Souris

Ouvertes sous anesthésie pour que leurs embryons reçoivent une injection intracrânienne suivie d'une impulsion électrique, les femelles gestantes de ce projet risquent l'avortement ou une mise bas prématurée. 2 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur note que les embryons peuvent ressentir une douleur de courte durée au moment de l'injection, leur crâne étant "encore totalement mou à ce stade", et que les cerveaux sont prélevés sur les souriceaux trois à cinq jours après la naissance pour cultiver des explants. Il affirme que ces cultures "permettent de réduire considérablement le nombre de souris utilisées puisqu'une seule souris permet de réaliser plusieurs essais", pour un effectif déclaré de 2 100 animaux.

Objectifs

Des altérations de la neurotransmission sont à la base de toutes les pathologies du cerveau. Le contrôle de la neurotransmission permet d’adapter les réponses des neurones et donc du cerveau aux modifications de l’environnement. Les microglies, qui sont les macrophages du cerveau, sont fortement impliquées dans le contrôle de la fonction synaptique. Un tel contrôle est important pour la physiologie du cerveau puisque les microglies représentent jusqu'à 20 pourcent des cellules du cerveau et qu'elles contactent en permanence 1 à 10 pourcent des synapses. En particuliers, les microglies sont nécessaires à la régulation des synapses inhibitrices : quand l’activité neuronale augmente, un rétro contrôle induit une augmentation du nombre de récepteurs au neuromédiateurs aux synapses inhibitrices ; ce rétro-contrôle ne peut pas se faire sans cytokines produites par les microglies. Le présent projet s’appuie sur ces observations et cherche à mieux comprendre les mécanismes de la régulation des synapses inhibitrices et à décrire les interactions morphologiques et fonctionnelles entre la microglie et les synapses.

Bénéfices attendus

Les microglies sont les macrophages du cerveau. Elles representent jusqu’à 20 pourcent des cellules selon les régions du cerveau. En permanence, elles envoient et retractent leurs prolongements qui contactent en permanence 1 à 10 pourcent des synapses. Pourtant, on ne sait pas encore à quoi servent ces interactions. Notre projet permettra de le comprendre. De plus, les microglies sont activées dans la quasi-totalité si ce n’est dans toutes les pathologies du cerveau, et elles ne sont donc plus dans un état physiologique. Il est donc probable qu’une perte des fonctions microgliales fasse partie de l’étiologie des pathologies du cerveau. Comprendre ces fonctions physiologiques a donc un intérêt majeur dans la compréhension des pathologies.

Procédures

Les femelles gestantes subiront une chirurgie unique sous anesthésie et analgésie d’une durée de 30 minutes. Les embryons subiront lors de cette chirurgie une injection intracrânienne suivie d’une impulsion électrique (électroporation in utéro). Les animaux seront ensuite euthanasiés par différentes méthodes réglementaires en fonction des analyses nécessaires

Impact sur les animaux

Les femelles gestantes subiront une unique chirurgie pouvant entraîner un stress thermique et des risques liés à l’anesthésie (détresse respiratoire, mauvais endormissement, etc.). Les femelles pourront également ressentir de la douleur en post-opératoire avec également un risque infectieux ou de dessiccation. Au cours de cette chirurgie, les embryons seront manipulés afin de réaliser une électroporation in utero (injection d’une solution intracrânienne suivie d’une application d’un courant électrique sur la tête). Les embryons seront susceptibles de ressentir de la douleur de courte durée lors de l’injection. Il est à noter que le crâne est encore totalement mou à ce stade. Un risque d’avortement ou de mise bas prématuré existe également avec ce type de chirurgie.

Devenir

Nos études se fondent sur des cultures d'explants de cerveaux ou de cellules de cerveau dissociées. Il est donc indispensable d'euthanasier les animaux pour extraire leur cerveau.

Remplacement

Les études des interactions entre les microglies et les synapses doivent se faire dans un système qui récapitule les interactions spatiales et temporelles qui ont lieu dans le cerveau. A notre connaissance, ces interactions ne sont pas reproduites dans des systèmes en culture, mais sont acceptables dans des cultures organotypiques que nous utiliserons. De plus, nous souhaitons étudier l'importance cytokines et des mouvements des microglies et nous utiliserons des outils génétiques disponibles chez la souris qui permettent de les étudier.

Réduction

Nous utiliserons 2100 souris. Notre projet s'appuie sur des cultures d'explants qui permettent de réduire considérablement le nombre de souris utilisées puisqu'une seule souris permet de réaliser plusieurs essais. La taille des échantillons est calculée sur la base de nos études précédentes.

Raffinement

Les procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de papier kraft ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons systématiquemnet de raffiner nos procédures pour optimiser le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études . Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et la structure de bien être animale et ou la vétérinaire pourra être sollicitée. Les animaux sont hébergés dans des conditions standard : Hébergement en cages ventilées individuellement (moins de 6 souris/cages) - Salle d’hébergement en surpression - Cycle nycthémère de 12h (7h - 19h) - Hygrométrie de 55 plus ou moins 5 pourcent - Température 22 plus ou moins 2C - Change litière/abreuvement/nourriture 1 fois par semaine + vérification quotidienne - Enrichissement du milieu : papier kraft.

Choix des espèces

La souris est choisie pour plusieurs raisons dont les plus importantes sont la disponibilté des modèles transgéniques et de manipulations génétiques multiples, et l'existence de nombreuses études antérieures qui nous permettent d'étayer notre projet. Les électroporation in utéro se font entre 13,5 et 15, 5 jours après fécondation (début du 3eme tiers de la gestation) , au moment où les neurones qui nous interessent sont générés. Les cultures organotypiques de cerveaux se réalisent à partir de cerveaux de souris 3 à 5 jours après la naissance et on sait que dans ces conditions, les régulations microglies-synapses sont conservées .

2 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'équipe implante une tumeur sous la peau du flanc sur animal vigile, puis mesure cette tumeur deux à trois fois par semaine pendant qu'elle grossit, avec gêne à la mobilité, frottement, ulcération et nécrose possibles. Le porteur écrit qu'aucun dommage majeur n'est attendu, les produits testés étant déjà évalués chez l'être humain dans un essai clinique qu'il référence. Ces études servent à compléter des dossiers réglementaires auprès de l'ANSM et de la FDA, puis une demande d'autorisation de mise sur le marché.

Objectifs

Le Projet est une étude Préclinique de Pharmacologie expérimentale. Il a pour principal but de valider le mécanisme d'action de différents candidats Immunothérapeutiques via l'étude de l'activité antitumorale et de la réponse immunitaire induite sur souris porteuses de tumeurs. Nos candidats immunothérapeutiques seront administrés sous forme de cellules à récepteur antigénique chimérique (CAR), peptidique ou sous forme d'anticorps. Ces candidats seront spécifiques de différents antigènes de tumeurs déterminés par des études de recherche cognitive.

Bénéfices attendus

Ce projet de Pharmacologie s'inscrit dans une phase de développement préclinique de différents candidats immunothérapeutiques destinés à lutter contre les différentes formes de cancer chez l'Homme. Ces études, nous permettront la complétion de dossiers réglementaires pour obtenir l'accord de l'Agence Nationale de Sécurité du Médicament (ANSM (France) ou FDA (US)) pour évaluer l'efficacité de nos candidats immunothérapeutiques dans des phases cliniques sur des patients atteints de cancers. D'autre part elles seront constitutives d'une partie du dossier de demande d'autorisation de mise sur le marché (AMM). En effet, ces produits d'immunothérapie devront répondre à des normes internationales de qualité scientifique et clinique qui seront étroitement évaluées par les autorités de santé pour la délivrance de l'AMM.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à une procédure comprenant l'identification (animaux vigiles, 1 fois, 1 minute/animal), des pesées (animaux vigiles, 2 à 3/semaine, 1 minute/animale), des traitements (animaux vigiles, en injection sous cutanée, intrapéritonéale ou intraveineux en fonction du produit testé et du schéma de traitement qui est à déterminer : dose unique ou dose répétée), d'implantation de tumeurs sous cutanées (animaux vigiles, 1 fois, 1 minute/animale) et de mesures tumorales (animaux vigiles, 2 à 3 fois/semaine, 1 minute/animale). Pour certaines études, un suivi de la réponse dans le sang pourra être envisagé. Pour cela un prélèvement de sang périphérique sera effectué à la veine retro-mandibulaire. En fonction de la cinétique, au maximum une fois par semaine en respectant les volumes autorisés : 0.5% du poids de l'animal pour un intervalle d'une semaine, 0.75% pour 2 semaines et 1% pour 3-4 semaines. Les animaux seront ensuite mis à mort pour le prélèvement de sang et organes en point finale pour les évaluations pharmacologiques ex vivo.

Impact sur les animaux

Les agents thérapeutiques utilisés au cours de ce projet ayant déjà montré leur innocuité chez la souris sont en cours d'évaluation chez l'Homme (NCT05672459). De ce fait, aucun dommage majeur / effet indésirable lié au traitement n'est attendu dans le cadre de nos études. Cependant, une nuisance qui sera surveillée et contrôlée par le suivi et le respect des points limites, peux intervenir après injection de cellules tumorales et développement de la tumeur en sous cutanée sur le flanc de la souris (gêne à la mobilité lors du grossissement de la tumeur, frottement ulcération et nécrose). Il est important de noter que l'expérimentation animale sera utilisée de manière rationnelle et selon les réglementations en vigueur qui garantissent un traitement éthique de l'animal de laboratoire (application des 3R), avec pour objectif le raffinement, la réduction de l'utilisation de l'animal de laboratoire ou son remplacement par des modèles in vitro (ou autres) lorsque cela est possible.

Devenir

En fin d'étude les animaux seront mis à mort et certains organes (rate, poumons, foie, ganglions, sang, cerveau, tumeurs) seront prélevés pour des études de Pharmacocinétiques et de Pharmacodynamie.

Remplacement

Dans un premier temps, les différents candidats immunothérapeutiques feront l'objet d'une sélection et d'un développement préclinique in vitro, sur divers modèles cellulaires, afin de confirmer leur fonctionnalité. Par la suite, les modèles murins ayant leurs propres limitations pour les études de toxicologie sur des cibles humaines, des méthodes in vitro et/ou ex vivo seront mises en place avec l'utilisation notamment de culture 3D organoïdes, cellules primaires humaines ou banque de protéines d'expression sur modèles cellulaires.

Réduction

Chaque étude fera l'objet d'une rédaction de protocole expérimental, afin de garantir l'optimisation des expériences. L'optimisation du nombre d'animaux : entre 5 et 10 souris par groupe seront utilisées pour évaluer et interpréter l'efficacité antitumorale des différents candidats. La réduction des répétitions inutiles et optimisation du nombre d'animaux contrôles entre les différentes expériences réalisées dans les mêmes conditions. Les critères d'optimisation du nombre d'animaux contrôles vont dépendre du design de l'expérience (nombre de groupes expérimentaux) et des résultats des expériences précédentes / antérieures. La réduction du nombre d'animaux ne devra néanmoins pas se faire au dépend de la fiabilité des résultats. Lorsque cela est possible, et principalement pour les souris provenant de fournisseurs agréés, l'utilisation d'animaux homogènes (même sexe, même âge, même état sanitaire) sera privilégiée. Cette précaution sera prise afin de réduire autant que faire se peut la variabilité d'un individu à l'autre. Le nombre d'animaux utilisé dans les études a été déterminé pour permettre une étude statistique non paramétrique. Pour les études qui impliquent la comparaison de 2 groupes nous utiliserons un test de Mann-Whitney et pour les études impliquant des comparaison multi-groupes, nous utiliserons un test de Kruskal-Wallis avec correction de Dunn.

Raffinement

Utilisation des mesures de raffinement suivantes chaque fois que possible : - Procédures non invasives - Assurer les soins pré-, per- et postopératoires adéquats - Recours à l'anesthésie / analgésie - Application des points limites établis préalablement - Utilisation des procédures d'euthanasie appropriées - Utilisation de litière chirurgicale pour limiter les frottements/blessures/ulcérations de la tumeur lié à la litière - Utilisation de portoirs et cages ventilées - Enrichissement du milieu (maison, matériel de nidification) - Désinfection à l'aide de désinfectant iodé - Application d'Aluspray en aide à la cicatrisation

Choix des espèces

Les différents candidats immunothérapeutiques seront d'abord évalués par des tests cellulaires in vitro pour confirmer leur fonctionnalité et leur innocuité. Néanmoins, il n'existe pas actuellement de tests de remplacement ou d'alternatives à l'utilisation d'animaux de laboratoire pour étudier la réponse immunitaire et l'efficacité antitumorale. Ces deux critères sont essentiels et critiques pour évaluer le potentiel thérapeutique réel des immunothérapies développées. Aujourd'hui, la souris est le principal modèle utilisé / étudié en recherches anticancéreuses et en immunologie. Pour notre projet, nous utiliserons des modèles de souris, dans lesquelles de nombreux modèles de tumeurs ont été isolés / développés et sont parfaitement caractérisés. Souris adultes entre 5 et 10 semaines : âge compatible avec le monitoring d'une réponse immunitaire et l'implantation de cellules tumorales en sous cutanées ou injection intraveineuse.

Injectées d'antigènes, prélevées par ponction dans l'orbite de l'œil sous anesthésie à quatorze, vingt-huit et quarante-deux jours, puis exposées à cinq moustiques chacune pendant qu'elles sont endormies : 295 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Neuf jours après les piqûres, de nouveaux prélèvements rétro-orbitaires suivent, puis des biopsies de peau, pour un objectif que le porteur situe à long terme, un vaccin universel contre tous les flavivirus. Une partie des souris fournit le sérum, collecté par ponction dans le cœur juste après leur mise à mort, sérum ensuite injecté à d'autres souris exposées aux mêmes moustiques. Toutes sont tuées, les dernières par dislocation cervicale sous anesthésie après le prélèvement de la peau, avant tout réveil.

Objectifs

Le projet de recherche permettra de tester une nouvelle stratégie de lutte contre tous les flavivirus, tel que la dengue, le Zika et la fièvre jaune. L’objectif est de déterminer l’effet d’une immunisation contre un nouveau facteur de transmission chez le moustique et de déterminer le mécanisme. Ces données fourniront la base nécessaire au développement d’une stratégie vaccinale contre tous les flavivirus. Il sera réalisé sur deux établissements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme sont : i) Identifier une cible vaccinale contre tous les flavivirus, ii) Comprendre l’effet de l’immunisation contre la cible vaccinale sur la transmission. A long terme, les résultats permettront le développement d’un vaccin universel contre tous les flavivirus, lesquels infectent un demi-milliard de personnes et en tuent 250000 par an.

Procédures

D'abord, nous optimiserons l’immunisation contre le facteur de transmission. La procédure durera 42 jours. Nous injecterons les souris avec des antigènes et ferons des prélèvements sanguins à 14, 28 et 42 jours par ponction rétro-orbitaire sous anesthésie volatile. Ensuite, nous testerons l’effet de l’optimisation sur la transmission d’un flavivirus par piqûre de moustique. La procédure durera 52 jours. Les souris seront injectées avec les antigènes, exposées aux moustiques sous anesthésie générale et nous effectuerons à 3, 6 et 9 jours post piqûre des prélèvements par ponction rétro-orbitaire sous anesthésie. Puis, nous déterminerons si la protection contre la transmission est liée à l’immunité humorale (c.-à-d. les anticorps), en testant l’effet d’une immunisation passive par injection de sérum immune sur la transmission par piqûre. La procédure durera 52 jours. Nous injecterons les souris avec les antigènes, collecterons le sang par ponction cardiaque après euthanasie, injecterons le sérum immun dans d’autres souris, exposerons ce second lot de souris aux piqûres de moustiques et effectuerons à 3, 6 et 9 jours post piqure de moustiques des prélèvements sanguin par prélèvement retro-orbitaires sous anesthésie. Enfin, nous décrypterons comment l’immunisation contre le facteur de transmission affecte l’infection de la peau par piqûre du moustique. La procédure durera 52 jours. Nous injecterons les souris avec les antigènes, les exposerons aux piqûres de moustiques sous anesthésie et collecterons des biopsies cutanées à l'endroit de piqures de moustiques avec des punch et sous anesthésie. Les animaux seront sacrifiés juste après la réalisation des biopsies.

Impact sur les animaux

- Il est possible qu'une douleur légère soit occasionnée lors d'injection de l'anesthésique ou de l’antisérum. Toutes les autres interventions seront réalisées sous anesthésie. -Perte de poids, mobilité réduite ou inactivité, mauvais état corporel, stress, comportement anormal, troubles neurologiques liés à l’infection par le virus.

Devenir

Les souris dans toutes les procédures seront mises à mort sous anesthésie. Toutes les souris dédiées à la production des sérums seront prélevées par ponction intracardiaque juste après leur mise à mort. Les souris seront mises à mort après la réalisation de biopsies cutanées sous anesthésie et avant leur réveil.

Remplacement

Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. Aucun modèle, à par le modèle animal, ne nous permettra de faire un test d’immunisation. Néanmoins, nous avons générés les données préliminaires nécessaires, supportant notre hypothèse, sur des modèles in vitro. De plus, nous caractériserons la fonction des gènes régulés identifiés par le scRNAseq (expérience 4) sur des modèles in vitro en utilisant des cellules primaires.

Réduction

-Afin de réduire le nombre de souris, nous allons utiliser une seule dose (la plus élevée) dans les groupes contrôles pour déterminer les meilleures conditions d’immunisation (procédure 1) -Dans les procédures 2, 3 et 4, nous exposerons chaque souris à 5 moustiques pour réduire le nombre d’animaux nécessaire aux tests de survie et à la collecte des biopsies de peau.

Raffinement

-Les souris seront manipulées de façon à réduire au maximum le stress, la douleur et la souffrance. Elles seront anesthésiées avant les prélèvements sanguins ou leur exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Nous utiliserons des coussins chauffants et une lampe chauffante pour maintenir la température des souris anesthésiées. Un contrôle régulier, toutes les 15 min, sera effectué pour déceler toute possible anomalie liée à la narcose : suivi des grandes fonctions et desséchement de la cornée. En dehors des expériences, le suivi des souris s’effectuera chaque jour. - Les souris infectées seront mises à mort après la collecte des biopsies cutanées par dislocation cervicale sous anesthésie. - Nous ajouterons du gel ophtalmique pour palier au dessèchement de la cornée. - Les souris seront maintenues par 3 à 5 individus / cage avec de la litière et des enrichissements en alternance. Nous changerons la litière tous les 3 jours.

Choix des espèces

Nous allons utiliser des souris C57BL/6J. Contrairement aux autres modèles d’infection pour les flavivirus, ces souris ne sont pas immunodéprimées. Les modèles de transmission des flavivirus utilisent généralement des souris transgéniques avec une immunité innée déficiente. Notre projet vise à étudier la réponse immunitaire et nécessite un modèle animal avec une immunité fonctionnelle. De plus, nous avons déjà validé et établie les conditions pour infecter les C57BL/6J par piqûre de moustique. Par ailleurs, les souris sont des animaux de petites tailles, faciles à manipuler. Les constantes physiologiques seront facilement mesurables avec des outils adaptés. Nous allons utiliser des sujets adultes de 6 semaines, qui ont une taille corporelle et un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate, une piqûre par plusieurs moustiques simultanément et leur manipulation.

Deux chirurgies du crâne de deux heures chacune, puis une injection sous-cutanée quotidienne pendant six à neuf semaines : 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une lentille optique implantée dans le cerveau et vivent seules en cage individuelle huit à seize semaines, avec une alimentation contrôlée pour rester motivées à chercher des récompenses dans une enceinte de test. Le porteur affirme que son dispositif miniature a "gommé" la plupart des limitations éthiques de l'imagerie in vivo et n'entrave pas les comportements normaux de la souris, quand l'isolement prolongé et la restriction alimentaire figurent au même protocole. Toutes sont tuées pour prélever le cerveau et vérifier que la lentille était bien placée.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer de quelle manière un traitement antidépresseur peut modifier le traitement de l’information et les codes neuronaux de la région cérébrale appelé hippocampe, une région essentielle pour la mémoire et l’adaptation aux conditions de stress. Cet objectif sera réalisé à travers (1) l’étude du comportement de souris traitées à un antidépresseur ou à un placebo lors de l’exposition à de nouveaux environnements couplée à (2) l’enregistrement simultané de neurones de la région d’intérêt. Pour cela, nous allons utiliser une technologie de pointe basée sur un système ultra miniaturisé et portatif permettant d’imager de manière longitudinale l’activité individuelle de multiples neurones en même temps chez l’animal libre de ses mouvements. La plupart des limitations habituelles éthiques et techniques liées à l’imagerie in vivo ont été gommées grâce à la conception de notre système d’imagerie : miniaturisation (moins de 2 cm et de 2 grammes) permettant de le placer directement sur la tête de l’animal de manière amovible comme un chapeau et sans entraver sans comportement normal. En outre, il permet de visualiser simultanément, à haute résolution et de manière répétée un nombre important de neurones par animal (jusqu’à plusieurs centaines) offrant ainsi une qualité de données et une puissance statistique inatteignable avec les autres techniques implantables.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d’apporter des éléments de connaissances des mécanismes et impacts des antidépresseurs à des niveaux cognitifs et neuronale permettant de comprendre comment les antidépresseurs peuvent induite leurs effets thérapeutiques et à l’avenir créer de nouvelles apporches favorisant ces effets

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 interventions chirurgicales (d’envrion 2h chacune) et un traitement antidépresseur quotidien par voie subcutanée pendant 6 à 9 semaines. Entrainements et tests comportementaux correspondant à une exploration libre de la souris d’une enceinte à la recherche de récompenses alimentaires (séance quotidienne de 30 à 40 minutes, ~6 semaines)

Impact sur les animaux

- Les chirurgies stéréotaxiques permettant l’injection du vecteur et l’implantation de la lentille optique avec son receptacle peuvent induire des douleurs post-opératoires légères à modérées avec un impact réduit dans le temps (quelques jours) sur le bien-être animal, les animaux étant traités avec un analgésique et récupérant rapidement de ce type de chirurgie. - Encombrement du système d’imagerie lors des tests, qui reste toutefois limité et léger (fibre optique et réceptacle seuls : < 0,2 g, miniscope < 2g), et n’entrave pas les mouvements et comportements normaaux de la souris après une première séance d’habituation. - Souris isolées après l’implantation du réceptacle, lors des phases d’entrainements et lors des tests (souris hébergées en cage individuelle pour une durée totale comprise entre 8 et 16 semaines). - Douleur légère au niveau du site d’injection (ip, sc)

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de récupérer le cerveau pour confirmer par histologie le bon positionnement de la lentille optique dans la zone cérébrale à imager puis doser l’expression de protéines cérébrales et comment celle-ci a été influencée par le traitement antidépresseur.

Remplacement

Ce modèle s'intéressant à l’activité du cerveau, aux effets cognitifs et comportementaux à la suite de traitement antidépresseur. Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique permettant une réduction des effectifs optimisée selon les recommandations éthiques. En outre, le nombre d'animaux pourra être réduit en fonction des résultats et notamment de l’efficacité de l’implantation (maximum 104 souris avec un taux de succès attendu de 50% d’après la société du système et notre expérience ; minimum 52 souris avec un taux de succès de 100%).

Raffinement

Les méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont optimisés : Les injections/implantations intracérébrales se feront sous anesthésie générale par des chercheurs formés et expérimentés. Les animaux recevront un traitement analgésique avant l’intervention chirurgicale, un traitement anti-inflammatoire après l’intervention et 24 heures après. Pendant la chirurgie, chaque animal sera placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie et les cornées sont protégées de la déshydratation. L’anesthésie gazeuse est ici privilégiée pour mieux contrôler la profondeur d’anesthésie et pour une meilleure récupération post-opératoire. Une surveillance post-opératoire d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris et intervenir si nécessaire (si reprise de poids déficiente ou température élevée, traitement antibiotique de penicilline). En cas de plaie, les animaux recevront un traitement analgésique. La plaie est désinfectée par l’application de bétadine dermique. Une surveillance accrue d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris montrant des signes de mal-être (hypothermie, prostration...) et intervenir si nécessaire (injection de saline pour l’hydratation, nourriture appétente...). Les injections sous-cutanées sont préférées aux intra-péritonéales pour leur plus grande sûreté et leur moindre invasivité. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. Les expérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites sont appliqués: les animaux surveillés sont pesés et oscultés quotidiennement (hydratation, température, état de la blessure si blessure). La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine. D’un point de vue scientifique, le système utilisé représente la méthode d’imagerie de résolution neuronale la plus moderne, performante et spécifique, permettant de visualiser simultanément à haute résolution un nombre important de neurones (jusqu’à plusieurs centaines) offrant ainsi une qualité de données et une puissance statistique inatteignable avec les autres techniques d’imagerie.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, espèce modèle dans le domaine des pathologies psychiatriques. En outre, les traitements de référence ont démontré leur efficacité dans cette espèce. Les souris utilisées seront des individus adultes, l’étude ayant comme objectif d’améliorer la compréhension des mécanismes sous-tendant les effets cognitifs et thérapeutiques des antidépresseurs qui sont prescrits en premier lieu pour la dépression majeure de l’adulte chez l’homme.

Un morceau de queue d'environ un millimètre coupé au ciseau chirurgical sur animal vigile, à dix jours de vie : tous les souriceaux nés dans ce projet subissent ce prélèvement pour génotypage. 370 souris porteuses d'un transgène humain lié à la maladie d'Alzheimer vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 120 reçoivent des injections directement dans l'œil sous anesthésie, 280 passent trois ou quatre séances d'imagerie, 90 subissent une heure d'enregistrement de potentiels évoqués, et le porteur reconnaît que ces manipulations peuvent provoquer inflammation, opacité cornéenne ou paupières mi-closes. Quarante souris passent des "examens d'acuité visuelle" à trois reprises dans leur vie, sans que le RNT précise en quoi ils consistent.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative caractérisée par des troubles cognitifs et psychocomportementaux entraînant une perte d’autonomie. L’incidence de cette maladie est en augmentation avec le vieillissement de la population. Un diagnostic précoce représente un véritable enjeu de santé public. Aussi, déterminer des signes de diagnostic précoce, est indispensable pour le traitement dans les meilleurs délais des patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Lors des études précédentes, il a été découvert qu’un modèle murin (souris) de la maladie d'Alzheimer, présentait des altérations au niveau rétine dès l’âge de 6 mois avec l’apparition de protéines Tau phosphorylés, ainsi qu’un déficit visuel accompagné d’un retard de la transmission synaptique au niveau de la couche des photorécepteurs de la rétine. Le but du présent projet est de comprendre le mécanisme de ces changements physiologiques précoces durant la maladie d'Alzheimer et de visualiser les protéines Tau phosphorylé (enchevêtrements) in vivo.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus dans le cadre de ce projet sont d’établir un nouvel outil de diagnostic précoce de la maladie d’Alzheimer ainsi que de comprendre le mécanisme de ces changements physiologiques précoces durant la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Les animaux transgéniques présentent un phénotype dommageable. Ces souris peuvent souffrir de déficit moteur à partir du 7ème mois. Au 10ème jour après la naissance, un prélèvement caudal d’environ un mm coupé au ciseau chirurgical à bout pointu sur animal vigile pour génotypage sera réalisé. Quelques secondes seront nécessaires pour réaliser cet acte. Tous les animaux naissants seront soumis à cet acte une seule fois dans leurs vies. Durant cette étude des examens d’acuité visuelle seront réalisés sur des souris vigiles. Quarante animaux seront soumis à cet examen d'une duré de quelques minutes trois fois dans leurs vie. Les examens d’imageries seront réalisé sur 280 souris anesthésiés. La procédure d'imagerie dure 5 à 10 min, le groupe de quarante souris non injecté sera soumis a ce test 3 fois dans leurs vie, les 240 souris injecté seront quant à elle soumise 4 fois à l'examen d'imagerie. Les injections en intraveineuses des molécules d’intérêt sur animal vigile sont une procédure à durée de moins d'une minute, cela concernera 120 souris. Les injections intraoculaire des molécules d’intérêt seront réalisés sur 120 animaux anesthésiés , cette procédure dure 5 à 10min. L'enregistrement des potentiels évoqués se fera une seule fois sur 90 animaux sous anesthésie générale, la durée de l'enregistrement est d'une heure. Des analgésiques seront donnés aux animaux afin de réduire la sensation de douleur. Les 370 souris seront euthanasiées par différentes méthodes réglementaires selon les besoins expérimentaux.

Impact sur les animaux

Les animaux développent une pathologie neurodégénérative avec l’âge et pourront donc présenter une perte de poids après le 7ème mois de vie ainsi qu’un déficit cognitif pouvant entraîner une agressivité accrue. Les animaux seront soumis à une biopsie caudale (environ 1mm) afin de réaliser l’identification génétique des animaux et à un transport de courte durée. Pendant les anesthésies, il est possible que les animaux présentent des difficultés respiratoires ou une mauvaise réaction à l'anesthésie pouvant aller jusqu’à l’arrêt cardio-respiratoire (très rare). Au cours de l’étude, et suite aux manipulations (imagerie de l’œil, injection intra-veineuse/intra-oculaire, etc.) une atteinte oculaire est possible telle que : inflammation, opacité cornéenne, paupières mi-closes, etc.

Devenir

La totalité des animaux seront euthanasiés en fin de période de maintien par différentes méthodes réglementaires pour la réalisation des différentes analyses.

Remplacement

Les animaux serviront à comprendre la réponse physiologique de la rétine ainsi que le développement de nouveaux marqueurs rétiniens lors de la maladie d’Alzheimer. La fonction rétinienne sera étudiée par imagerie et électrophysiologie in-vivo chez ce modèle. L’objectif de cette étude concerne l’exploration des relations cellulaires au sein de la rétine à ce jour aucun modèle cellulaire n’est assez complexe pour se substituer à mimer la rétine.

Réduction

Une analyse de puissance statistique a été établie et le nombre d’animaux utilisé a été estimé à 370 animaux en vue d’atteindre un compromis entre une puissance élevée et un nombre d’animaux nécessaire. Nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (cotons, tunnel en carton et un bâton en bois) alimentation et abreuvement à volonté. Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Les animaux seront pesés une fois par semaine à partir du 7ème mois. La première pesée sera prise comme référence. L’atmosphère est contrôlée pour les conditions d’hébergement (température et hygrométrie stable). Les animaux bénéficieront si nécessaire d’une anesthésie gazeuse ou fixe par injection intrapéritonéale. Deux différents analgésiques seront aussi administrés pour réduire la douleur pendant les expérimentations. Tous signes d’inconfort ou d’atteinte oculaire sera pris en compte tels que l'apparence et la position anormale : poil ébouriffé, perte de poids (à partir de 6 mois), dos courbé, couché sur le côté ; comportements anormaux : agressivité soudaine, isolement, réduction de la mobilité. Les points limites sont : atteinte oculaire (cataracte, inflammation...), léthargie, immobilité, perte de 20 pour cent de poids et difficultés respiratoires (gasps). Toutefois, les critères absolus ne devraient pas être mis en évidence aux vues des procédures utilisées et de notre expérience sur ce modèle dans notre laboratoire.

Choix des espèces

La souris présente l’avantage d’être physiologiquement similaire à l’Homme. En plus la souris modèle présente un transgène humain. Ce modèle fait partie des modèles les plus utilisés pour l’étude de la maladie d’Alzheimer. Les souris seront étudiées à trois différents âges : - 3 mois : âge où un début de gliose et de perte synaptique sont observé - 6 mois : âge auquel les enchevêtrements sont observés avec un début de déficit cognitif - 9 mois : âge correspondant à une perte neuronale Ces âges ont été bien définis dans la littérature

Jusqu'à sept prélèvements sanguins en vingt-quatre heures et sept anesthésies par animal : 50 600 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent les composés par gavage, injection intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée, intraveineuse caudale ou dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, et peuvent être hébergées en cage métabolique. Le porteur annonce qu'aucune dégradation de leur état de santé n'est attendue, tout en listant les effets non prédictibles possibles, perte de poids, hypothermie ou hyperthermie, comportement anormal, vocalisations. L'objet réel est de mesurer où va une molécule dans le corps avant une première administration humaine, à raison de 580 études par an, un rythme que le RNT chiffre sans le justifier.

Objectifs

L’objectif du projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques et/ou les concentrations tissulaires d’entités thérapeutiques chimiques ou biologiques après administration chez la souris. Dans la recherche préclinique et la recherche de candidats, ces paramètres sont essentiels pour la sélection et l’évaluation des candidats médicaments. Les entités testées sont préalablement analysées lors de tests in-vitro. Une première sélection est ainsi réalisée pour n’administrer aux animaux que des entités avec des caractéristiques favorables en terme pharmacocinétique. Ces études préliminaires permettent d’objectiver les processus d’absorption, de dégradation, de distribution et d’élimination de chaque entité afin de prédire le comportement de ces entités chez l’homme. Ce projet s’inscrit dans une stratégie globale de caractérisation de nouveaux composés en vue de la première administration chez l’homme, c’est donc une étape clé dans le cycle de vie de tout médicament en développement. Nous estimons réaliser 580 études par an répartie sur les trois procédures décrites dans le projet, soit 50600 animaux sur cinq ans.

Bénéfices attendus

A court terme, les expérimentations de ce projet permettront de déterminer les paramètres essentiels pour l’avancée du développement préclinique pour les entités testées. Ces résultats permettront de sélectionner les candidats potentiels ainsi que les doses et les voies d’administration les plus adaptées. A long terme, les entités sélectionnées constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme.

Procédures

Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : Durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Administrations des composés à potentiel thérapeutiques o par voir orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique), intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée: Durée 30 secondes sur animaux vigiles. Unique ou répétée max 2 ou 3 fois par jour selon la voie o par voie intraveineuse à la veine caudale sur animal vigile: Durée 30 secondes. Unique ou répétée max 2 fois par jour o par voie intraveineuse au sinus rétro orbitale : Durée 30 secondes sous anesthésie générale gazeuse ou chimique. Maximum deux administrations par sinus. Cette technique ne sera utilisée que très occasionnellement et seulement sur justification scientifique. Prélèvements de sang o via la veine caudale en microsampling: Durée 30 secondes sur animal vigile. Maximum 7 fois sur 24h. o via ponction cardiaque en phase terminale : Durée 1 minute sous anesthésie générale gazeuse ou chimique. Les volumes et la fréquence des prélèvements seront selon les critères de la consigne en vigueur. Les volumes seront généralement de 20 à 50 µL. Le volume total prélevé n'excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l'animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place entre les prélèvements. • Anesthésie pour imagerie : anesthésie gazeuse de 30 minutes maximum ; 7 anesthésies maximum par animal sur la durée de l'étude.

Impact sur les animaux

Aucune dégradation de l'état de santé de l'animal n’est attendue par l’application des procédures de ce projet. Toutefois dans ces phases précoces de développement, des effets secondaires non prédictibles peuvent survenir : perte de poids, hypo- ou hyperthermie, comportement anormal (animaux hypo ou hyperactifs), vocalisations. Tout effet observé sera noté selon une grille spécifique et donnera lieu à une action adaptée à la gravité des signes ; les points-limite anticipés permettent de limiter la nuisance à un niveau de gravité modéré au maximum. Au cours des études, les animaux peuvent être soumis à une ou plusieurs anesthésie(s), des administrations et des prélèvements sanguins, ou un hébergement en cage à métabolisme, qui peuvent induire un certain stress (manipulation de l'animal, administration orale, cage métabolique) ou une douleur passagère lié au geste lui-même (injection de l'administration ou réalisation du prélèvement); ces nuisances sont de niveau léger, à modéré par leur cumul.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures. D’une part, les études nécessitant des prélèvements d’organes ne permettent pas une réutilisation D’autre part, le but de ces études étant de générer les premières données PK sur les composés étudiés, il n’est pas possible d’anticiper une période de wash-out permettant une réutilisation. De plus, l’homogénéité d’âge des animaux utilisés en étude est nécessaire pour limiter la variabilité et ainsi augmenter la fiabilité des résultats et la comparaison entre études appartenant à un même projet scientifique.

Remplacement

De nombreux tests in vitro existent et permettent de sélectionner les entités d'intérêt uniquement sur la base de leurs caractéristiques pharmacocinétiques, notamment l'absorption et le métabolisme. Il n'existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de déterminer l'ensemble des propriétés pharmacocinétiques d'un composé d'intérêt. Seul un modèle animal peut permettre de caractériser ces entités et discriminer celles qui pourront être envisagées pour un traitement chez l’homme.

Réduction

Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d'interaction du composé avec la cible d'intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). Cette approche préalable permet de réduire fortement le nombre d’entités à tester. La forte sensibilité des méthodes analytiques permet la mise en œuvre de techniques de prélèvements sanguins de volumes réduits autorisant la réalisation de prélèvements répétés sur un même animal. Il est ainsi possible d’obtenir une cinétique complète à partir d’un seul animal. Cela augmente aussi la robustesse des données obtenues pouvant mettre en évidence une éventuelle variabilité inter-individuelle. Le nombre d’animaux s’appuie sur des recommandations internationales dans le domaine de la pharmacocinétique et des publications scientifiques (European Medicines Agency). Autant que possible, il est réduit au minimum scientifique de 3 animaux par groupe pour les études de pharmacocinétique et 5 animaux par groupe pour les études de biodistribution par imagerie.

Raffinement

Les animaux seront hébergés conformément aux standards réglementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront groupés dans des cages contenant de l'enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Les locaux d'hébergement font l'objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d'hébergement et d'animaux sentinelles. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous l'autorité du vétérinaire désigné ou mis à mort selon les recommandations définies dans la consigne en vigueur. Un plan d'action sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire. Le projet sera mis en œuvre par du personnel qualifié et habilité conformément à la réglementation en vigueur. De plus, les procédures sont fortement améliorées grâce à l’organisation de formations complémentaires pour le personnel en relation directe avec les animaux sur les techniques d’administrations et de prélèvements de liquides biologiques.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus communément utilisées lors d’essais de pharmacocinétique préclinique. De nombreuses publications le démontrent comme suit: • Surgical and pharmacological animal models used in drug metabolism and pharmacokinetics, K.A. Landskroner, P. Hess, and A. Treiber, Xenobiotica, 2011; 41(8): 687–700. • Experimental models for predicting drug absorption and metabolism - Saeed Alqahtani, Loqman A Mohamed & Amal Kaddoumi, Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. (2013) 9(10):1241-1254. Le choix de l’espèce est dicté par différents impératifs : - techniques : quantités de composé disponibles - scientifiques : comparaison de résultats pharmacodynamiques et pharmacocinétiques chez la même espèce animale, homologie de récepteur de l’espèce choisie avec le récepteur humain. Le stade adulte sera utilisé par défaut (à partir de 7 semaines) car c’est celui qui permet de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de l’espèce pour une entité donnée. Toutefois, il sera possible d’utiliser des animaux à un stade plus précoce (âgés de 15 jours) pour établir des données d’exposition spécifique à un modèle ou une cible thérapeutique.