animaux du protocole seront mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Nous avons d’ores et déjà accumulé de nombreuses données in vitro sur les différentes lignées correspondant au projet proposé, et avons constaté l’effet anti-tumoral spécifique de notre inhibiteur pharmacologique sur les lignées dépendantes d’une voie de signalisation particulière. Cependant, les modèles in vitro ne peuvent pas récapituler la complexité des tumeurs in vivo. Ces dernières ne sont pas simplement constituées de cellules tumorales, elles sont également colonisées par des cellules de l’hôte (macrophages, cellules du système immunitaire, fibroblastes) et des vaisseaux sanguins qui viennent vasculariser les tumeurs et permettent leur croissance. De plus, il est également impossible de mimer in vitro la dissémination métastatique à partir d’une tumeur primaire vers d’autres organes à distance. C’est pour ces raisons que nous avons besoin d’utiliser ce modèle murin.
Réduction
La taille des groupes d’animaux nécessaires à la réalisation de l’étude a été calculée à l’aide d’une analyse de puissance qui nous a permis de déterminer l’effectif minimal garantissant l’obtention de résultats statistiquement significatifs. De plus, ce projet sera réalisé par étape. La première partie du projet, permettra de déterminer le nombre de souris nécessaires pour la deuxième partie du projet. Cette analyse ne sera lancée que dans un deuxième temps, sur les modèles les plus pertinents obtenus en première partie de projet.
Raffinement
Afin de réduire le stress des animaux, une période d’acclimatation de 2 semaines est observée suite à leur réception. Pendant cette période les animaux seront uniquement manipulés afin de les habituer au contact de l’utilisateur et réduire leur stress. Un examen clinique approfondi (avec pesées des animaux) sera réalisé deux fois par semaine pour évaluer les anomalies comportementales naturelles, qui incluent (1) l’apparition de morsures ou de lésions indiquant des comportements agressifs de souris entre elles, (2) une hyperactivité locomotrice et la modification de la structure du nid, (3) un isolement de l’animal (4) une prostration de l’animal dans un coin de la cage, mais également aux anomalies comportementales provoquées en touchant l’animal (l’animal bouge lentement ou refuse de bouger, prostration transitoire, hyperactivité, agressivité). Les signes de douleur comprennent également (1) l’apparition de plaies par grattage, (2) une expression faciale modifiée (rétrécissement de l'aire orbitale, gonflements du museau et joues, oreilles écartées vers l'arrière, vibrisses orientées vers l'arrière), (3) un écoulement naso-oculaire, et (4) une perte de poids supérieure à 10 % sur une semaine. En cas de petites plaies causées par les souris, une solution aqueuse de chlorhexidine sera appliquée afin de les désinfecter, suivie de l’application d’une crème cicatrisante afin d’aider à la régénération des tissus endommagés. Suivant le type de dommage et afin de garantir le bien-être animal, les souris pourront être (1) isolées dans une nouvelle cage en vue de leur apporter les soins adaptés, (2) observées plusieurs fois par jour, (3) recevoir des antalgiques en cas de signe de douleur, et (4) mises à mort si aucune amélioration n’est observée au bout des premières 24h. L’observation de signes de douleur ou de mal être entraînera automatiquement la sortie de l’animal du protocole. L’identification d’un point limite entraînera la mise à mort de l’animal par dislocation cervicale.
Choix des espèces
Nous avons obtenu de nombreuses données in vitro à partir de lignées tumorales. Cependant, ces modèles in vitro ne peuvent pas récapituler la complexité des tumeurs in vivo qui ne sont pas simplement constituées de cellules tumorales mais également de cellules de l’hôte (macrophages, cellules immunitaire, fibroblastes, vaisseaux). De plus, il est également impossible de mimer in vitro la dissémination métastatique à partir d’une tumeur primaire vers d’autres organes à distance. Le recours à un organisme-modèle est indispensable. Les souris sont des mammifères couramment utilisés en recherche cancérologique. Les souris immunodéficientes, permettent de réaliser des greffes de cellules humaines dans le modèle murin sans rejet par son système immunitaire. De plus, l’activité biologique de notre inhibiteur pharmacologique pourra être évalué sans que le système immunitaire des souris puisse moduler son effet. Les protocoles seront réalisés avec des souris âgées de 6 semaines. A cet âge, l’ensemble des fonctions sont matures.
Fibrose hépatique au cours du diabète : impact des récepteurs CB1 et du transporteur de glucose SGLT2 chez la souris obèse et diabétique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Nourries d'un régime gras pendant vingt semaines à partir de l'âge de 4 semaines, des souris peuvent grossir au point de ne plus atteindre leur nourriture ni leur eau, et développer un état dépressif et de l'anxiété. 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, afin de tester l'association de deux traitements contre la fibrose du foie liée à l'obésité et au diabète. Elles reçoivent ces traitements par gavage et subissent 14 incisions de la veine de la queue sous anesthésique local, chaque test de glycémie étant précédé de six heures d'isolement à jeun. Pour décrire les actes, le porteur compte en secondes : 30 secondes de pesée par semaine, "soit un total de 12 minutes par souris", 10 secondes de contention par gavage, 3 à 4 secondes par incision, sans y faire figurer le régime.
Objectifs
La prévalence mondiale de l’obésité est en constante progression. L'obésité est un facteur de risque majeur pour le développement du diabète de type 2 et de perturbations cardiométaboliques dont la MAFLD (Metabolic dysfunction-Associated Fatty Liver Disease). Cette pathologie est principalement caractérisée par une profonde perturbation du métabolisme du foie et par un développement de fibrose. Actuellement, aucune approche médicamenteuse efficace n’est commercialisée à l’heure actuelle. L’objectif de notre projet est d’étudier les potentielles interactions entre 2 cibles thérapeutique sur l’évolution de fibrose dans un modèle de souris souffrant de MAFLD.
Bénéfices attendus
La prise en charge et le traitement du diabète de type II et de ses complications est un enjeu de santé publique de plus en plus prégnant. Les stratégies médicamenteuses bien que multiples voient leurs limites dans le fait qu’elles ne ciblent généralement qu’un récepteur et donc qu’un point précis du métabolisme, limitant ainsi leur efficacité. Ce projet permettra de nous renseigner sur le réel potentiel thérapeutique d’une double approche pharmacologique dont les deux stratégies ont déjà chacune démontré des effets hépato-protecteurs. Ceci pourrait avoir un réel impact pour les patients.
Procédures
Pendant les 24 semaines de la procédure, les souris seront manipulées hebdomadairement pour monitorer leur masse corporelle. Cette action mécanique durera 30 secondes par souris à chaque fois, soit un total de 12 minutes par souris sur l’ensemble du projet. L’administration des traitements pharmacologiques par gavage oro-pharyngé nécessitera l’immobilisation de chaque animal pendant 10 secondes à chaque administration. Pour chaque test nécessitant une mesure de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local afin de prélever du sang total et ainsi réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement durera 3-4 secondes et aura lieu 14 fois par animal (2 x 7 prélèvements à 5 jours d’intervalle). Pour les tests faisant intervenir une mesure de glycémie, un isolement de 6h préalable sera nécessaire pour effectuer un jeun. Les tests en eux-même durent 2h.
Impact sur les animaux
En plus d’une altération des paramètres métaboliques, un régime gras de longue durée peut entrainer une prise de poids importante et altérer les capacités motrices de l’animal au point de le rendre incapable d’accéder à la nourriture et la boisson. Le régime gras peut également altérer la santé mentale des animaux et créer un état dépressif et de l’anxiété.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.
Remplacement
L’obésité, le diabète de type 2 et le développement de MAFLD sont le fruit de dérégulations multifactorielles entraînant une élévation incontrôlée du glucose sanguin et une perturbation de l’homéostasie lipidique ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier ces aspects, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé sur la base de projets similaires précédemment réalisés. Grâce à notre expérience du travail sur les molécules antidiabétiques, nous avons pu au cours des projets réduire le nombre d’animaux par groupe en optimisant les temps et doses de traitement. En effet, il ne nous est plus nécessaire de réaliser des effets doses, ni de multiplier les temps de traitements, pour un large spectre de molécule, dont celles utilisées dans ce projet. De plus, l’utilisation des animaux a été réfléchie afin qu’un maximum de données soient obtenues avec un minimum de douleurs et de stress pour les animaux. Ainsi des tests in vivo et des prélèvements d’organes seront réalisés chez les mêmes animaux. Pour ces raisons, avec une seule dose et un seul temps de traitement, nous avons réduit le nombre d’animaux pour mener à bien ce projet et obtenir un puissance statistique suffisante.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe (5 animaux par cages) avec un enrichissement de leur milieu de vie, dans une pièce calme et tempérée. Les aliments et l’eau de boisson seront fournis ad libitum. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel qualifié et des soins pourront être apportés si l’état de santé des rongeurs le nécessite. Pendant les traitements pharmacologiques, les souris seront amenées à être hébergées de manière individuelle pour les tests de tolérance au glucose et de sensibilité à l’insuline (total de 8h par expérimentation). Pour chaque cas, un enrichissement plus important sera apporté dans chaque cage. De plus, le contact visuel entre animaux sera maintenu via l’utilisation de cages transparentes.
Choix des espèces
L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’espèce humaine. Dans ce sens, dans le cadre de la recherche fondamentale, il paraît déterminant de choisir un modèle animal dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris, qui sur le plan neurobiologique et métabolique, présente de multiples similarités avec l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Le début du projet fera appel à des souris de 4 semaines. L’utilisation d’animaux jeunes se justifie par le fait qu’à cet âge, l’efficacité du régime est optimale car ils sont en pleine croissance. Ceci permet donc de limiter le temps de régime et donc le stress et les nuisances engendrées. Considérant les 20 semaines de régime WD, les animaux seront âgés de 24 semaines lors du commencement de l’approche pharmacologique et de 28 semaines lors de la fin de l’expérimentation.
Etude de l’influence des androgènes sur la régénération musculaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
800 souris reçoivent dans le muscle de la patte une injection de cardiotoxine, un venin de serpent qui lèse les fibres et provoque une douleur que le porteur reconnaît, après cinq jours de tamoxifène et, pour certains groupes, la pose chirurgicale d'un implant d'androgènes. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance sévère, le plus élevé de l'échelle. Le porteur écrit pourtant n'avoir "pas prévu d'administrer d'analgésiques", hors chirurgie, et fixe la mise à mort à une perte de plus de 20 % du poids sur une semaine. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour que leurs muscles soient analysés, l'enjeu déclaré étant de savoir si les androgènes améliorent ou aggravent la réparation d'un muscle lésé.
Objectifs
La régénération musculaire est indispensable pour maintenir la fonctionnalité du muscle squelettique. Le muscle squelettique adulte est capable de se régénérer spontanément à la suite d'une lésion grâce à des cellules souches musculaires localisées à la périphérie des fibres musculaires. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la dégénération d’une part et la régénération musculaire d'un muscle adulte d’autre part. Pour ce faire, les muscles des souris de type sauvage (non sujettes à des mutations) seront traitées à la cardiotoxine (un venin de serpent) afin d'induire une blessure au niveau du muscle tibial antérieur. Ces souris seront en parallèle traitées avec une substance synthétique qui a le même rôle des androgènes sécrétés par l'organisme ou un placébo afin de mettre en évidence une amélioration ou au contraire une aggravation du processus de réparation du muscle lésé.
Bénéfices attendus
L'ensemble de ces procédures permettra de déterminer le potentiel thérapeutique des androgènes dans le processus de régénération musculaire.
Procédures
Tous les animaux seront traités au Tamoxifène par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec/ souris), anesthésiés à l'isoflurane (5-10 min/ souris), injectés à la cardiotoxine par voie intramusculaire (30 sec/souris). Un des groupes subira un implant d'androgènes en sous-cutané dans la région interscapulaire (5 min/souris). Un autre recevra les androgènes par voie musculaire en même temps que la cardiotoxine (30 sec/souris).
Impact sur les animaux
Les injections peuvent très rarement causer des infections. Le site d'injection sera surveillé chaque jour, et désinfecté si besoin. L'injection de cardiotoxine engendrera une douleur au niveau du muscle lésé. La chirurgie nécessaire pour la pose de l'implant pourra générer un inconfort dans les premiers jours suivant l'intervention.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale pour des études moléculaires et histologiques.
Remplacement
Afin de déterminer le potentiel thérapeutique des molécules identifiées dans des systèmes cellulaires, le recours à un organisme entier est nécessaire. Par ailleurs, de nombreux facteurs et hormones interviennent dans la régénération fibrillaire. Ainsi il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte.
Réduction
De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, pour une même souris une patte sera utilisée pour des analyses moléculaires et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.
Raffinement
Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène et de cardiotoxine. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage et son activité (un dos vouté, un pelage hérissé ou inactivité après stimulation, sont tous des signes d'incofort de l'animal). Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, l'animal sera sorti du lot et une euthanasie sera réalisée. L'injection de cardiotoxine, la substance synthétique et la chirurgie seront faites sous anesthésie. Nous n'avons pas prévu d'administrer d'analgésiques. Ils seront par contre donnés pour la chirurgie.
Choix des espèces
Les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Les souris de 7 à 11 semaines seront utilisées. En effet, le projet s’intéresse à l’organisme adulte et les souris jeunes possèdent davantage de cellules satellites que les souris agées.